CN117947057A - 一种用于预防猪瘟的mRNA纳米脂质体颗粒及其制备、检测方法 - Google Patents

一种用于预防猪瘟的mRNA纳米脂质体颗粒及其制备、检测方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种用于预防猪瘟的mRNA纳米脂质体颗粒及其制备、检测方法，所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框编码囊膜糖蛋白，所述囊膜糖蛋白具有猪瘟病毒的抗原表位。本申请还提供一种DNA分子、一种药物组合物、一种蛋白、一种mRNA药物以及mRNA或药物组合物或蛋白或DNA分子或重组质粒在制备预防猪瘟病的药物中的用途。本申请提供的mRNA，在体内利用自身的原料和翻译机制可以合成囊膜糖蛋白，通过该囊膜糖蛋白可同时刺激机体的体液免疫与细胞免疫，使宿主获得较为持久和坚实的免疫保护。

Description

一种用于预防猪瘟的mRNA纳米脂质体颗粒及其制备、检测 方法
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体涉及一种用于预防猪瘟的mRNA纳米脂质体颗粒及其制备、检测方法。
背景技术
猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fevervirus）引起的猪和野猪的一种高度接触性、高致死性传染病。猪瘟是世界动物卫生组织（World Organisation for Animal Health，WOAH ）规定的须申报的疫病。该病以发病急、持续高热、全身广泛性出血和白细胞减少为主要特征，发病率和死亡率高。
CSFV属于黄病毒科瘟病毒属，是单股正链RNA病毒，基因组大小为12.3kb，由中间的开放阅读框（Opening reading frame，ORF）及两侧的5’和3’非编码区（Untranslatedregions，UTR）构成，其ORF编码3898个氨基酸并形成多聚蛋白前体，随后在宿主细胞和病毒自身特异性蛋白酶的作用下裂解成12个成熟的蛋白，包括4种结构蛋白（C、Erns、E1、E2）和9种非结构蛋白（Npro、p7、NS2-3、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）。在编码的结构蛋白中，C蛋白为衣壳蛋白，具有保护和转录调节作用，Erns和E2蛋白均为囊膜糖蛋白，两者囊括了CSFV的大部分抗原表位，其中E2蛋白是CSFV的主要保护抗原。
发明内容
近年来，随着猪瘟强制免疫的推行和猪瘟C株活疫苗的应用，猪瘟疫情得到有效控制，猪瘟净化已提上日程。由于活疫苗无法实现疫苗免疫与野毒感染的鉴别诊断，本申请开发一种mRNA可以实现疫苗免疫与野毒感染的区分，而且本申请的mRNA在体内利用自身的原料和翻译机制可以合成囊膜糖蛋白，该囊膜糖蛋白可同时刺激机体的体液免疫与细胞免疫，使宿主获得较为持久和坚实的免疫保护。
本申请提供如下技术方案。
1、一种信使核糖核酸(mRNA)，其中，所述mRNA包含开放阅读框(ORF)，所述开放阅读框(ORF)编码囊膜糖蛋白，所述囊膜糖蛋白具有猪瘟病毒（CSFV）的抗原表位。
2、根据项1所述的mRNA，其中，所述囊膜糖蛋白为E2蛋白，
优选所述E2蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列以下位点的一个或多个突变：第27位，第63位，第81位，第134位，第173位和第290位。
3、根据项2所述的mRNA，其中，所述第27位的氨基酸突变为脯氨酸，
所述第63位的氨基酸突变为脯氨酸，
所述第81位的氨基酸突变为脯氨酸，
所述第134位的氨基酸突变为脯氨酸，
所述第173位的氨基酸突变为脯氨酸，
所述第290位的氨基酸突变为脯氨酸。
4、根据项3所述的mRNA，其中，所述E2蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
5、根据项1所述的mRNA，其中，所述RNA还包含5’非编码区(5’UTR)和3’非编码区(3’UTR)。
6、根据项5所述的mRNA，其中，所述RNA中从5’端到3’端依次包括5’端帽子结构、5’非编码区(5’UTR)、开放阅读框(ORF)、3’非编码区(3’UTR)以及多聚腺嘌呤尾(PolyA)。
7、根据项1所述的mRNA，其中，所述mRNA为未修饰或经修饰的；
优选地，所述修饰包括：假尿苷三磷酸修饰或N1-甲基假尿苷三磷酸修饰。
8、一种编码项1~7任一项所述mRNA的DNA分子。
9、一种药物组合物，其中，包括载体以及项1~7任一项所述的mRNA或项8所述的DNA。
10、根据项9所述组合物，其中，所述载体包括病毒载体或非病毒载体；
所述病毒载体选自腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒(Ad)载体、慢病毒(LV)载体或单纯疱疹病毒(HSV)载体；
所述非病毒性载体选自质粒、阳离子脂质体、脂质体纳米颗粒(LNP)、脂质体、聚合物基载体、类病毒颗粒或细胞外囊泡；
优选为脂质体纳米颗粒(LNP)。
11、根据项10所述的组合物，其中，所述载体为脂质体纳米颗粒，所述mRNA与所述脂质体纳米颗粒(LNP)的摩尔比为1:2至1:2，优选为1:5。
12、根据项10所述的组合物，其中，所述脂质体纳米颗粒包含PEG修饰的脂质体、非阳离子脂质体、固醇、可电离的阳离子脂质体或其任何组合；
优选地，所述PEG修饰的脂质是1，2二肉豆蔻酰基-sn-甘油或甲氧基聚乙二醇(PEG2000 DMG)，
所述非阳离子脂质是1 ,2二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，
所述固醇是胆固醇；
所述可电离的阳离子脂质选自化合物SM-102、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）、cpd-18或4-(N,N-二甲基氨基)丁酸（二亚油基）甲酯（DLin-MC3-DMA）中的一种，其中所述化合物SM-102具有如下结构：
化合物SM-102 ；
所述1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）具有如下结构：
；
所述4-(N,N-二甲基氨基)丁酸（二亚油基）甲酯（DLin-MC3-DMA）具有如下结构：
。
13、一种蛋白，其中，所述蛋白包含项1~7任一项所述的mRNA编码得到的氨基酸序列。
14、一种含有项8所述的DNA分子的重组质粒。
15、一种mRNA药物，其中，所述mRNA药物包含项1~7任一项所述的mRNA、项9~12任一项所述的药物组合物、项13所述的蛋白、项8所述的DNA分子或项14所述的重组质粒。
16、一种根据项1~7任一项所述的mRNA，或项9~12任一项所述的药物组合物、或项13任一项所述的蛋白，或项8所述的DNA分子，或项14所述的重组质粒在制备预防猪瘟的药物中的用途。
在本申请提供的mRNA，在体内利用自身的原料和翻译机制可以合成囊膜糖蛋白，通过该囊膜糖蛋白可同时刺激机体的体液免疫与细胞免疫，使宿主获得较为持久和坚实的免疫保护。
附图说明
附图用于更好地理解本申请，不构成对本申请的不当限定。其中：
图1为CSFV E2蛋白氨酸突变位点三维结构示意图；
图2为E2和突变体原核表达的SDS-PAGE结果；
图3为mRNA结构示意图；
图4为 E173P E2 mRNA转染293T细胞24 h 后的免疫印迹结果；M为150 kDa蛋白Marker；
图5 流式细胞术试验验证目的基因序列E173P E2 mRNA和E2 mRNA的表达；
图6为E173P E2 mRNA疫苗分别以10 μg/只和5 μg/只的剂量注射小鼠后首次免疫和二次免疫后的血清E2 ELISA检测结果；
图7为E173P E2 mRNA疫苗分别以10 μg/只和5 μg/只的剂量注射小鼠后二免4个月后的抗体水平结果图。
具体实施方式
以下对本申请的示范性实施例做出说明，其中包括本申请实施例的各种细节以助于理解，应当将它们认为仅仅是示范性的。因此，本领域普通技术人员应当认识到，可以对这里描述的实施例做出各种改变和修改，而不会背离本申请的范围和精神。同样，为了清楚和简明，以下的描述中省略了对公知功能和结构的描述。
本申请提供一种mRNA，所述mRNA包含开放阅读框(ORF)，所述开放阅读框(ORF)编码囊膜糖蛋白，所述囊膜糖蛋白具有猪瘟病毒（CSFV）的抗原表位。
囊膜（envelope）是指病毒外壳包被的由、/>和/>构成的类脂双层膜，也称为包膜。囊膜主要来源于/>膜（磷脂层和/>），但也包含有一些病毒自身的。病毒囊膜的主要功能是帮助病毒进入宿主细胞。
囊膜糖蛋白又称包膜糖蛋白（Glycoprotein, GP），是指由病毒自身编码的、包被在病毒外层的。GP是一种多/>质，在病毒的吸附和穿入/>、致病性、下调宿主细胞表面蛋白质表达和增加病毒装配和出芽过程中起着至关重要的作用；同时包膜糖蛋白是保护性免疫的主要目标，是诱导产生中和抗体的最理想抗原。
信使RNA(mRNA)是编码(至少一种)蛋白质(天然存在、非天然存在或经修饰的氨基酸聚合物)的任何RNA，并且可经翻译以在体外、体内、原位或离体产生所编码的蛋白质。本领域技术人员将了解，除非另有注明，否则本申请中所陈述的核苷酸序列可在代表性DNA序列中列举“T”，但在所述序列代表RNA(例如mRNA)时，“T”将由“U”取代。因此，由本文中的特定序列识别号公开并识别的任何DNA也公开与所述DNA互补的相应RNA(例如mRNA)序列，其中所述DNA序列的每个“T”被“U”取代。
开放阅读框(ORF)是以起始密码子(例如甲硫氨酸(ATG或AUG))开始并以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA，或UAA、UAG或UGA)结束的连续DNA或RNA区段。ORF通常编码蛋白质。
“同一性”是指如通过对两个或两个以上多肽(例如抗原)或多核苷酸(核酸)的序列进行比较以确定序列之间的关系。具体方法是对两个或更多个氨基酸残基或核酸残基串之间的匹配数来确定的序列间的序列相关性程度，其中空位比对(如果存在)通过特定数学模型或计算机程序(例如“算法”)寻址。相关抗原或核酸的同一性可通过已知方法容易地计算。“同一性百分比(%)”在应用于多肽或多核酸序列时被定义为在比对序列并引入空位(必要时)以达到最大同一性百分比后，候选氨基酸或核苷酸序列中与第二序列的氨基酸序列或核苷酸序列中的残基(氨基酸残基或核酸残基)同一的残基的百分比。用于比对的方法和计算机程序是本领域中众所周知的。应理解，同一性取决于对同一性百分比的计算，但其值可因在计算中所引入的空位和罚分而有所不同。
在本申请中，所述囊膜糖蛋白为E2蛋白，所述E2蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列以下位点的一个或多个突变：第27位，第63位，第81位，第134位，第173位和第290位。
SEQ ID NO:1为：RLACKEDYRYALSSTNEIGLLGAGGLTTTWEEYSHDLQLNDGTVKAICVAGSFKVTALNVVSRRYLASLHKGALLTSVTFELLFDGTNPSTEEMGDDFGFGLCPFDTSPVVKGKYNTTLLNGSAFYLVCPIGWTGVIECTAVSPTTLRTEVVKTFRREKPFPHRMDCVTTTVENEDLFYCKLGGNWTCVKGEPVVYTGGQVKQCKWCGFDFNEPDGLPHYPIGKCILANETGYRIVDSTDCNRDGVVISAEGSHECLIGNTTVKVHASDERLGPMPCRPKEIVSSAGPVRKTSCTFNYAKTLKNKYYEPRDSYFQQYMLKGEYQYWFDLDVTDRHSDYFAEFVVLVVVALLGGRYVLWLIVTYIVLTEQLAAG。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第27位的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第63位的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第81位的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第134位的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第173位的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第290位的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第27位和第63位的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第27位和第81位的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第27位和第134位的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第27位和第173位的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第27位和第290位的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第63位和第81位的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第63位和第134位的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第63位和第173位的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第63位和第290位的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第81位和第134位的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第81位和第173位的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第81位和第290位的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第134位和第173位的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第134位和第290位的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第173位和第290位的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第27位、第63位以及第81的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第27位、第63位以及第134的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第27位、第63位以及第173的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第27位、第63位以及第290的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第27位、第81位以及第134的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第27位、第81位以及第173的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第27位、第81位以及第290的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第27位、第134位以及第173的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第27位、第134位以及第290的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第27位、第173位以及第290的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第63位、第81位以及第134的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第63位、第81位以及第173的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第63位、第81位以及第290的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第81位、第134位以及第173的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第81位、第134位以及第290的突变。
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在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第63位、第134位、第173位以及第290的突变。
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在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第27位、第63位、第81位、第134位以及第173的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第27位、第63位、第81位、第134位以及第290的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第27位、第81位、第134位、第173位以及第290的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第63位、第81位、第134位、第173位以及第290的突变。
在一些实施方式中，所述E2蛋白包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有第27位、第63位、第81位、第134位、第173位以及第290的突变。
在本申请中，所述第27位的氨基酸突变为脯氨酸，
所述第63位的氨基酸突变为脯氨酸，所述第81位的氨基酸突变为脯氨酸，所述第134位的氨基酸突变为脯氨酸，所述第173位的氨基酸突变为脯氨酸，所述第290位的氨基酸突变为脯氨酸。
在本申请中，所述E2蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，即具有脯氨酸突变的E2蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。SEQ ID NO:2为相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列在第173位具有突变，且173位的氨基酸突变为脯氨酸。
SEQ ID NO:2为RLACKEDYRYALSSTNEIGLLGAGGLTTTWEEYSHDLQLNDGTVKAICVAGSFKVTALNVVSRRYLASLHKGALLTSVTFELLFDGTNPSTEEMGDDFGFGLCPFDTSPVVKGKYNTTLLNGSAFYLVCPIGWTGVIECTAVSPTTLRTEVVKTFRREKPFPHRMDCVTTTVPNEDLFYCKLGGNWTCVKGEPVVYTGGQVKQCKWCGFDFNEPDGLPHYPIGKCILANETGYRIVDSTDCNRDGVVISAEGSHECLIGNTTVKVHASDERLGPMPCRPKEIVSSAGPVRKTSCTFNYAKTLKNKYYEPRDSYFQQYMLKGEYQYWFDLDVTDRHSDYFAEFVVLVVVALLGGRYVLWLIVTYIVLTEQLAAG。
在本申请中，所述E2蛋白包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，即具有脯氨酸突变的E2蛋白包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。SEQ ID NO:3为相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列在第27位具有突变，且27位的氨基酸突变为脯氨酸。
SEQ ID NO:3为RLACKEDYRYALSSTNEIGLLGAGGLPTTWEEYSHDLQLNDGTVKAICVAGSFKVTALNVVSRRYLASLHKGALLTSVTFELLFDGTNPSTEEMGDDFGFGLCPFDTSPVVKGKYNTTLLNGSAFYLVCPIGWTGVIECTAVSPTTLRTEVVKTFRREKPFPHRMDCVTTTVENEDLFYCKLGGNWTCVKGEPVVYTGGQVKQCKWCGFDFNEPDGLPHYPIGKCILANETGYRIVDSTDCNRDGVVISAEGSHECLIGNTTVKVHASDERLGPMPCRPKEIVSSAGPVRKTSCTFNYAKTLKNKYYEPRDSYFQQYMLKGEYQYWFDLDVTDRHSDYFAEFVVLVVVALLGGRYVLWLIVTYIVLTEQLAAG。
在本申请中，所述E2蛋白包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，即具有脯氨酸突变的E2蛋白包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。SEQ ID NO:4为相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列在第63位具有突变，且63位的氨基酸突变为脯氨酸。
SEQ ID NO:4为RLACKEDYRYALSSTNEIGLLGAGGLTTTWEEYSHDLQLNDGTVKAICVAGSFKVTALNVVSPRYLASLHKGALLTSVTFELLFDGTNPSTEEMGDDFGFGLCPFDTSPVVKGKYNTTLLNGSAFYLVCPIGWTGVIECTAVSPTTLRTEVVKTFRREKPFPHRMDCVTTTVENEDLFYCKLGGNWTCVKGEPVVYTGGQVKQCKWCGFDFNEPDGLPHYPIGKCILANETGYRIVDSTDCNRDGVVISAEGSHECLIGNTTVKVHASDERLGPMPCRPKEIVSSAGPVRKTSCTFNYAKTLKNKYYEPRDSYFQQYMLKGEYQYWFDLDVTDRHSDYFAEFVVLVVVALLGGRYVLWLIVTYIVLTEQLAAG。
在本申请中，所述E2蛋白包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，即具有脯氨酸突变的E2蛋白包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。SEQ ID NO:5为相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列在第81位具有突变，且81位的氨基酸突变为脯氨酸。
SEQ ID NO:5为RLACKEDYRYALSSTNEIGLLGAGGLTTTWEEYSHDLQLNDGTVKAICVAGSFKVTALNVVSRRYLASLHKGALLTSVTFPLLFDGTNPSTEEMGDDFGFGLCPFDTSPVVKGKYNTTLLNGSAFYLVCPIGWTGVIECTAVSPTTLRTEVVKTFRREKPFPHRMDCVTTTVENEDLFYCKLGGNWTCVKGEPVVYTGGQVKQCKWCGFDFNEPDGLPHYPIGKCILANETGYRIVDSTDCNRDGVVISAEGSHECLIGNTTVKVHASDERLGPMPCRPKEIVSSAGPVRKTSCTFNYAKTLKNKYYEPRDSYFQQYMLKGEYQYWFDLDVTDRHSDYFAEFVVLVVVALLGGRYVLWLIVTYIVLTEQLAAG。
在本申请中，所述E2蛋白包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，即具有脯氨酸突变的E2蛋白包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。SEQ ID NO:6为相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列在第134位具有突变，且134位的氨基酸突变为脯氨酸。
SEQ ID NO:6为RLACKEDYRYALSSTNEIGLLGAGGLTTTWEEYSHDLQLNDGTVKAICVAGSFKVTALNVVSRRYLASLHKGALLTSVTFELLFDGTNPSTEEMGDDFGFGLCPFDTSPVVKGKYNTTLLNGSAFYLVCPIGWPGVIECTAVSPTTLRTEVVKTFRREKPFPHRMDCVTTTVENEDLFYCKLGGNWTCVKGEPVVYTGGQVKQCKWCGFDFNEPDGLPHYPIGKCILANETGYRIVDSTDCNRDGVVISAEGSHECLIGNTTVKVHASDERLGPMPCRPKEIVSSAGPVRKTSCTFNYAKTLKNKYYEPRDSYFQQYMLKGEYQYWFDLDVTDRHSDYFAEFVVLVVVALLGGRYVLWLIVTYIVLTEQLAAG。
在本申请中，所述E2蛋白包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，即具有脯氨酸突变的E2蛋白包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。SEQ ID NO:7为相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列在第290位具有突变，且290位的氨基酸突变为脯氨酸。
SEQ ID NO:7为RLACKEDYRYALSSTNEIGLLGAGGLTTTWEEYSHDLQLNDGTVKAICVAGSFKVTALNVVSRRYLASLHKGALLTSVTFELLFDGTNPSTEEMGDDFGFGLCPFDTSPVVKGKYNTTLLNGSAFYLVCPIGWTGVIECTAVSPTTLRTEVVKTFRREKPFPHRMDCVTTTVENEDLFYCKLGGNWTCVKGEPVVYTGGQVKQCKWCGFDFNEPDGLPHYPIGKCILANETGYRIVDSTDCNRDGVVISAEGSHECLIGNTTVKVHASDERLGPMPCRPKEIVSSAGPVPKTSCTFNYAKTLKNKYYEPRDSYFQQYMLKGEYQYWFDLDVTDRHSDYFAEFVVLVVVALLGGRYVLWLIVTYIVLTEQLAAG。
在一个具体实施方式中，所述mRNA包含开放阅读框(ORF)，所述开放阅读框(ORF)编码E2蛋白。
在一个具体实施方式中，所述mRNA包含开放阅读框(ORF)，所述开放阅读框(ORF)编码具有脯氨酸突变的E2蛋白。
在本申请中，所述mRNA还包含5’端帽子结构、5’非编码区(5’UTR)、3’非编码区(3’UTR)以及多聚腺嘌呤尾(PolyA)。
具体地，在所述mRNA中从5’端到3’端依次包括5’端帽子结构、5’非编码区(5’UTR)、开放阅读框(ORF)、3’非编码区(3’UTR)以及多聚腺嘌呤尾(PolyA)。
在一个具体实施方式中，所述mRNA还包括KOZAK，且所述mRNA从5’端到3’端依次包括5’端帽子结构、5’非编码区(5’UTR)、KOZAK、开放阅读框(ORF)、3’非编码区(3’UTR)以及多聚腺嘌呤尾(PolyA)。
KOZAK是位于真核生物mRNA 5'端帽子结构后面的一段核苷酸序列，它可以与翻译起始因子结合而介导含有5’端帽子结构的mRNA翻译起始。对应于原核生物的SD序列。
多聚腺嘌呤尾(PolyA)：是大多数真核生物mRNA 3’末端的尾巴，有助于调节mRNA的稳定性，运输和翻译。
5’UTR和3’UTR两者通常都从基因组DNA转录，并且是成熟前mRNA的元件。成熟mRNA的特征性结构特征(例如5’端帽子结构和多聚腺嘌呤尾(PolyA)通常是在mRNA加工期间添加至经转录(成熟前)的mRNA。
所述5’UTR、3’UTR 序列独立地来源于天然蛋白、人工合成蛋白中的至少一种；优选地，所述天然蛋白包括α-球蛋白、β-球蛋白、热休克蛋白HSP70中的任意一种。
在本申请中，所述KOZAK包含核苷酸序列（GCCACC）。
在本申请中，所述5’非编码区(5’UTR)包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列。
SEQ ID NO:9为GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACCCCGGCGCC。
在本申请中，所述3’非编码区(3’UTR)包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列。
SEQ ID NO:10为GCTGGAGCCTCGGTGGCCTAGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCA。
在本申请中，所述多聚腺嘌呤尾(PolyA)包含SEQ ID NO:11的核苷酸序列。
SEQ ID NO:11为AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。
在本申请中，所述mRNA为未修饰或经修饰的；优选地，所述修饰包括：5-甲基胞苷三磷酸、假尿苷三磷酸修饰或N1-甲基假尿苷三磷酸修饰。
在一些实施方案中，mRNA未经化学修饰，并且包含由腺苷、鸟苷、胞苷和尿苷组成的标准核糖核苷酸。在一些实施方案中，本申请公开的核苷酸和核苷包含标准核苷残基，例如存在于所转录RNA中的那些残基(例如A、G、C或U)。在一些实施方案中，本申请公开的核苷酸和核苷包含标准脱氧核糖核苷，例如存在于DNA中的那些脱氧核糖核苷(例如dA、dG、dC或dT)。
在一些实施方案中，本申请公开的经修饰的天然存在的核苷酸或核苷是如本领域中所通常已知或公认的核苷酸或核苷。此类经修饰的天然存在的核苷酸和核苷的非限制性实例可见于广泛认可的MODOMICS数据库中。
在一些实施方案中，本申请公开的经修饰的非天然存在的核苷酸或核苷是如本领域中所通常已知或公认的核苷酸或核苷。此类经修饰的非天然存在的核苷酸和核苷的非限制性实例可见于如下已公开的美国申请第PCT/US2012/058519号；第PCT/US2013/075177号；第PCT/US2014/058897号；第PCT/US2014/058891号；第PCT/US2014/070413号；第PCT/US2015/36773号；第PCT/US2015/36759号；第PCT/US2015/36771号；或第PCT/IB2017/051367号，所有所述申请均通过引用并入本文。
因此，本申请公开的核酸(例如DNA和RNA，例如mRNA)可包含标准核苷酸和核苷、天然存在的核苷酸和核苷、非天然存在的核苷酸和核苷或其任何组合。
在一些实施方案中，本申请公开的核酸(例如DNA和RNA，例如mRNA)包含各种(一种以上)不同类型的标准和/或经修饰的核苷酸和核苷。
在一些实施方案中，核酸的特定区域含有一个、两个或更多个(任选地不同)类型的标准和/或经修饰的核苷酸和核苷。
在一些实施方案中，相对于包含标准核苷酸和核苷的未经修饰的核酸，引入到细胞或生物体中的经修饰的RNA(例如经修饰的mRNA)分别在所述细胞或生物体中表现出较低程度的降解。
在一些实施方案中，相对于包含标准核苷酸和核苷的未经修饰的核酸，引入到细胞或生物体中的经修饰的RNA(例如经修饰的mRNA)可分别在所述细胞或生物体中表现出炎症反应的降低(例如降低的先天性免疫反应)。
在一些实施方案中，核酸(例如RNA，例如mRNA)包含非天然修饰的核苷酸，其是在核酸的合成期间或合成后引入，以实现所需功能或性质。所述修饰可存在于核苷酸间键联、嘌呤或嘧啶碱基或糖上。修饰可利用化学合成或利用聚合酶在链末端或链中的任何其他位置处引入。核酸中的任何区域都可经化学修饰。
本申请公开提供了核酸(例如RNA，例如mRNA)的经修饰的核苷和核苷酸。“核苷”是指含有糖分子(例如戊糖或核糖)或其衍生物与有机碱基(例如嘌呤或嘧啶)或其衍生物(在本文中也称为“核碱基”)的组合的化合物。“核苷酸”是指包括磷酸基的核苷。经修饰的核苷酸可通过任何可用方法(例如化学、酶促或重组地)来合成，以包括一个或多个经修饰或非天然的核苷。核酸可包含一个或多个连接的核苷区域。此类区域可具有可变的主链键联。所述键联可为标准磷酸二酯键联，在这种情况下，核酸将包含核苷酸区域。经修饰的核苷酸碱基配对不仅涵盖标准腺苷-胸腺嘧啶、腺苷-尿嘧啶或鸟苷-胞嘧啶碱基对，并且还涵盖在核苷酸和/或包含非标准或经修饰碱基的经修饰核苷酸之间形成的碱基对，其中氢键供体和氢键受体的排列允许在非标准碱基与标准碱基之间或在两个互补非标准碱基结构之间(例如在具有至少一个化学修饰的那些核酸中)形成氢键。这种非标准碱基配对的一个实例是在经修饰的核苷酸肌苷与腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之间的碱基配对。碱基/糖或接头的任何组合可并入到本公开的核酸中。
在一些实施方案中，mRNA统一经修饰(例如完全修饰、贯穿整个序列中修饰)以获得特定修饰。例如，核酸可统一经1-甲基-假尿苷修饰，这意味着mRNA序列中的所有尿苷残基均用1-甲基-假尿苷代替。类似地，可针对序列中所存在的任何类型的核苷残基对核酸进行统一修饰，其是通过用经修饰的残基(例如上文所陈述的那些残基)进行代替来实施。
本申请公开的核酸可沿着整个分子长度部分或完全地修饰。例如，在本公开的核酸中或在其预定序列区域中(例如在包括或不包括多聚(A)尾的mRNA中)，一个或多个或全部或给定类型的核苷酸(例如嘌呤或嘧啶，或A、G、U、C中的任何一者或多者或全部)可统一经修饰。
在一些实施方案中，本申请公开的核酸中(或其序列区域中)的所有核苷酸X都是经修饰的核苷酸，其中X可为核苷酸A、G、U、C中的任一者，或组合A+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U+C或A+G+C中的任一者。
核酸可含有约1%至约100%的经修饰核苷酸(相对于总核苷酸含量，或相对于一种或多种类型的核苷酸，即A、G、U或C中的任何一者或多者)或任何中间百分比 (例如1%至20%、1%至25%、1%至50%、1%至60%、1%至70%、1%至80%、1%至90%、1%至95%、10%至20%、10%至25%、10%至50%、10%至60%、10%至70%、10%至80%、10%至90%、10%至95%、10%至100%、20%至25%、20%至50%、20%至60%、20%至70%、20%至80%、20%至90%、20%至95%、20%至100%、50%至60%、50%至70%、50%至80%、50%至90%、50%至95%、50%至100%、70%至80%、70%至90%、70%至95%、70%至100%、80%至90%、80%至95%、80%至100%、90%至95%、90%至100%和95%至100%)。任何剩余的百分比是由存在未经修饰的A、G、U或C引起。
mRNA可含有最少1%且最多100%的经修饰核苷酸，或任何中间百分比，例如至少5%的经修饰核苷酸、至少10%的经修饰核苷酸、至少25%的经修饰核苷酸、至少50%的经修饰核苷酸、至少80%的经修饰核苷酸或至少90%的经修饰核苷酸。例如，核酸可含有经修饰的嘧啶，例如经修饰的尿嘧啶或胞嘧啶。
在一些实施方案中，核酸中至少5%、至少10%、至少25%、至少50%、至少80%、至少90%或100%的尿嘧啶由经修饰的尿嘧啶(例如5-取代的尿嘧啶)代替。经修饰的尿嘧啶可由具有单一独特结构的化合物代替，或者可由多种具有不同结构(例如2、3、4或更多种独特结构)的化合物代替。
在一些实施方案中，核酸中至少5%、至少10%、至少25%、至少50%、至少80%、至少90%或100%的胞嘧啶由经修饰的胞嘧啶(例如5-取代的胞嘧啶)代替。经修饰的胞嘧啶可由具有单一独特结构的化合物代替。
本申请提供一种编码前述mRNA的DNA分子。
本申请提供一种药物组合物，其中，包括载体以及前述的mRNA或前述的DNA。
所述载体为所述载体包括病毒载体或非病毒载体；
病毒递送系统的优点是递送效率高，持续时间长，但缺点是安全性差，可能引起免疫反应或致癌。非病毒递送系统的优点是安全性好，可调控性强，但缺点是递送效率低，持续时间短。
所述病毒载体选自腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒(Ad)载体、慢病毒(LV)载体或单纯疱疹病毒(HSV)载体；包括但不限于此。
所述AAV载体包括AAV1载体、AAV2载体、AAV5载体、AAV6载体、AAV8载体、AAV9载体、AAVrh10载体中的一种或多种。AVV根据血清型的不同可分为AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9和AAVrh10。
所述非病毒性载体选自质粒、阳离子脂质、脂质体纳米颗粒(LNP)、脂质体、聚合物基载体、类病毒颗粒或细胞外囊泡。优选脂质体纳米颗粒(LNP)。
当所述药物组合物中，包括前述的mRNA时，所述载体为脂质体纳米颗粒(LNP)。
在一些实施方式中，所述药物组合物包括腺相关病毒(AAV)载体和DNA，所述DNA包含开放阅读框(ORF)，所述开放阅读框(ORF)编码囊膜糖蛋白。
在一些实施方式中，所述药物组合物包括脂质体纳米颗粒和mRNA，所述mRNA包含开放阅读框(ORF)，所述开放阅读框(ORF)编码E2蛋白。
在一些实施方式中，所述药物组合物包括脂质体纳米颗粒和mRNA，所述mRNA包含开放阅读框(ORF)，所述开放阅读框(ORF)编码具有脯氨酸突变的E2蛋白。
mRNA不稳定，自身携带负电荷，而细胞膜表面也带有负电荷，静电排斥使得mRNA分子难以穿过细胞膜进入细胞内，所以需要特殊的修饰或包裹递送系统才能实现mRNA的胞内表达。脂质体纳米颗粒(lipid nanoparticle，LNP)因递送效率高和安全性好，成为目前最热门的递送技术。因此，将mRNA包裹在脂质体纳米颗粒内制备成组合物。
具体地，所述载体为脂质体纳米颗粒，所述mRNA与所述脂质体纳米颗粒(LNP)的质量比为1:2至1:20，优选为1:5，例如可以为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19或1:20。
具体地，所述脂质体纳米颗粒包含PEG修饰的脂质、非阳离子脂质、固醇、可电离的阳离子脂质或其任何组合。例如：可电离脂质(DLin-MC3-DMA)：胆固醇：辅助脂质(DSPC)：聚乙二醇50:38.5:10:1.5。
具体地，所述PEG修饰的脂质是1，2二肉豆蔻酰基-sn-甘油或甲氧基聚乙二醇(PEG2000 DMG)，所述非阳离子脂质是1 ,2二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，所述固醇是胆固醇；并且所述可电离的阳离子脂质选自化合物SM-102、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）、cpd-18或4-(N,N-二甲基氨基)丁酸（二亚油基）甲酯（DLin-MC3-DMA）中的一种，其中所述化合物SM-102具有如下结构：
化合物SM-102；
所述1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）具有如下结构：
；
所述4-(N,N-二甲基氨基)丁酸（二亚油基）甲酯（DLin-MC3-DMA）具有如下结构：
。
本申请还提供一种mRNA的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：构建包含有目的基因ORF的载体；
在所述载体上，所述CMV启动子、T7 启动子、非编码区5’UTR、目的基因ORF、非编码区3’UTR、polyA尾巴以及紧邻其后的线性化位点依次排布。
步骤二：将构建完成的载体进行扩增；
步骤三：将扩增后得到的载体进行转录和纯化，从而得到mRNA；
步骤四：所述目的基因编码囊膜糖蛋白。
CMV启动子是人们从人巨细胞病毒(Cytomegalovirus, CMV)中发现的强启动子，被广泛应用于构建高效真核表达载体。
T7 启动子是来自于T7噬菌体的能够对T7RNA聚合酶有特异性反应的强启动子，是启动T7噬菌体基因转录的一段序列。T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个启动子是原核表达的首选。 T7启动子专一受控于 T7 RNA 聚合酶，而高活性的 T7 RNA 聚合酶合成 mRNA 的速度比大肠杆菌 RNA 聚合酶快5倍，当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过 T7 表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白。
非编码区5’UTR是指位于起始密码子(即由核糖体翻译的mRNA转录本的第一个密码子)正上游(即5′)的不编码多肽的mRNA区域。当产生RNA转录本时，5’UTR可包含启动子序列。此类启动子序列是本领域中已知的。
非编码区3’UTR是指位于终止密码子(即mRNA转录本中发出终止翻译信号的密码子)正下游(即3′)的不编码多肽的mRNA区域。
Poly(A)是大多数真核生物mRNA 3’末端的尾巴，有助于调节mRNA的稳定性，运输和翻译。
线性化位点是Xhol/XbaI酶切位点，Xhol/XbaI限制性内切酶识别载体中5' C^TCGAG 3'/5' T^CTAGA 3'序列，以产生线性化的DNA作为体外转录的模板。
本申请提供一种蛋白，所述蛋白包含前述的mRNA 编码得到的氨基酸序列。
本申请还提供一种前述mRNA的DNA分子。
本申请还提供一种前述DNA分子的重组质粒。
本申请还提供一种前述的mRNA，或前的述蛋白，或前述的DNA分子，或前述的重组质粒在制备预防疫病的药物中或在预防疫病中的用途。所述疫病为猪瘟。
本申请提供一种预防疫病的方法，其包括，向有此需要的受试动物给药前述mRNA，或前述蛋白，或前述DNA分子，或前述重组质粒。
所述疫病为猪瘟。所述受试者为猪。
本申请提供一种药物制剂，其为用于预防例如猪感染猪瘟的组合物(例如药物组合物)、方法、试剂盒和试剂。本文所提供的组合物可用作预防剂。其可用于药物中以预防猪瘟。
在一些实施方案中，可将含有如申请所阐述的mRNA的药物制剂施用给受试者(例如哺乳动物受试者，例如猪，并且mRNA多核苷酸在体内翻译以产生囊膜糖蛋白，其用作抗原，通过该囊膜糖蛋白可同时刺激机体的体液免疫与细胞免疫，使宿主获得较为持久和坚实的免疫保护。
药物或组合物(例如包含RNA)的“有效量”至少部分地基于靶组织、靶细胞类型、施用方式、RNA的物理特征(例如长度、核苷酸组成和/或经修饰核苷的程度)、药物的其他组分和其他决定因素，例如受试者的年龄、体重、身高、性别和一般健康状况。通常，有效量的组合物提供经诱导或加强的免疫反应，其随受试者细胞中的囊膜糖蛋白的产生而变化。
在一些实施方案中，有效量的含有具有至少一个化学修饰的RNA多核苷酸的组合物比含有编码相同囊膜糖蛋白相应未经修饰的多核苷酸的组合物更有效。增加的囊膜糖蛋白产生可通过以下来证明：细胞转染增加(经RNA转染的细胞百分比)、从多核苷酸的蛋白质翻译和/或表达增加。
术语“药物组合物”是指活性剂与惰性或活性载体的组合，使得组合物尤其适于体内或离体的诊断性或预防性用途。“药学上可接受的载体”在施用于受试者后或施用给受试者时不会引起不希望的生理学效应。药物组合物中的载体也必须在与活性成分相容并且可能够使其稳定的意义上为“可接受的”。可利用一种或多种增溶剂作为用于递送活性剂的药物载体。药学上可接受的载体的实例包括(但不限于)生物相容性媒介物、佐剂、添加剂和稀释剂，以实现可用作剂型的组合物。其他载体的实例包括胶体氧化硅、硬脂酸镁、纤维素和月桂基硫酸钠。其他适宜药物载体和稀释剂以及使用其的药物必需品阐述于Remington'sPharmaceutical Sciences中。
在一些实施方案中，本申请公开的组合物(包含多核苷酸和其编码的囊膜糖蛋白)可用于预防猪瘟。组合物可作为主动免疫方案的一部分预防性地施用给健康猪只。
在一些实施方案中，向细胞、组织或受试者提供的RNA量可为有效用于免疫预防的量。
组合物可与其他预防性或治疗性化合物一起施用。作为非限制性实例，预防性或治疗性化合物可为佐剂或第二活性成分。本申请的药剂或组合物的初始施用与施用其他预防性组合物之间的施用时间可为(但不限于)1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年、35年、40年、45年、50年、55年、60年、65年、70年、75年、80年、85年、90年、95年或99年以上。在示例性实施方案中，本申请的组合物的初始施用与其他预防性或治疗性化合物之间的施用时间可为(但不限于)1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月或1年。
本申请提供了药物组合物，其包括mRNA和/或任选地与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的复合物。
mRNA可单独或与一种或多种其他组分联合配制或施用。例如，免疫组合物可包含其他组分，包括(但不限于)佐剂。
在一些实施方案中，免疫组合物不包括佐剂(其不含佐剂)。mRNA可与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合配制或施用。
在一些实施方案中，本申请的药物或组合物包含至少一种额外活性物质，例如治疗活性物质、预防活性物质或二者的组合。
本文所阐述药物或药物组合物的制剂可通过药理学领域中已知或以后开发的任何方法来制备。一般来说，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分(例如mRNA多核苷酸)与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分缔合，然后在必要时和/或需要时，将产品分割、成型和/或包装成期望的单剂量或多剂量单元。
根据本申请公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何其他成分的相对量将取决于受试者的身份、体型和/或疾患并且进一步取决于待施用组合物的途径而变化。举例来说，组合物可包含介于0 .1％与100％之间、例如介于0.5％与50％之间、介于1％至30％之间、介于5％至80％之间、至少80％(w/w)的活性成分。
在一些实施方案中，使用一种或多种赋形剂配制mRNA，以：(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染；(3)允许持续或延迟释放(例如来自储积制剂)；(4)改变生物分布(例如靶向至特定组织或细胞类型)；(5)增加所编码囊膜糖蛋白在体内的翻译；和/或(6)改变所编码囊膜糖蛋白在体内的释放曲线。除传统赋形剂如任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠或乳化剂、防腐剂以外，赋形剂还可包括(但不限于)类脂质、脂质粒、脂质体纳米颗粒、聚合物、脂质复合物(lipoplex)、核-壳纳米颗粒、肽、蛋白质、经RNA转染的细胞(例如用于移植至受试者中)、玻尿酸酶、纳米颗粒模拟物和它们的组合。
在一些实施方案中，本申请的组合物用于提供针对猪瘟的预防性保护。
在一些实施方案中，本申请的组合物用于启动对受试者体内抗体糖链结构的修饰。受试者为猪。
在一些实施方案中，将本申请的药物以有效量施用给受试者(例如哺乳动物受试者)，使编码囊膜糖蛋白(E2蛋白或为具有脯氨酸突变的E2蛋白)的mRNA在体内表达并翻译以产生囊膜糖蛋白，其随后对受试者体内抗体糖链结构进行修饰。
本申请还提供了在受试者中预防猪瘟的方法，其是通过向所述受试者施用具有编码囊膜糖蛋白的开放阅读框的RNA来实施，其中所述RNA不包括稳定化元件，并且其中佐剂不与mRNA制剂或含有mRNA的药物组合物共配制或共施用。mRNA制剂或含有mRNA的药物组合物可通过产生预防有效结果的任何途径来施用。这些途径包括(但不限于)真皮内、肌内、鼻内和/或皮下施用。本申请公开提供了包括向有需要的受试者施用mRNA制剂或含有mRNA的药物组合物的方法。所需的确切量将因受试者而异，这取决于受试者的物种、年龄和一般状况、疾病的严重程度、特定组合物、其施用模式、其活性模式等。通常以剂量单位形式配制RNA以便于施用和统一剂量。然而，应理解，RNA的总日用量可由兽医在合理的医学判断范围内决定。用于任何特定动物的具体预防有效或适当成像剂量水平将取决于多种因素，包括所预防的病症和病症的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合物；动物的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体化合物的施用时间、施用途径和排泄速率；与所采用的具体化合物组合或同时使用的药物；和医学领域中众所周知的类似因素。
如本申请所提供的mRNA的有效量可低至5μg，例如作为单一剂量或作为两个2.5μg剂量施用。
在一些实施方案中，有效量为5μg-300μg或25μg-300μg的总剂量。例如，有效量可为5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、11μg、12μg、13μg、14μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg、55μg、60μg、65μg、70μg、75μg、80μg、85μg、90μg、95μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg、150μg、160μg、170μg、180μg、190μg、200μg、250μg或300μg的总剂量。
在一些实施方案中，有效量为5μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为20μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为75μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为150μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为300μg的总剂量。
可将本申请所阐述的mRNA配制成本申请所阐述的剂型，例如可注射的(例如静脉内、肌内、真皮内、心内、腹膜内和皮下)。
“预防”在本文中定义为向受试者应用或施用本申请的mRNA，或施用包含本申请的所述mRNA的药物组合物。
实施例
本申请在实施例中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，%表示wt%，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1 CSFV E2及突变体重组质粒的构建和表达纯化
通过NCBI 下载CSFV石门株并获取相应免疫原性E2蛋白的DNA序列（例如E2蛋白的DNA序列为SEQ ID NO:8为cggctagcctgcaaggaagattacaggtacgcaatatcatcaaccaatgagatagggccactcggggccggtggtcttactaccacctggaaagaatacagccacgatttgcaactgtatgacgggaccgttaaggccatttgcgtggcaggttcctttaaagtcacagcacttaatgtggtcagcaggaggtatttggcatcattgcataagggggctttactcacttccgtgacattcgagctcctgttcgacgggaccaacccatcaaccgaagaaatgggagatgacttcgggttcgggctgtgcccgtttgatacgagtcctgttgtcaagggaaagtacaatacaaccttgttgaacggtagtgctttctatcttgtctgcccaatagggtggacgggtgttatagagtgcacagcagtgagcccaacaactctgagaacagaagtggtaaagaccttcaggagagagaagccttttccacacagaatggattgtgtgaccaccacagtggaaaatgaagatctattctactgtaagttggggggcaactggacgtgtgtgaaaggtgaaccagtggtctacacaggggggcaagtaaaacaatgcaaatggtgtggcttcgacttcaacgagcctgacggactcccacactaccccataggcaagtgcattttggcaaatgagacaggttacagaatagtagattcaacggactgtaacagagatggcgttgtaatcagcgcagaggggagtcatgagtgcttgatcggcaacacaactgtcaaggtgcatgcatcagatgaaagactgggccctatgccatgcagacctaaagagattgtctctagtgcaggacctgtaaggaaaacttcctgtacattcaactacgcaaaaactttgaagaacaagtactatgagcccagggacagctacttccagcaatatatgctcaagggcgagtatcagtactggtttgacctggacgtgacagaccgccactcagattacttcgcagaatttgttgtcttggtggtggtagcactgttaggaggaagatatgtcctgtggctgatagtgacctacatagttctaacagaacaactcgccgctggt），发明人通过三维结构分析对E2蛋白在α-螺旋和β-转角位点进行单点脯氨酸突变，分别构建6株E2突变体，分别为T27P，R63P，E81P，T134P，E173P和R290P。合成后分别连接至PET-28a载体构建重组质粒，按照1:100的比例转接于含卡那霉素（100µg/mL）的LB液体培养基中，37℃培养至OD600nm值为0.6~0.8，取1ml菌液作为诱导前对照，剩余菌液中加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，置16℃，220 rpm/min继续诱导16小时，将诱导后的菌液在4℃，12000rpm/min条件下离心5分钟，弃去上清，菌体沉淀用等体积PBS（0.01 mol/L，pH值7.4）重复洗涤两次，最后一次菌体沉淀用1/10体积超声破菌缓冲液重悬，冰上超声30分钟裂解菌体，破碎后的匀浆在4℃条件下，以12000rpm/min离心5分钟，收集上清，沉淀用1/10体积PBS（0.01mol/L，pH值7.4）重悬。最后使用镍柱纯化洗脱不同目的蛋白，进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色及脱色，进行表达鉴定。结果如图2所示，使用纯化回收的1μg E2蛋白及突变蛋白进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色及脱色。结果表明，E2和突变体PET-28a菌株经IPTG诱导后成功表达特异性蛋白，大小约为55kDa, 其中E173P E2的蛋白表达量最高。
实施例2 E2 突变体mRNA的制备和表达鉴定
根据猪体内表达的密码子偏好性，利用GeneSmart对E173P E2序列进行密码子优化。此外，为了提高RNA的稳定性，在核酸的5’端引入5’-帽结构、5’UTR（5’UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO:9）和KOZAK序列（KOZAK的核苷酸序列如SEQ ID NO:12）；在核酸3’端引入3’UTR（3’UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO:10）和polyA尾（polyA尾的核苷酸如SEQ ID NO:11）。本申请同时引入了T7启动子序列以便进行体外转录操作。在目的序列两端引入Hind Ⅲ 和EcoR Ⅰ酶切位点，连接pUC载体构建质粒。使用核酸内切酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ 将pUC-GW-Kana和合成的序列进行酶切，然后将目的序列连接到载体上，挑取菌斑进行测序，然后对序列正确的阳性质粒在大肠杆菌进行扩大和保存。用内切酶Hind Ⅲ 和EcoR Ⅰ对重组质粒酶切处理，胶回收得到线性化DNA片段，通过T7 RNA聚合酶体外转录获得mRNA。然后通过牛痘病毒加帽系统对mRNA进行加帽，最后通过寡聚dT-纤维素液相离心法纯化mRNA。将293T细胞分别铺至6孔板，待其密度达到85%~90%时，使用lipofectamine3000试剂盒将获得的mRNA转染至细胞内。转染24 h后，其中一份细胞收集细胞沉淀制备蛋白样品，样品经SDS-PAGE电泳分离后，转印至PVDF膜后进行Western blot鉴定是否有条带。结果如图4所示，将E173P E2mRNA使用lipofectamine3000转染293T细胞24 h后经SDS-PAGE电泳，用Western blot方法进行鉴定，结果表明E173P E2 mRNA转染细胞后出现特异性的条带大小均约55 kDa和110kDa的二聚体两条带，符合结果预期。
实施例3 猪瘟E173P E2 mRNA疫苗的制备
首先用乙醇溶解化合物cpd18（25 mg/mL）、DSPC（15 mg/mL）、胆固醇（12.5 mg/mL）和DMG-PEG2000（15 mg/mL），按照50 : 10 : 38.5 : 1.5的摩尔比将脂质混合，混匀制备LNP。同时，LNP和mRNA的摩尔比N：P设置不同摩尔比例（20:1、10:1、5:1、2:1），按照上述比例分别计算出E173P E2 mRNA的量，将E173P E2 mRNA与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（50 mM）混合，将混匀的有机相加入无机相中。然后，使用孔径为100kDa 的超滤管进行超滤以去除酒精。使用Malvern Zetasizer Pro纳米粒径电位分析仪对不同N：P包裹得到的LNP-mRNA进行纳米粒径和Zeta电位分析。利用Ribogreen先测定游离在LNP-mRNA之外的E173P E2 mRNA含量，再利用Triton裂解LNP-mRNA脂质体结果，测得总E173P E2 mRNA含量，从而计算出LNP-mRNA的包裹效率，结果如表1所示，不同N:P比例下制备得到的mRNA疫苗的纳米粒径、Zeta电位和包裹效率有明显差别。其中最适比例为5:1，此条件下制备的mRNA疫苗平均纳米粒径为110.2nm，平均Zeta电位为+20.29 mV，平均包裹效率达到94.18%以上。
表1
。
实施例4 流式细胞术试验验证猪瘟E173P E2 mRNA和E2 mRNA的表达
参考实施例3所述方法，采用N:P摩尔比为5:1获得的LNP分别包裹E173P E2 mRNA和E2 mRNA，并转染至293T细胞，5% CO2环境下37 ℃培养15 h。弃去培养液，用PBS润洗细胞两次，加入1 mL 细胞解离液，37 ℃孵育1-5 min，收集细胞。500 g离心5 min，弃去上清后用染色缓冲液润洗两次。使用100 μL固定液重悬细胞，室温固定30 min，加入1 mL破膜液重悬细胞，500 g离心5 min，弃去上清后用染色缓冲液润洗两次。然后使用100 μL破膜液以1:1000稀释猪瘟E2鼠单抗，重悬细胞，室温孵育1 h，加入染色缓冲液润洗两次，用100 μL PBS以1:2000稀释FITC标记山羊抗鼠二抗，重悬细胞，室温孵育30 min，加入染色缓冲液润洗两次，400目细胞筛过滤细胞，对细胞进行计数。最后，500 g离心5 min，弃去上清后用染色缓冲液重悬细胞，将细胞稀释到合适密度，用流式细胞检测阳性细胞个数。流式细胞术结果如图5所示，LNP包裹E173P E2 mRNA转染293T细胞后的表达量为88.9%, 而LNP包裹E2 mRNA转染293T细胞后的表达量为49.2%。
实施例5 猪瘟E173P E2 mRNA疫苗小鼠免疫试验
随机将18只Balb/c小鼠分为三组，其中一组为阴性对照组，注射没有包裹mRNA的LNP（采用实施例3中的LNP）。另外两组为实验组，注射包裹E173P E2-mRNA的LNP（采用实施例3中的LNP，并且N:P摩尔比为5:1），免疫剂量分别为10 μg/只和5 μg/只。在第0周和第3周后以肌肉注射的方式对小鼠进行免疫，每次注射后两周采集小鼠血清，并记录体重、精神、食欲等临床变化，使用于ELISA试验检测抗体水平。如图6所示，本申请获得的E173P突变 E2mRNA疫苗以10 μg/只和5 μg/只的剂量注射小鼠体内均能使小鼠产生E2抗体，并且二免产生的抗体效价均高于一免产生的抗体。其中一免后注射剂量为10 μg/只的小鼠产生的抗体滴度明显高于5 μg/只，而二免后产生的抗体滴度差异不大。同时，如图7所示，二免后抗体能持续四个月以上。
实施例6 猪瘟E173P E2 mRNA疫苗免疫攻毒试验
随机将8只猪分为两组，其中一组为空白对照组。另1组为实验组，注射包裹E173PE2 mRNA的LNP（采用实施例3中的LNP，并且N:P的摩尔比为5:1），免疫剂量为10μg/只，在第0周和第3周后以肌肉注射的方式对猪进行免疫，免疫后每周采血，无菌分离血清，免疫后第7周以肌肉注射的方式对猪进行猪瘟强毒株石门株的攻毒，攻毒剂量为10MLD，攻毒后测定猪只体温，记录精神、食欲等临床变化，测定试验猪的血清效价，攻毒后的体温变化及猪只存活情况。本申请制备mRNA疫苗免疫仔猪后21天即可产生保护性抗体（阻断率>40%），二免后抗体阻断率可达近80%以上，抗体阳性率在实验结束前一直保持较高水平（70%~90%）。首免后42天对仔猪肌注猪瘟强毒石门株，实验组未出现明显的临床症状，体温升高不明显，采食、精神、活动等各方面表现正常，全部存活，而对照组在攻毒9天内出现典型的猪瘟临床症状，发烧、厌食、精神沉郁，发病并死亡。
尽管以上结合附图对本申请的实施方案进行了描述，但本申请并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本申请权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本申请保护之列。

Claims (11)

1.一种mRNA，其中，所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框编码囊膜糖蛋白，所述囊膜糖蛋白具有猪瘟病毒的抗原表位；
所述囊膜糖蛋白为E2蛋白，
所述E2蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列以下位点的一个或多个突变：第27位，第63位，第81位，第134位，第173位和第290位。
2.根据权利要求1所述的mRNA，其中，所述第27位的氨基酸突变为脯氨酸，
所述第63位的氨基酸突变为脯氨酸，
所述第81位的氨基酸突变为脯氨酸，
所述第134位的氨基酸突变为脯氨酸，
所述第173位的氨基酸突变为脯氨酸，
所述第290位的氨基酸突变为脯氨酸。
3.根据权利要求2所述的mRNA，其中，所述E2蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的mRNA，其中，所述RNA中从5’端到3’端依次包括5’端帽子结构、5’非编码区、开放阅读框、3’非编码区以及多聚腺嘌呤尾；或者
所述mRNA为未修饰或经修饰的；
所述修饰包括：假尿苷三磷酸修饰或N1-甲基假尿苷三磷酸修饰。
5.一种编码权利要求1~4任一项所述mRNA的DNA分子。
6.一种药物组合物，其中，包括载体以及权利要求1~4任一项所述的mRNA或权利要求5所述的DNA。
7.根据权利要求6所述组合物，其中，所述载体包括病毒载体或非病毒载体；
所述病毒载体选自腺相关病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体或单纯疱疹病毒载体；
所述非病毒性载体选自质粒、阳离子脂质、脂质体纳米颗粒、脂质体、聚合物基载体、类病毒颗粒或细胞外囊泡。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中，所述载体为脂质体纳米颗粒，所述mRNA与所述脂质体纳米颗粒的摩尔比为1:2至1:2；或
所述脂质体纳米颗粒包含PEG修饰的脂质体、非阳离子脂质体、固醇、可电离的阳离子脂质体或其任何组合；
所述PEG修饰的脂质体是1，2二肉豆蔻酰基-sn-甘油或甲氧基聚乙二醇PEG2000 DMG，
所述非阳离子脂质体是1 ,2二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱DSPC，
所述固醇是胆固醇；
所述可电离的阳离子脂质体选自化合物SM-102、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷DOTAP、cpd-18或4-(N,N-二甲基氨基)丁酸（二亚油基）甲酯DLin-MC3-DMA中的一种，其中所述化合物SM-102具有如下结构： 化合物SM-102 ；
所述1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷DOTAP具有如下结构：
；
所述4-(N,N-二甲基氨基)丁酸（二亚油基）甲酯DLin-MC3-DMA具有如下结构：
。
9.一种蛋白，其中，所述蛋白包含权利要求1~4任一项所述的mRNA编码得到的氨基酸序列。
10.一种mRNA药物，其中，所述mRNA药物包含权利要求1~4任一项所述的mRNA、权利要求6~8任一项所述的药物组合物、权利要求9所述的蛋白、权利要求5所述的DNA分子。
11.一种根据权利要求1~4任一项所述的mRNA，或权利要求6~8任一项所述的药物组合物、或权利要求9任一项所述的蛋白，或权利要求5所述的DNA分子在制备预防猪瘟病的药物中的用途。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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