CN117964700A - 具有镇痛抗焦虑双重作用的新型跨膜多肽 - Google Patents
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Abstract
一段具有镇痛抗焦虑双重作用的新型跨膜多肽。该多肽能缓解小鼠福尔马林诱导的急性炎性痛、醋酸诱导的内脏痛，能够调节部分坐骨神经结扎的神经病理性疼痛(sparednerve injury,SNI)小鼠前扣带回皮层(anterior cingulate cortex,ACC)的突触可塑性进而发挥镇痛及抗焦虑作用。所述肽段可恢复SNI小鼠ACC的兴奋性α‑氨基‑3‑羧基‑5‑甲基‑4‑异恶唑丙酸1型受体(Alpha‑amino‑3‑carboxyl‑5‑methyl‑4‑isooxazopropionic acidreceptor R1,AMPAR1)的p‑GluR1‑Ser831,p‑GluR1‑Ser845受体和N‑甲基‑D‑天冬氨酸受体2B亚单位(N‑Methyl‑D‑aspartate receptor2B,NMDA‑NR2B)的异常表达而发挥镇痛作用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有镇痛抗焦虑双重作用的新型跨膜多肽。
背景技术
国际疼痛联合研究会将疼痛定义为“与实际或潜在的组织损伤有关，一种不愉快的感觉和情感体验”，疼痛被认为是对受到情感、记忆、疾病和遗传等因素影响的伤害性输入的一种复杂的生理心理活动。临床上慢性痛患者常常由于长期忍受疼痛而诱发焦虑、抑郁等负性情绪，负性情绪状态会显著影响患者的痛感受和病情变化，由疼痛特别是慢性痛导致的负性情绪问题已经成为一个公共健康问题，越来越受到人们的关注。神经病理性疼痛是临床上最常见且对现有镇痛药物都不敏感的一类慢性痛，无论周围或中枢起源的神经病理性疼痛都会对个体和社会持续造成很大的负担，因此开发能够缓解疼痛尤其是神经病理性痛及相关痛情绪的新型镇痛药物具有重要意义。
前扣带回皮层(anterior cingulated cortex,ACC)是脑边缘系统的重要组成部分，接受来自丘脑内侧核群的纤维投射，参与痛觉情绪信息的编码，将痛的感觉和认知信息与情绪信息整合。疼痛发生时，ACC区域的神经元被激活，接收到丘脑-皮质的输入增强，进而导致中枢敏化，ACC区域突触可塑性的变化是神经病理性痛条件下焦虑抑郁样行为的产生的关键机制。α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体是影响突触传递、调节突触可塑性的关键分子，AMPAR1的p-GluR1-Ser831,p-GluR1-Ser845和NMDA-NR2B的膜表达异常是慢性痛发生及产生相关痛情绪的关键机制，抑制AMPAR1的p-GluR1-Ser831,p-GluR1-Ser845和NMDA-NR2B在的异常表达。
目前，阿片类药物占全球疼痛药物治疗市场的三分之一。但是，由于阿片类镇痛药具有便秘、呼吸抑制、耐受性和成瘾性等缺点，使阿片类药物不能满足疼痛患者的治疗需求。许多天然产生的多肽是潜在的具有镇痛作用的药物，内啡肽2(Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2,EM-2)是一种对mu-opioid类受体均具有较高的亲和力和选择性的内源性阿片肽，具有显著的镇痛效果。鲑降钙素(saleatonin,SCT)是一种重要的多肽类钙调节激素，是治疗骨质疏松的主要药物之一，1977年有研究人员发现鲑降钙素对佩吉特骨病人具有显著的镇痛作用。鲑降钙素可以通过血脑脊液屏障与下丘脑网状结构中降钙素受体特异性结合，调节5-羟色胺和血清素通路，而5-羟色胺和血清素通路的异常与抑郁和焦虑障碍密切相关，鲑降钙素的镇痛抗焦虑作用使其吸引了众多学者的关注。鲑降钙素的不良反应主要有休克、皮疹、恶心、呕吐、腹泻、心悸、头痛、眩晕、耳鸣等，由于药物的副作用以及价格的关系，大大的限制了其临床的应用。已有研究表明，降钙素分子片段SC16-21(Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr)，它既保持了全长分子的镇痛活性，又显著减少了全长鲑鱼降钙素分子的缺陷。
运用于中枢神经系镇痛的多肽需跨过血脑屏障，到达关键部位继而发挥镇痛作用，但多数多肽药物难以直接透过血脑屏障进入中枢神经系统,因此，我们的发明在内吗啡肽2和鲑降钙素分子片段的基础上添加了具有穿透多种细胞膜作用的HIV-1反式激活蛋白TAT(Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg)，旨在最终发明具有镇痛抗焦虑作用的新型跨膜多肽。
发明内容
本发明的目的是公开具有镇痛抗焦虑双重作用的新型跨膜多肽，在内吗啡肽2和鲑降钙素分子片段的基础上添加了具有穿透多种细胞膜作用的HIV-1反式激活蛋白TAT(Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg)，旨在最终发明具有镇痛抗焦虑作用的新型跨膜多肽，该多肽在福尔马林诱导的急性炎性痛、醋酸诱导的内脏痛中起到镇痛作用，在部分坐骨神经结扎的神经病理性疼痛小鼠中起到镇痛及抗焦虑作用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一段具有明显镇痛抗焦虑作用的跨膜多肽，所述跨膜多肽包括穿膜肽、内吗啡肽2及鲑降钙素的核心肽段，其氨基酸序列为：GRKKRRQRRRYPFFLHKLQT。
所述的跨膜多肽应用于鞘内注射在福尔马林诱导急性炎性痛、醋酸诱导内脏痛的脊髓L5至L6节段，静脉注射于神经病理性疼痛小鼠尾静脉部位。
所述的跨膜多肽应用于恢复SNI小鼠ACC中AMPAR1的p-GluR1-Ser831,p-GluR1-Ser845受体和NMDA-NR2B的异常表达而发挥镇痛作用。
所述的跨膜多肽应用于缓解福尔马林诱导的急性炎性痛、醋酸诱导的内脏痛、坐骨神经结扎的神经病理性疼痛及痛相关焦虑样行为。
本发明的有益效果是：
本发明有明显镇痛抗焦虑作用，该多肽能缓解福尔马林诱导的急性炎性痛、醋酸诱导的内脏痛，能够调节部分坐骨神经结扎的神经病理性疼痛(spared nerve injury,SNI)小鼠前扣带回皮层的突触可塑性进而发挥镇痛及抗焦虑作用。
附图说明
图1为镇痛多肽的序列示意图；
图2镇痛多肽对福尔马林诱导的急性炎性痛的镇痛效果评价；
图3该肽段对醋酸诱导的急性内脏痛小鼠的镇痛效果评价；
图4该肽段对部分坐骨神经结扎导致的慢性神经病理性痛小鼠的镇痛效果评价；
图5是该肽段对部分坐骨神经结扎导致的慢性神经病理性痛小鼠的抗焦虑作用的效果；
图6是该肽段对部分坐骨神经结扎导致的慢性神经病理性痛小鼠前扣带回皮层中AMPAR1的p-GluR1-Ser831,p-GluR1-Ser845和NMDA-NR2B的抑制效果；
图7是该肽段对部分坐骨神经结扎导致的慢性神经病理性痛小鼠前扣带回皮层sEPSC频率的抑制效果。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
肽段合成：
合成采用DCC/HOBt(N,N'-二环己基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑)氨基酸激活法，采用自动固相fmoc合成法进行。用哌啶/DMF(哌啶/N,N-二甲基甲酰胺)(1:4)溶液处理7min。侧链基团由以下基团保护:tBu(叔丁基醚)保护酪氨酸，苏氨酸，Trt(三苯基或三苯基甲基)保护谷氨酰胺和组氨酸，Boc(t-丁基羰基)保护赖氨酸。多肽从聚合物中去除，并通过TFA/H2O/EDT(三氟乙酸/水/1,2-乙醇)(90:5:5)混合物分离。采用反相高效液相色谱(HPLC)(C18柱)，洗脱液-乙酰-腈-水(0.1M磷酸二氢钾)，以6:4的比例进行纯化。用质谱和HPLC-Waters DeltaPak C18 3.9*150mm 5mm 100柱对肽进行描述；A溶液:0.1％TFA溶于100％水/mecn，流速为1ml/min，检测波长为230nm。
实验动物：本研究中使用的动物是6-8周大的雄性C57BL/6小鼠(25-30克)，由第四军医大学实验动物中心提供。动物被安置在一个温度控制的环境中，接受12小时光照/12小时黑暗循环。
部分坐骨神经结扎手术：小鼠腹腔注射4％水合氯醛(10mg/kg)进行麻醉。在无菌条件下，钝性解剖股二头肌，分离出左坐骨神经分支。腓肠神经和胫骨神经被紧紧结扎，并在结扎的远端横切，留下完整的硬膜神经。术后对覆盖的肌肉和皮肤进行缝合和消毒。假手术小鼠经历了上述所有的操作，但没有进行神经结扎和横断。
福尔马林急性炎性痛试验：在小鼠右后爪皮下注射5％福尔马林溶液(20μL),用试验化合物对小鼠进行预处理，并立即将小鼠送回有机玻璃箱(高20cm，直径15cm)，在地板下以45°角放置一面镜子。记录小鼠舔爪洗脸的时间，每5分钟为一个时间段，共记录60分钟。痛觉反应以秒(sec)表示，假手术组以0.9％生理盐水作为对照。
醋酸诱导内脏痛试验：在小鼠腹腔注射1％醋酸溶液(10mL/kg)，用试验化合物对小鼠进行预处理，记录20分钟内小鼠腹部肌肉的收缩和后肢的伸展表现的总次数，假手术组以0.9％生理盐水作为对照。
Vonfery机械痛阈试验(PMWT)：Vonfery机械穿刺仪购自江苏赛隆生物科技有限公司(SA502)。在疼痛行为测试中，小鼠被放置在升高的网格地板上一个倒置的塑料箱下，在阈值测试环境适应1小时后，用Vonfery丝测试小鼠后爪的机械收缩阈值。试验中逐渐增加对单丝施加的力，直到小鼠缩回爪子，对每根丝线施加五次，阈值是对五次重复刺激中的一次诱发快速撤回反应的最小力。
冷热板实验(PWTL)：冷热板疼痛测量仪购自南京凯文生物技术有限公司(KW-LB)。小鼠提前适应实验环境1小时后，将小鼠放在有机玻璃罩中，后爪脚下直接放置一个可移动的红外辐射热源，板的温度设置为55℃，辐射热的潜伏期被定义为从辐射热开始到小鼠后爪退出的时间，取三个估计值的平均值来获得平均缩回潜伏期。
旷场实验(OFT)：仪器购买于上海凡比智能科技有限公司(VanBi-OF)，所有测试都在黑暗阶段进行，光照强度控制在相同条件。试验在无盖的方形盒子(40cm×40cm×40cm)中进行，中心区域为中间24×24cm区域。测试前，小鼠适应实验环境3小时，并保持实验过程的安静。测试时，将每只小鼠放在盒子的中央，让其自由探索15分钟，用固定在箱体上方的摄像机记录小鼠的探索行为。在测试下一只小鼠之前，用75％的乙醇将仪器擦拭干净，以避免气味对小鼠的影响。使用视频跟踪系统(VanBi Tracking Master V3.0，上海凡比智能科技有限公司)对小鼠的跟踪情况进行分析。
高架迷宫实验(EPM)：仪器购买于上海凡比智能科技有限公司(VanBi-OF)，所有测试都在黑暗阶段进行，光照强度控制在相同条件。仪器由两个开放臂(25cm×8cm×0.5cm)和两个封闭臂(25cm×8cm×12cm)组成，从一个共同的中心区域(8cm×8cm)延伸。测试前，小鼠适应实验环境3小时，实验过程中保持安静。在每次测试中，每只小鼠被放置在面向开放臂的中心区域，随后允许其自由探索5分钟，同时用固定在迷宫上方的摄像机进行拍摄。在测试下一只小鼠之前，用75％的乙醇将仪器擦拭干净，以避免气味对小鼠的影响。用视频跟踪系统(VanBi Tracking Master V3.0，上海凡比智能科技有限公司)分析小鼠在开臂和闭臂中停留的时间和进入的次数。
Western Blotting实验：SNI手术后第14天，用4％水合氯醛(10ml/kg)将小鼠进行深度麻醉，用0.9％生理盐水进行心内灌注，迅速分离双侧ACC。用总蛋白提取试剂盒将组织在裂解液中裂解，裂解完成后进行BCA定量。在SDS-PAGE凝胶电泳中将蛋白分离后转移到PVDF膜上，用5％脱脂牛奶密封2h。用TBST洗涤后，用指定的抗体在4℃下孵育膜过夜：β-Actin(mice,1:10000,NB600-501,Novus),GluN2A(rabbit,1:1000,ab124913,Abcam),GluN2B(rabbit,1:3000,ab124913,Abcam),p-GluR1-Ser831(rabbit,1:5000,ab109464,Abcam),p-GluR1-Ser845(rabbit,1:5000,ab76321,Abcam),and GluR1(rabbit,ab31232,1:1000)。用TBST洗涤后，将相应的二抗在室温下孵育1小时，用化学发光剂ECL进行显色。
全细胞膜片钳记录：SNI手术后第14天后，用4％水合氯醛(10ml/kg)将小鼠进行深度麻醉，向小鼠心脏灌注冰冷的含氧溶液(95％O2,5％二氧化碳)孵育液(95mM氯化钠，1.8mM氯化钾，1.2mM KH2磷酸盐，0.5mM氯化钙，7mM硫酸镁，26mM碳酸氢钠，15mM葡萄糖，50mM蔗糖，pH 7.4)。用振动切片机制备含有ACC的冠状切片(300μm)，并在32±1℃下敷育至少1小时。记录ACC的II层和III层锥体神经元，切片液除127mM氯化钠、2.4mM氯化钙、1.3mM硫酸镁和0mM蔗糖外，其余均与敷育液相同。灌流溶液由135mm葡萄糖甲酸，5mM氯化钾，0.5mM氯化钙，2mM氯化镁，5mM EGTA，5mM HEPES，5mM Mg-ATP，用氢氧化钾调节pH 7.4，渗透压300mOsm。所记录的神经元的电生理特性为通过Axon 700B放大器和pCLAMP 10软件获得，信号在5kHz处进行低通滤波，在10kHz处进行采样，随后离线分析。
实例1:镇痛多肽的合成
本发明的多肽序列为YGRKKRRQRRRYPFFLHKLQT，如图1所示。
实例2:镇痛肽在福尔马林诱导的急性炎性痛小鼠实验中对疼痛的抑制作用
福尔马林试验模拟了由急性组织损伤引起的炎症性疼痛。福尔马林诱导产生的炎性疼痛反应是双相的，第一阶段(0-10分钟)是在注射福尔马林后立即发生的疼痛反应，代表了急性痛觉性疼痛反应。第二阶段(10-60分钟)是由炎症介质的释放引起的继发性痛觉反应。如图2所示，A.福尔马林诱导的急性炎性痛小鼠在60分钟内的添足洗脸时间统计图；B.福尔马林诱导的急性炎性痛小鼠在60分钟内的添足洗脸时间曲线下面积；C.福尔马林诱导的急性炎性痛小鼠的第一时相和第二时相添足洗脸时间统计图。(n＝5，ns P＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001)
如图2a所示，我们通过鞘内注射给药的方式注射了3μg/kg的镇痛肽，10分钟之后，在小鼠的足底注射20μl的5％的福尔马林，记录给予福尔马林60min后小鼠的添足洗脸时间。在给予镇痛肽之后，福尔马林诱导的急性痛小鼠的舔足洗脸时间较给予生理盐水组显著降低，在第一阶段的和第二阶段均有显著的效果，结果说明，该镇痛肽对福尔马林诱导的急性痛小鼠有明显的镇痛作用。
实例3:镇痛肽在醋酸诱导的急性内脏痛小鼠实验中对疼痛的抑制作用
醋酸诱导的急性内脏痛实验用于模拟由腹部炎症引起的内脏疼痛。如图3a所示，我们通过鞘内注射给药的方式注射了3μg/kg的镇痛肽，10分钟之后，腹腔注射1％的醋酸(10mL/kg)诱导小鼠产生蠕动反应，记录给予醋酸后20分钟小鼠的扭体次数。如图3，醋酸诱导的内脏痛小鼠在20分钟内的扭体次数统计图。(n＝5，ns P＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001)，镇痛肽能减少绞痛次数，表现出了良好的镇痛效果。
实例4:镇痛肽在部分坐骨神经结扎的慢性神经病理性痛小鼠实验中对疼痛的抑制作用
如图4所示，A.在神经病理性痛小鼠中给予镇痛多肽及对其镇痛效果评价示意图；B.不同组别小鼠热痛阈值统计图；C.不同组别小鼠对侧后足的机械痛阈统计图；D.不同组别小鼠同侧后足的机械痛阈统计图。
如图4A所示，我们构建了一个慢性神经病理性疼痛模型，并在建模前测试了小鼠的基础痛阈，以排除偏差小鼠。在建模后的第1、3和5天，我们通过尾静脉注射3μl/kg的镇痛肽并对小鼠进行热潜伏期和机械痛阈值的测试。PWTL试验显示，镇痛肽明显增加了SNI小鼠后脚的退出时间(图4B)。PWMT试验显示，SNI小鼠的对侧机械痛阈值明显降低，并在第7天降至最低。很明显，与模型组相比，给予镇痛肽的SNI小鼠的机械痛阈值明显增加(图4C)，SNI小鼠同侧小鼠机械痛阈值无差异(图4D)。结果表明,尾静脉给药的镇痛肽明显改善了慢性疼痛小鼠模型的痛觉超敏反应。
实例5:镇痛肽在部分坐骨神经结扎的慢性神经病理性痛小鼠实验中对痛相关焦虑样情绪的改善作用
在SNI手术后第14天进行了OFT和EPM测试，以评估镇痛肽对SNI小鼠焦虑样行为的影响。如图5所示，A.不同组别小鼠旷场实验轨迹示意图；B.不同组别小鼠旷场运动总距离统计图；C.不同组别小鼠旷场中心运动距离统计图；D.不同组别小鼠旷场中心运动时间统计图；E.不同组别小鼠高架十字迷宫实验轨迹示意图；F.不同组别小鼠高架十字迷宫开臂运动距离统计图；G.不同组别小鼠高架十字迷宫开臂运动时间统计图；H.不同组别小鼠高架十字迷宫进入开臂次数统计图。(n＝5，ns P＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001)
OFT的结果显示两组小鼠的总运动距离没有明显变化，表明小鼠的运动能力没有受损(图5A、5B)。然而，SNI组小鼠的中心区距离明显下降，而镇痛肽治疗则增加了小鼠的中心区行走距离(图5B)。SNI组小鼠的中心区时间明显短于假手术的小鼠，镇痛肽治疗明显增加了小鼠的中心区时间(图5C)。EMP测试的结果显示，与假手术组相比，SNI组的开臂运动距离明显减少，而疼痛肽处理后小鼠的开臂距离增加(图5e、5f)。与假手术组相比，SNI组进入开臂的时间明显减少，而镇痛肽处理组的开臂时间有增加(图5G)。同样，与假手术组相比，SNI组进入开臂的小鼠数量明显减少，而在镇痛肽处理后，SNI组进入开臂的小鼠数量明显增加(图5H)。这些结果表明，SNI手术确实会诱发小鼠的焦虑样行为，而镇痛肽能明显改善小鼠的焦虑样行为。
实例6:镇痛肽对部分坐骨神经结扎的慢性神经病理性痛小鼠的前扣带回皮层突触可塑性的影响
神经性疼痛小鼠前扣带皮层突触可塑性的改变是疼痛超敏反应和产生相关疼痛情绪发展的关键机制。ACC突触可塑性主要由谷氨酸型离子感受器调节，我们探索了兴奋性AMPA和NMDA受体表达的变化。结果显示SNI组GluN2B、p-GluR1-Ser831和p-GluR1-Ser845的表达较假手术组明显升高，GluN2A和GluR1的表达无明显差异。与SNI组相比，镇痛肽处理后GluN2B、p-GluR1-Ser831和p-GluR1-Ser845蛋白表达水平明显降低(图6)。如图6所示，图6不同组别小鼠前扣带回皮层中突触可塑性相关蛋白的表达变化，A.Western blot检测突触可塑性相关蛋白表达；B.突触可塑性相关蛋白表达水平的统计分析。(ns P＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001)结果表明，镇痛肽可以恢复SNI小鼠ACC区谷氨酸离子感受器的异常表达，具有镇痛和抗焦虑作用。
实例7:镇痛肽对部分坐骨神经结扎的慢性神经病理性痛小鼠的前扣带回皮层兴奋性的影响
通过对不同组别的小鼠前扣带回皮层中的锥体神经元进行了全细胞膜片钳记录，如图所示，A.不同组别小鼠前扣带回皮层中锥体神经元的膜片钳记录示意图；B.不同组别小鼠前扣带回皮层的sEPSC的幅度统计图；C.不同组别小鼠前扣带回皮层的sEPSC的代表性幅度变化统计图；D.不同组别小鼠前扣带回皮层的sEPSC记录的示意图；E.不同组别小鼠前扣带回皮层的sEPSC的频率统计图；F.不同组别小鼠前扣带回皮层的sEPSC的代表性频率变化统计图。(n＝5，ns P＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001)
评估了镇痛肽对ACC中突触传递的功能的影响(图7A、7D)。研究中，不同组别的小鼠sEPSC的强度并没有发生变化(图7B、7C)。但在给予镇痛肽后，显著缓解了神经病理性痛小鼠的sEPSC的频率(图7E、7F)，抑制了ACC中的异常兴奋性放电情况。结果表明，镇痛肽可以影响SNI小鼠ACC区突触传递效率，降低小鼠的兴奋性，可产生镇痛和抗焦虑作用。
综上所述：本发明有明显镇痛抗焦虑作用，该多肽能缓解福尔马林诱导的急性炎性痛、醋酸诱导的内脏痛，能够调节部分坐骨神经结扎的神经病理性疼痛(sparednerveinjury,SNI)小鼠前扣带回皮层的突触可塑性进而发挥镇痛及抗焦虑作用。
Claims (5)
1.具有镇痛抗焦虑双重作用的新型跨膜多肽，所述跨膜多肽包括穿膜肽、内吗啡肽2及鲑降钙素的核心肽段，其氨基酸序列为：
GRKKRRQRRRYPFFLHKLQT。
2.根据权利要求1所述的具有镇痛抗焦虑双重作用的新型跨膜多肽，其特征在于，所述的跨膜多肽应用于鞘内注射在福尔马林诱导急性炎性痛、醋酸诱导内脏痛的脊髓L5至L6节段，静脉注射于神经病理性疼痛小鼠尾静脉部位。
3.根据权利要求1所述的具有镇痛抗焦虑双重作用的新型跨膜多肽，其特征在于，所述的跨膜多肽应用于恢复SNI小鼠ACC中AMPAR1的p-GluR1-Ser831,p-GluR1-Ser845受体和NMDA-NR2B的异常表达而发挥镇痛作用。
4.根据权利要求1所述的具有镇痛抗焦虑双重作用的新型跨膜多肽，其特征在于，所述的跨膜多肽应用于缓解福尔马林诱导的急性炎性痛、醋酸诱导的内脏痛、坐骨神经结扎的神经病理性疼痛及痛相关焦虑样行为。
5.一段具有镇痛抗焦虑双重作用的新型跨膜多肽，其特征在于，采用DCC/HOBt(N,N'-二环己基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑)氨基酸激活法，采用自动固相fmoc合成法进行，用哌啶/DMF(哌啶/N,N-二甲基甲酰胺)(1:4)溶液处理7min，侧链基团由以下基团保护:tBu(叔丁基醚)保护酪氨酸，苏氨酸，Trt(三苯基或三苯基甲基)保护谷氨酰胺和组氨酸，Boc(t-丁基羰基)保护赖氨酸，多肽从聚合物中去除，并通过TFA/H2O/EDT(三氟乙酸/水/1,2-乙醇)(90:5:5)混合物分离，采用反相高效液相色谱(HPLC)(C18柱)，洗脱液-乙酰-腈-水(0.1M磷酸二氢钾)，以6:4的比例进行纯化，用质谱和HPLC-Waters DeltaPak C183.9*150mm 5mm100柱对肽进行描述；A溶液:0.1％TFA溶于100％水/mecn，流速为1ml/min，检测波长为230nm。
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