CN117947142A - 一种试剂盒及其应用以及一种核酸杂交方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种试剂盒及其应用以及一种核酸杂交方法。该试剂盒用于第一核酸片段和第二核酸片段结合，其中，第一核酸片段的至少一端含有第一单链末端，第二核酸片段含有第二单链末端，且第一核酸片段和第二核酸片段通过第一单链末端和第二单链末端结合，试剂盒至少包括第一试剂和第二试剂，且试剂盒中的各试剂混合形成的混合溶液的粘度为1‑6mpa.s。该试剂盒能够降低短片段测序文库的分子运动速率，从而降低短片段测序文库的杂交效率，使得长片段测序文库的杂交比率上升，以此达到降低测穿序列比率的目的，使得测序结果准确性得以提高。
Description
技术领域
本发明涉及测序领域，特别是涉及一种试剂盒及其应用以及一种核酸杂交方法。
背景技术
二代测序技术(Next-generation sequencing，NGS)又称为高通量测序(High-throughput sequencing)，是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术。该技术主要涉及的步骤是测序文库构建(待测序列的一端或两端连接接头序列得到测序文库)、测序文库杂交(通过芯片表面固定的探针与测序文库的接头序列互补杂交以捕获测序文库)、对测序文库进行扩增、扩增后解链将原始测序文库切除，留下与测序文库对应的模板链、利用聚合酶由探针开始依据模板链合成子链，过程中利用荧光信号辨别子链添加的每一个核苷酸，完成对待测序列中碱基次序的测定。
NGS的测序过程中，测序文库杂交这一步骤通常需要在一个有一定离子强度、中性的溶液体系中进行。在将测序文库杂交到芯片表面上时，测序文库的片段越短，其杂交效率越高，主要原因有两点：①片段越短，分子运动速率越快；②片段越短，该片段形成发卡结构的概率越低，因此，短片段测序文库在杂交这一过程中会比长片段测序文库优先杂交，导致在最终的测序结果中，出现较多的测穿序列(即测序文库长度小于测序平台的最大测序读长，测序平台在自身的测序读长之内，即可测定测序文库的全部碱基的情况)，轻则造成资源浪费，重则直接影响测序质量，导致错误率急剧攀升，进而影响结果判读。
发明内容
为了解决测序文库杂交过程中，存在长度差异的测序文库的杂交概率不同，导致最终测序结果出现较多测穿序列，影响测序结果准确性的问题，本发明的实施方式提供一种试剂盒及其应用，以及一种核酸杂交方法。
第一方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒用于第一核酸片段和第二核酸片段结合，其中，第一核酸片段的至少一端含有第一单链末端，第二核酸片段含有第二单链末端，且第一核酸片段和第二核酸片段通过第一单链末端和第二单链末端结合，试剂盒至少包括第一试剂和第二试剂，且试剂盒中的各试剂混合形成的混合溶液的粘度为1-6mpa.s。
该试剂盒中各试剂混合形成的混合溶液是发明人意外发现作出的，适于在涉及核酸分子杂交的应用中作为杂交的溶液体系使用。混合溶液的粘度范围为1-6mpa.s，能够降低短片段测序文库在其中的分子运动速率，从而降低短片段测序文库的杂交效率，使得长片段测序文库的杂交比率上升，以此达到降低测穿序列比率的目的，使得测序结果准确性得以提高。
在一个示例中，第一试剂为增粘剂。增粘剂可以增加混合溶液的粘度，使其达到一定范围，降低短片段测序文库在其中的分子运动速率，从而降低短片段测序文库的杂交效率，以此达到降低测穿序列占比的目的。
较佳地，增粘剂为多聚体。
在一些示例中，增粘剂为硫酸葡聚糖钠盐、硫酸葡聚糖及其衍生物、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000或聚丙烯酸中的至少一种。
在一些示例中，增粘剂在混合溶液中的质量浓度为0％～7.5％。
在另一示例中，第二试剂为变性剂。使用加入了变性剂的混合溶液进行杂交时的杂交温度比使用未添加变性剂的溶液进行杂交时的杂交温度低，能够降低长片段测序文库形成发卡结构的概率，从而提高长片段测序文库的杂交效率，进而提高长片段测序文库的占比，使测序结果更准确，减少资源浪费。
在一些示例中，变性剂为酰胺和/或亚砜。
较佳地，变性剂为二甲基亚砜和/或甲酰胺。
在一些示例中，变性剂在混合溶液中的体积百分比浓度为0％～50％。
在一些示例中，试剂盒还包括缓冲液和/或表面活性剂。
较佳地，表面活性剂为聚山梨醇酯20、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯、聚山梨酸酯60、聚山梨醇酯80、十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠或Triton X-100中的至少一种。
在一些示例中，表面活性剂在混合溶液中的体积百分比浓度为0.1％～1％。
在一些示例中，试剂盒还包括金属离子螯合剂。
较佳地，金属离子螯合剂为乙二胺四乙酸、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸或二羟乙基甘氨酸中的至少一种。
在又一示例中，试剂盒中至少一种试剂分装，或试剂盒中的所有试剂混合形成混合溶液。
第二方面，本发明还提供了上述试剂盒在核酸分子杂交中的应用。在核酸分子杂交反应中应用上述试剂盒，能够提高长片段核酸分子的杂交效率。
第三方面，本发明还提供一种核酸杂交方法，包括：将第一核酸片段、第二核酸片段和上述试剂盒中的混合溶液混合，使得第一核酸片段与第二核酸片段结合，其中，第一核酸片段的至少一端含有第一单链末端，第二核酸片段含有第二单链末端，且第一核酸片段和第二核酸片段通过第一单链末端和第二单链末端结合。
在一个示例中，第一核酸片段为DNA双链片段、DNA单链片段或RNA片段。
在另一示例中，第二核酸片段为DNA双链片段、DNA单链片段或RNA片段。
该方法适用于核酸分子杂交过程。核酸杂交过程可以是基因测序中的测序文库和探针的杂交过程、识别特异性核苷酸序列实验中的探针与待测靶核苷酸的杂交过程等。
本发明实施方式的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明实施方式的实践了解到。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施方式。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例，下面描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
在本文中，除非另有说明，核苷酸指四种天然核苷酸(如dATP、dCTP、dGTP和dTTP或者ATP、CTP、GTP和UTP)或其衍生物，有时也直接以其包含的碱基(A、T或U、C和G)表示。本领域普通技术人员根据上下文记载可以知晓所示表达方式所指代的核苷酸或碱基。
在本文中，所称的“测序”为序列测定，同“核酸测序”或“基因测序”，指核酸序列中碱基次序的测定；包括合成测序(边合成边测序，SBS)和/或连接测序(边连接边测序，SBL)；包括DNA测序和/或RNA测序；包括双末端测序、单末端测序和/或配对末端测序等，所称的双末端测序或者配对末端测序可以指同一核酸分子的不完全重叠的任意两段或两个部分的读出。
所称的测序包括使核苷酸(包括核苷酸类似物)结合到模板并采集相应的反应信号的过程。在一些使核苷酸结合到模板和采集相应的反应信号非同步/实时进行的测序平台中，一般是通过多轮测序来实现模板上的多个核苷酸/碱基的次序的测定，一轮测序(cycle)也称为测序轮，可定义为四种核苷酸/碱基的一次碱基延伸，换个说法，可定义为完成模板上任意一个指定位置的碱基类型的测定过程。
对于基于控制聚合或连接反应实现测序的测序平台，一轮测序可包括实现一次四种核苷酸结合到所称的模板并采集相应的反应信号的过程；对于基于聚合反应实现测序的平台，反应体系包括反应底物核苷酸、聚合酶和模板，使模板上结合有一段预设序列(测序引物)，基于碱基配对原则和聚合反应原理，加入的反应底物(核苷酸)在聚合酶的催化下，可控地连接到测序引物的3'末端、实现与模板的相应位置碱基的配对；通常地，一轮测序可包括一次或多次碱基延伸(repeat)，例如，四种核苷酸依次加入到反应体系中，分别进行碱基延伸和相应的反应信号的采集，一轮测序包括四次碱基延伸、四次信号采集；又例如，四种核苷酸任意组合加入到反应体系中，例如两两组合或者一三组合，两个组合分别进行碱基延伸和相应的反应信号的采集，一轮测序包括两次碱基延伸、四次信号采集；再例如，四种核苷酸同时加入到反应体系中进行碱基延伸和反应信号的采集，一轮测序包括一次碱基延伸和四次信号采集。
测序可以通过测序平台进行，测序平台可选择但不限于真迈生物的GenoLab测序平台、Illumina公司的Hiseq/Miseq/Nextseq/Novaseq测序平台、Thermo Fisher/LifeTechnologies公司的IonTorrent平台、华大基因的BGISEQ和MGISEQ/DNBSEQ平台以及单分子测序平台；测序方式可以选择单端测序，也可以选择双末端测序。
在本文中，所称的“测序文库”指待测序列的一端或两端连接接头序列而得到的核酸片段。所称的“长片段测序文库”是与“短片段测序文库”相比较而言，在构建测序文库时，测序文库片段长度大部分情况下会呈现正态分布，但长度范围与构建条件相关，因此没有具体的数值范围。在本文中，长片段测序文库指在用于测序的全部测序文库中自身片段长度相对较长的测序文库，例如，用于测序的全部测序文库中，测序文库的片段长度呈300bp～600bp正态分布，则认为片段长度为500bp～600bp的测序文库为长片段测序文库。
在本文中，所称的“待测序列”指待测核酸序列，可来自核酸样本。
在本文中，所称的“探针”指能够与接头序列结合的核酸序列，探针可以是存在于溶液中，也可以是固定在固体基底上，所称的“固体基底”可以是任何可用于固定核酸序列的固体支持物，例如尼龙膜、玻璃片、塑料、硅片、磁珠等；有时也称为反应器、芯片或流动池。
在本文中，所称的“核酸分子”指DNA双链片段、DNA单链片段或RNA片段。在本文中，核酸分子包括待测核酸序列和探针，也可以指测序文库和探针。
在本文中，所称的“杂交”指具有一定同源性的两条核酸单链或具有单链末端的核酸双链在一定条件下按照碱基互补配对原则退火形成双链的过程，该过程是高度特异性的。杂交的双方是待测核酸序列和探针，在本文中，也可以指测序文库和探针。
在本文中，所称的“待测序列长度均值”指测序结果中测得的各待测序列长度的平均值。所称的“待测序列长度中位数”指测序结果中测得的各待测序列长度的中位数。所称的“待测序列相对增加长度”指各实施例中待测序列长度中位数与对比例实验中待测序列长度中位数的差值，表征各实施例中测序得到的待测序列长度的增加程度。待测序列长度增加明显，表明测序过程中测得的长片段测序文库数量增加，也即在测序前杂交过程，探针杂交捕获的长片段测序文库数量增加，从而体现出长片段测序文库的杂交效率有所升高，杂交的测序文库中长片段测序文库的占比有所提高。
测序过程中，测序文库与探针杂交时，由于短片段测序文库的分子运动速率比长片段测序文库快，以及短片段测序文库形成发卡结构的概率比长片段测序文库低，短片段测序文库在杂交过程中一般会比长片段测序文库优先与探针杂交，导致在最终的测序结果中，出现较多的测穿序列，即测序文库长度小于测序平台的最大测序读长，测序平台在自身的测序读长之内，即可测定测序文库的全部碱基的情况。而测穿序列携带的序列信息较少，当出现较多测穿序列时，容易造成测序读长的浪费，从而造成测序资源浪费，更严重地，由于测定的序列多为短片段，序列信息分布不均，还可能影响测序结果的准确性。
为了进一步规避上述风险，发明人发现可通过对杂交过程中的溶液体系进行优化，增加长片段测序文库的相对杂交比率，以此达到降低测穿序列占比的目的。
应用于测序文库杂交的溶液体系在本领域内的基础配方主要是柠檬酸钠缓冲液(SSC)，该缓冲液由氯化钠和柠檬酸钠配制得到。发明人在使用SSC缓冲液进行测序文库杂交时，发现测序结果中杂交的测序文库片段长度较短，也即相比于短片段测序文库，长片段测序文库的杂交比率低。因此，发明人对SSC缓冲液的物理性质对片段长度不同的测序文库的杂交可能具有的影响进行了评估。发明人发现，由于短片段测序文库的分子运动速率更快，其在流动性较强的SSC缓冲液中容易比长片段测序文库更快接触到探针从而进行杂交。因此，通过降低杂交使用的溶液体系的流动性，可能可以降低短片段测序文库的分子运动速率。
基于上述意外发现和多次试验调整，发明人发现通过使杂交使用的溶液体系的粘度达到一定范围，可以显著提高长片段测序文库的杂交比率。同时，发明人还发现杂交过程中，长片段测序文库形成发卡结构的概率较高，影响其杂交可能性，对此，可以在杂交使用的溶液体系中添加能够降低核酸分子熔解温度的成分，使得杂交过程可以在温度较低的条件下进行，以降低长片段测序文库形成发卡结构的概率。
因此，第一方面，根据本发明的实施方式，提供一种试剂盒，该试剂盒用于第一核酸片段和第二核酸片段结合，其中，第一核酸片段的至少一端含有第一单链末端，第二核酸片段含有第二单链末端，且第一核酸片段和第二核酸片段通过第一单链末端和第二单链末端结合，试剂盒至少包括第一试剂和第二试剂，且试剂盒中的各试剂混合形成的混合溶液的粘度为1-6mpa.s。使用混合溶液作为测序文库杂交时的溶液体系，由于其具备一定粘度，流动性较低，短片段测序文库在其中的分子运动速率下降，杂交效率变低，杂交概率下降，同时长片段测序文库的杂交概率有所上升，使得最终测序结果中长片段测序文库的比率升高，测穿序列减少，从而得到更准确的测序结果。结合混合溶液的粘度对杂交的结果中长片段测序文库的杂交比率的影响，混合溶液的粘度在超过一定范围之后，对长片段测序文库的杂交比率不再有提升作用，且由于粘度过大，很可能影响杂交的进行。而如果粘度过低，则起不到降低短片段测序文库的分子运动速率的作用，因此经过实验测试，选定混合溶液的粘度为1-6mpa.s，在该粘度范围内，混合溶液能够降低短片段测序文库的分子运动速率，降低测穿序列的占比，且混合溶液的粘度不会阻碍杂交反应的进行。
本发明实施例所指的混合溶液是指由试剂盒中各试剂按照一定比例混合形成的、各试剂在混合液中具有一定浓度的混合体系。在一些示例中，混合溶液应用于固-液相杂交中，例如作为测序文库杂交时的溶液体系，与测序文库混合后通入芯片中，芯片上的探针在混合溶液中对测序文库进行杂交捕获。在另一些示例中，混合溶液作为核酸分子液相杂交的溶液体系，待测核酸片段与探针游离在混合溶液中进行杂交反应。
较佳地，在一个示例中，混合溶液的粘度为2～5mpa.s，对长片段测序文库的杂交比率有较大的提升作用。特别是粘度为4～5mpa.s时，长片段测序文库的杂交比率的提升作用更为明显。
在其他示例中，混合溶液的粘度范围在选取时也需要考虑使用场景。例如，当应用于某一测序平台时，混合溶液的浓度选取需要考虑该测序平台能够承担的溶液粘度限度。
在一个具体示例中，第一试剂为增粘剂。增粘剂可以增加混合溶液的粘度，使其达到一定范围，降低短片段测序文库在其中的分子运动速率，从而降低短片段测序文库的杂交效率，以此达到降低测穿序列占比的目的。
较佳地，在一个示例中，增粘剂为多聚体。多聚体一般相对分子量很大，碳链很长，由于多聚体大分子结构的特殊性，导致其在溶液中运动阻力较小分子高的多，因此这类物质溶于适当的溶剂后，溶液粘度一般比较大。
更佳地，增粘剂为硫酸葡聚糖钠盐、硫酸葡聚糖及其衍生物、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000或聚丙烯酸中的至少一种。
在一些示例中，增粘剂在混合溶液中的质量浓度为0％～7.5％。测试中发现，在一定粘度范围内，增粘剂在混合溶液中的质量浓度越大，最终混合溶液的粘度越大。而为了混合溶液的粘度在可控范围内，增粘剂在混合溶液中的质量浓度经过测试，选定为0％～7.5％。较佳地，增粘剂在混合溶液中的质量浓度为2％～7.5％。
较佳地，在一个示例中，增粘剂为硫酸葡聚糖钠盐，其在混合溶液中的质量浓度为4％～7.5％。经实验，在其他条件相同的情况下，选择硫酸葡聚糖钠盐作为增粘剂，对于增加长片段测序文库的杂交比率有较为明显的效果。在一定范围内，硫酸葡聚糖钠盐在混合溶液中的质量浓度增加，混合溶液的粘度增大，长片段测序文库的杂交比率升高，但在将混合溶液用于测序平台时，混合溶液的粘度设置受到测序平台的限制。当混合溶液的粘度增大，测序平台在抽取混合溶液进入芯片时，液路管道内负压会急剧增加，导致漏气现象的发生，此时需要通过降低混合溶液的流速来消除其粘度增大的影响，但流速降低会影响杂交的均一性，使得芯片入口端的杂交密度显著高于芯片出口端，考虑到上述因素，为了平衡混合溶液的粘度和长片段测序文库的杂交比率，增粘剂在混合溶液中的质量浓度优选为4％～7.5％。
在一个具体示例中，第二试剂为变性剂。变性剂能够降低核酸分子熔解温度，使得杂交过程可以在温度较低的条件下进行。使用加入了变性剂的混合溶液进行杂交时的杂交温度比使用未添加变性剂的溶液进行杂交时的杂交温度低，能够降低长片段测序文库形成发卡结构的概率，从而提高长片段测序文库的杂交效率，进而提高长片段测序文库的占比，使测序结果更准确，减少资源浪费。
在一些示例中，变性剂为酰胺和/或亚砜。较佳地，在一个示例中，变性剂为二甲基亚砜、甲酰胺或尿素中的至少一种。
在一些示例中，变性剂在混合溶液中的体积百分比浓度为0％～50％。
较佳地，在一个示例中，变性剂为甲酰胺，其在混合溶液中的体积百分比浓度为0％～50％。在实际应用中，需根据混合溶液中甲酰胺的体积百分比浓度计算杂交体系中核酸分子的熔解温度，并对应调整杂交温度。考虑到所使用的探针的熔解温度、进行杂交的测序文库的熔解温度和本领域一般的核酸杂交过程的最低杂交温度(一般最低杂交温度控制在37℃)，甲酰胺在混合溶液中的体积百分比浓度优选为50％，能够有效增加长片段测序文库的相对杂交比率。在该示例中，杂交温度选用37℃。
经过实验，在混合溶液中仅添加一定浓度的变性剂，不添加任何增粘剂的情况下，使用该混合溶液测序得到的结果中，杂交捕获的长片段测序文库占比有一定程度的提高。而当使用同时添加一定浓度范围内的增粘剂和变性剂的混合溶液进行测序，对比使用仅添加了相同浓度的增粘剂或变性剂的混合溶液进行测序的情况，前者杂交捕获的长片段测序文库占比更高，且随着添加的增粘剂浓度的增大，杂交捕获的长片段测序文库占比变大，并且，实验中还发现，同时含有一定浓度的增粘剂和一定浓度的变性剂的混合溶液的粘度，大于仅含有相同浓度的增粘剂的混合溶液的粘度和仅含有相同浓度的变性剂的混合溶液的粘度相加的和，猜测增粘剂和变性剂在提高杂交中长片段测序文库杂交概率上存在一定的协同作用。但当增粘剂的浓度增大到某个浓度后，便不再对长片段测序文库占比有明显的提高，即增粘剂和变性剂的协同作用存在一定的上限。猜测可能由于混合溶液的粘度增加到一定程度，会影响杂交进程，也无法再提高长片段测序文库的杂交概率。
在一个具体示例中，混合溶液还包括缓冲液和/或表面活性剂。缓冲液包含盐离子，能够为核酸双链片段的稳定提供其需要的盐环境，也即在缓冲液中，测序文库与探针能够进行杂交并保持双链的稳定状态。为了进一步提升固液杂交效率，可在混合溶液中加入表面活性剂。
在一个具体示例中，缓冲液选自SSC缓冲液或SSPE缓冲液。SSC缓冲液为柠檬酸钠缓冲液，由NaCl和柠檬酸钠配制得到。SSPE缓冲液由NaCl、NaH2PO4和EDTA配制得到。
在一些示例中，缓冲液为SSC缓冲液，SSC缓冲液的浓度为1×SSC～20×SSC(1×SSC为0.15mol/LNaCl和0.015mol/L柠檬酸钠)。本发明的一个具体示例中，SSC缓冲液的浓度优选为5×SSC(0.75mol/LNaCl和0.075mol/L柠檬酸钠)。
在一些示例中，表面活性剂为聚山梨醇酯20、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯、聚山梨酸酯60、聚山梨醇酯80、十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠或Triton X-100中的至少一种。
较佳地，在一个示例中，表面活性剂在混合溶液中的体积百分比浓度为0.1％～1％。
在一个具体示例中，混合溶液还包括金属离子螯合剂。金属离子螯合剂的添加一方面可以起抑菌作用，另一方面，如果混合溶液中存在一些可能会催生氧负离子、过氧负离子等的金属离子，可能会对DNA造成一定损伤，而金属离子螯合剂的添加可以结合这些金属离子，从而提升混合溶液的性能稳定性。
在一些示例中，金属离子螯合剂为乙二胺四乙酸、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸或二羟乙基甘氨酸中的至少一种。
在一些示例中，试剂盒中至少一种试剂分装，或试剂盒中的所有试剂混合形成混合溶液。在一个示例中，试剂盒用于核酸分子杂交，在使用时，将至少两种试剂混合形成混合溶液，使用混合溶液作为测序文库杂交时的溶液体系。试剂盒中至少一种试剂是分装状态，使用时，按照每种试剂在混合溶液中的所需的最终浓度范围对分装试剂进行混合形成混合溶液。在另一个示例中，试剂盒中的所有试剂混合形成混合溶液，试剂盒使用时，可直接将混合溶液作为测序文库杂交时的溶液体系。在一些示例中，增粘剂在混合溶液中的质量浓度为0％～7.5％。在一些示例中，变性剂在混合溶液中的体积百分比浓度为0％～50％。在一些示例中，表面活性剂在混合溶液中的体积百分比浓度为0.1％～1％。
第二方面，试剂盒在核酸分子杂交中的应用。可以理解，上述试剂盒不仅可用于测序，也可以用于其他需要进行核酸杂交的方法或产品中。如利用此试剂盒进行序列杂交捕获和/或测序中时，可以作为对照组实验对序列杂交捕获进行质控。
第三方面，根据本发明的实施方式，提供一种核酸杂交方法，包括：
将第一核酸片段、第二核酸片段和上述试剂盒中的混合溶液混合，使得第一核酸片段与第二核酸片段结合，其中，第一核酸片段的至少一端含有第一单链末端，第二核酸片段含有第二单链末端，且第一核酸片段和第二核酸片段通过第一单链末端和第二单链末端结合。
在一些示例中，该核酸杂交方法用于基因测序中的测序文库和探针的杂交过程，可选地，第一核酸片段为测序文库，第二核酸片段为探针。测序文库包括待测序列和接头序列，待测序列的一端或两端分别连接接头序列，在混合溶液中，当测序文库为一端连接有接头序列的待测序列时，测序文库的一端，即接头序列部分可与探针结合，当测序文库为两端均连接有接头序列的待测序列时，测序文库两端的接头序列部分均可与探针结合。两种情况下，长片段测序文库的杂交比率均有所提升。在一些示例中，接头序列和探针可以是全部结合，也可以是部分结合。
可选地，第一核酸片段为DNA双链片段、DNA单链片段或RNA片段，第二核酸片段为DNA双链片段、DNA单链片段或RNA片段。
以下通过具体实施例对本发明做详细的阐述，应当理解，实施例仅是示例性的。实施例中涉及的材料、试剂以及序列等，如无特殊说明，可自行制备、合成或者通过市售途径获取。
对比例
对比例中对比试剂的配方选自市面上Illumina公司所使用的用于二代测序平台的杂交溶液配方。
对比试剂配方：5×SSC缓冲液中加入最终体积浓度为0.1％的聚山梨醇酯20。
配制方法：量取75mL ddH2O到125mL试剂瓶中；加入25mL 20×SSC缓冲液；加入100μL聚山梨醇酯20，混匀。
配制完成后，于对比试剂中加入4pM E.coli文库，将加入了文库的对比试剂通入测序仪上的芯片中进行文库与芯片上的探针之间的杂交反应，杂交反应时的杂交温度设置在50℃。
测序完成后，得到在使用对比试剂的条件下，最终测序得到的待测序列长度均值为249.37bp，待测序列长度中位数为248bp，设置本对比例的待测序列相对增加长度为0bp。
同时测量对比试剂的粘度为0.79mpa.s。
实施例1
混合溶液1配方：5×SSC缓冲液中加入最终体积浓度为0.1％的聚山梨醇酯20和最终质量浓度为2％的硫酸葡聚糖钠盐。
配制方法：量取ddH2O 65mL到250mL烧杯中；加入25mL 20×SSC缓冲液；加入2g的硫酸葡聚糖钠盐，磁力搅拌混匀；于100mL容量瓶定容，转移到125mL试剂瓶中，加入100μL聚山梨醇酯20，混匀。
配制完成后，于混合溶液1中加入4pM E.coli文库，将加入了文库的混合溶液1通入测序仪上的芯片中进行文库与芯片上的探针之间的杂交反应，杂交反应时的杂交温度设置在50℃。
测序完成后，得到在使用混合溶液1的条件下，最终测序得到的待测序列长度均值为250.5bp，待测序列长度中位数为249bp，待测序列相对增加长度为1bp。
同时测量混合溶液1的粘度为1.29mpa.s。
实施例2
混合溶液2配方：5×SSC缓冲液中加入最终体积浓度为0.1％的聚山梨醇酯20和最终质量浓度为4％的硫酸葡聚糖钠盐。
配制方法：量取ddH2O 65mL到250mL烧杯中；加入25mL 20×SSC缓冲液；加入4g的硫酸葡聚糖钠盐，磁力搅拌混匀；于100mL容量瓶定容，转移到125mL试剂瓶中，加入100μL聚山梨醇酯20，混匀。
配制完成后，于混合溶液2中加入4pM E.coli文库，将加入了文库的混合溶液2通入测序仪上的芯片中进行文库与芯片上的探针之间的杂交反应，杂交反应时的杂交温度设置在50℃。
测序完成后，得到在使用混合溶液2的条件下，最终测序得到的待测序列长度均值为258.77bp，待测序列长度中位数为259bp，待测序列相对增加长度为11bp。
同时测量混合溶液2的粘度为2.14mpa.s。
实施例3
混合溶液3配方：5×SSC缓冲液中加入最终体积浓度为0.1％的聚山梨醇酯20和最终质量浓度为7.5％的硫酸葡聚糖钠盐。
配制方法：量取ddH2O 65mL到250mL烧杯中；加入25mL 20×SSC缓冲液；加入7.5g的硫酸葡聚糖钠盐，磁力搅拌混匀；于100mL容量瓶定容，转移到125mL试剂瓶中，加入100μL聚山梨醇酯20，混匀。
配制完成后，于混合溶液3中加入4pM E.coli文库，将加入了文库的混合溶液3通入测序仪上的芯片中进行文库与芯片上的探针之间的杂交反应，杂交反应时的杂交温度设置在50℃。
测序完成后，得到在使用混合溶液3的条件下，最终测序得到的待测序列长度均值为268.5bp，待测序列长度中位数为270bp，待测序列相对增加长度为22bp。
同时测量混合溶液3的粘度为4.36mpa.s。
实施例4
混合溶液4配方：5×SSC缓冲液中加入最终体积浓度为0.1％的聚山梨醇酯20、最终体积浓度为50％的甲酰胺和最终质量浓度为2％的硫酸葡聚糖钠盐。
配制方法：量取ddH2O 65mL到250mL烧杯中；加入25mL 20×SSC缓冲液；加入2g的硫酸葡聚糖钠盐，磁力搅拌混匀；加入50mL甲酰胺；100mL容量瓶定容，转移到125mL试剂瓶中，加入100μL聚山梨醇酯20，混匀。
配制完成后，于混合溶液4中加入4pM E.coli文库，将加入了文库的混合溶液4通入测序仪上的芯片中进行文库与芯片上的探针之间的杂交反应，杂交反应时的杂交温度设置在37℃(由于甲酰胺会影响Tm值，故使用含有50％甲酰胺的混合溶液进行杂交时的杂交温度为37℃)。
测序完成后，得到在使用混合溶液4的条件下，最终测序得到的待测序列长度均值为268.87bp，待测序列长度中位数为270bp，待测序列相对增加长度为22bp。
同时测量混合溶液4的粘度为2.47mpa.s。
实施例5
混合溶液5配方：5×SSC缓冲液中加入最终体积浓度为0.1％的聚山梨醇酯20、最终体积浓度为50％的甲酰胺和最终质量浓度为4％的硫酸葡聚糖钠盐。
配制方法：量取ddH2O 65mL到250mL烧杯中；加入25mL 20×SSC缓冲液；加入4g的硫酸葡聚糖钠盐，磁力搅拌混匀；加入50mL甲酰胺；100mL容量瓶定容，转移到125mL试剂瓶中，加入100μL聚山梨醇酯20，混匀。
配制完成后，于混合溶液5中加入4pM E.coli文库，将加入了文库的混合溶液5通入测序仪上的芯片中进行文库与芯片上的探针之间的杂交反应，杂交反应时的杂交温度设置在37℃(由于甲酰胺会影响Tm值，故使用含有50％甲酰胺的混合溶液进行杂交时的杂交温度为37℃)。
测序完成后，得到在使用混合溶液5的条件下，最终测序得到的待测序列长度均值为270.17bp，待测序列长度中位数为272bp，待测序列相对增加长度为24bp。
同时测量混合溶液5的粘度为4.69mpa.s。
实施例6
混合溶液6配方：5×SSC缓冲液中加入最终体积浓度为0.1％的聚山梨醇酯20、最终体积浓度为50％的甲酰胺和最终质量浓度为7.5％的硫酸葡聚糖钠盐。
配制方法：量取ddH2O 65mL到250mL烧杯中；加入25mL 20×SSC缓冲液；加入7.5g的硫酸葡聚糖钠盐，磁力搅拌混匀；加入50mL甲酰胺；100mL容量瓶定容，转移到125mL试剂瓶中，加入100μL聚山梨醇酯20，混匀。
配制完成后，于混合溶液6中加入4pM E.coli文库，将加入了文库的混合溶液6通入测序仪上的芯片中进行文库与芯片上的探针之间的杂交反应，杂交反应时的杂交温度设置在37℃(由于甲酰胺会影响Tm值，故使用含有50％甲酰胺的混合溶液进行杂交时的杂交温度为37℃)。
测序完成后，得到在使用混合溶液6的条件下，最终测序得到的待测序列长度均值为269.66bp，待测序列长度中位数为271bp，待测序列相对增加长度为23bp。
同时测量混合溶液6的粘度为9.60mpa.s。
实施例7
混合溶液7配方：5×SSC缓冲液中加入最终体积浓度为0.1％的聚山梨醇酯20、最终体积浓度为50％的甲酰胺和最终质量浓度为2％的聚乙二醇6000。
配制方法：量取ddH2O 15mL到250mL烧杯中；加入25mL 20×SSC缓冲液；加入2g的聚乙二醇6000，磁力搅拌混匀；加入50mL甲酰胺；100mL容量瓶定容，转移到125mL试剂瓶中，加入100μL聚山梨醇酯20，混匀。
配制完成后，于混合溶液7中加入4pM E.coli文库，将加入了文库的混合溶液7通入测序仪上的芯片中进行文库与芯片上的探针之间的杂交反应，杂交反应时的杂交温度设置在37℃(由于甲酰胺会影响Tm值，故使用含有50％甲酰胺的混合溶液进行杂交时的杂交温度为37℃)。
测序完成后，得到在使用混合溶液7的条件下，最终测序得到的待测序列长度均值为265.26bp，待测序列长度中位数为266bp，待测序列相对增加长度为18bp。
同时测量混合溶液7的粘度为1.54mpa.s。
将对比例和实施例1-7的测序结果归纳如下表：
由上表的结果可以看到，相对于对比例，实施例1-7的测序结果中待测序列相对增加长度均有所提高，这表明实施例1-7的测序结果中长片段测序文库的占比比对比例的有所提高。
从实施例1-6的测序结果可看出，当使用同时添加一定浓度范围内的增粘剂和变性剂的混合溶液进行测序，对比使用仅添加了相同浓度的增粘剂的混合溶液进行测序的情况，前者的待测序列相对增加长度更大，表明前者杂交捕获的长片段测序文库占比更高，且随着添加的增粘剂浓度的增大，杂交捕获的长片段测序文库占比变大。猜测增粘剂和变性剂在提高杂交中长片段测序文库杂交概率上存在一定的协同作用。但当增粘剂的浓度增大到某个浓度后，便不再对长片段测序文库占比有明显的提高，即增粘剂和变性剂的协同作用存在一定的上限。
从实施例2、3、5和6可看出，在加入了变性剂的基础上，长片段测序文库的杂交比率在增粘剂浓度处于较低水平时就能与增粘剂浓度处于较高水平时基本一致，甚至更高。
从实施例1、4和7的测序结果可看出，当使用的混合溶液中添加了增粘剂和变性剂，所得到的测序结果中长片段测序文库占比比使用仅添加增粘剂的混合溶液的长片段测序文库占比高。增粘剂中同浓度下，硫酸葡聚糖钠盐对长片段测序文库占比提高的效果比聚乙二醇6000较好。
综上所述，增粘剂和变性剂能显著增加长片段测序文库的杂交比率，降低短片段测序文库在测序结果中的占比，从而降低测穿序列的占比，提升数据利用率。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施方式”、“一些实施方式”、“示意性实施方式”、“示例”、“某些示例”、“具体示例”或“实施例”等的描述意指结合所述实施方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施方式或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施方式或示例中以合适的方式结合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施方式，可以理解的是，上述实施方式是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施方式进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于第一核酸片段和第二核酸片段结合，其中，所述第一核酸片段的至少一端含有第一单链末端，所述第二核酸片段含有第二单链末端，且所述第一核酸片段和所述第二核酸片段通过所述第一单链末端和所述第二单链末端结合，
所述试剂盒至少包括第一试剂和第二试剂，且所述试剂盒中的各试剂混合形成的混合溶液的粘度为1-6mpa.s。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一试剂为增粘剂，
任选地，所述增粘剂为多聚体；
任选地，所述增粘剂为硫酸葡聚糖钠盐、硫酸葡聚糖及其衍生物、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000或聚丙烯酸中的至少一种；
任选地，所述增粘剂在所述混合溶液中的质量浓度为0％～7.5％。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述第二试剂为变性剂，
任选地，所述变性剂为酰胺和/或亚砜；
任选地，所述变性剂为为二甲基亚砜、甲酰胺或尿素中的至少一种；
任选地，所述变性剂在所述混合溶液中的体积百分比浓度为0％～50％。
4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括缓冲液和/或表面活性剂，
任选地，所述表面活性剂为聚山梨醇酯20、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯、聚山梨酸酯60、聚山梨醇酯80、十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠或Triton X-100中的至少一种；
任选地，所述表面活性剂在所述混合溶液中的体积百分比浓度为0.1％～1％。
5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括金属离子螯合剂，
任选地，所述金属离子螯合剂为乙二胺四乙酸、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸或二羟乙基甘氨酸中的至少一种。
6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中至少一种试剂分装，或所述试剂盒中的所有试剂混合形成所述混合溶液。
7.权利要求1-6任一项所述的试剂盒在核酸分子杂交中的应用。
8.一种核酸杂交方法，其特征在于，包括：
将第一核酸片段、第二核酸片段和权利要求1-6任一项所述试剂盒中的混合溶液混合，使得所述第一核酸片段和所述第二核酸片段结合，其中，所述第一核酸片段的至少一端含有第一单链末端，所述第二核酸片段含有第二单链末端，且所述第一核酸片段和所述第二核酸片段通过所述第一单链末端和所述第二单链末端结合。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第一核酸片段为DNA双链片段、DNA单链片段或RNA片段。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述第二核酸片段为DNA双链片段、DNA单链片段或RNA片段。
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