CN117965490A - 一种3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸盐合酶突变体及其应用 - Google Patents

一种3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸盐合酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种3'‑磷酸腺苷‑5'‑磷酸硫酸盐合酶突变体及其应用，通过对3'‑磷酸腺苷5'‑磷酸硫酸盐合酶的氨基酸序列进行突变，得到了酶活性显著提高的3'‑磷酸腺苷5'‑磷酸硫酸盐合酶突变体Mu‑1、Mu‑2、Mu‑3，其活性分别为野生型3'‑磷酸腺苷5'‑磷酸硫酸盐合酶活性的197.14％，143.62％，116.75％。本发明采用3'‑磷酸腺苷5'‑磷酸硫酸盐合酶突变体作为催化剂，催化合成3'‑磷酸腺苷5'‑磷酸硫酸盐，并采用离子交换层析对3'‑磷酸腺苷5'‑磷酸硫酸盐进行分离纯化，进一步提高了3'‑磷酸腺苷5'‑磷酸硫酸盐产量，此合成方法不使用有毒有害溶剂、绿色环保、工艺简单易操作、收率高、纯度高且生产成本较低，有利于大规模生产。

Description

一种3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸盐合酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程和酶工程领域，尤其涉及一种3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸盐合酶突变体及其应用。
背景技术
硫酸化反应广泛存在于生物体内源性物质代谢及外源性物质化学修饰过程中，对细胞发育、分化、免疫、解毒等生物学功能作用显著。在生物体中，3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸盐(PAPS)是活性硫酸根供体，是细胞对无机硫酸盐的吸收和代谢至关重要的物质，硫酸转移酶催化PAPS的硫酸基团转移到对应的底物中合成硫酸化的代谢产物。上述硫酸化反应机制也用于体外酶法制备硫代葡萄糖苷、肝素、硫酸软骨素和氧氨喹等化合物。
在人体内合成PAPS的途径主要是依靠3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶(PAPSS)。PAPSS是哺乳动物体内生成PAPS的关键酶，在人体内发现两种类型的3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶PAPSS1与PAPSS2，都能够以ATP、无机硫酸盐为底物一步催化合成PAPS。但是野生型3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶活性较低，无法用于工业生产，此外制备得到的PAPS难以分离纯化，使得生产效率低下，不适合规模化生产。
因此，构建稳定、高效的PAPS合成、纯化体系，对PAPS的高效合成十分重要。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶突变体及其应用，采用酶活性显著提高的突变体作为催化剂，制备得到高纯度、高收率3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐。
本发明解决上述问题的技术方案如下：
一种3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶突变体，所述突变体是在野生型3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶的氨基酸序列SEQ ID NO.1、野生型3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶亚型的氨基酸序列SEQ ID NO.2的基础上进行如下突变得到：
选择SEQ ID NO.1的N端前50个氨基酸进行不同长度截短或选择SEQ ID NO.2的N端前50个氨基酸进行不同长度截短，得到3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶突变体。
作为优选，所述突变体是如下突变之一得到的：
突变a：将野生型3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶的氨基酸序列从N端截短至第34位缬氨酸得到突变体Mu-1；Mu-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
突变b：将野生型3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶亚型的氨基酸序列从N端截短至第43位精氨酸得到突变体Mu-2；Mu-2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
突变c：将野生型3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶的氨基酸序列从N端截短至第34位缬氨酸，并将野生型3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶氨基酸序列第207位的半胱氨酸突变为丝氨酸得到突变体Mu-3；Mu-3的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供了上述3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶突变体的编码基因。
本发明还提供了包含上述3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶突变体的编码基因的重组载体。
本发明还提供了包含上述重组载体的基因工程菌。
本发明的另一目的是，提供一种3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶突变体在制备3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐中的应用。
本发明还提供了一种制备3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐的方法，以ATP盐、无机硫酸盐为底物，以上述3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶突变体为催化剂，在含氯化镁、氯化锂、缓冲液的溶液中进行催化反应，合成3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐。
作为优选，所述ATP盐的添加量为0.1～30mM，所述无机硫酸盐添加量为0.01～0.3M；所述氯化镁添加量为0.15～20mM，所述氯化锂添加量为0.15～45mM；所述3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶突变体的添加量为0.1～5mg/mL；所述催化反应pH值为5～10，温度为25～30℃，时间为0.5～24h。
作为优选，将所述3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐进行分离纯化。
作为优选，将所述3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐通过离子交换层析进行分离纯化。
本发明所述SEQ ID NO.1：
MEIPGSLCKKVKLSNNAQNWGMQRATNVTYQAHHVSRNKRGQVVGTRGGFRGCTVWLTGLSGAGKTTVSMALEEYLVCHGIPCYTLDGDNIRQGLNKNLGFSPEDREENVRRIAEVAKLFAD AGLVCITSFISPYTQDRNNARQIHEGASLPFFEVFVDAPLHVCEQRDVKGLYKKARAGEIKGFTGIDSEYEKPEAPELVLKTDSCDVNDCVQQVVELLQERDIVPVDASYEVKELYVPENKLHLAKTDAETLPALKINKVDMQWVQVLAEGWATPLNGFMREREYLQCLHFDCLLDGGVINLSVPIVLTATHEDKERLDGCTAFALMYEGRRVAILRNPEFFEHRKEERCARQWGTTCKNHPYIKMVMEQGDWLIGGDLQVLDRVYWNDGLDQYRLTPTELKQKFKDMNADAVFAFQLRNPVHNGHALLMQDTHKQLLERGYRRPVLLLHPLGGWTKDDDVPLMWRMKQHAAVLEEGVLNPETTVVAIFPSPMMYAGPTEVQWHCRARMVAGANFYIVGRDPAGMPHPETGKDLYEPSHGAKVLTMAPGLITLEIVPFRVAAYNKKKKRMDYYDSEHHEDFEFISGTRMRKLAREGQKPPEGFMAPKAWTVLTEYYKSLEKA
本发明所述SEQ ID NO.2：
MSGIKKQKTENQQKSTNVVYQAHHVSRNKRGQVVGTRGGFRGCTVWLTGLSGAGKTTISFALEEYLVSHAIPCYSLDGDNVRHGLNRNLGFSPGDREENIRRIAEVAKLFADAGLVCITSFISPFAKDRENARKIHESAGLPFFEIFVDAPLNICESRDVKGLYKRARAGEIKGFTGIDSDYEKPETPERVLKTNLSTVSDCVHQVVELLQEQNIVPYTIIKDIHELFVPENKLDHVRAEAETLPSLSITKLDLQWVQVLSEGWATPLKGFMREKEYLQVMHFDTLLDGMALPDGVINMSIPIVLPVSAEDKTRLEGCSKFVLAHGGRRVAILRDAEFYEHRKEERCSRVWGTTCTKHPHIKMVMESGDWLVGGDLQVLEKIRWNDGLDQYRLTPLELKQKCKEMNADAVFAFQLRNPVHNGHALLMQDTRRRLLERGYKHPVLLLHPLGGWTKDDDVPLDWRMKQHAAVLEEGVLDPKSTIVAIFPSPMLYAGPTEVQWHCRSRMIAGANFYIVGRDPAGMPHPETKKDLYEPTHGGKVLSMAPGLTSVEIIPFRVAAYNKAKKAMDFYDPARHNEFDFISGTRMRKLAREGENPPDGFMAPKAWKVLTDYYRSLEKN
本发明所述SEQ ID NO.3：
VSRNKRGQVVGTRGGFRGCTVWLTGLSGAGKTTVSMALEEYLVCHGIPCYTLDGDNIRQGLNKNLGFSPEDREENVRRIAEVAKLFADAGLVCITSFISPYTQDRNNARQIHEGASLPFFEVFVDAPLHVCEQRDVKGLYKKARAGEIKGFTGIDSEYEKPEAPELVLKTDSCDVNDCVQQVVELLQERDIVPVDASYEVKELYVPENKLHLAKTDAETLPALKINKVDMQWVQVLAEGWATPLNGFMREREYLQCLHFDCLLDGGVINLSVPIVLTATHEDKERLDGCTAFALMYEGRRVAILRNPEFFEHRKEERCARQWGTTCKNHPYIKMVMEQGDWLIGGDLQVLDRVYWNDGLDQYRLTPTELKQKFKDMNADAVFAFQLRNPVHNGHALLMQDTHKQLLERGYRRPVLLLHPLGGWTKDDDVPLMWRMKQHAAVLEEGVLNPETTVVAIFPSPMMYAGPTEVQWHCRARMVAGANFYIVGRDPAGMPHPETGKDLYEPSHGAKVLTMAPGLITLEIVPFRVAAYNKKKKRMDYYDSEHHEDFEFISGTRMRKLAREGQKPPEGFMAPKAWTVLTEYYKSLEKA
本发明所述SEQ ID NO.4：
RGCTVWLTGLSGAGKTTISFALEEYLVSHAIPCYSLDGDNVRHGLNRNLGFSPGDREENIRRIAEVAKLFADAGLVCITSFISPFAKDRENARKIHESAGLPFFEIFVDAPLNICESRDVKGLYKRARAGEIKGFTGIDSDYEKPETPERVLKTNLSTVSDCVHQVVELLQEQNIVPYTIIKDIHELFVPENKLDHVRAEAETLPSLSITKLDLQWVQVLSEGWATPLKGFMREKEYLQVMHFDTLLDGMALPDGVINMSIPIVLPVSAEDKTRLEGCSKFVLAHGGRRVAILRDAEFYEHRKEERCSRVWGTTCTKHPHIKMVMESGDWLVGGDLQVLEKIRWNDGLDQYRLTPLELKQKCKEMNADAVFAFQLRNPVHNGHALLMQDTRRRLLERGYKHPVLLLHPLGGWTKDDDVPLDWRMKQHAAVLEEGVLDPKSTIVAIFPSPMLYAGPTEVQWHCRSRMIAGANFYIVGRDPAGMPHPETKKDLYEPTHGGKVLSMAPGLTSVEIIPFRVAAYNKAKKAMDFYDPARHNEFDFISGTRMRKLAREGENPPDGFMAPKAWKVLTDYYRSLEKN本发明所述SEQ ID NO.5：
MEIPGSLCKKVKLSNNAQNWGMQRATNVTYQAHHVSRNKRGQVVGTRGGFRGCTVWLTGLSGAGKTTVSMALEEYLVCHGIPCYTLDGDNIRQGLNKNLGFSPEDREENVRRIAEVAKLFADAGLVCITSFISPYTQDRNNARQIHEGASLPFFEVFVDAPLHVCEQRDVKGLYKKARAGEIKGFTGIDSEYEKPEAPELVLKTDSSDVNDCVQQVVELLQERDIVPVDASYEVKELYVPENKLHLAKTDAETLPALKINKVDMQWVQVLAEGWATPLNGFMREREYLQCLHFDCLLDGGVINLSVPIVLTATHEDKERLDGCTAFALMYEGRRVAILRNPEFFEHRKEERCARQWGTTCKNHPYIKMVMEQGDWLIGGDLQVLDRVYWNDGLDQYRLTPTELKQKFKDMNADAVFAFQLRNPVHNGHALLMQDTHKQLLERGYRRPVLLLHPLGGWTKDDDVPLMWRMKQHAAVLEEGVLNPETTVVAIFPSPMMYAGPTEVQWHCRARMVAGANFYIVGRDPAGMPHPETGKDLYEPSHGAKVLTMAPGLITLEIVPFRVAAYNKKKKRMDYYDSEHHEDFEFISGTRMRKLAREGQKPPEGFMAPKAWTVLTEYYKSLEKA
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过对3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶的氨基酸序列进行突变，得到了酶活性显著提高的3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶突变体Mu-1、Mu-2、Mu-3，其活性分别为野生型3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶活性的197.14％，143.62％，116.75％；
(2)本发明采用3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶突变体作为催化剂，催化合成3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐，并采用离子交换层析对3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐进行分离纯化，进一步提高了3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐产量，此合成方法不使用有毒有害溶剂、绿色环保、工艺简单易操作、收率高、产物纯度高且生产成本较低，有利于大规模生产。
附图说明
图1为空白对照高效液相图(以不添加酶的反应液作为空白，仅有底物ATP)；
图2为3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶催化反应液高效液相图；
图3为3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐纯化以碳酸氢铵作为洗脱剂梯度洗脱色谱图；
图4为3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶催化反应液以碳酸氢铵作为洗脱剂纯化后高效液相图；
图5为3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐纯化以氯化钠作为洗脱剂梯度洗脱色谱图；
图6为3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶催化反应液以氯化钠作为洗脱剂纯化后高效液相图。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但是实施例具体细节仅为了说明本发明，并不代表本发明构思下全部技术方法。因此不应理解为对本发明总的技术方案限定。
实施例1：野生型3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶的制备
编码人源(Homo sapiens)3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶1基因(GenBank:NM_005443)经密码子优化后(序列如SEQ ID NO.6)，3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶2b基因(GenBank:NM_001015880)序列经密码子优化后(序列如SEQ ID NO.7)，由金斯瑞(南京)有限公司全合成后连入pET-28a(+)载体，构建PAPSS1-pET-28a(+)、PAPSS2-pET-28a(+)质粒，并测序验证序列后，热击转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶表达工程菌，由含有50μg/mL卡那霉素的LB平板培养基上挑取单菌落，接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，于37℃摇床200rpm振荡培养12h后，转接至3L液体TB培养基中扩大培养，于37℃摇床200rpm继续振荡培养12h，当培养液的光密度OD600达到0.6时，将温度降低至16℃，加入终浓度为0.2～0.8mM的IPTG溶液用于诱导表达16～20h，将培养液4000rpm离心25min，弃去上清培养液，菌体-20℃保存备用。
收集的菌体每4g加入20mL细胞裂解液(20mM咪唑，50mM NaH2PO4，300mM NaCl，pH8.0)，临用前加入1mg/mL溶菌酶，4℃条件下超声细胞破碎20min，12,000rpm离心25min，上清液即为粗酶液。玻璃层析柱中加入3mL Ni-NTA填料，待填料沉降，20mL裂解液平衡，以1ml/min的速率上样粗酶液。20mL细胞裂解液洗脱杂蛋白，洗脱液缓冲液(250mM咪唑，50mMNaH2PO4，300mM NaCl，pH 8.0)洗脱目标蛋白，测定蛋白浓度，并进行透析，去除咪唑，得到纯度较高的3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶，4℃保存备用。
上述SEQ ID NO.6：
ATGGAAATTCCTGGCTCCCTGTGCAAAAAGGTAAAACTGTCCAACAACGCGCAAAACTGGGGTATGCAACGTGCCACCAACGTCACCTATCAGGCACACCACGTGAGCCGTAACAAACGTGGCCAGGTGGTTGGCACGCGCGGTGGTTTTCGTGGTTGCACCGTTTGGCTGACTGGTCTGAGCGGCGCTGGTAAAACCACCGTTTCCATGGCCCTGGAGGAATACCTGGTGTGTCATGGTATCCCGTGTTACACTCTGGACGGTGACAACATCCGTCAAGGCCTGAACAAAAACCTGGGCTTCTCCCCGGAAGACCGCGAGGAAAACGTGCGCCGTATCGCTGAGGTTGCGAAACTGTTTGCGGATGCAGGTCTGGTATGCATCACTTCTTTCATCTCCCCGTACACGCAGGACCGCAACAACGCACGTCAGATCCACGAAGGTGCGTCTCTGCCGTTCTTTGAGGTTTTCGTGGATGCACCGCTGCACGTGTGTGAACAACGTGATGTTAAAGGCCTGTACAAAAAAGCGCGCGCAGGTGAAATTAAAGGTTTCACCGGCATCGATTCCGAATATGAGAAACCTGAGGCTCCGGAGCTGGTTCTGAAGACCGACTCCTGTGATGTAAACGACTGTGTGCAGCAGGTTGTGGAACTGCTGCAGGAACGCGACATTGTACCGGTCGACGCGTCTTACGAAGTAAAAGAACTGTACGTTCCGGAAAACAAACTGCATCTGGCAAAAACTGATGCTGAAACTCTGCCGGCACTGAAAATCAACAAAGTCGACATGCAGTGGGTGCAGGTGCTGGCAGAGGGTTGGGCAACCCCTCTGAACGGCTTCATGCGTGAACGTGAATATCTGCAGTGCCTGCATTTCGATTGCCTGCTGGACGGCGGCGTAATTAATCTGTCTGTTCCGATTGTTCTGACTGCAACCCATGAAGACAAGGAACGTCTGGACGGTTGTACTGCGTTCGCGCTGATGTATGAGGGTCGTCGCGTCGCGATCCTGCGCAACCCAGAATTCTTCGAACACCGCAAAGAGGAACGTTGCGCACGCCAATGGGGCACTACCTGTAAGAACCACCCATACATCAAAATGGTTATGGAACAGGGCGATTGGCTGATCGGTGGTGATCTGCAGGTACTGGATCGCGTTTATTGGAACGATGGCCTGGACCAGTATCGTCTGACCCCGACCGAACTGAAACAGAAGTTCAAAGACATGAATGCCGATGCAGTTTTCGCGTTCCAACTGCGTAACCCGGTGCACAATGGTCACGCGCTGCTGATGCAAGATACGCACAAACAGCTGCTGGAACGTGGTTACCGTCGTCCGGTACTGCTGCTGCACCCGCTGGGTGG TTGGACTAAGGATGATGACGTCCCACTGATGTGGCGTATGAAGCAGCACGCCGCTGTTCTGGAAGAAGGTGTTCTGAATCCGGAAACGACCGTCGTAGCGATCTTTCCATCTCCGATGATGTATGCAGGTCCAACCGAAGTACAGTGGCATTGTCGTGCCCGCATGGTAGCCGGTGCGAACTTCTACATTGTCGGTCGTGATCCGGCTGGTATGCCGCACCCTGAAACCGGTAAAGATCTGTACGAGCCGTCCCACGGCGCAAAGGTTCTGACCATGGCACCGGGTCTGATCACTCTGGAAATCGTACCGTTCCGTGTTGCGGCGTATAATAAAAAGAAGAAGCGTATGGACTACTATGACAGCGAACATCACGAAGACTTCGAGTTCATCTCCGGCACTCGTATGCGCAAACTGGCTCGCGAAGGTCAGAAACCGCCGGAAGGCTTCATGGCGCCGAAAGCATGGACTGTTCTGACCGAATACTACAAAAGCCTGGAAAAAGCATAA
上述SEQ ID NO.7：
ATGAGCGGCATCAAAAAACAAAAAACCGAAAACCAACAGAAAAGCACCAACGTAGTCTATCAGGCACACCACGTTAGCCGCAATAAACGTGGTCAGGTGGTCGGCACCCGTGGTGGTTTCCGTGGTTGTACTGTTTGGCTGACCGGCCTGAGCGGTGCGGGTAAAACTACCATCAGCTTCGCGCTGGAAGAGTACCTGGTTTCTCACGCAATCCCGTGCTACTCTCTGGACGGCGATAACGTGCGTCATGGTCTGAACCGCAACCTGGGTTTCTCCCCGGGTGACCGCGAAGAAAACATCCGTCGCATCGCTGAGGTCGCAAAACTGTTCGCTGATGCAGGCCTGGTTTGTATCACCTCCTTCATCTCTCCGTTCGCTAAAGACCGTGAGAACGCTCGTAAAATCCACGAATCTGCAGGCCTGCCATTTTTCGAAATTTTCGTGGACGCGCCGCTGAACATTTGCGAGAGCCGTGACGTGAAGGGTCTGTACAAACGTGCGCGTGCGGGTGAGATCAAAGGTTTCACCGGCATCGATAGCGATTACGAAAAGCCGGAAACCCCGGAACGTGTGCTGAAAACCAACCTGAGCACCGTATCCGACTGCGTTCACCAGGTTGTTGAACTGCTGCAGGAACAGAACATCGTCCCGTATACGATCATTAAGGATATCCACGAGCTGTTCGTTCCAGAAAACAAACTGGACCACGTTCGTGCCGAAGCCGAAACCCTGCCGAGCCTGTCCATCACCAAGCTGGATCTGCAGTGGGTTCAAGTTCTGAGCGAAGGTTGGGCCACTCCACTGAAAGGTTTCATGCGCGAAAAGGAATATCTGCAGGTTATGCACTTTGATACCCTGCTGGACGGCATGGCCCTGCCGGATGGTGTGATTAACATGTCCATCCCGATCGTACTGCCGGTGTCTGCTGAAGATAAAACTCGCCTGGAAGGCTGCTCCAAATTTGTTCTGGCGCATGGCGGCCGTCGCGTAGCGATTCTGCGTGATGCGGAATTTTATGAACACCGTAAGGAAGAACGTTGCTCCCGTGTTTGGGGTACCACTTGTACTAAACACCCGCACATCAAAATGGTTATGGAATCTGGTGACTGGCTGGTGGGTGGTGATCTGCAGGTACTGGAAAAAATCCGCTGGAACGACGGCCTGGACCAGTACCGTCTGACCCCGCTGGAGCTGAAGCAAAAATGCAAAGAAATGAACGCGGACGCTGTGTTCGCTTTCCAGCTG CGTAATCCGGTGCACAACGGTCACGCACTGCTGATGCAGGACACCCGTCGTCGTCTGCTGGAGCGCGGTTATAAACATCCGGTGCTGCTGCTGCACCCGCTGGGCGGCTGGACCAAAGATGACGACGTCCCGCTGGATTGGCGCATGAAACAACACGCTGCAGTCCTGGAAGAAGGTGTACTGGATCCGAAATCTACCATCGTCGCAATCTTTCCGTCTCCGATGCTGTATGCAGGTCCGACCGAAGTACAGTGGCACTGCCGTTCCCGCATGATCGCCGGCGCAAACTTCTACATTGTTGGCCGTGATCCAGCAGGCATGCCGCACCCGGAAACTAAAAAAGACCTGTATGAGCCGACGCACGGTGGCAAAGTTCTGTCCATGGCACCGGGTCTGACCTCCGTTGAAATCATTCCATTCCGCGTTGCGGCCTATAACAAAGCGAAAAAAGCGATGGACTTCTACGATCCGGCGCGCCATAACGAGTTCGATTTCATTAGCGGCACTCGTATGCGCAAGCTGGCTCGCGAAGGTGAAAACCCACCGGATGGCTTTATGGCTCCGAAAGCGTGGAAAGTGCTGACTGACTATTATCGCTCTCTGGAAAAAAACTAA
实施例2：3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶突变体的制备
经结构及氨基酸序列比对，确定野生型3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶N端前50个氨基酸为底物结合关键位点，将PAPSS1氨基酸序列从N端截短至第34位缬氨酸得到突变体Mu-1；将APSS2b氨基酸序列从N端截短至第43位精氨酸得到突变体Mu-2；将PAPSS1氨基酸序列从N端截短至第34位缬氨酸，并将PAPSS1氨基酸序列第207位的半胱氨酸突变为丝氨酸得到突变体Mu-3。以连有野生型3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶1DNA、3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶2b DNA的质粒PAPSS1-pET-28a(+)、PAPSS2-pET-28a(+)为模板，对上述氨基酸位置进行突变，突变所用引物如下表。
表1：3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶突变所用引物表
各突变产物经测序验证后，转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞进行表达，获得3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶突变体表达工程菌。3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶突变体的表达和纯化方法与实施例1相同。
实施例3：3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶野生型及突变体以ATP为底物催化合成PAPS
将实施例1和2中所得3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶野生型或突变体按照0.6mg/mL加入到反应体系中，在含有25mM Na2SO4，5mM MgCl2，10mM LiCl的50mM pH7.5Tris-HCl缓冲液中，再分别加入终浓度为10mM的底物ATP于30℃恒温振荡(660rpm)反应16h，加等体积乙腈醇终止反应，反应液经12000rpm，30min离心后，取上清液进样高效液相(HPLC)对底物和产物量进行分析。
HPLC分析方法为：色谱仪安捷伦高效液相色谱1260；色谱柱HILIC Silica250*4.6mm；柱温30℃；流速1mL/min；检测波长260nm；流动相：A相10mM甲酸铵，B相10mM甲酸铵乙腈，梯度洗脱，洗脱程序为：0～10min，60％B相；10～10.1min，90％B相；10.1～20min 90％B相。产物为PAPS，以PAPS标准品为对照，分析3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶生型及突变体催化反应，并通过PAPS标准品浓度曲线计算产率，比较各突变体相对活性，相对活性数据如下表所示。
表2：3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶及突变体活性检测
3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶 相对活性(％)
PAPSS1野生型 100
PAPSS2b野生型 134.01
Mu-1 197.14
Mu-2 143.62
Mu-3 116.75
实施例4：3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐的分离纯化
(1)将实施例3中所得的含有PAPS的反应液在10000rpm离心30min，所述离心的温度为4℃，收集上清液，将收集上清液电导率用水调节至5ms/cm以下后用0.22um滤膜过滤后收集滤液。
(2)使用5个柱体积的平衡缓冲液平衡离子交换层析柱，所述离子交换层析柱采用的离子交换层析填料为UniGel-30Q(纳微科技)，将步骤(1)所得上清液上样至离子交换层析柱中，使用5个柱体积的洗杂缓冲液冲洗离子交换层析柱，依次使用5个柱体积的洗脱缓冲液一和5个柱体积的洗脱缓冲液二洗脱离子交换层析柱，收集含有PAPS的洗脱液；离子交换层析填料UniGel-30Q的层析图如图3所示，从图3可以看出，离子交换层析填料UniGel-30Q可有效的将杂质APS、ATP、ADP与目的产物PAPS分开。如图4所示，经过HPLC验证，获得了高纯度的PAPS，其纯度达到了98％。
上述平衡缓冲液按摩尔浓度计为20mM Tris-HCl，pH为7.5，溶剂为水；洗杂缓冲液按摩尔浓度计为20mM Tris-HCl和10mM NH4HCO3，pH为7.5，溶剂为水；洗脱缓冲液一按摩尔浓度计为20mM Tris-HCl、0.6mM NH4HCO3，pH为7.5，溶剂为水；洗脱缓冲液二按摩尔浓度计为20mM Tris-HCl、2mM NH4HCO3，pH为7.5，溶剂为水。
实施例5：3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐的分离纯化
(1)将实施例3含有PAPS的反应液在10000rpm离心30min，所述离心的温度为4℃，收集上清液，将收集上清液电导率用水调节至5ms/cm以下后用0.22um滤膜过滤后收集滤液。
(2)使用5个柱体积的平衡缓冲液平衡离子交换层析柱，所述离子交换层析柱采用的离子交换层析填料为UniGel-30Q(纳微科技)，将步骤(1)所得上清液上样至离子交换层析柱中，使用5个柱体积的洗杂缓冲液冲洗离子交换层析柱，依次使用5个柱体积的洗脱缓冲液一和5个柱体积的洗脱缓冲液二洗脱离子交换层析柱，收集含有PAPS的洗脱液；离子交换层析填料UniGel-30Q的层析图5如所示，从图5可以看出，离子交换层析填料UniGel-30Q可有效的将杂质APS、ATP、ADP与目的产物PAPS分开。如图6所示，经过HPLC验证，获得了高纯度的PAPS，其纯度达到了98％。
其中，平衡缓冲液按摩尔浓度计为20mM Tris-HCl，pH为7.5，溶剂为水；洗杂缓冲液按摩尔浓度计为20mM Tris-HCl和10mM NaCl，pH为7.5，溶剂为水；洗脱缓冲液一按摩尔浓度计为20mM Tris-HCl、0.6mM NaCl，pH为7.5，溶剂为水；洗脱缓冲液二按摩尔浓度计为20mM Tris-HCl、2mM NaCl，pH为7.5，溶剂为水。

Claims (10)

1.一种3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶突变体，其特征在于，所述突变体是在野生型3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶的氨基酸序列SEQ ID NO.1、野生型3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶亚型的氨基酸序列SEQ ID NO.2的基础上进行如下突变得到：
选择SEQ ID NO.1的N端前50个氨基酸进行不同长度截短或选择SEQ ID NO.2的N端前50个氨基酸进行不同长度截短，得到3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶突变体。
2.根据权利要求1所述的一种3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶突变体，其特征在于，所述突变体是如下突变之一得到的：
突变a：将野生型3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶的氨基酸序列从N端截短至第34位缬氨酸得到突变体Mu-1；Mu-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
突变b：将野生型3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶亚型的氨基酸序列从N端截短至第43位精氨酸得到突变体Mu-2；Mu-2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
突变c：将野生型3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶的氨基酸序列从N端截短至第34位缬氨酸，并将野生型3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶氨基酸序列第207位的半胱氨酸突变为丝氨酸得到突变体Mu-3；Mu-3的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
3.权利要求1～2任一项所述的3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶突变体的编码基因。
4.包含权利要求3所述的3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶突变体的编码基因的重组载体。
5.包含权利要求4所述的重组载体的基因工程菌。
6.权利要求1～2任一项所述的一种3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶突变体在制备3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐中的应用。
7.一种制备3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐的方法，其特征在于，以ATP盐、无机硫酸盐为底物，以权利要求1～2任一项所述3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶突变体为催化剂，在含氯化镁、氯化锂、缓冲液的溶液中进行催化反应，合成3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述ATP盐的添加量为0.1～30mM，所述无机硫酸盐添加量为0.01～0.3M；所述氯化镁添加量为0.15～20mM，所述氯化锂添加量为0.15～45mM；所述3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶突变体的添加量为0.1～5mg/mL；所述催化反应pH值为5～10，温度为25～30℃，时间为0.5～24h。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将所述3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐进行分离纯化。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，将所述3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐通过离子交换层析进行分离纯化。
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