CN117959420A - 一种猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗及制备方法，属于兽用生物制品领域。本发明构建了含S基因的重组真核质粒pPEDV‑2b‑S和pPEDV‑2a‑S，经纯化得到较纯的重组蛋白PEDV‑2a‑S和pPEDV‑2b‑S，将两者混合后与佐剂共同构建猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗，利用该疫苗免疫猪后，重组蛋白能有效刺激仔猪和母猪产生特异性抗体，且在血清和乳汁中诱导较高的中和抗体水平，免疫的仔猪/乳猪的粪便中病毒载量较低，说明本发明制备的猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗对猪具有良好的免疫原性，为猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗的研发提供了基础。
Description
技术领域
本发明涉及兽用生物制品领域，特别是涉及一种猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗及制备方法。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)属于冠状病毒科冠状病毒Alphacoronavirus属，是猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)的病原体。该疾病具有发病快、传染性强、死亡率高的特点，并以急性水样腹泻、呕吐和脱水为主要症状。1970年在欧洲首先发现PEDV G1型。目前，变异PEDV已成为导致仔猪腹泻和高病死率的主要病原体，给全球养猪业造成重大经济损失。
接种疫苗是目前防控PED的主要手段之一。目前市面上售卖的猪流行性腹泻疫苗主要都是传统的PEDV灭活疫苗和弱毒疫苗。PEDV灭活疫苗是通过加热或者化学试剂使PEDV活病毒失活并配合佐剂使用的一种疫苗。灭活疫苗安全性更高且易于产业化。但是，在病毒灭活过程中，抗原的免疫原性可能会有一定损伤，灭活疫苗存在免疫持续期短、需要多次免疫等局限，通常需要多次免疫。与灭活疫苗相比，减毒疫苗免疫原性更强，通常单次免疫就可产生足够的免疫保护。但是，减毒疫苗最大的危害是存在退化为野生型毒株的风险，因此限制了减毒疫苗的适用性。
PEDV ORF2编码的纤突糖蛋白(spike,S)属于亚稳态的Ⅰ类融合蛋白，主要负责病毒与宿主细胞的吸附和膜融合，包括受体结合片段S1和膜融合片段S2两个部分。S1包含优势抗原COE区域(499～638aa)及2个B淋巴细胞位点(744～755和756～771aa)，S2的胞外区有胰酶切割位点。S蛋白在与宿主细胞受体的相互作用以及进入宿主细胞的过程中发挥着重要作用，还与病毒的体外适应性生长及体内毒力衰减密切相关。更重要的是，S蛋白是诱导机体发生中和抗体反应的关键蛋白，因此S蛋白是设计开发PEDV疫苗的首选抗原蛋白。
真核表达系统是将载体转染至真核细胞中，对外源基因产物进行一系列复杂的加工折叠，形成具有生物活性的蛋白质。但其表达的周期相对较长，需要的条件也较为繁琐苛刻。其中，应用的最为广泛的就是酵母表达系统、昆虫表达系统以及哺乳动物细胞表达系统。其中哺乳动物细胞表达系统使重组基因易转染、遗传稳定、可重复，同时可以识别和去除内含子。哺乳动物细胞翻译后的加工修饰体系更趋完善，产生的外源蛋白质与天然的蛋白质更加相近，它的活性方面远胜于其他表达系统，免疫原性高，可改造成类人体源性，还可以分泌至培养基，纯化工艺操作简单。因此，本发明利用HEK-293F细胞真核表达系统制备了针对不同亚型PEDV S基因的一种二价亚单位疫苗，通过猪体动物实验评价了该疫苗的免疫效果，为PED亚单位疫苗的研发提供了理论支持。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗及制备方法，以解决上述现有技术存在的问题，该二价亚单位疫苗在猪体具有免疫保护效果，为PEDV亚单位疫苗的研发提供了基础。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗，包括重组蛋白PEDV-2a-S和PEDV-2b-S，其中，所述PEDV-2a-S的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述PEDV-2b-S的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
优选的是，所述猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗还包括佐剂。
优选的是，所述PEDV-2a-S和PEDV-2b-S的混合物与所述佐剂的体积比为1:1。
优选的是，所述混合物为所述PEDV-2a-S和PEDV-2b-S等质量混合，所述混合物在所述猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗中的终浓度为0.3mg/mL。
优选的是，所述佐剂包括M103佐剂。
优选的是，所述PEDV-2a-S的制备方法包括以下步骤：
将目的基因序列导入表达载体，构建重组表达载体；
将所述重组表达载体转入真核细胞表达，经蛋白纯化，获取所述PEDV-2a-S；
其中，所述目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选的是，所述PEDV-2b-S的制备方法包括以下步骤：
将目的基因序列导入表达载体，构建重组表达载体；
将所述重组表达载体转入真核细胞表达，经蛋白纯化，获取所述PEDV-2b-S；
其中，所述目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明还提供一种猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：
将重组蛋白PEDV-2a-S和PEDV-2b-S混合后与佐剂等体积混合后，室温搅拌乳化，获取猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗；其中，所述PEDV-2a-S的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述PEDV-2b-S的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
优选的是，所述重组蛋白PEDV-2a-S和PEDV-2b-S按照等质量混合后，混合物在所述猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗中的终浓度为0.3mg/mL。
本发明还提供重组蛋白PEDV-2a-S和PEDV-2b-S在制备猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗中的应用，所述PEDV-2a-S的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述PEDV-2b-S的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。在制备猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗中，包括但不限于重组蛋白PEDV-2a-S和PEDV-2b-S，还可以是PEDV-2a-S和PEDV-2b-S的编码基因，或包含PEDV-2a-S和PEDV-2b-S的编码基因的表达载体或者宿主细胞。
本发明公开了以下技术效果：
本发明通过实验证明重组真核质粒能特异性表达PEDV G2a-S和G2b-S蛋白，且能够得到较纯的蛋白；通过将PEDV G2a-S和G2b-S蛋白混合后与佐剂构建二价亚单位疫苗，用该疫苗免疫仔猪和母猪后，重组蛋白能有效刺激仔猪和母猪产生特异性抗体，且在血清和乳汁中诱导较高的中和抗体水平。相比于对照组，免疫组仔猪/乳猪肠道组织病变明显较少，只有一只或没有仔猪出现轻度腹泻；然而，在攻毒对照组中所有仔猪/乳猪均出现轻度至水样腹泻，且仔猪粪便中病毒载量明显升高，二价亚单位疫苗免疫组仔猪/乳猪的粪便中病毒载量较低。本发明明确了PEDV G2a-S/G2b-S二价亚单位疫苗在猪体上的免疫保护效果，为PEDV亚单位疫苗的研发提供了基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为真核表达PEDV G2a-S与PEDV G2b-S蛋白的表达纯化与鉴定结果；A为pPEDV-2a-S与pPEDV-2b-S的质粒图谱；B为表达PEDV-2b-S与PEDV-2a-S蛋白的Western blot分析结果；C为表达PEDV-2b-S与PEDV-2a-S蛋白的间接免疫荧光分析；D为纯化PEDV-2b-S与PEDV-2a-S蛋白的Western blot分析结果；E为纯化PEDV-2b-S与PEDV-2a-S蛋白的SDS-PAGE分析结果；图中M为标准DNA分子，G2a-S为重组蛋白G2a-S，G2b-S为重组蛋白G2b-S，Control为对照；
图2为二价亚单位疫苗主动免疫原性分析结果；A为二价亚单位疫苗主动免疫流程图；B为采用间接ELISA法检测血清样本中IgG抗体的滴度；C为血清样品中和抗体滴度检测结果；
图3为27日龄仔猪腹泻评分结果；A为27日龄仔猪攻G2a(HK2021)毒腹泻评分结果；B为27日龄仔猪攻G2b(AH2012)毒腹泻评分结果；
图4为27日龄仔猪病毒载量检测结果；A为27日龄仔猪攻G2a毒肛拭子病毒载量；B为27日龄仔猪攻G2b毒肛拭子病毒载量；C为分别攻G2a和G2b毒后空肠和回肠的病毒载量；
图5为验证PEDV G2a-S/G2b-S二价亚单位疫苗接种5日龄仔猪的保护作用；a为PBS组仔猪口服DMEM；b-c分别为二价亚单位疫苗免疫组和PBS对照组攻PEDV HK2021；d和e分别为二价亚单位疫苗免疫组和PBS对照组攻PEDV AH2012；f为PBS对照组仔猪的大体病理学；g和i分别为二价亚单位疫苗免疫组仔猪的大体病理学；h和j分别为攻毒对照组仔猪的大体病理学；
图6为验证PEDV G2a-S/G2b-S二价亚单位疫苗接种5日龄仔猪的保护作用；a-e为仔猪回肠HE染色结果，其中a为PBS对照组；b和d为二价亚单位疫苗免疫组；c和e为攻毒对照组；f-j为仔猪回肠的免疫荧光结果，其中f为PBS对照组；g和i为二价亚单位疫苗免疫组；h和j为攻毒对照组；
图7为二价亚单位疫苗被动免疫原性分析结果；A为二价亚单位疫苗被动免疫流程图；B为采用间接ELISA法检测血清样本中IgG抗体的滴度；C为采用间接ELISA法检测血清和初乳样本中IgA抗体的滴度；D为血清和初乳样品中和抗体滴度；
图8为5日龄仔猪腹泻评分结果；A为5日龄仔猪攻G2a(HK2021)毒腹泻评分结果；B为5日龄仔猪攻G2b(AH2012)毒腹泻评分结果；
图9为5日龄仔猪病毒载量检测结果；A为5日龄仔猪攻G2a毒肛拭子病毒载量；B为5日龄仔猪攻G2b毒肛拭子病毒载量；C为分别攻G2a和G2b毒后空肠和回肠的病毒载量；
图10为PEDV G2a-S/G2b-S二价亚单位疫苗接种临产期1月龄母猪的保护作用；a为PBS组仔猪口服DMEM；b-c分别为二价亚单位疫苗免疫组和PBS对照组攻PEDV HK2021；d和e分别为二价亚单位疫苗免疫组和PBS对照组攻PEDV AH2012；f-j为仔猪的大体病理学结果，其中f为PBS对照组，g和i为二价亚单位疫苗免疫组；h和j为攻毒对照组；
图11为PEDV G2a-S/G2b-S二价亚单位疫苗接种临产期1月龄母猪的保护作用；a-e为仔猪回肠HE染色结果，其中a为PBS对照组，b和d为二价亚单位疫苗免疫组，c和e为攻毒对照组；f-j为仔猪回肠的免疫荧光结果，f为PBS对照组，g和i为二价亚单位疫苗免疫组，h和j为攻毒对照组。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例涉及的主要实验材料、试剂盒仪器：
(1)细胞、质粒和毒株
真核表达载体、悬浮驯化的HEK-293F细胞、Vero细胞、AH2012毒株和HK2021毒株均由本实验室保存；HK2021毒株S基因密码子的优化合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
(2)主要试剂与仪器
Tans5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；去内毒素质粒大提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；Opti-MEM购自美国Gibco公司；SinofectionTransfection Reagent和SMM 293-TII Expression Medium均购自北京Sino biological公司；台盼蓝染色剂(0.4％)购自美国Invitrogen公司；HRP标记的山羊抗猪IgG(IgA)购自美国Bethyl Laboratories公司和TMB底物显色液购自湖州英创生物科技有限公司；细胞摇瓶购自广州Jet biofil股份有限公司；耐CO2水平摇床(CO-06U)购自美国精骐有限公司；HisTrap HP蛋白纯化柱购自美国Cytiva公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。
实施例1
1、pPEDV-2b-S与pPEDV-2a-S质粒提取
分别以PEDVG2a毒株HK2021株S基因序列(GenBank:OL762457)和G2b毒株AH2012/12株S基因序列(GenBank:KU646831)为基础，通过南京金斯瑞生物科技有限公司优化合成，构建到pcDNA3.1载体中。该基因S中包含S蛋白基因(aa19-1383)以及T4噬菌体纤维蛋白折叠(Fd)三聚结构域片段。将sp10信号肽通过同源重组手段克隆到该合成质粒中，构建得到用于表达G2a型的PEDV S三聚体重组蛋白的重组质粒pPEDV-2a-S(核苷酸如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)和表达G2b型的PEDV S三聚体重组蛋白的重组质粒pPEDV-2b-S(核苷酸如SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示)。
将pPEDV-2b-S与pPEDV-2a-S重组质粒转化到Tans5α感受态细胞中，用氨苄抗性的LB固体培养基筛选出单克隆菌，然后挑取单克隆菌接种到氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃摇床过夜培养14h，然后按照去内毒素质粒大提试剂盒的说明书进行质粒的提取，测浓度后-20℃保存。
PEDV-2a-S(SEQ ID NO：1):
ATGCACAGCTCTGCTTTACTGTGTTGTCTGGTGCTGCTGACAGGAGTTAGAGCCCTGCCTCAGGACGTGACAAGATGCTCCGCCAACACCAACTTCAGAAGATTCTTCAGCAAGTTCAACGTGCAGGCTCCTGCCGTGGTGGTGCTGGGCGGCTACCTGCCTATCGGCGAGAACCAGGGAGTCAACAGCACCTGGTACTGCGCCGGCCAACACCCTACCGCCAGCGGTGTGCACGGGATCTTCCTGAGCCACATCCGGGGCGGACACGGCTTTGAGATCGGCATCTCTCAAGAGCCTTTCGACCCTTCCGGCTACCAGCTGTATCTGCATAAGGCCACCAACGGCAACACCAACGCCACAGCCAGACTCAGAATTTGCCAGTTCCCCTCTATCAAGACCCTGGGCCCTACAGCCGATAACGACGTGACAACAGGCAGAAACTGCCTGTTCAACAAAGCTATCCCCGCTCACATGAGCGAGCACAGCGTGGTGGGCATCACATGGGACAACGATAGAGTCACAGTGTTCTCTGATAAGATCTACCACTTCTATTTCAAGAACGATTGGTCCCGGGTGGCCACTAAATGTTACAATTCTGGCGGCTGTGCCATGCAGTACGTGTACGAGCCCACCTACTACATGCTGAACGTGACGTCTGCCGGCGAGGACGGCATCTCTTACCAGCTGTGCACCGCCAACTGTATTGGCTACGCCGCCAACGTGTTCGCCACTGAACCTAACGGGCACATACCAGAAGGCTTTTCCTTCAACAACTGGTTCCTGCTGAGCAATGACAGCACGCTGGTCCACGGCAAGGTGGTCTCCAATCAACCTCTGCTGGTCAACTGCCTGCTGGCAATGCCTAAGATCTACGGTCTGGGACAGTTTTTCAGCTTCAATCAGACCATCGATGGCGTGTGTAACGGCGCCGCCGTACAAAGAGCCCCTGAGGCCCTCAGATTCAACATCAACGATACAAGCGTCATCCTGGCTGAGGGCTCGATCGTGCTTCACACAGCCCTGGGCACCAACCTGAGCTTCGTGTGCAGCAATAGTTCCGATCCTCACCTGGCTACATTTGCCATTCCTCTGGGCGCCACCCAGGTGCCCTACTACTGCTTTCTGAAGGTGGATACATACAACAGTACCGTGTATAAGTTCCTGGCCGTGCTGCCACCTACCGTGCGCGAAATCGTGATCACAAAGTACGGCGACGTGTATGTGAACGGTTTCGGCTATCTGCACCTGGGCCTGCTCGACGCCGTGACCATCAACTTCACCGGCCACGGCACAGATGACGACGTCTCCGGCTTCTGGACCATTGCGTCCACAAATTTCGTCGATGCCCTCATCGAGGTGCAGGGCACAGCTATACAGAGAATCCTGTACTGCGATGACCCAGTGTCCCAGCTGAAATGCTCCCAAGTGTCATTCGATCTGGATGACGGCTTCTACCCTATCAGCAGCAGGAACCTGTTAAGCCACGAGCAGCCTATCAGCTTCGTTACCCTACCTTCCTTCAACGACCACAGCTTCGTGAATATCACAGTCAGCGCCAGCTTCGGCGGCCACTCTGGCGCCAATCTGATCGCCAGCGATACCACAATCAACGGGCTGTCCAGCTTCTGTGTCGACACCCGACAGTTCACAATCTCCCTCTTTTACAACGTGACCAACTCTTACGGCTATGTATCCAAGAGCCAAGATAGCAATTGTCCTTTTACCCTGCAGTCTGTGAACGACTACCTCAGCTTCAGCAAATTCTGCGTGTCTACCAGTCTGCTGGCCAGCGCCTGCACAATCGACCTGTTTGGATACCCTGAGTTTGGATCTGGAGTGAAGTTCACCTCTCTGTACTTTCAATTCACCAAGGGCGAGCTGATCACCGGAACACCCAAGCCTCTGGAAGGGGTGACCGACGTGTCGTTTATGACCCTGGACGTGTGCACCAAGTACACCATCTACGGCTTCAAGGGCGAGGGAATCATCACCCTGACCAACTCCAGCATCTTGGCCGGCGTGTACTACACCAGCGACAGCGGCCAGCTGCTCGCATTCAAGAACGTGACCAGCGGCGCAGTGTACTCCGTGACCCCTTGCAGCTTCTCTGAACAGGCCGCTTATGTCGACGACGACATCGTCGGCGTGATCAGCAGCTTAAGCAGCTCAACCTTTAATAGCACCCGGGAACTGCCCGGATTCTTCTACCACAGCAATGATGGCTCTAATTGCACCGAGCCAGTGCTGGTGTACAGCAACATCGGCGTGTGCAAGAGCGGCTCTATCGGATACGTGCCTAGCCAAAGCGGCCAGGTGAAGATCGCCCCTACTGTGACCGGAAACATCAGCATCCCCACTAACTTTTCCATGAGCATCAGAACCGAGTACCTGCAGCTGTACAACACCCCTGTGTCCGTGGACTGCGCTACATACGTGTGTAACGGTAACTCTCGGTGCAAACAGCTGCTGACGCAGTACACCGCCGCCTGCAAGACGATTGAGAGCGCTCTGCAGCTGAGCGCCCGGCTGGAGTCCGTGGAAGTGAATAGCATGCTGACCATCTCCGAAGAAGCACTGCAGCTGGCCACCATTAGCTCCTTCAATGGCGACGGCTACAACTTCACCAATGTGCTGGGCGTGAGCGTCTACGACCCAGCCAGCGGAAGAGTCGTCCAGAAGCGGAGCTTCATTGAGGATCTGCTTTTCAACAAGGTTGTGACCAACGGACTGGGAACCGTGGATGAGGACTACAAGAGATGCTCTAACGGGCGGAGCGTGGCCGACCTGGTGTGCGCCCAGTACTACAGCGGAGTGATGGTGCTGCCCGGAGTGGTGGACGCCGAAAAACTGCACATGTACAGCGCCAGCCTGATCGGCGGCATGGTCCTGGGCGGCTTTACCAGCGCCGCCGCCCTGCCTTTCTCCTATGCCGTCCAGGCCCGGCTGAACTACCTGGCCCTGCAGACCGACGTGCTGCAGCGGAATCAGCAGATGCTGGCCGAAAGCTTTAACTCCGCTATCGGAAACATTACCTCTGCGTTTGAGTCTGTGAAGGAAGCTATCAGCCAGACATCCAAAGGACTGAACACAGTTGCCCACGCCCTGACAAAGGTGCAAGAGGTGGTGAACAGCCAGGGCGCTGCCCTGACCCAGCTGACCGTGCAACTGCAGCACAACTTCCAGGCCATCAGCAGCTCCATCGACGATATCTACAGCAGACTGGACATCCTGTCTGCTGATGTGCAGGTGGACAGACTCATCACCGGAAGACTGTCTGCCCTGAACGCCTTCGTGGCCCAAACCCTGACCAAATACACAGAAGTGCAGGCCTCCAGAAAACTGGCTCAACAGAAAGTGAATGAGTGCGTCAAGTCTCAGTCCCAGCGGTACGGCTTTTGCGGCGGCGACGGCGAGCACATCTTCAGCCTGGTGCAAGCCGCTCCCCAGGGACTGCTGTTCCTGCATACAGTTCTGGTCCCTGGCGATTTCGTGGACGTGATAGCAATCGCCGGTCTGTGCGTGAACGACGAGATCGCCCTGACCCTGCGGGAACCCGGCCTGGTGCTGTTCACCCACGAGCTGCAGAACCACACCGCCACAGAGTACTTCGTGAGCAGTAGAAGAATGTTCGAGCCCAGAAAGCCCACCGTGTCTGACTTCGTGCAGATCGAGAGCTGCGTGGTTACCTATGTGAACCTCACCCGTGATCAGCTGCCTGACGTGATCCCAGACTACATCGATGTCAACAAGACGCTGGATGAGATCCTGGCCAGTCTGCCGAATAGAACAGGCCCTTCTCTGCCCCTGGACGTGTTTAACGCCACATACTTGAACCTGACCGGCGAAATCGCCGACCTGGAACAGAGAAGCGAGAGCCTGCGGAATACCACAGAGGAGCTGCAGAGCTTGATCTATAACATCAACAACACCCTGGTGGACCTGGAATGGCTGAACCGGGTGGAAACCTACATCAAGTGGCCCTCCACTGGCTGTTGCGGCTGCTGTGGCTGCTGCTGCGCCTGTTTTTCTGGCTGCTGCCGCGGCCCTAGACTGCAGCCTTACGAAGTGTTCGAGAAGGTGCACGTGCAGGGCTACATCCCCGAAGCCCCTCGGGACGGGCAGGCTTACGTGAGGAAGGACGGCGAATGGGTACTCCTGTCTACATTCCTGCACCACCACCACCACCATCATCACTGA.
PEDV-2a-S(SEQ ID NO：2):
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PEDV-2b-S(SEQ ID NO：3):
ATGGGCTGGAGCTGGATCTTCCTGTTCCTGCTGAGCGGCACAGCTGGCGTGCTGAGCCTCCCTCAGGATGTCACTAGATGCACCGCCAATACGAACTTTAGACGGTTCTTCAGCAAATTCAACGTGCAAGCCC
CTGCTGTGGTGGTGCTGGGGGGCTACCTGCCTATCGGAGAAAACCAGGGCGTGAACTCCACCTGGTA
CTGCGCCGGCCAACACCCCACAGCCAGCGGCGTGCACGGTATCTTCCTGAGCCACATCAGAGGCGGC
CACGGCTTCGAGATCGGCATCAGCCAGGAGCCCTTCGACCCTAGCGGATACCAGCTGTACCTGCATAA
GGCCACCAATGGCAACACCAACGCCACGGCCAGACTGCGGATCTGCCAGTTTCCTAGCATCAAGACG
CTGGGCCCTGCCGCTAACAACGACGTGACCACTGGCAGAAATTGTCTGTTCAACAAAGCCATCCCCG
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AGGTTGTGCCATGCAGTACGTGTACGAGCCTACCTACTACATCCTAAACGTGACATCTGCCGGCGAGG
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CCTAACGGCCATATACCTGAAGGATTCTCCTTCAACAACTGGTTCCTCCTGAGCAATGACAGCACACT
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ATGGCCTGGGCCAGTTCTTTTCATTCAACCAGACAATCGACGGCGTGTGCAATGGCGCCGCTGTGCAA
AGAGCCCCTGAAGCCCTGAGATTCAACATCAACGACACCAGCGTTATCCTGGCCGAGGGCTCTATCGT
GCTGCACACCGCCCTTGGAACCAACTTCAGCTTCGTGTGCAGCAACAGCAGCGACCCCCACCTGGCC
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GCGATGTCTACGTAAACGGGTTCGGCTACCTGCACCTGGGCCTGCTCGATGCCGTAACCATCAACTTC
ACCGGCCATGGTACTGACGACGACGTGAGCGGCTTCTGGACCATCGCTTCCACAAACTTCGTGGATG
CCCTGATCGAAGTGCAGGGCACCGCCATTCAGAGGATTCTCTACTGCGACGATCCTGTGTCGCAGCTG
AAGTGCAGTCAGGTTGCCTTTGACCTGGACGATGGCTTCTACCGGATCAGCAGCACCAACCTGCTGT
CTCACGAGCAGCCAACCAGCTTCGTGACCCTCCCTAGCTTCAATGATCACTCTTTTGTGAACATCACT
GTTTCTGCTGCATTCGGCGGCCACAGCGGCGCCAACCTGATTGCAAGCGACACAACCATTAATGGCTT
CTCTAGCTTCTGTGTGGACACCAGACAGTTCACAATCTCACTCTTTTACAACGTGACCAACTCCTACG
GCTACGTGTCTAAGTCCCAGGACTCTAATTGCCCCTTCACCCTACAGAGTGTGAACGACTACCTGAGC
TTTAGCAAGTTTTGCGTGTCTACCAGCCTGCTGGCCTCCGCGTGTACAATCGACCTGTTCGGATACCCC
GAGTTCGGCTCCGGCGTGAAATTCACCTCTCTGTACTTTCAGTTCACGAAGGGCGAGCTGATCACCGG
CACACCCAAGCCTCTGGAGGGAGTGACAGACGTTTCCTTCATGACCCTGGACGTGTGCACAAAGTAC
ACAATCTACGGCTTTAAGGGCGAGGGCATCATCACACTGACCAACAGCAGCTTCCTGGCCGGAGTGT
ACTACACTTCTGACAGCGGCCAGCTGCTGGCCTTCAAAAACGTGACCAGCGGGGCCGTGTATTCTGT
GACACCATGTAGCTTCAGCGAACAGGCCGCTTACGTCGATGACGACATCGTCGGCGTGATCAGCAGT
CTGTCAAGCTCCACATTCAACTCTACACGGGAGCTGCCTGGCTTTTTCTACCACAGCAATGACGGCAG
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TTCAGCATGAGCATTAGAACCGAATACCTGCAGCTGTACAACACACCTGTGAGCGTGGACTGCGCCA
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GCGAGGAAGCGCTGCAACTGGCTACCATCAGCAGCTTCAATGGCGATGGATATAACTTCACCAATGTG
CTAGGCGTGTCTGTGTACGACCACGCCAGCGGCAGGGTGGTGCAGAAAATGTCCTTTATCGAGGACC
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TGACCAAGGTCCAGGAGGTGGTGAACTCCCAGGGCGCTGCCCTCACCCAGCTGACAGTGCAGCTCC
AACACAACTTCCAGGCCATCAGCTCTAGCATCGATGATATCTACAGCAGACTGGACATCCTGTCTGCC
GACGTGCAGGTCGACAGACTGATCACCGGCAGACTGTCCGCCCTGAACGCATTTGTGGCCCAGACCC
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AAAGCCAATCCCAGAGATACGGCTTCTGCGGCGGCGACGGCGAACACATCTTTTCCCTGGTTCAGGC
CGCCCCCCAGGGACTGCTGTTCCTGCACACCGTGCTGGTGCCTGGAGATTTCGTGAACGTGATCGCCA
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GCCCAACCGGACCGGGCCCTCTCTGAGCTTGGACGTGTTCAATGCCACATACCTGAATCTGACCGGA
GAGATCGCCGATCTGGAACAGCGCAGCGAGTCGCTCCGCAACACCACAGAAGAGCTCCAGAGCCTC
ATCTACAACATCAATAACACCCTGGTGGATCTGGAATGGCTGAACAGAGTGGGATACATCCCAGAGGC
CCCGCGGGACGGCCAGGCCTATGTGCGGAAGGACGGCGAATGGGTCCTGTTATCAACCTTTCTGCACCACCACCACCACCATCATCACTGA.
PEDV-2b-S(SEQ ID NO：4):
MGWSWIFLFLLSGTAGVLSLPQDVTRCTANTNFRRFFSKFNVQAPAVVVLGGYLPIGENQGVNSTWYCAGQHPTASGVHGIFLSHIRGGHGFEIGISQEPFDPSGYQLYLHKATNGNTNATARLRICQFPSIKTLGPAANNDVTTGRNCLFNKAIPAHMSEHSVVGITWDNDRVTVFSDKIYYFYFKNDWSRVATKCYNSGGCAMQYVYEPTYYILNVTSAGEDGISYQPCTANCIGYAANVFATEPNGHIPEGFSFNNWFLLSNDSTLVHGKVVSNQPLLVNCLLAIPKIYGLGQFFSFNQTIDGVCNGAAVQRAPEALRFNINDTSVILAEGSIVLHTALGTNFSFVCSNSSDPHLATFAIPLGAIQVPYYCFLKVDTYNSTVYKFLAVLPPTVREIVITKYGDVYVNGFGYLHLGLLDAVTINFTGHGTDDDVSGFWTIASTNFVDALIEVQGTAIQRILYCDDPVSQLKCSQVAFDLDDGFYRISSTNLLSHEQPTSFVTLPSFNDHSFVNITVSAAFGGHSGANLIASDTTINGFSSFCVDTRQFTISLFYNVTNSYGYVSKSQDSNCPFTLQSVNDYLSFSKFCVSTSLLASACTIDLFGYPEFGSGVKFTSLYFQFTKGELITGTPKPLEGVTDVSFMTLDVCTKYTIYGFKGEGIITLTNSSFLAGVYYTSDSGQLLAFKNVTSGAVYSVTPCSFSEQAAYVDDDIVGVISSLSSSTFNSTRELPGFFYHSNDGSNCTEPVLVYSNIGVCKSGSIGYVRSQSGQVKIAPTVTGNISIPTNFSMSIRTEYLQLYNTPVSVDCATYVCNGNSRCKQLLTQYTAACKTIESALQLSARLESAEVNSMLTISEEALQLATISSFNGDGYNFTNVLGVSVYDHASGRVVQKMSFIEDLLFNKVVTNGLGTVDEDYKRCSNGRSVADLVCAQYYSGVMVLPGVVDAEKLHMYSASLIGGMVLGGFTAAAALPFSYAVQARLNYLALQTDVLQRNQQLLAESFNSAIGNITPAFESVKEAISQTSKGLNTVAHALTKVQEVVNSQGAALTQLTVQLQHNFQAISSSIDDIYSRLDILSADVQVDRLITGRLSALNAFVAQTLTKYTEVQASRKLAQQKVNECVKSQSQRYGFCGGDGEHIFSLVQAAPQGLLFLHTVLVPGDFVNVIAIAGLCVNDEIALTLREPGLVLFTHELQDTATEYFVSSRRMYEPRKPTVGDFVQIESCVVTYVNLTRDQLPEVIPDYIDVNKTLDEILASLPNRTGPSLSLDVFNATYLNLTGEIADLEQRSESLRNTTEELQSLIYNINNTLVDLEWLNRVGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLHHHHHHHH*.
2、pPEDV-2b-S与pPEDV-2a-S蛋白的表达与纯化
采用瞬时转染的方法将pPEDV-2b-S与pPEDV-2a-S转染至293F细胞。转染前一天，测定细胞密度和活率；以2×106cells/mL的密度将细胞进行传代，37℃，5％ CO2，150rpm转速的摇床中过夜培养；转染当天，测定细胞密度和活率，调整细胞密度至3×106cells/mL，进行质粒转染。在转染24小时后旋松瓶口以满足后续细胞高密度生长的溶氧以及CO2排放需求，影响细胞生长。转染后48-72小时可用SDS-PAGE和Western-blot检测目的基因的表达情况确定最佳收样时间。收集293F-2b-S与293F-2a-S悬浮细胞表达上清与细胞，使用HisTrap HP镍柱进行蛋白分离纯化。纯化结束后，通过BCA蛋白定量试剂盒测定浓度，分装后于-80℃保存。
3、二价亚单位疫苗免疫实验
将等量的PEDV G2a-S和G2b-S重组蛋白混合后与M103佐剂体积1：1混合，室温搅拌乳化获取亚单位疫苗，疫苗中蛋白等质量混合后的总的终浓度为0.3mg/mL。将20头5日龄仔猪和2头临产期一个月的母猪随机分为2组(n＝10，n＝1)分别为PEDV G2a/G2b二价亚单位疫苗免疫组与control对照组(PBS组)。采用肌肉接种的方式，5日龄仔猪免疫组免疫2mL，对照组的仔猪用2mL DMEM免疫(见表1)。在免疫后14d进行二免，在第0d，14d和27d对仔猪进行前腔静脉采血，分离血清，于-20℃进行保存。
母猪免疫组接种3mL PEDV G2a/G2b二价亚单位疫苗(见表1)，所有母猪在分娩前30天进行免疫，并在分娩前15天进行二免。免疫后在第0、15、30天采集母猪血清。分娩后5天采集乳汁。
表1PEDV G2a/G2b二价亚单位疫苗免疫程序
4、免疫仔猪/母猪血清和乳汁的ELISA检测
包被表达纯化的PEDV-S1抗原，进行免疫仔猪/母猪血清(乳汁)特异性S1抗体的检测。其中S1抗原包被量为25ng/孔；检测时，血清(乳汁)稀释100倍，孵育时间30min，血清中羊抗猪二抗按1∶20 000稀释，乳汁中羊抗猪二抗按1∶80 000稀释，孵育时间30min，底物作用20min，最终测定450nm吸收光值。
5、免疫仔猪/母猪血清和乳汁的中和抗体测定
采集的血清(乳汁)在56℃下灭活30min。从1：2开始连续2倍稀释后，血清(乳汁)与PEDV(200TCID50/0.1mL)等体积混合，在37℃共孵育1小时。然后，将混合物接种到96孔组织培养板的Vero细胞单层上，在37℃孵育2.5h后，弃用混合物，用DMEM洗涤3次。然后，每孔加入病毒进入细胞所需的DMEM胰蛋白酶(10μg/mL)，37℃孵育3～5天。
6、仔猪攻毒保护试验
5日龄仔猪二免后10d，分别使用30mL×106.5TCID50/mL的PEDV AH2012和20mL×105.5TCID50/mL的PEDV HK2021毒株对27日龄仔猪口服攻毒，在此期间每天对仔猪状态进行观察、记录并进行腹泻评分(0＝固体；1＝糊状；2＝半液体；3＝水样)。
免疫母猪后，乳猪吸食5d初乳后，分别使用4mL×106.5TCID50/mL的AH2012和2mL×105.5TCID50/mL的HK2021毒株对5日龄仔猪口服攻毒，在此期间每天对仔猪状态进行观察、记录并进行腹泻评分(0＝固体；1＝糊状；2＝半液体；3＝水样)。
7、病毒RNA定量检测
为进一步研究二价亚单位疫苗对PEDV的保护能力，采用qRT-PCR检测粪便拭子中病毒RNA。qRT-PCR引物如下：
qPEDV-N-F：5’-GTCTGAAAAGCCAATCATTC-3’；
qPEDV-N-R：5’-TTGCCTCTGTTGTTACTC-3’；
PEDV-N-probe：5’-CTGTTGTTGCCATTGCCACGA-3’；
反应体系：2×ACQ 10μl，qPEDV-N-F 0.4μl，qPEDV-N-R 0.4μl，PEDV-N-probe 0.2μl，DYE 0.4μl，cDNA 2μl，ddH2O 6.6μl，总体积20μl。
反应程序：预变性95℃5min，95℃10s，60℃30s，40个循环。
8、统计学分析
使用GraphPad Prism 8软件对检测数据进行分析，数据采用均值±标准差表示，以P<0.05为差异有统计学意义。
9、结果与分析
9.1PEDV-2b-S与PEDV-2a-S重组蛋白的表达与纯化
pPEDV-2b-S与pPEDV-2a-S(图谱见图1中A)转染293T细胞48h后，通过Westernblot和IF进行蛋白表达鉴定。结果显示，PEDV-2b-S与PEDV-2a-S蛋白在约180kDa处均出现特异性条带且有特异性荧光，而未转染的细胞无特异性荧光，与预期结果一致(见图1中B和C)。
将纯化后的蛋白进行Western blot和SDS-PAGE检测。结果显示，PEDV-2b-S与PEDV-2a-S蛋白均能被纯化到，其SDS-PAGE检测结果与Western blot检测大小一致(见图1中D和E)；经BCA试剂盒检测，100mL细胞可以纯化到2mg G2b-S蛋白和1mg G2a-S蛋白。
9.2PEDV G2a-S/G2b-S二价亚单位疫苗主动免疫结果
9.2.1PEDV G2a-S/G2b-S二价亚单位疫苗主动免疫原性的测定结果
为了评价PEDV G2a-S/G2b-S二价亚单位疫苗是否能在仔猪体内诱导抗PEDV G2a型和PEDV G2b型的中和抗体，本发明使用PEDV G2a-S/G2b-S二价亚单位疫苗免疫仔猪(见图2中A)，结果发现，PEDV G2a-S/G2b-S二价亚单位疫苗诱导了血清中高滴度的IgG和sIgA抗体(见图2中B)。此外，本发明还发现S蛋白在血液中诱导了高滴度的中和抗体，免疫仔猪血液中滴度超过1：32(见图2中C)。
为评估仔猪免疫后针对S蛋白特异性抗体的变化，使用PEDV-S1间接ELISA对免疫仔猪抗体水平进行检测。间接ELISA结果显示：一免后2周各组仔猪特异性抗体水平均较低，并无明显差异。二免后，除对照组外，其他组S蛋白特异性IgG和sIgA抗体均上升，说明二价亚单位疫苗可以刺激仔猪产生特异性抗体(见图2中B)。
9.2.2 27日龄仔猪临床症状统计结果
每头27日龄仔猪分别使用30mL×106.5TCID50/mL的PEDV AH2012和20mL×105.5TCID50/mL的PEDV HK2021进行攻毒，根据仔猪是否出现呕吐、腹泻等症状来判断仔猪是否发病。结果显示：对于27日龄仔猪，攻AH2012的免疫组1只仔猪在3dpc时出现中度腹泻，对照组6只仔猪均出现水样腹泻；攻HK2021的免疫组2只仔猪在3dpc时出现重度腹泻，对照组5只仔猪均出现水样腹泻(见图3)。
9.2.3 27日龄仔猪肛拭子病毒RNA定量检测结果
为进一步研究二价亚单位疫苗对PEDV的保护能力，本发明采用qRT-PCR检测粪便拭子和肠道中病毒RNA。在攻毒前，从PBS组和任何其他猪收集的任何粪便拭子样本中均未检测到PEDV RNA。攻毒后，发现除空白对照组外在其他所有的肛拭子和肠道中都可以检测到病毒RNA，但是免疫组和对照组存在显著差异(见图4)。
9.2.4 27日龄仔猪剖检与病理组织检测结果
在7DPC时也进行了剖检和组织病理学检查。结果显示，攻毒7d后对所有实验动物剖杀，处死前可见对照组仔猪感染病毒后严重的腹泻，粘有很多黄色稀粪，而免疫组和未攻毒组则表现正常(见图5中a-e).剖检后，免疫仔猪未见大体上的肠道组织病变(图5中g和i)。感染最严重的对照仔猪小肠透明、薄壁、气体膨胀(图5中h和j)。PBS组仔猪肠组织中未见肉眼可见的病变(图5中f)。
仔猪小肠显微镜病变。对照仔猪回肠肠绒毛，呈钝化、碎片化、萎缩，空泡化(图6中c和e)。而免疫仔猪的肠道组织均未发生病理变化(图6中b和d)。PBS组仔猪肠组织未见病变(图6中a)。对PEDV核衣壳(N)蛋白的免疫荧光分析(见图6中f-j)显示，对照仔猪的肠道组织中含有表达N蛋白的细胞，这一现象在任何免疫仔猪和PBS组仔猪中均未见。
9.3PEDV G2a-S/G2b-S二价亚单位疫苗被动免疫结果
9.3.1PEDV G2a-S/G2b-S二价亚单位疫苗被动免疫原性检测结果
为了评价PEDV G2a-S/G2b-S二价亚单位疫苗对仔猪的被动保护效果，本发明使用PEDV G2a-S/G2b-S二价亚单位疫苗免疫临产期1个月的母猪(见图7中A)，使仔猪采食母乳5d，分别在产仔当日采集母猪血液以及产仔后5d采集乳猪血液并分离血清。结果发现，PEDVG2a-S/G2b-S二价亚单位疫苗诱导了母猪血清和初乳中高滴度的IgG和sIgA抗体(图7中B和C)。此外，还发现在乳猪血清中能够检测到免疫母猪抗体对乳猪的被动转移，且中和抗体滴度达到了1：64(图7中D)。乳猪血清中也可以检测到高滴度的IgG和sIgA抗体。
9.3.2仔猪临床症状统计结果
所有仔猪均健康正常，对每窝猪随机分组，每头吸食5天初乳的仔猪使用4mL×106.5TCID50/mL的AH2012和2mL×105.5TCID50/mL的HK2021进行攻毒和对照DMEM。攻毒后每日观察并记录仔猪精神状态、健康情况，对腹泻症状严重程度进行打分，对肠组织病变情况作相关记录。实验期间对照组仔猪健康状况良好，饮食正常，无腹泻症状。感染病毒PEDVAH2012和HK2021后，未免疫疫苗的母猪生产的仔猪在攻毒后24h到72h之间陆续发病，发病率达到100％，病猪精神萎靡、站立不稳、呕吐，所有仔猪均有腹泻症状并且大多持续腹泻、严重脱水。相反，产于免疫PEDV二价亚单位疫苗的母猪的仔猪在攻毒AH2012 24h后仅有1头仔猪出现中度的腹泻现象，在攻毒HK2021 24h后仅有1头仔猪出现重度的腹泻现象，说明免疫疫苗并采食母乳对仔猪抗PEDV感染有很大的影响。以上的结果表明，该疫苗产生的抗体可以通过乳汁转移到新生仔猪身上，从而产生有效的被动免疫进而预防乳猪对PEDV的感染(见图8)。
9.3.3病毒RNA定量检测结果
在攻毒前，从PBS组和任何其他猪收集的任何粪便拭子样本中均未检测到PEDVRNA。攻毒后对每日每头仔猪的肛拭子病毒RNA进行提取，在第7天时进行剖杀，收集肠道组织并利用荧光定量PCR的方法检测病毒RNA水平。结果发现在所有的肛拭子和肠道中都可以检测到病毒RNA，但是免疫组和对照组存在显著差异(见图9)。
9.3.4 5日龄仔猪剖检与病理组织检测结果
攻毒7d后对所有实验动物剖杀，处死前可见对照组仔猪感染病毒后严重的腹泻粘有很多黄色稀粪，而免疫组和未攻毒组则表现正常(见图10中a-e)。
处死仔猪并打开腹腔后，观察到感染PEDV并表现严重腹泻症状的对照组仔猪有明显的肠道病变，肠组织明显变薄、变透明，充满淡黄色或亮黄色的液体，而且有明显的胀气现象(见图10中h和j)。而出现轻微腹泻症状的免疫组仔猪的肠段病变程度轻，并且该组大部分的仔猪肠组织并无PEDV感染症状。HE染色结果显示感染PEDV的仔猪肠组织有较为明显的异常症状，表现为肠绒毛脱落、萎缩，嗜酸性粒细胞积聚，局部组织空泡化或水肿等症状。但是该毒株感染免疫组的仔猪后无明显症状，轻微腹泻者则仅表现为空肠和回肠的轻度病变。HE染色和免疫荧光试验共同显示引起回肠病变的PEDV集中侵害回肠绒毛上皮细胞，这与其它PEDV感染类似(见图11)。
从上述的实验研究以及实验结果可以看出，本发明选用PEDV G2a型和G2b型的S蛋白全长免疫仔猪和母猪，分别对PEDV GⅡ-a和GⅡ-b 2个亚型的S蛋白进行了大量真核表达纯化并制作亚单位疫苗进行免疫原性研究。通过免疫5日龄仔猪和临产期一个月的母猪，对免疫仔猪血清及母猪血清和乳汁IgG/IgA测定、血清中和试验来验证制备的亚单位疫苗的免疫原性，对PEDV亚单位疫苗免疫抗体效价评估，这样可以更加直观的观察S蛋白的免疫效果，为进一步的研究提供科学依据。本发明PEDV G2a-S/G2b-S实验组中和抗体滴度最高可达128，因此，可以初步认为本发明研发的PEDV G2a-S/G2b-S二价亚单位疫苗可起到较好的保护作用。之后，本发明分别用HK2021(G2a)和AH2012毒株(G2b)对免疫组和PBS组的27日龄仔猪和吸食5天初乳的5日龄乳猪进行了攻毒保护作用的研究。攻毒试验表明，血清抗体对仔猪具有保护作用。27日龄仔猪疫苗免疫组中只有1头仔猪出现轻度至中度腹泻，5日龄仔猪疫苗免疫组中只有1头仔猪出现轻度至中度腹泻，而感染对照组中所有仔猪均出现水样腹泻。此外，通过qRT-PCR和免疫荧光检测到免疫仔猪肠道组织中PEDV抗原蛋白与对照组存在明显差异。结果表明，本试验使用真核表达的S蛋白制备的亚单位疫苗诱导了强大的体液免疫应答的免疫效果，并预防了仔猪对PEDV G2a和G2b的感染。这些数据表明，基于S蛋白的亚单位疫苗是一种很有前途的候选疫苗，可用于预防PEDV的感染。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗，其特征在于，包括重组蛋白PEDV-2a-S和PEDV-2b-S，其中，所述PEDV-2a-S的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述PEDV-2b-S的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗还包括佐剂。
3.如权利要求2所述的猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗，其特征在于，所述PEDV-2a-S和PEDV-2b-S的混合物与所述佐剂的体积比为1:1。
4.如权利要求3所述的猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗，其特征在于，所述混合物为所述PEDV-2a-S和PEDV-2b-S等质量混合，所述混合物在所述猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗中的终浓度为0.3mg/mL。
5.如权利要求2所述的猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗，其特征在于，所述佐剂包括M103佐剂。
6.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗，其特征在于，所述PEDV-2a-S的制备方法包括以下步骤：
将目的基因序列导入表达载体，构建重组表达载体；
将所述重组表达载体转入真核细胞表达，经蛋白纯化，获取所述PEDV-2a-S；
其中，所述目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
7.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗，其特征在于，所述PEDV-2b-S的制备方法包括以下步骤：
将目的基因序列导入表达载体，构建重组表达载体；
将所述重组表达载体转入真核细胞表达，经蛋白纯化，获取所述PEDV-2b-S；
其中，所述目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
8.一种猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将重组蛋白PEDV-2a-S和PEDV-2b-S混合后与佐剂等体积混合后，室温搅拌乳化，获取猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗；其中，所述PEDV-2a-S的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述PEDV-2b-S的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述重组蛋白PEDV-2a-S和PEDV-2b-S按照等质量混合后，混合物在所述猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗中的终浓度为0.3mg/mL。
10.重组蛋白PEDV-2a-S和PEDV-2b-S在制备猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗中的应用，其特征在于，所述PEDV-2a-S的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述PEDV-2b-S的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
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|---|---|---|---|---|
| CN118667886A (zh) * | 2024-08-22 | 2024-09-20 | 畜科生物工程有限公司 | 一种pedvs嵌合蛋白的重组腺病毒及其制备方法和用途 |
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