CN117940584A - 用于评估免疫疗法的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及癌症治疗的诊断和患者分层领域。具体地，它涉及一种用于评估有需要的受试者中与免疫疗法相关的治疗应答的方法，其包括以下步骤：确定需要免疫疗法的受试者的样品中或在包含需要免疫疗法的受试者的成像数据的数据集中表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)PD‑1阳性(+)T细胞或其CD8+T细胞前体，和基于表现出活化或耗竭特征的所述肝脏自身侵袭性CD8+PD‑1+T细胞或其CD8+T细胞前体的存在、不存在或丰度，评估与免疫疗法相关的治疗应答。进一步设想了一种用于对受试者建议免疫疗法的方法或用于通过免疫疗法治疗受试者的方法。本发明还提供了一种用于执行本发明的方法的诊断装置。

Description

用于评估免疫疗法的装置和方法
本发明涉及癌症治疗的诊断和患者分层领域。具体地，它涉及一种用于评估有需要的受试者中与免疫疗法相关的治疗应答的方法，其包括以下步骤：确定需要免疫疗法的受试者的样品中或在包含需要免疫疗法的受试者的成像数据的数据集中表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)PD-1阳性(+)T细胞或其CD8+T细胞前体，和基于表现出活化或耗竭特征的所述肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞或其CD8+T细胞前体的存在、不存在或丰度，评估与免疫疗法相关的治疗应答。进一步设想了一种用于对受试者建议免疫疗法的方法或用于通过免疫疗法治疗受试者的方法。本发明还提供了一种用于执行本发明方法的诊断装置。
潜在治愈性肝细胞癌(HCC)治疗方案(例如肝移植、肿瘤切除或消融)仅限于早期肿瘤(Llovet 2021；Galle 2018)。多激酶抑制剂或抗VEGF-R2抗体已被批准用于晚期HCC免疫疗法，其被认为可以活化T细胞或重新恢复针对癌症的免疫监视，显示缓解率为21-26％(Duffy 2016,Sangro 2013)。
纳武利尤单抗和帕博利珠单抗(PD1定向抗体)被批准用于HCC治疗(Zhu 2018,El-Khoueiry 2017)，尽管III期试验未能达到提高生存率的主要终点。在一项III期试验中，阿替利珠单抗(抗PD-L1)/贝伐珠单抗(抗VEGF)联合用药证明可提高总体/无进展生存期，使其成为晚期HCC的一线治疗药物(Finn 2020)。
影响免疫疗法疗效的一个问题可能是不同潜在HCC病因的影响，不同的肝脏环境通过不同的机制驱动HCC诱导和免疫应答的局部调节(Roderburg 2020)。
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是具有大流行规模的HCC病因，影响全球＞2亿人(Anstee 2019)，并有进一步强劲增长的趋势。约10-20％的NAFLD个体从脂肪变性随时间进展成NASH。先天性和适应性免疫细胞活化与代谢物和内质网应激增加相结合(Wolf 2014,Ma 2016,Malehmir2019,Nakagawa 2014)被认为导致肝脏坏死性炎症和再生循环，从而可能导致HCC(Ringelhan 2018,Michelotti 2013,Friedman 2018)。NASH已成为新兴的HCC风险因素。
因此，需要对患有病因不明的HCC患者进行免疫疗法获益分层。
本发明的技术问题可以被视为提供用于满足前述需要的装置和方法。该技术问题通过权利要求和下文中所表征的实施方案来解决。
因此，本发明涉及一种用于评估有需要的受试者中与免疫疗法相关的治疗应答的方法，其包括以下步骤：
(a)确定需要免疫疗法的受试者的样品中(i)表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)PD-1阳性(+)T细胞或(ii)其肝脏CD8+T细胞前体；和
(b)基于(i)表现出活化和耗竭特征的所述肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞或(ii)所述其肝脏CD8+T细胞前体的存在、不存在或丰度，评估与免疫疗法相关的治疗应答。
应当理解，如在说明书和权利要求书所用，“一种(a或an)”可以表示一个或多个，这取决于其使用的上下文。因此，例如，对“一种”项目的引用可以表示可以利用至少一个项目。
如以下所用，术语“具有”、“包含”或“包括”或其任何语法变体以非排他性的方式使用。因此，这些术语既可以是指除了这些术语引入的特征之外，在该背景下描述的实体中不存在其他特征的情况，也可以是指存在一个或多个另外的特征的情况。作为实例，表述“A具有B”、“A包含B”和“A包括B”均可以是指除B之外，A中不存在其他要素的情况(即，A单独并且仅由B组成的情况)以及其中除了B之外，实体A中还存在一个或多个另外的要素(例如要素C、要素C和D或甚至另外的要素)的情况。术语“包含”还涵盖其中仅存在所提及的项的实施方案，即其在“由……组成”或“基本上由……组成”的意义上具有限制性含义。
此外，如下文中所用，术语“优选地”、“更优选地”、“最优选地”、“特别地”、“更特别地”、“典型地”和“更典型地”或类似术语仅指定优选的主题，但并不应表示限制一般主题。因此，这些术语引入的特征不旨在以任何方式限制权利要求的范围。如技术人员将认识到的，本发明可以通过不使用所引入的特征或通过使用可选的特征来进行。
此外，应当理解，如本文所用，术语“至少一个”意指根据本发明可以使用该术语后面提及的一项或多项。例如，如果该术语指示应当使用至少一种生物标志物，则其可以被理解为一种生物标志物或多于一种生物标志物，即两种、三种、四种、五种或任何其他数量。根据项目，本领域技术人员理解该术语可以是指该术语可以指代的上限(如果有)。
本发明的方法可以由前述步骤组成或可以包括另外的步骤，例如用于进一步评价步骤(b)中获得的评估的步骤、建议治疗措施(例如治疗)的步骤等。此外，它可以包括步骤(a)之前的步骤，例如与样品预处理有关的步骤。然而，优选地，设想上述方法是离体方法，其不需要在人体或动物体上实施任何步骤。此外，该方法得到自动化的辅助。通常，细胞的测定可以由机器人装置支持，而评估可以由数据处理装置(例如计算机)支持。进一步的详情可见本文其他地方。
根据本发明提及的疾病和病症是本领域熟知的，并且与其相关的临床体征和症状在标准医学教科书(例如Stedman医学词典等)中描述。本文提及的“肝癌”通常涉及肝细胞癌或胆管癌。术语“非肝癌”涉及不累及肝脏的癌症实体。优选地，根据本发明的非癌症实体是黑色素瘤、前列腺癌、结肠癌或乳腺癌。非酒精性脂肪性肝病是熟知的医学病况，其特征在于肝脏中脂肪过多，而这些脂肪并非由过量酒精引起的。通常，肝脏重量的额外脂肪超过5％指示患有脂肪肝。非酒精性脂肪性肝病可能发展成非酒精性脂肪性肝炎，包括肝脏肿胀和炎症。所述非酒精性脂肪性肝炎可能导致肝纤维化、肝硬化，并且最终导致肝癌。如本文所用，术语“全身性肥胖”或“代谢综合征”是指包含以下病况中的三种或更多种的病症：向心性肥胖、高血压、高血糖、高血清甘油三酯和低血清高密度脂蛋白(HDL)。
根据本发明所提及的术语“免疫疗法”涵盖单免疫疗法，即涉及施用一种免疫疗法药物的免疫疗法，以及联合免疫疗法，即涉及施用多于一种免疫疗法药物的免疫疗法。优选地，根据本发明的免疫疗法涉及PD-1和/或PD-L1靶向免疫疗法。针对PD-1的抗体疗法可以涵盖施用药物(例如纳武利尤单抗或帕博利珠单抗)。还设想根据本发明的免疫疗法是使用抗PD-L1(例如阿替利珠单抗)和抗VEGF(例如贝伐珠单抗)的联合疗法。此外，免疫疗法还可以涵盖施用另外的抗癌药物或支持该疗法的药物。
如本文所用，术语“治疗应答”是指在通过免疫疗法治疗的受试者中发生的任何生物应答。所述应答可以是治疗有效的应答，涉及通过免疫疗法治疗的疾病或病症的改善或治愈或者伴随其的症状的改善或治愈。优选地，所述治疗有效的治疗应答是指受试者从免疫疗法获益的情况。更优选地，根据本发明的治疗有效的治疗包括改善或治愈肝癌，优选地，肝细胞癌(HCC)或胆管癌(CCA)。当免疫疗法用于治疗或预防肝癌(优选地，HCC或CCA)时，通常根据本发明观察到治疗有效的应答。此外，它还可以包括对免疫疗法的任何不良应答，例如包含肝癌(优选地，HCC或CCA)的进展或持续或任何来源的肝内转移的应答。通常，当免疫疗法用于治疗或预防肝癌时，根据本发明观察到的不良治疗应答包括肝癌(优选地，HCC或CCA)的进展或持续或任何来源的肝内转移，或肝损害。此外，根据本发明所指的治疗应答包括无应答，即受试者的状态没有可观察到的临床相关生理变化的情况。然而，施用免疫疗法后的治疗应答还可能涉及肝脏不良副作用的发展。优选地，所述肝脏不良副作用发生在受试者不需要免疫疗法来治疗肝癌但患有其他癌症实体的情况下。更优选地，受试者患有对全身免疫疗法敏感的非肝癌，优选地，黑色素瘤、前列腺癌、结肠癌或乳腺癌。更优选地，在涉及肝脏不良副作用的发生的这种情况下，受试者患有或疑似患有非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)或全身性肥胖(代谢综合征)。所述不良肝脏副作用优选地包括肝损害、肝功能障碍或肝癌(优选地，HCC或CCA)的发展。
如本文所用，术语“评估”是指确定受试者对免疫疗法的治疗应答(即不良应答、无应答、治疗有效的应答或不良肝脏副作用)。这包括在诊断方法中确定受试者当前生理状态下的所述治疗应答。此外，该术语还涵盖在预后方法中确定受试者将来(即在某个预测窗口内)是否将发生根据本发明的治疗应答(即不良应答、无应答、治疗有效的应答或不良肝脏副作用)。因此，评估还实现对受试者关于对免疫疗法敏感或不敏感进行分层。此外，评估还可以包括监测受试者随时间的治疗应答的方法，例如，在作为治疗或预防措施在一定时间段内施用免疫疗法的情况下。如本领域技术人员将理解的，这种评估虽然是优选的，但通常对于100％的被研究的受试者而言可能不是正确的。然而，该术语要求能够正确评估统计学上显著部分的受试者。本领域技术人员可以使用各种熟知的统计学评价工具(例如，置信区间的确定、p值确定、Student t检验、Mann-Whitney检验等)毫不费力地确定一部分是否具有统计学显著性。详细信息可见于Dowdy and Wearden,Statistics for Research,JohnWiley&Sons,New York 1983。通常设想的置信区间是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％。p值通常为0.2、0.1、0.05。
如本文所用，术语“样品”是指包含或怀疑包含表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)PD-1阳性(+)T细胞或其肝脏CD8+T细胞前体的任何生物样品材料。优选地，样品是可从肝脏获得的组织、细胞或液体样品，更优选地，样品是肝脏活检样品，最优选地，包含肝脏组织。
如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物，优选地，人、宠物、农畜或实验动物，例如啮齿动物，优选地，小鼠或大鼠。更优选地，所述受试者是人。受试者应需要免疫疗法。这涵盖由于对免疫疗法治疗敏感的明显疾病或病症(例如病毒相关或非病毒相关肝癌、黑色素瘤、前列腺癌、结肠癌、子宫颈癌或乳腺癌)而需要免疫疗法的受试者。此外，需要免疫疗法的受试者还可以是疑似对施用免疫疗法敏感或从中获益的受试者。优选地，这包括在成功治疗疾病或病症以预防疾病或病症复发后可以接受免疫疗法的受试者或接受免疫疗法作为预防措施的受试者。
如本文所用，术语“表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)PD-1阳性(+)T细胞”是指由细胞表面生物标志物CD8和PD-1表征的T细胞群，即T细胞呈CD8和PD-1阳性。此外，所述CD8+PD-1+T细胞应表现出活化和耗竭的特征，其由指示所述特征的生物标志物的表达表征。此外，已发现这种类型的CD+PD-1+T细胞具有肝脏自身侵袭性，即在受刺激(例如，通过免疫疗法中使用的抗PD-1抗体或PD-1L)时对肝组织进行自身侵袭。由于这种肝脏自身侵袭行为，所述类型的T细胞将造成接受全身免疫疗法的受试者的肝脏重度损害。造成的所述重度损害包括本文其他地方描述的不良治疗应答和不良肝脏副作用。由于所述治疗应答累及肝脏，因此CD8+PD-1+T细胞必须出现在肝脏中，因此，必须被确定为肝脏CD8+PD-1+T细胞。此外，除了肝脏之外，所述T细胞还可能出现在外周血中，并且能够通过血流进入肝脏。应当理解，自身侵袭性T细胞还可以对肝组织以外的组织进行自身侵袭。因此，根据本发明的肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞优选地驻留在肝脏中和/或存在于外周血中。此外，自身侵袭性T细胞必须表现出活化和耗竭的特征。这些特征伴随，例如，与对照CD8+T细胞相比，选自由以下组成的组的至少一种生物标志物的表达增加：TOX、CXCR6、TNFα、LAG3、GZMB(颗粒酶B)和TIGIT，更优选地，CXCR6和TOX，或与对照CD8+T细胞相比，选自由KLF2、IL-7R、TCF7、Foxo1和SELL组成的组的至少一种生物标志物的表达减少。因此，优选地，与对照CD8+T细胞相比，所述表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞表现出选自由以下组成的组的至少一种生物标志物的表达增加：TOX、CXCR6、TNFα、LAG3、GZMB(颗粒酶B)和TIGIT，更优选地，CXCR6和TOX。还优选地，与对照CD8+T细胞相比，所述表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞表现出选自由KLF2、IL-7R、TCF7、Foxo1和SELL组成的组的至少一种生物标志物的表达减少。更优选地，与对照CD8+T细胞相比，所述表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞表现出选自由TOX、CXCR6、TNFα、LAG3、GZMB(颗粒酶B)和TIGIT组成的组的所有生物标志物的表达增加，并且，还优选地，与对照CD8+T细胞相比，选自由KLF2、IL-7R、TCF7、Foxo1和SELL组成的组的所有生物标志物表现出表达减少。
如本文所用，术语“CD8+T细胞前体”是指进一步经历优选不可逆转地分化成表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)PD-1阳性(+)T细胞的CD8+T细胞。通常，此类细胞已经被不可撤销地编程成为这样的细胞。优选地，所述前体驻留在肝脏中，即是肝脏T细胞，或存在于外周血中，即是外周血来源的T细胞。所述CD8+T细胞前体表达已经典型的生物标志物，例如TCF7、SELL和/或IL-7R。然而，它们可以通过另外的生物标志物(例如TOX、CXCR6、TNFα、LAG3、GZMB(颗粒酶B)TIGIT、KLF2、IL-7R、TCF7、Foxo1和SELL)的表达谱随时间的变化来进一步表征。表达随时间的变化通常可以在一个月、两个月、三个月、六个月、十二个月或24个月的时间窗内观察到。因此，优选地，所述CD8+T细胞前体通过选自由TCF7、SELL和IL-7R组成的组的至少一种生物标志物或所有生物标志物来表征。优选地，所述CD8+T细胞前体表现出选自由以下组成的组的至少一种生物标志物或所有生物标志物的表达随时间的变化：TOX、CXCR6、TNFα、LAG3、GZMB(颗粒酶B)TIGIT、KLF2、IL-7R、TCF7、Foxo1和SELL。更优选地，(i)如果所述至少一种生物标志物选自由KLF2、IL-7R、TCF7、Foxo1和SELL组成的组，则所述变化是表达随时间减少；和(ii)如果所述至少一种生物标志物选自由TOX、CXCR6、TNFα、LAG3、GZMB(颗粒酶B)和TIGIT组成的组，则所述变化是表达随时间增加。
可以通过分子生物学的标准技术，包括任何类型的基于抗体或适体的生物标志物蛋白的检测，确定样品(例如通过活检或从外周血样品获得的器官、组织或细胞样品)中表现出活化和耗竭特征的所述肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)PD-1阳性(+)T细胞或其CD8+T细胞前体的存在、不存在或丰度。可选地，可以通过合适的核酸检测技术来确定编码生物标志物蛋白的转录物。本领域技术人员熟知如何定性和定量确定生物标志物蛋白或编码它们的转录物。特别优选的技术包括免疫组织化学和组织化学分析、原位杂交技术、免疫测定(例如ELISA或RIA)、细胞分选(例如FACS分析)、高通量RNA测序、单细胞RNA测序分析、RNA速度分析、质谱、质谱流式细胞术、MRI等。此外，特别优选的技术在以下所附实施例中详细描述。
更典型地，确定根据本发明提及的生物标志物的存在、不存在或丰度包括使样品与特异性结合生物标志物或编码其的转录物的检测剂接触。如果将要通过检测剂检测蛋白或肽生物标志物，则通常可以使用抗体、适体、肽或蛋白作为根据本发明的检测剂。如果将要检测编码生物标志物蛋白的转录物，则应当理解，通常，作为根据本发明的检测剂，可以使用RNA或DNA的核酸探针进行检测。优选的检测剂还在本文其他地方更详细地描述。更典型地，所述检测剂可以在与内在可检测标记结合后被识别，或可以被作为或包含这种标记的分子结合。根据本发明的可检测标记可以是在结合后能够产生与生物标志物缔合的可检测信号的任何化合物或元件。通常，可检测标记可以是荧光分子或部分、放射性元素、酶、化学发光分子或部分、电化学可检测分子或部分、免疫标签、质量标签等。应当理解，标记还可以被包含在第二检测分子(例如包含标记的二抗或适体)中，该第二检测分子一旦与生物标志物结合就与检测剂特异性地结合。优选的标记在本文其他地方更详细地描述。
本文提及的作为检测剂的抗体涵盖与生物标志物蛋白特异性结合的所有类型的抗体。优选地，本发明的抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体或仍能够与生物标志物蛋白特异性结合的此类抗体的任何片段或衍生物。如本文所用，术语抗体所包含的此类片段和衍生物涵盖双特异性抗体、合成抗体、Fab、F(ab)2Fv或scFv片段，或任何这些抗体的化学修饰衍生物。在本发明的抗体的背景下使用的特异性结合意指抗体不与待研究的样品中存在的其他分子发生交叉反应。特异性结合可以通过各种熟知的技术来测试。通常，抗体或其片段可以通过使用例如以下描述的方法获得，Harlow and Lane"Antibodies,ALaboratory Manual",CSH Press,Cold Spring Harbor,1988。单克隆抗体可以通过包括将小鼠骨髓瘤细胞与源自免疫哺乳动物(并且优选地，免疫小鼠)的脾细胞融合的技术进行制备。优选地，将免疫原性肽应用于哺乳动物。优选地，所述肽与载体蛋白(例如牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白和匙孔血蓝蛋白(KLH))缀合。根据宿主物种，可以使用各种佐剂来增强免疫应答。此类佐剂优选地涵盖Freund佐剂、矿物凝胶(例如，氢氧化铝)，以及表面活性物质，例如，溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔血蓝蛋白和二硝基苯酚。随后可以使用熟知的杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术和EBV杂交瘤技术来制备与分析物特异性结合的单克隆抗体。使用抗体的检测系统基于抗体对特定抗原(即生物标志物蛋白)的高度特异性结合亲和力。结合事件导致物理化学变化，其可以如本文其他地方所述进行检测。
作为根据本发明的检测剂的适体涵盖与特定生物标志物蛋白结合的寡核酸或肽分子。通过重复轮次选择或所谓的指数富集配体系统进化(SELEX技术)对寡核酸适体进行工程化。肽适体由两端附接至蛋白支架的可变肽环组成。这种双重结构约束应将肽适体的结合亲和力增加至纳摩尔范围。所述可变肽环长度通常由十至二十个氨基酸组成，并且支架可以是具有改善的溶解度和容量特性的任何蛋白，例如硫氧还蛋白-A。可以使用不同的系统(包括例如酵母双杂交系统)进行肽适体选择。使用适体作为检测剂的检测系统可以基于模拟适体的特异性抗体作为适体传感器。
根据本发明，用作检测剂的核酸分子是指能够与生物标志物的转录物特异性相互作用的DNA或RNA分子。生物标志物转录物也是核酸分子，并且可以经由互补或反向互补核苷酸链的特异性相互作用来实现特异性结合。通常，用作检测剂的核酸选自由以下组成的组：反义RNA、核酶、siRNA或micro RNA。还优选地，具有互补和反向互补序列的寡核苷酸可以用作基于PCR的检测技术的靶转录物特异性引物。
如本文所用，反义RNA是指包含与靶转录物基本上互补或完全互补的核酸序列的RNA。通常，反义核酸分子基本上由与靶转录物的至少100个连续核苷酸，更优选地，至少200个、至少300个、至少400个或至少500个连续核苷酸互补的核酸序列组成。如何产生和使用反义核酸分子是本领域熟知的。
如本文所用，核酶是指具有明确的三级结构的催化性RNA分子，其允许与靶RNA特异性结合并催化其自身磷酸二酯键中的一个的水解(自切割核酶)，或靶RNA中的键的水解，但它们还被发现可以催化核糖体的转氨酶活性。如何产生和使用此类核酶是本领域熟知的。
如本文所用，siRNA是指小干扰RNA(siRNA)，其与靶RNA(编码目的基因)互补并且通过RNA干扰(RNAi)减少或消除基因表达。RNAi通常用于通过靶向mRNA来沉默目的基因的表达。简言之，细胞中的RNAi过程由双链RNA(dsRNA)启动，该dsRNA被核糖核酸酶切割，从而产生siRNA双链体。siRNA与另一种细胞内酶复合物结合，从而活化该复合物以靶向与siRNA序列同源(或互补)的任何mRNA分子。该复合物的功能是通过siRNA链中的一条与靶mRNA之间的碱基配对相互作用来靶向同源mRNA分子。因此，siRNA分子能够特异性结合并且可以用作根据本发明的检测剂。
如本文所用，micro RNA是指包含经由发夹结构连接的有义链和反义链的自互补单链RNA。micro RNA包含与待下调转录物所包含的RNA靶向序列互补的链。micro RNA经加工成更小的单链RNA，因此，可能还经由RNAi机制发挥作用。如何设计和合成特异性结合和降解目的转录物的microRNA是本领域已知的并且例如在EP 1 504 126 A2中详细描述。由于特异性核酸结合能力，它们可以用作根据本发明的检测剂。
使用核酸作为检测分子的检测系统可以基于互补碱基配对相互作用。识别过程基于互补核酸碱基配对的原理。如果已知靶核酸序列，则可以合成互补序列并标记用于检测。杂交事件可以，例如，被检测。此外，使用基于PCR的技术，甚至可以确定和定量少量的转录物。如何进行这种基于PCR的技术是本领域技术人员熟知的。
根据本发明用作检测剂的蛋白可以是与待确定的生物标志物蛋白特异性相互作用的蛋白。因此，根据所述生物标志物蛋白的性质，该蛋白通常可以是酶、受体、配体、信号传导蛋白、转录因子或结构蛋白。此外，此类蛋白的部分可用作根据本发明的肽检测分子，例如，配体结合结构域或底物结合袋。根据本发明的蛋白通常包含通过肽键共价连接的至少100个氨基酸。它们可以进一步包含修饰，例如糖基化、磷酸化、甲基化、泛素化或十四烷基化。
例如，酶的特异性结合能力和催化活性使它们特别适合作为检测剂。生物标志物底物识别通过几种可能的机制实现：将生物标志物蛋白底物转化成可检测产物的酶，检测生物标志物蛋白对酶的抑制或活化，或监测由于与生物标志物蛋白相互作用而导致的酶性质的改变。可选地，受体分子可以表现出对其配体的特异性结合特性，并且可以用作类似于抗体的检测剂。
适合作为根据本发明的检测剂的肽可以是仍能够特异性结合待检测的生物标志物蛋白的蛋白的功能片段。因此，用作检测分子的肽可以是配体结合结构域或底物结合袋。此外，可以通过筛选人工肽文库来人工产生和选择用于与生物标志物蛋白特异性结合的肽。肽通常包含少于100个通过共价肽键连接的氨基酸。肽也可以被修饰。例如，具有良好生物物理特性的小蛋白支架已经工程化以产生人工结合肽。这些肽分子能够与不同生物标志物蛋白特异性结合。通常，与抗体及其衍生物相反，这些人工结合蛋白比抗体小得多(通常小于100个氨基酸残基)，具有强稳定性，缺乏二硫键并且可以在还原性细胞环境(如细菌细胞质)中高产量表达。
根据本发明可以使用的典型标记包括金颗粒、乳胶珠、吖啶、鲁米诺、钌、酶活性标记、放射性标记、磁性标记(例如，磁珠，包括顺磁和超顺磁标记)以及荧光标记。酶活性标记包括例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶及其衍生物。适合检测的底物包括二氨基-联苯胺(DAB)、3,3'-5,5'-四甲基联苯胺、NBT-BCIP(4-硝基蓝四唑氯化物和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐)。合适的酶-底物组合可以产生有色反应产物、荧光或化学发光，其可以根据本领域已知的方法(例如使用光敏胶片或合适的相机系统)进行测量。至于测量酶促反应，以上给出的标准类似地适用。典型的荧光标记包括荧光蛋白(例如GFP及其衍生物)、Cy3、Cy5、Texas红、荧光素和Alexa染料。还设想使用量子点作为荧光标记。典型的放射性标记包括35S、125I、32P、33P等。放射性标记可以通过任何已知且合适的方法(例如光敏胶片或磷光成像仪)进行检测。合适的标记还可以是或包含标签，例如生物素、地高辛、His标签、GST标签、FLAG标签、GFP标签、MYC标签、甲型流感病毒血凝素(HA)、麦芽糖结合蛋白等。
根据本发明使用的术语“生物标志物”涉及由表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)PD-1阳性(+)T细胞或其CD8+T细胞前体表达的分子。因此，生物标志物蛋白和/或其转录物可以用作根据本发明的生物标志物。根据本发明用作生物标志物的转录物通常可以是mRNA或其前体。根据本发明的生物标志物优选是指示细胞的某种生理或病理状态的分子。然而，它不一定是所述状态的原因或与所述状态有任何因果关系。
如本文所用，术语“CD8”是指“分化簇8”，其是跨膜糖蛋白，是免疫球蛋白超家族的成员，具有用作T细胞受体(TCR)的辅助受体的连接至膜的免疫球蛋白可变(IgV)样细胞外结构域。CD8辅助受体连同TCR一起在T细胞信号传导和细胞毒性T细胞抗原相互作用中发挥作用。已知该蛋白有两种亚型：CD8α和CD8β。CD8形成二聚体，由一对CD8链组成。CD8的最常见形式由CD8α和CD8β链组成。优选地，人CD8α具有保藏在Uniprot数据库中登录号为P01732的氨基酸序列，人CD8β具有保藏在Uniprot数据库中登录号为P10966的氨基酸序列。优选地，小鼠CD8α具有保藏在Uniprot数据库中登录号为P01731的氨基酸序列，小鼠CD8β具有保藏在Uniprot数据库中登录号为P10300的氨基酸序列。该术语还涵盖前述CD8蛋白的变体。
本文提及的生物标志物蛋白的变体应具有与前述生物标志物蛋白至少相同的基本生物学和免疫学特性。特别地，如果它们可以通过本说明书中提及的相同特定测定(例如，通过使用特异性识别生物标志物蛋白的多克隆或单克隆抗体的ELISA测定)检测到，则它们共享相同的基本生物学和免疫学特性。此外，应当理解，根据本发明提及的变体应具有由于至少一个氨基酸取代、缺失和/或添加而不同的氨基酸序列，其中变体的氨基酸序列与特定生物标志物蛋白的氨基酸序列仍优选具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性，优选地在其整个长度上相同。两个氨基酸序列之间的同一性程度可以通过本领域熟知的算法进行确定。优选地，通过在比较窗口内比较两个最佳比对的序列来确定同一性程度，其中与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗口中的氨基酸序列片段可以包含添加或缺失(例如，空位或突出端)以实现最佳比对。通过确定两个序列中出现相同氨基酸残基的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100，得到序列同一性百分比。用于比较的序列的最佳比对可以通过本领域熟知的比较算法进行。优选地，可以使用在GAP、BESTFIT、BLAST、FAST、PASTA和TFASTA(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr.,Madison,WI)中实现的算法。优选地，使用空位权重的默认值5.00和空位权重长度的默认值0.30。上述变体可以是等位基因变体或任何其他物种特异性同源物、旁系同源物或直系同源物。
如本文所用，术语“PD-1”是指“程序性细胞死亡蛋白1”，也称为CD279(“分化簇279”)。PD-1是免疫球蛋白超家族的表面受体蛋白，其通过下调免疫系统来调节免疫反应，并通过抑制T细胞炎症活性来促进自身耐受。因此，它预防自身免疫性疾病，但也可以阻止免疫系统杀死癌细胞。PD-1通过两种机制发挥作用。首先，它促进抗原特异性T细胞的凋亡；其次，它减少调节性T细胞的凋亡。人的PD-1蛋白由PDCD1基因编码。PD-1通常在T细胞和pro-B细胞上表达，并与两种配体PD-L1和PD-L2结合。优选地，人PD-1具有保藏在Uniprot数据库中登录号为Q15116的氨基酸序列，小鼠PD-1具有保藏在Uniprot数据库中登录号为Q02242的氨基酸序列。该术语还涵盖上述PD-1蛋白的变体。
如本文所用，术语“TOX”是指“胸腺细胞选择相关的高迁移率族盒蛋白”。TOX是染色质相关蛋白大超家族中的蛋白，其共享约75个氨基酸的DNA结合基序，即HMG(高迁移率族)-盒。虽然TOX具有单个HMG-盒基序，但预期它以序列非依赖性方式结合DNA。TOX也是蛋白的小亚家族(TOX2、TOX3和TOX4)的成员，这些亚家族具有几乎相同的HMG-盒序列，并被认为参与肿瘤形成。TOX在胸腺(T细胞的发育部位)中高表达。TOX对于T细胞的持久存在是必需的，但也驱动T细胞“耗竭”，从而导致这些细胞的抗肿瘤或抗病毒功能减弱。
如本文所用，术语“CXCR6”是指“C-X-C趋化因子受体6型”，其是七次跨膜受体样蛋白。它是存在于淋巴细胞表面上的趋化因子受体，参与炎症过程和病毒感染过程。它的配体是细胞因子CXCL16。优选地，人CXCR6具有保藏在Uniprot数据库中登录号为O00574的氨基酸序列，小鼠CXCR6具有保藏在Uniprot数据库中登录号为Q9EQ16的氨基酸序列。该术语还涵盖上述CXCR6蛋白的变体。
如本文所用，术语“TNFα”是指“肿瘤坏死因子α”，其是炎症过程中释放的细胞因子。TNF是TNF超家族的成员，该家族由多种具有同源TNF结构域的跨膜蛋白组成。TNF信号传导通过两种受体：TNFR1和TNFR2发生。TNFR1几乎普遍表达，而TNRF2主要局限于内皮细胞、上皮细胞和免疫细胞亚群。TNFR1信号传导倾向于促炎和凋亡，而TNFR2信号传导则具有抗炎作用并促进细胞增殖。抑制TNFR1信号传导对于治疗自身免疫性疾病非常重要，而TNFR2信号传导促进伤口愈合。TNF-α以跨膜形式(mTNF-α)和可溶形式(sTNF-α)存在，根据本发明这两种形式均被涵盖。sTNF-α由mTNF-α酶切割产生。优选地，人TNFα具有保藏在Uniprot数据库中登录号为P01375的氨基酸序列，小鼠TNFα具有保藏在Uniprot数据库中登录号为P06804的氨基酸序列。该术语还涵盖前述TNFα蛋白的变体。
如本文所用，术语“LAG3”是指“淋巴细胞活化基因3”，其是对T细胞功能具有多种生物学效应的细胞表面受体。LAG3蛋白属于免疫球蛋白(Ig)超家族，包含503个氨基酸的I型跨膜蛋白，具有四个细胞外Ig样结构域，指定为D1至D4。优选地，人LAG3具有保藏在Uniprot数据库中登录号为P18627的氨基酸序列，小鼠LAG3具有保藏在Uniprot数据库中登录号为Q61790的氨基酸序列。该术语还涵盖上述LAG3蛋白的变体。
如本文所用，术语“GZMB”或“颗粒酶B”是指通常在自然杀伤细胞(NK细胞)和细胞毒性T细胞的颗粒中发现的丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.79)。它由这些细胞与成孔蛋白穿孔素一起分泌，以介导靶细胞的凋亡。它还具有各种次要功能，包括通过刺激细胞因子释放诱导炎症的功能，并且还参与细胞外基质重塑。颗粒酶B水平升高还与多种自身免疫性疾病、多种皮肤病和1型糖尿病有关。优选地，人GZMB具有保藏在Uniprot数据库中登录号为P10144的氨基酸序列，小鼠GZMB具有保藏在Uniprot数据库中登录号为P04187的氨基酸序列。该术语还涵盖前述GZMB蛋白的变体。
如本文使用，术语“TIGIT”是指“具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体”并且是存在于T细胞和自然杀伤细胞(NK)上的免疫受体。TIGIT可以以高亲和力与树突细胞(DC)、巨噬细胞等上的CD155(PVR)结合，也可以以较低的亲和力与CD112(PVRL2)结合。TIGIT可以抑制NK细胞毒性。优选地，人TIGIT具有保藏在Uniprot数据库中登录号为Q495A1的氨基酸序列，小鼠TIGIT具有保藏在Uniprot数据库中登录号为P86176的氨基酸序列。该术语还涵盖前述TIGIT蛋白的变体。
如本文所用，术语“KLF2”是指锌指转录因子的Krüppel样因子家族的成员“Krüppel样因子2”。它与人体的多种生化过程有关，包括肺发育、胚胎红细胞生成、上皮完整性、T细胞活力和脂肪生成。优选地，人KLF2具有保藏在Uniprot数据库中登录号为Q9Y5W3的氨基酸序列，小鼠KLF2具有保藏在Uniprot数据库中登录号为Q60843的氨基酸序列。该术语还涵盖前述KLF2蛋白的变体。
如本文所用，术语“IL-7R”是指“白介素-7受体”，其是与白介素7结合的细胞因子受体。它是异二聚体受体，由两条不同的较小蛋白链即白介素-7受体-α(CD127)和共同γ链受体(CD132)组成。共同γ链受体与多种细胞因子(包括白介素-2、白介素-4、白介素-9和白介素-15)共享。白介素-7受体在多种细胞类型上表达，包括幼稚T细胞和记忆T细胞等。优选地，人IL-7R具有保藏在Uniprot数据库中登录号为P16871的氨基酸序列，小鼠IL-7R具有保藏在Uniprot数据库中登录号为P16872的氨基酸序列。该术语还涵盖前述IL-7R蛋白的变体。
如本文所用，术语“TCF7”是指“转录因子7”，其是参与T细胞发育和分化、胚胎发育或肿瘤发生的转录因子蛋白。多种TCF7同工型由作为转录活化子的全长同工型(FL-TCF7)或作为转录抑制子的显性负同工型(dn-TCF7)表征。TCF7与多种蛋白或靶基因相互作用，并参与多种信号通路。优选地，人TCF7具有保藏在Uniprot数据库中登录号为P36402的氨基酸序列，小鼠TCF7具有保藏在Uniprot数据库中登录号为Q00417的氨基酸序列。该术语还涵盖前述TCF7蛋白的变体。
如本文所用，术语“Foxo1”是指叉头家族的转录因子“叉头盒蛋白O1”，其共享特征性叉头结构域作为共同结构元件。它参与胰岛素信号传导对糖异生和糖原分解的调节，并且对于前脂肪细胞进行脂肪生成的决定也至关重要。其活性取决于其磷酸化状态。优选地，人Foxo1具有保藏在Uniprot数据库中登录号为Q12778的氨基酸序列，小鼠Foxo1具有保藏在Uniprot数据库中登录号为Q9R1E0的氨基酸序列。该术语还涵盖前述Foxo1蛋白的变体。
如本文所用，术语“SELL”是指“L-选择素”，也称为“CD62L”。它是在白细胞和植入前胚胎上发现的细胞粘附分子。它属于识别硫化碳水化合物基团的蛋白的选择素家族。它被ADAM17切割。CD62L是细胞表面组分，其是在淋巴细胞-内皮细胞相互作用中起重要作用的归巢受体。该分子由多个结构域组成：一个与凝集素同源，一个与表皮生长因子同源，以及两个与C3/C4结合蛋白中发现的共有重复单元同源。优选地，人SELL具有保藏在Uniprot数据库中登录号为P14151的氨基酸序列，小鼠SELL具有保藏在Uniprot数据库中登录号为P18337的氨基酸序列。该术语还涵盖前述SELL蛋白的变体。
更优选地，根据本发明的表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)pD-1阳性(+)T细胞可能表现出选自由以下组成的组的至少一种另外的生物标志物的表达增加：颗粒酶A、颗粒酶K、Prf1、CCL3、CCL4 CCL5、Pdcd1、Mki-67low、IFNγ、Eomes、CD44和CD244low。此外，更优选地，表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)PD-1阳性(+)T细胞可以表现出选自由以下组成的组的至少一种另外的生物标志物的表达减少：CD127、Tbet和CD62L。上述生物标志物是本领域熟知的。定义其一级结构的氨基酸序列可见于Uniprot数据库。根据本发明还涵盖如本文其他地方定义的特定生物标志物的变体。
还优选地，可以在本发明的方法中进一步确定CD4+PD-1+T细胞的存在、不存在或丰度。基于肝脏或外周血中CD4+PD-1+T细胞的存在、不存在或丰度，可以进一步加强所进行的评估。
有利地，在本发明的研究中已发现，在NASH累及的肝脏或外周血中，耗竭的非常规活化的CD8+PD-1+T细胞(即表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)PD-1阳性(+)T细胞)逐渐蓄积。在NASH诱导的HCC临床前模型中，治疗性PD-1靶向免疫疗法使肿瘤内表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)PD-1阳性(+)T细胞扩增，但未导致肿瘤消退，表明肿瘤免疫监视受损。当预防性给予时，抗PD-1治疗导致与上述表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)PD-1阳性(+)T细胞的数量相关的NASH-HCC发病率/肿瘤结节升高。CD8+T细胞耗竭或TNF中和防止抗PD1触发的HCC增加，表明表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)PD-1阳性(+)T细胞在诱导NASH-HCC中具有作用，而不是增强免疫监视。在人NASH中发现了类似的肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞的表型和功能特征。为了表征这些结果的临床相关性，对超过1600名晚期HCC患者测试PD-L1/PD-1抑制剂的三项随机III期试验进行的荟萃分析显示，免疫疗法未改善非病毒性HCC的生存率。在另外两个队列中，与患有其他病因的患者相比，接受抗PD-(L)1治疗的NASH驱动的HCC患者的总体生存期(OS)显著降低。总之，临床前和临床数据发现，非病毒相关的HCC，特别是NASH-HCC，可能对免疫疗法应答较差，这可能是由于导致组织损害的NASH相关的异常T细胞活化和受损的免疫监视。此外，表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)PD-1阳性(+)T细胞是在不同阶段的NASH受试者中发现的CD+PD1+T细胞的明显亚群。这些细胞的存在、不存在或丰度可以作为用于鉴定可能从免疫疗法获益的受试者的生物标志物。特别地，CXCR6和TOX被证明是特别合适的生物标志物。
肝癌主要在慢性炎症的基础上发展。后者可以通过免疫疗法活化，以诱导肝癌患者子集的肿瘤消退。然而，HCC免疫疗法的应答者的身份尚不清楚。本发明的数据鉴定肝脏损害和癌症的非病毒病因(即NASH)，作为用免疫检查点抑制剂治疗的患者的不利结局的预测因子。与非病毒性HCC患者相比，病毒诱导的HCC患者对免疫疗法的应答更好，可能是由于病毒性抗原的数量或质量或不同的肝脏微环境，可能不损害免疫监视。目前的结果对于患有其他器官部位癌症(例如黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌)且因全身应用免疫疗法而面临肝脏损害和发展为肝癌风险的NALFD/NASH肥胖患者也有影响。由于本发明，可以在测试免疫疗法作为主要或辅助治疗的研究中根据潜在病因学提供HCC患者分层的基本原理，并且总体而言，提供了根据肝脏损害和癌症的病因学对HCC患者分层的合理基础，以用于个性化癌症治疗中的未来的试验设计。
以上对术语的所有解释和定义经过必要的修改后适用于以下实施方案。
在本发明的方法的优选实施方案中，受试者患有或疑似患有非病毒相关肝癌，优选地，肝细胞癌。在这种情况下，所述治疗应答优选地是不存在治疗应答或是不良治疗应答。表现出活化和耗竭特征的所述肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞或其CD8+T细胞前体的存在优选地指示不存在与免疫疗法相关的治疗应答或是与免疫疗法相关的不良治疗应答。在这种情况下，不良治疗应答优选地包括肝癌(优选地，HCC或CCA)的进展或持续或任何来源的肝内转移。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，所述受试者患有或疑似患有病毒相关肝癌，优选地，HCC或CCA。优选地，所述治疗应答是治疗有效的治疗应答。优选地，不存在表现出活化和耗竭特征的所述肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞或其CD8+T细胞前体指示与免疫疗法相关的治疗有效的治疗应答。所述治疗有效的治疗应答优选地包括肝癌(优选地，HCC或CCA)的改善或治愈。
在本发明的方法的另外的优选实施方案中，所述受试者患有或疑似患有非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)或全身性肥胖(代谢综合征)。优选地，所述受试者患有对全身免疫疗法敏感的非肝癌，优选地，黑色素瘤、前列腺癌、结肠癌、子宫颈癌或乳腺癌。此外，在所述情况下，所述治疗应答优选是不良肝脏副作用。存在表现出活化和耗竭特征的所述肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞或其CD8+T细胞前体优选地指示与免疫疗法相关的不良肝脏副作用。所述不良肝脏副作用通常包括肝脏损害、肝功能障碍或肝癌(优选地，HCC或CCA)的发展。
本发明还设想了用于评估有需要的受试者中与免疫疗法相关的治疗应答的方法，其包括以下步骤：
(a)确定在包含需要免疫疗法的受试者的成像数据的数据集中指示(i)表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)PD-1阳性(+)T细胞或(ii)其CD8+T细胞前体的存在、不存在或丰度的数据；和
(b)基于(i)表现出活化和耗竭特征的所述肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞或(ii)所述其CD8+T细胞前体的存在、不存在或丰度，评估与免疫疗法相关的治疗应答。
根据本发明的术语“包含成像数据的数据集”是指从受试者的肝组织的体内或离体研究获得的成像数据集合。该方法本身是离体方法，其用于评价所述数据，以评估所述受试者中与免疫疗法相关的治疗应答。通过确定成像数据的数据集中指示表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)PD-1阳性(+)T细胞或其CD8+T细胞前体的存在、不存在或丰度的数据，可以对免疫疗法的治疗应答进行评估，如本文其他地方所讨论的。成像数据可以通过本领域熟知的各种技术获得，包括射线照相、磁共振成像、闪烁扫描、SPECT、PET、磁性粒子成像、功能近红外光谱等。指示表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)PD-1阳性(+)T细胞或其CD8+T细胞前体的存在、不存在或丰度的数据类型取决于检测技术和所使用的检测剂。本领域技术人员熟知如何鉴定指示表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)PD-1阳性(+)T细胞或其CD8+T细胞前体的存在、不存在或丰度的数据。优选地，设想确定对应于本文提及的一种或多种生物标志物的存在、不存在或丰度的数据。所述数据可以是与由本文指定的可检测标记引发的可检测信号相关的数据。
本发明还涉及用于对受试者建议免疫疗法的方法，其包括通过实施本发明的前述方法来评估所述受试者对免疫疗法的治疗应答，并且，如果受试者经评估无非治疗应答、无不良治疗应答、有治疗有效的治疗应答和/或无不良肝脏副作用，则对所述受试者建议免疫疗法。
此外，本发明还涉及用于通过免疫疗法治疗受试者的方法，其包括通过实施本发明的前述方法来评估所述受试者对免疫疗法的治疗应答，并且，如果受试者经评估无非治疗应答、无不良治疗应答、有治疗有效的治疗应答和/或无不良肝脏副作用，则对所述受试者施用免疫疗法。
本发明还涉及用于评估有需要的受试者中与免疫疗法相关的治疗应答的装置，其包含：
(a)分析单元，其能够确定需要免疫疗法的受试者的样品中(i)表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)PD-1阳性(+)T细胞或(ii)其CD8+T细胞前体；和
(b)评价单元，其包含数据处理器，基于(i)表现出活化和耗竭特征的所述肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞或(ii)所述其CD8+T细胞前体的存在、不存在或丰度，该数据处理器能够评估与免疫疗法相关的治疗应答。
如本文所用，术语“装置”是指包含彼此可操作地连接的前述单元的系统，以实现根据本发明的方法确定生物标志物的存在、不存在或丰度并对其进行评价，从而可以提供评估。
分析单元通常包含至少一个反应区，该反应区具有第一和第二生物标志物以及优选地还有第三生物标志物的生物标志物检测剂，其以固定形式固定在将与样品接触的固体支持物或载体上。此外，在反应区中，可以应用实现检测剂与样品中包含的生物标志物特异性结合的条件。反应区可以实现直接进行样品施加，或可以连接至施加样品的装载区。在后一种情况下，样品可以经由装载区和反应区之间的连接主动或被动地输送至反应区。此外，反应区还应连接至检测器。连接应使得检测器能够检测生物标志物与其检测剂的结合。合适的连接取决于用于测量生物标志物的存在或数量的技术。例如，对于光学检测，在检测器和反应区之间可能需要光传输，而对于电化学测定，例如在反应区和电极之间可能需要流体连接。检测器应适用于检测并确定生物标志物的量。随后可以将所确定的量传输至评价单元。
所述评价单元包含数据处理元件，例如计算机，其具有用于确定样品中存在的量的实施算法。根据本发明的方法所提及的处理单元通常包含中央处理单元(CPU)和/或一个或多个图形处理单元(GPU)和/或一个或多个专用集成电路(ASIC)和/或一个或多个张量处理单元(TPU)和/或一个或多个现场可编程门阵列(FPGA)等。例如，数据处理元件可以是通用计算机或便携式计算装置。还应当理解，多个计算装置可以例如经网络或其他传输数据的方法一起使用，以进行本文公开的方法的一个或多个步骤。示例性计算装置包括台式计算机、便携式计算机、个人数据助理(“PDA”)、蜂窝装置、智能或移动装置、平板计算机、服务器等。通常，数据处理元件包含能够执行多个指令(例如软件程序)的处理器。评价单元通常包含或可以访问存储器。存储器是计算机可读介质并且可以包含例如位于计算装置本地或者计算装置可通过网络访问的单个存储装置或多个存储装置。计算机可读介质可以是可由计算装置访问的任何可用介质并且包括易失性和非易失性介质。此外，计算机可读介质可以是可移动介质和不可移动介质中的一者或两者。作为实例而非限制，计算机可读介质可以包含计算机存储介质。示例性计算机存储介质包括但不限于RAM、ROM、EEPROM、闪存或任何其他存储技术、CD-ROM、数字多功能盘(DVD)或其他光盘存储、磁带盒、磁带、磁盘存储装置或其他磁存储装置，或可用于存储能够由计算装置访问并由计算装置的处理器执行的多个指令的任何其他介质。评价单元还可以包含或可以访问输出装置。示例性输出装置包括例如传真机、显示器、打印机和文件。根据本公开的一些实施方案，计算装置可以执行本文公开的方法的一个或多个步骤，并且此后经由输出装置提供与该方法的结果、指示、比率或其他因素相关的输出。
优选地，采用该装置来实施本发明的方法。
此外，本发明涉及用于评估有需要的受试者中与免疫疗法相关的治疗应答的装置，其包括：
(a)分析单元，其能够确定在包含需要免疫疗法的受试者的成像数据的数据集中指示(i)表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)PD-1阳性(+)T细胞或(ii)其CD8+T细胞前体的存在、不存在或丰度的数据；和
(b)评价单元，其能够基于(i)表现出活化和耗竭特征的所述肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞或(ii)所述其CD8+T细胞前体的存在、不存在或丰度，评估与免疫疗法相关的治疗应答。
优选地，采用所述装置来实施本发明的方法。
然而，本发明提供了用于评估有需要的受试者中与免疫疗法相关的治疗应答的试剂盒，其包含至少一种检测剂，该检测剂实现特异性测定(i)表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)PD-1阳性(+)T细胞或(ii)CD8+T细胞前体。
如本文所用，术语“试剂盒”是指前述组分的集合，通常单独提供或在单个容器内提供。容器通常还包含用于实施本发明的方法的说明。这些说明可以是手册的形式或可以由计算机程序代码提供，当在计算机或数据处理装置上实施时，该计算机程序代码能够执行或支持本发明的方法中涉及的生物标志物的确定。计算机程序代码可以在数据存储介质或装置(例如光学存储介质(例如，光盘))上提供，或直接在计算机或数据处理装置上提供，或可以以下载格式(例如到可访问服务器或云的链接)提供。此外，试剂盒通常可以包含用于校准目的的生物标志物参考量的标准品，如本文其他地方详细描述的。根据本发明的试剂盒还可以包含实施本发明的方法所必需的其他组分，例如检测所释放的第二分子所需的溶剂、缓冲液、洗涤溶液和/或试剂。此外，它可以部分地或全部地包括本发明的装置。
优选地，所述至少一种检测剂实现特异性检测选自由以下组成的组的生物标志物：TOX、CXCR6、TNFα、LAG3、GZMB(颗粒酶B)TIGIT、KLF2、IL-7R、TCF7、Foxo1和SELL。更优选地，所述检测剂是特异性结合生物标志物或编码其的核酸转录物的抗体、适体或核酸分子。
以下实施方案是根据本发明特别设想的实施方案。
实施方案1.用于评估有需要的受试者中与免疫疗法相关的治疗应答的方法，其包括以下步骤：
(a)确定需要免疫疗法的受试者的样品中(i)表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)PD-1阳性(+)T细胞或(ii)其CD8+T细胞前体；和
(b)基于(i)所述表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞或(ii)所述其CD8+T细胞前体的存在、不存在或丰度，评估与免疫疗法相关的治疗应答。
实施方案2.实施方案1的方法，其中所述样品是肝活检样品。
实施方案3.用于评估有需要的受试者中与免疫疗法相关的治疗应答的方法，其包括以下步骤：
(a)确定在包含需要免疫疗法的受试者的成像数据的数据集中指示(i)表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)PD-1阳性(+)T细胞或(ii)其CD8+T细胞前体的存在、不存在或丰度的数据；和
(b)基于(i)所述表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞或(ii)所述其CD8+T细胞前体的存在、不存在或丰度，评估与免疫疗法相关的治疗应答。
实施方案4.实施方案1至3中任一项的方法，其中所述受试者患有或疑似患有非病毒相关肝癌，优选地，肝细胞癌。
实施方案5.实施方案1至4中任一项的方法，其中所述治疗应答是不存在治疗应答或是不良治疗应答。
实施方案6.实施方案5的方法，其中存在(i)所述表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞或(ii)所述其CD8+T细胞前体指示不存在与免疫疗法相关的治疗应答或指示与免疫疗法相关的不良治疗应答。
实施方案7.实施方案5或6的方法，其中所述不良治疗应答包含肝癌(优选地，肝细胞癌(HCC)或胆管癌(CCA))的进展或持续或任何来源的肝内转移。
实施方案8.实施方案1至3中任一项的方法，其中所述受试者患有或疑似患有病毒相关肝癌，优选地，HCC或CCA。
实施方案9.实施方案8的方法，其中所述治疗应答是治疗有效的治疗应答。
实施方案10.实施方案9的方法，其中不存在(i)所述表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞或(ii)所述其CD8+T细胞前体指示与免疫疗法相关的治疗有效的治疗应答。
实施方案11.实施方案9或10的方法，其中所述治疗有效的治疗应答包含肝癌(优选地，HCC或CCA)的改善或治愈。
实施方案12.实施方案1至3中任一项的方法，其中所述受试者患有或疑似患有非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)或全身性肥胖(代谢综合征)。
实施方案13.实施方案12的方法，其中所述受试者患有对全身免疫疗法敏感的非肝癌，优选地，黑色素瘤、前列腺癌、结肠癌、子宫颈癌或乳腺癌。
实施方案14.实施方案12或13的方法，其中所述治疗应答是不良肝脏副作用。
实施方案15.实施方案14的方法，其中存在(i)所述表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞或(ii)所述其CD8+T细胞前体指示与免疫疗法相关的不良肝脏副作用。
实施方案16.实施方案14或15的方法，其中所述不良肝脏副作用包含肝脏损害、肝功能障碍或肝癌(优选地，HCC或CCA)的发展。
实施方案17.实施方案1至16中任一项的方法，其中所述免疫疗法涉及PD-1和/或PD-L1靶向免疫疗法。
实施方案18.实施方案1至17中任一项的方法，其中所述受试者是哺乳动物，优选地，人。
实施方案19.实施方案1至18中任一项的方法，其中与对照CD8+T细胞相比，所述表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞表现出选自由以下组成的组的至少一种生物标志物的表达增加：TOX、CXCR6、TNFα、LAG3、GZMB(颗粒酶B)和TIGIT，更优选地，CXCR6和TOX。
实施方案20.实施方案1至19中任一项的方法，其中与对照CD8+T细胞相比，所述表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞表现出选自由以下组成的组的至少一种生物标志物的表达减少：KLF2、IL-7R、TCF7、Foxo1和SELL。
实施方案21.实施方案1至18中任一项的方法，其中所述CD8+T细胞前体由选自由以下组成的组的至少一种生物标志物表征：TCF7、SELL和IL-7R。
实施方案22.实施方案21的方法，其中所述CD8+T细胞前体表现出选自由以下组成的组的至少一种生物标志物的表达随时间的变化：TOX、CXCR6、TNFα、LAG3、GZMB(颗粒酶B)TIGIT、KLF2、IL-7R、TCF7、Foxo1和SELL，更优选地，CXCR6和TOX。
实施方案23.实施方案22的方法，其中(i)如果所述至少一种生物标志物选自由KLF2、IL-7R、TCF7、Foxo1和SELL组成的组，则所述变化是表达随时间减少；和(ii)如果所述至少一种生物标志物选自由TOX、CXCR6、TNFα、LAG3、GZMB(颗粒酶B)和TIGIT组成的组，更优选地，CXCR6和TOX，则所述变化是表达随时间增加。
实施例24.用于对受试者建议免疫疗法的方法，其包括通过实施实施方案1至23中任一项所述的方法来评估所述受试者对免疫疗法的治疗应答，并且，如果受试者经评估无非治疗应答、无不良治疗应答、有治疗有效的治疗应答和/或无不良肝脏副作用，则对所述受试者建议免疫疗法。
实施方案25.用于通过免疫疗法治疗受试者的方法，其包括通过实施实施方案1至23中任一项所述的方法来评估所述受试者对免疫疗法的治疗应答，并且，如果受试者经评估无非治疗应答、无不良治疗应答、有治疗有效的治疗应答和/或无不良肝脏副作用，则对所述受试者施用免疫疗法。
实施方案26.用于评估有需要的受试者中与免疫疗法相关的治疗应答的装置，其包含：
(a)分析单元，其能够确定需要免疫疗法的受试者的样品中的(i)表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)PD-1阳性(+)T细胞或(ii)其CD8+T细胞前体；和
(b)评价单元，其包含数据处理器，该数据处理器能够基于(i)所述表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞或(ii)所述其CD8+T细胞前体的存在、不存在或丰度，评估与免疫疗法相关的治疗应答。
实施方案27.实施方案26的装置，其中采用所述装置来执行实施方案1、2，或至于从属于实施方案1或2，实施方案4至25任一项的方法。
实施方案28.一种用于评估有需要的受试者中与免疫疗法相关的治疗应答的装置，其包括：
(a)分析单元，其能够确定包含需要免疫疗法的受试者的成像数据的数据集中指示(i)表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)PD-1阳性(+)T细胞或(ii)其CD8+T细胞前体的存在、不存在或丰度的数据；和
(b)评价单元，其能够基于(i)所述表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞或(ii)所述其CD8+T细胞前体的存在、不存在或丰度，评估与免疫疗法相关的治疗应答。
实施方案29.根据实施方案28所述的装置，其中采用所述装置来实施实施方案3，或从属于实施方案3，实施方案4至25中任一项的方法。
实施方案30.用于评估有需要的受试者中与免疫疗法相关的治疗应答的试剂盒，其包含至少一种检测剂，该检测剂能够特异性确定(i)表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)PD-1阳性(+)T细胞或(ii)CD8+T细胞前体。
实施方案31.实施方案30的试剂盒，其中所述至少一种检测剂能够特异性检测选自由以下组成的组的生物标志物：TOX、CXCR6、TNFα、LAG3、GZMB(颗粒酶B)TIGIT、KLF2、IL-7R、TCF7、Foxo1和SELL，更优选地，CXCR6和TOX。
实施方案32.实施方案31的试剂盒，其中所述检测剂是特异性结合生物标志物或编码其的核酸转录物的抗体、适体或核酸分子。
贯穿本说明书和下文引用的所有参考文献均通过引用公开内容具体提及的内容以及以其全文并入本文。
附图
图1：(a)喂食不同NASH饲料或对照饲料时肝脏脂肪变性的组织学分析。ND：正常饲料；CD-HFD：缺乏胆碱的高脂肪饲料。WD：西方饲料；(b)喂食不同NASH饲料或对照饲料的小鼠的肝脏损害特征(上图；ALT：氨基转移酶)和(c)NAFLD活性评分分析(下图)；(d)所有CD45+免疫细胞的流式细胞分析。可见T细胞群显著增加(CD8+PD1+，箭头)；(e)CD8和PD-1染色(右图)和肝脏5免疫组织化学的定量(n＝5-6只小鼠/组)；(f)基于免疫荧光的PD-1、CD8和CD4细胞检测(n＝3只小鼠/组)；(g)通过质谱对肝脏CD8+PD-1+6T细胞分选的TCRβ+细胞进行基因集富集分析(n＝4-6只小鼠/组)；(h)通过单细胞RNA Seq分析的TCRβ+细胞的tSNE；(i)通过单细胞RNA Seq分析的TCRβ+细胞的差异基因表达。(j)RNA速度，表明来自12个月ND或CD-HFD喂食小鼠(n＝3只小鼠/组)的转录活性、基因表达和scRNA-seq的CD8+细胞轨迹；(k)15个月CD-HFD处理8周后抗PD-1应用和肿瘤发生率的方案(肿瘤/病灶大小和肿瘤负荷：n＝7-9只小鼠/组；肿瘤发生率：CD-HFD n＝22只小鼠中的17个肿瘤/病变；CD-HFD+α-PD-1n＝10只小鼠中的10个肿瘤/病变)；(l)13个月喂食CD-HFD的小鼠，随后进行8周的抗PD-1处理(n＝4只小鼠)后，小鼠肝脏的磁共振成像。线条：肿瘤结节。标尺：10mm；(m)喂食饲料后进行或不进行免疫疗法的肝脏肉眼检查。箭头：肿瘤/病变。标尺：10mm；(n)通过免疫组织化学对肝脏CD8+细胞进行定量。(n＝3-13只小鼠/组；瘤内染色：n＝8-11只小鼠/组)；(o)通过mRNA原位杂交对肝脏肿瘤组织的CXCR6表达进行定量。标尺：100μm。箭头：阳性细胞。
图2：NASH中驻留样CD8+PD-1+T细胞在抗PD-1处理后以TNF依赖性方式驱动肝癌发生(a)显示表达的scRNA-seq数据的RNA速度分析，(b)所选基因的表达与潜伏时间的相关性。(c)12个月喂食ND、CD-HFD或CD-HFD的小鼠+8周α-PD-1抗体处理，通过质谱分析得出的肝脏或外周血来源的CD8+或CD8+PD-1+T细胞分选的TCRβ+细胞的PCA图。(d)UMAP示意图显示FlowSOM引导的聚类，热图显示中位标志物表达，以及(e)12个月ND、CD-HFD+IgG或CD-HFD喂食的小鼠+8周α-PD-1抗体处理的肝脏或外周血来源的CD8+T细胞的定量。(f)12个月喂食CD-HFD+IgG或CD-HFD的小鼠+8周α-PD-1抗体处理的肝脏或外周血来源的CD8+T细胞的CellCNN分析的流式细胞数据的定量。(g)ALT，(h)NAS评价(i)12个月喂食ND、CD-HFD、CDHFD的小鼠+8周α-PD-1、α-PD-1/α-CD8、α-TNF、α-PD-1/α-TNF、α-CD4或α-PD-1/α-CD4抗体处理的肝脏或外周血来源的CD8+PD-1+CXCR6+和CD8+PD-1+TNF+T细胞的定量。(j)肿瘤发生率的定量。
图3：PD-1和PD-L1靶向免疫疗法在晚期HCC中根据疾病病因有不同的效果(a)1656名患者的荟萃分析。首先评估免疫疗法，然后根据疾病病因学进行分析：非病毒性(NASH和酒精摄入)vs病毒性。随后对三种病因分别进行单独的荟萃分析：非病毒性(NASH和酒精摄入)、HCV和HBV。(b)NAFLD与接受PD-(L)1靶向免疫疗法治疗的肝细胞癌(HCC)患者的较差结果相关。总共130名晚期HCC患者接受PD-(L)1靶向免疫疗法。(c)使用PD-(L)1靶向免疫疗法治疗的HCC患者的验证队列。总共118名晚期HCC患者接受PD-(L)1靶向免疫疗法。
图4：对CD8+群体的研究表明，仅CD8+PD1+T细胞亚群表现出耗竭和活化的特征。(a)UMAP示意图显示FlowSOM引导的聚类，热图显示中位标志物表达，(b)CD8+PD1+T细胞群内个体耗竭和活化标志物的UMAP示意图显示了不同亚群。
实施例
实施例应仅用于说明本发明，而决不应解释为限制其范围。
实施例1：方法和材料
小鼠、饲料和处理
先前描述了标准小鼠饲料喂食(自由饮水和进食)和处理方案。在德国癌症研究中心(DKFZ)饲养雄性小鼠(恒温20-24℃，湿度45-65％，光照周期12h)。将动物维持在特定的无病原体条件下，并根据德国法律(G11/16、G129/16、G7/17)进行实验。接收来自表达人非常规前折叠蛋白RPB5相互作用蛋白的诱导型敲入小鼠的组织。先前已描述用于流体动力尾静脉递送的质粒。对于介入研究，喂食CD-HFD的雄性小鼠接受每两周静脉内注射25μg CD8耗竭抗体(Bioxcell，2.43)、50μg NK1.1耗竭抗体(Bioxcell，PK136)、300μg抗PD-L1(Bioxcell，10F.9G2)、200μg抗TNF(Bioxcell，XT3.11)、100μg抗CD4(Bioxcell，GK1.5)或150μg抗PD-1(Bioxcell，RMP1-14)处理，持续8周。PD-1-/-小鼠由G.Tiegs和K.Neumann友情提供。小鼠(扩展数据3g)抗PD-1抗体(Bioxcell，RMP1-14)或同种型对照(Bioxcell，2A3)，初始剂量为500μg i.p.，随后剂量为200μgi.p.，每两周一次，持续8周。对小鼠(扩展数据3h)进行i.p.抗PD-1(200μg，Bioxcell，RMP1-14)或IgG(200μg，Bioxcell，LTF-2)处理。现有技术中描述了扩展数据3i的处理方案。先前已描述腹腔内注射葡萄糖耐量试验和血清参数的测量。
磁共振成像
MRI在DKFZ的小动物成像核心设施中使用Bruker BioSpec 9.4Tesla(Ettlingen，Germany)进行。用3.5％七氟烷麻醉小鼠，并使用T2_TurboRARE序列进行T2加权成像：TE＝22ms，TR＝2200ms，视野(FOV)35×35mm，切片厚度1mm，平均值＝6次扫描时间3m18s，回波间隔11ms，稀有因子8，切片20，图像尺寸192×192，分辨率0.182×0.182mm。
多重ELISA
肝脏匀浆的制备类似于western印迹，并根据生产商手册(Meso ScaleDiscovery，U-PLEX Biomarker group 1，K15069L-1)基于定制的ELISA分析细胞因子/趋化因子。
流式细胞术和FACS：淋巴细胞的分离和染色
灌注和机械解剖后，将肝脏与胶原IV(60U f.c.)和DNase I(25μg/ml f.c.)在37℃下孵育至多35min，100μm过滤，用RPMI1640(#11875093)洗涤。接下来，2步Percoll梯度(25％/50％ Percoll/HBSS)，离心15min/1800g/4℃收集富集的白细胞，洗涤并计数。对于再刺激，使用1:500Biolegend的细胞活化混合物(含布雷菲德菌素A)(#423304)和1:1000莫能菌素溶液(#420701)，将细胞在37℃、5％ CO2下孵育2h。根据生产商的说明，使用DAPI或ZombieDyeNIR进行活/死区分，并随后对滴定抗体进行染色。根据生产商的说明，对用于流式细胞术活化细胞分选(FACS)的样品进行分选，并使用eBioscience IC固定(#00-8222-49)或Foxp3 Fix/Perm试剂盒(#00-5523-00)固定流式细胞术样品。在eBioscience Perm缓冲液(#00-8333-56)中进行细胞内染色。使用BD FACSFortessa或BD FACSSymphony分析细胞，并使用FlowJo(v10.6.2)分析数据。对于分选，使用与DKFZ FACS核心设施合作的FACSAria II和FACSAria FUSION。对于UMAP/FlowSOM图，BD FACSymphony数据(小鼠和人)从FlowJo(v10)导出。如现有技术中其他地方所述进行分析。
单细胞RNA测序和元细胞(metacell)分析(小鼠)
先前描述了scRNA-seq的单细胞捕获和文库制备。在Illumina NextSeq500上对文库(以等摩尔浓度合并)进行测序，中位测序深度为～40,000个读数/细胞。使用HISAT(版本0.1.6)将序列映射到小鼠(mm10)；排除具有多个映射位置的读数。如果使用Ensembl基因注释数据库(Embl版本90)将读数映射到外显子，则读数与基因相关。在同一链上共享基因组位置的不同基因的外显子被视为具有串联基因符号的单个基因。数据中的虚假UMI水平通过使用空MARS-seq孔的统计数据来估计，并排除估计噪声>5％的罕见情况(总体实验中估计噪声中位值为2％)。去除特定的线粒体基因、免疫球蛋白基因、与支持不良的转录模型相关的基因(用前缀“Rp-”注释)以及少于400UMI的细胞。使用Tvm＝0.3和最小UMI总计数>50选择基因特征。对这些基因之间的相关性矩阵进行分层聚类(过滤覆盖率低的基因并使用下采样的UMI矩阵计算相关性)并选择包含锚定基因的基因聚类。K＝50，750次引导迭代，其他使用标准参数。T细胞亚群通过混淆矩阵的分层聚类和同质元细胞组中富集基因的监督分析获得。
scRNA-seq数据的速度和相关性分析
Velocyto(0.6)用于估计预比对bam文件中的剪接/未剪接计数。RNA速度、潜伏时间、根状态和终态使用scvelo(0.2.2)的动态速度模型计算。Kendall排序相关系数用于将具有生物学意义的基因的表达模式与潜伏时间相关联。
质谱、数据采集和数据分析的准备
FACS纯化后，将细胞重悬于PBS pH 7.4缓冲液中的50％(体积/体积)2,2,2-三氟乙醇中，并通过重复超声处理和冻融循环进行裂解。蛋白在60℃下变性2h，使用终浓度为5mM的二硫苏糖醇还原(在60℃下30min)，冷却至RT，使用25mM碘乙酰胺烷基化(避光在RT下30min)，并使用100mM的碳酸氢铵(pH 8.0)按1:5稀释。蛋白用胰蛋白酶(1:100比，37℃)消化过夜，使用基于C18的stage吸头脱盐，真空干燥，重悬于20μL的含0.1％甲酸的HPLC级水中，并使用A380进行测量。使用纳米液相色谱系统(EASY-nLC 1200，Thermo FisherScientific)的C18柱，将0.5ug的以50-cm-分离的肽用于蛋白质组分析。使用5-30％缓冲液B(80％乙腈和0.1％甲酸)梯度，以300nL/min的流速、55℃的柱温洗脱肽。使用高分辨率轨道阱串联质谱仪(QExactive HFX，Thermo Scientific)通过数据依赖性Top15采集来获取数据。所有MS1扫描均以60,000分辨率采集，AGC目标为3e6，并且MS2扫描以15,000分辨率采集，AGC目标为1e5，最大进样时间为28ms。使用MaxQuant(1.6.7.0)、小鼠UniProt Isoformfasta(版本：2019-02-21，序列数25,233)作为蛋白序列来源进行分析。1％ FDR用于在肽和蛋白水平上的对照，考虑分析时至少需要两种肽。使用ClusterProfiler(3.18)42以及从WikiPathway(wikipathways.org)和MSigDB(broadinstitute.org/msigdb)获得的基因集进行基因集富集分析。
组织学、免疫组织化学、扫描和自动分析
先前描述了组织学、免疫组织化学、扫描和自动分析。实验中使用的抗体均是本领域已知的。对于免疫荧光染色，使用IHC构建的抗体，并结合AKOYABiosciences Opal荧光团试剂盒(Opal 520FP1487001KT、Opal540FP1494001KT、Opal 620FP1495001KT)。对于mRNA原位杂交，根据生产商(ACD Biotech)用于手动测定RNAscope的方案，使用探针TNF(311081)和CXCR6(871991)对新鲜未烘烤的5μm FFPE进行切割和染色。
用于批量RNA测序的RNA分离和文库制备
先前描述了聚(A)-RNA批量3’测序的RNA分离和文库制备。使用特征提取软件(11.0.1.1，Agilent Technologies)，gencode基因注释版本M18和小鼠参考基因组主要版本GRCm38源自(https://www.gencodegenes.org/)。Dropseq工具v1.1247用于将原始测序数据映射到参考基因组。将生成的UMI过滤计数矩阵导入至R v3.4.4中。估计了具有Limmav3.40.648样品特定权重的先前差异表达分析，并在使用Voom进行模型拟合期间将其与实验组一起用作系数和协变量。T检验用于确定所有可能的实验组之间差异(p值低于0.05)的调节基因。使用MSigDB Reactome、KEGG和Hallmark数据库(broadinstitute.org/msigdb)中预先排序的GSEA方法44进行基因集富集分析。原始测序数据可在登录号PRJEB36747下获得。
刺激CD8 T细胞
CD8 T细胞的刺激在现有技术中进行描述。
人活检的流式细胞术
对肝组织进行患者材料分析(针活检或切除组织，BIOFACS研究KEK 2019-00114)，其获自CHU Grenoble-Alpes生物资源中心(n BRIF BB-0033-00069)的患者集合n AC-2019-3627(CRB03)。使用手术刀切碎组织样品，在37℃下孵育(1mg/mL胶原酶IV(SigmaAldrich)、0.25μg/mL DNase(Sigma Aldrich)、10％ FCS(Thermo Fisher Scientific)、RPMI 1640(Seraglob))30min，通过PBS中的2mM EDTA(StemCell Technologies,Inc)终止酶促反应。经100μm细胞过滤器过滤后，将NexT细胞与Human TruStain FcXTM(Fc受体封闭溶液)(Biolegend)重悬于FACS缓冲液(PBS、EDTA 2mM、FCS 0.5％)中，并在4℃下孵育15min并用抗体染色。人样品的流式细胞术(扩展数据9d)获得当地伦理委员会的批准(AC-2014-2094n 03)。
人样品的高通量RNA测序
如先前所报道的，使用来自法国、德国、意大利和英国的被诊断为NAFLD并在欧洲NAFLD登记处(GSE135251)入组的206名患者的206份速冻活检样品的数据进行RNA测序分析。两名病理学家对样品进行NAS评分。排除可选的诊断，包括过量饮酒(男性每天30g，女性每天20g)、病毒性肝炎、自身免疫性肝病和致脂肪药物的使用。患者样品分组为：NAFL(n＝51)和NASH伴有不同纤维化阶段，范围从F0/1(n＝34)、F2(n＝53)、F3(n＝54)至F4(n＝14)。欧洲NAFLD登记处数据的采集和使用获得相关地方和/或国家伦理审查委员会的批准。对性别、批次和中心效应进行修正。现有技术中描述了通路富集和可视化。
NAFLD/NASH队列的免疫组织化学
纳入来自NAFLD患者的65份人FFPE活检样品。使用抗人CD8(Roche，SP57，即用型)、PD-1(Roche；NAT105，即用型)和CD4(Abcam，ab133616，1:500)抗体对连续切片进行免疫染色。所有染色均在37℃在在VENTANA BenchMark自动染色机上进行。在汇管束和贴壁实质中以400X放大倍数对免疫阳性细胞进行定量。
用于单细胞RNA-seq数据分析(人)的细胞分离
对在海德堡大学医院外科(S-629/2013)接受减肥手术的患者的肝脏样品进行分析，通过福尔马林固定/石蜡包埋进行病理评价，并通过切碎、按照生产商的说明操作Miltenyi肿瘤解离试剂盒(货号130-095-929)、通过70um细胞过滤器过滤并洗涤来生成单细胞。操作ACK裂解缓冲液(Thermo Fischer Scientific货号A1049201)，并将样品储存在FBS+20％DMSO中直至进一步处理(单细胞RNAseq分析和质谱流式分析)。将细胞在37℃水浴中解冻，用PBS+0.05mM EDTA(10min，300g，+4℃)洗涤，FC-block(10min，+4℃)，用CD45-PE(3μl，Hl30，#12-0459-42)染色和活/死区分(1:1000，Thermofischer，L34973)，与DKFZFACS合作在FACSAria FUSION上洗涤和分选。根据生产商的方案(Chromium Next EMSingle Cell 3`GEM，10000128)进行文库生成，在Illumina NovaSeq 6000上测序。使用Cell Ranger软件套件(版本4.0.0)进行解复用和条形码处理，并将读数与人GRCh3854进行比对。通过对单细胞3’UMI进行计数，生成包含细胞条形码和基因表达计数的基因条形码矩阵，并将其导入R(v4.0.2)，其中使用Seurat v355进行质量控制和归一化。排除线粒体基因超过10％、每个细胞少于200个基因或每个细胞超过6000个基因的细胞。将10个样品的矩阵与Seurat v3集成，以消除样品之间的批次效应。对所有CD3+细胞的过滤基因条形码矩阵进行PCA分析，通过UMAP(前50个主要成分)可视化，并使用高度可变的特征和指示性标志物识别主要细胞类型。此外，使用DESeq2(v1.28.1)的差异表达分析结果进行CD4+T细胞vs CD4+PD-1+T细胞和CD8+T细胞vs CD8+PD-1+T细胞的成对组合，设置CD4+/CD8+T细胞作为对照。然后使用EnhancedVolcano(v1.6.0)生成火山图，以可视化差异表达分析的结果。
质谱流式细胞术数据分析(人)
用于质谱流式细胞术的抗体缀合物购自Fluidigm，使用抗体标记试剂盒(Fluidigm X8，MCP9)内部生成，或如前所述。如前所述，冷冻保存用于质谱流式细胞术的抗体混合物。细胞的分离在“用于单细胞RNA-seq数据分析(人)的细胞分离”段落中进行描述。将细胞解冻，转移至RPMI+Benzonase(14ml RPMI+0.5μl Benzonase)中，并以500μg离心5min。将细胞沉淀重悬于1ml的CSM-B(CSM(PBS 0.5％ BSA 0.02％叠氮化钠)+1ul的Benzonase)中，用30μm细胞过滤器过滤，调整至3ml，计数，重悬于35μl CSM-B中，在4℃下孵育45min，加入100μl的CSM-B。合并细胞并用表面抗体混合物染色30min，4℃。使用mDOTA-103Rh进行死细胞区分(5min钟，RT)。对于细胞内染色，按照生产商的说明使用MiltenyiBiotec的Foxp3细胞内染色试剂盒，然后对细胞内靶标染色30min，RT。洗涤细胞，重悬于1ml铱嵌入剂溶液中，并孵育25min，RT。用CSM、PBS、MilliQ水洗涤细胞，调整终浓度为7.5×105个细胞/mL，并补充4元件EQ珠。在Helios质谱流式细胞仪上采集样品，并使用Helios质谱流式细胞仪和Helios仪器软件(版本6.7)对原始数据进行EQBead归一化。在CATALYST(v1.86)61和FlowCore(1.50.0)中进行补偿。使用FlowJo(v10.6.2)对单个活CD45+细胞进行去条形码和设门。然后，将CD45+细胞的数据导入Cytosplore 2.3.1并使用arcsinh(5)函数进行转换。在具有默认困惑度和迭代设置的2级分层随机邻域嵌入(HSNE)分析的第一级鉴定主要免疫细胞谱系。在CD3+细胞上运行具有相同参数的HSNE，以鉴定T细胞表型。在Cytosplore中进行高斯均值漂移聚类，并生成所有抗体靶标的arcsinh(5)转换表达值的热图。细胞类型鉴定基于转化的表达值，并且手动合并显示高度相似性的聚类。
NASH/HCC队列的组织学和免疫组织化学分析
选择4份健康样品、16例NASH病例以及来自以下病因患者的HCC肿瘤的邻近非肿瘤组织：NASH(n＝26)、病毒性肝炎(n＝19HCV，n＝3HBV)、酒精性(n＝5)和其他(n＝2)。所有样品均获自国际基因组HCC联盟并获得IRB批准。热诱导抗原修复(10mM柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)或通用HIER抗原修复试剂(ab208572)15min(3×5min))后，使用3％过氧化氢猝灭反应，用PBS洗涤样品，并与抗CD8(Cell Signaling，Danvers，MA)或抗PD-1(NAT105，ab52587)一起孵育。DAB(3,3'-二氨基联苯胺)用作检测系统(EnVision+System-HRP，Dako)。考虑以下因素定义PD-1阳性病例：a)免疫组织化学的中位阳性率和b)使用每张载玻片中存在的所有淋巴细胞中PD-1阳性淋巴细胞≥1％的临界值。对苏黎世大学医院病理学和分子病理学系的人样品进行的分析获得当地伦理委员会的批准(“Kantonale Ethikkommission Zürich”，KEK-ZH-Nr.2013-0382和BASEC-Nr.PB_2018-00252)。
III期临床试验的检索策略、选择标准和荟萃分析
通过PubMed、Cochrane图书馆、Web of Science和ClinicalTrials.gov上的MEDLINE进行文献检索，使用以下检索：2010年1月至2020年1月期间的“检查点抑制剂”、“HCC”、“III期”，并通过手动检索会议摘要/演示文稿进行补充。排除单中心、非对照试验，数据不足以提取风险比(HR)、95％置信区间的研究，或包括HCC以外疾病实体的试验。由于未排除会议摘要，因此未对纳入的研究进行质量评估。三项研究满足标准并被纳入定量综合。荟萃分析的主要结局是OS，定义为从随机分组到死亡的时间。与OS相关的HR和CI提取自从论文/会议演讲中。使用随机效应模型(Der Simonian和Laird)计算合并的HR，并使用通用逆方差来计算权重64。为了评估研究之间的异质性，使用Cochran’s Q检验和I2指数。Q检验中的p值<0.10被认为表明存在显著异质性。I2按照文献中的建议进行解释：0％至40％可能不代表显著异质性；30％至60％可能代表中等异质性，50％至90％可能代表实质异质性，75％至100％代表相当大异质性。所有统计学合并分析均使用RevMan 5.3软件进行。
接受PD-(L)1靶向免疫疗法治疗的HCC患者队列
回顾性分析获得当地伦理委员会的批准。该队列的数据先前已公开。纳入来自奥地利、德国、意大利和瑞士的12个中心的接受PD-(L)1靶向免疫检查点阻断剂治疗的肝硬化和晚期HCC患者。卡方检验或Fisher精确检验用于比较标称数据。OS定义为从检查点抑制剂治疗开始直至死亡的时间。末次联系日时删失仍存活的患者。通过Kaplan-Meier方法计算生存曲线并通过对数秩检验进行比较。通过Cox回归模型进行多变量分析。使用IBM SPSSStatistics版本25(SPSS Inc.,Chicago,IL)进行统计分析。
接受PD-1靶向免疫检查点阻断剂治疗的肝细胞癌患者的验证队列
对多机构数据集进行分析，其中纳入2017年至2019年期间在11个专门治疗HCC的三级护理转诊中心接受ICI治疗的427名HCC患者。该患者队列的临床结局已在其他地方报道过。纳入标准为：1)根据美国肝病研究协会和欧洲肝脏研究协会指南，通过组织病理学或影像学标准诊断为HCC；2)经当地多学科肿瘤委员会审查后，用于HCC的ICI全身治疗不适合治愈性或局部区域治疗；3)根据ICI开始时的RECIST v1.1标准可测量的疾病。从主要研究库中，选择118名晚期HCC患者，Child-Pugh A肝功能储备，并记录肝硬化的放射学或临床诊断，其在美国(n＝85)、欧洲(n＝7)、中国(n＝14)和日本(n＝12)招募。开展这项研究的伦理批准由帝国理工学院组织库授予(参考编号R16008)。
统计学分析
在Microsoft Excel中收集数据。小鼠数据表示为平均值±SEM。探索性试验和先前公开的结果用于估计样品量，使得适当的统计学检验可以产生显著结果。使用GraphPadPrism软件版本7.03(GraphPad Software)进行统计学分析。报告低于p<0.1的精确p值，并在图例中指示具体检验。
实施例2：小鼠NASH进展期间肝脏或外周血来源的CD8+PD-1+T细胞增加
为了研究NASH中肝脏或外周血来源的免疫细胞，给小鼠喂食饲料，在3-12个月内逐渐导致肝脏损害和NASH(图1a-c)，伴有肝脏或外周血来源的表达CD69/CD44和PD-1的活化CD8+T细胞的频率增加(扩展数据1a-d)。肝脏或外周血来源的白细胞的单细胞图谱显示，NASH中的免疫细胞组成发生改变(图1d；扩展数据1e，f)，CD8+PD-1+数量大幅增加，但TCRγδT细胞并非如此(图1e，f)。类似地，在遗传NASH小鼠模型中发现CD8+和PD-1+细胞升高。mRNA原位杂交和免疫组织化学(IHC)显示，肝细胞和非实质细胞中PD-L1表达增加与NASH严重程度相关。对来自NASH累及的肝脏的肝脏或外周血来源的CD8+PD-1+T细胞进行基于质谱的表征，表明持续T细胞活化和分化、TNF信号传导和NK细胞样细胞毒性的通路富集(图1g)。来自NASH肝脏的TCRβ+细胞的单细胞RNA测序(scRNA-seq)显示了在CD8+T细胞(例如GzmK/M)中的细胞毒性和效应功能相关特征和炎症标志物(例如Ccl3)，并具有升高的衰竭特征(例如Pdcd1，Tox)(图1h，i)。RNA速度分析表明了增强的转录活性和从表达SELL的CD8+到CD8+PD-1+T细胞的分化(图1j)，表明局部分化过程。这些数据表明NASH中肝脏或外周血来源的CD8+PD-1+T细胞丰度增加，具有衰竭和效应功能的特征。
基于NASH中大量的肝脏或外周血来源的T细胞，有人询问抗PD-1靶向免疫疗法是否可以作为NASH-HCC的有效疗法。在喂食CD-HFD持续13个月的C57BL/6小鼠中，30％的小鼠出现肝脏肿瘤，显示出与人NAFLD/NASH-HCC相似的基因改变负荷。通过磁共振成像鉴定，荷有HCC的NASH小鼠被分配到抗PD-1免疫疗法或对照臂(图1k-m)。既存肝脏肿瘤均未响应于抗PD-1疗法而消退(图1l，m)。相反，抗PD-1处理后观察到更明显的纤维化、肝脏损害未改变以及肝癌发病率略有增加，但肿瘤负荷/大小没有变化(图1k)。在抗PD-1处理的小鼠中，在肝肿瘤组织中发现更高数量的CD8+和PD1+T细胞，以及高水平的CXCR6-、TNF-mRNA表达细胞(图1n，o)。一致地，抗PD-L1免疫疗法后没有发现NASH诱导的肝脏肿瘤消退。相反，非NASH小鼠(有或没有伴随损害)的不同肝癌模型对PD-1免疫疗法产生反应伴有肿瘤消退，这表明缺乏对免疫疗法的应答与NASH-HCC特异性相关。因此，NASH排除HCC免疫疗法背景下的有效抗肿瘤监测。类似地，NASH继发性肝癌中也描述了免疫疗法损伤。
实施例3：CD8+T细胞促进NASH中的HCC
由于PD-1+CD8+T细胞未能执行有效的免疫监视，反而表现出组织损害的潜力，我们推断CD8+T细胞可能参与促进NASH-HCC以及在缺乏肝癌的NASH小鼠的预防性环境中的耗竭的CD8+T细胞(CD-HFD喂食10个月)。CD8+T细胞耗竭显著减少肝脏损害并降低HCC发病率[对照(溶媒处理和未处理)n＝32/87(37％)vs.CD8耗竭n＝2/31(6％)](图2m)。CD8+和NK1.1+细胞共耗竭后获得类似的结果(图2m)。这表明NASH中的肝脏CD8+T细胞不仅缺乏NASH中的免疫监视功能，而且还促进HCC。接下来，研究了抗PD-1疗法对NASH中HCC发展的影响。抗PD-1免疫疗法加重肝脏损害，并增加肝脏或外周血来源的CD8+PD-1+T细胞数量，而肝脏CD4+PD-1+T细胞和其他免疫细胞群仅发现微小变化。抗PD1免疫疗法导致肝癌发病率急剧增加，与肝纤维化的变化无关(图2m)。CD-HFD持续6个月后，PD-1-/-小鼠的肝癌发病率早发且增加，伴随肝脏损害恶化和活化的肝脏或外周血来源的CD8+T细胞数量增加伴有细胞因子表达(IFNγ、TNF)升高，这证实了这一点。总之，CD8+PD1+T细胞触发NASH-HCC转变——很可能是由于肿瘤监视受损和T细胞介导的组织损伤增强(另见Dudek等人，2020)。尽管肿瘤组织内CD8+PD1+T细胞大幅增加，但治疗性PD-1或PD-L1相关免疫疗法未能引起NASH-HCC的肿瘤消退。
应用与人HCC发展相关的免疫介导的癌症领域(ICF)基因表达特征来了解抗PD-1免疫疗法的肿瘤驱动机制。预防性抗PD-1治疗与促肿瘤ICF特征(例如Ifnγ、Tnf、Stat3、Stat5、Tgfβ、Kras)，捕获T细胞耗竭特征，促致癌信号传导和免疫耐受和抑制介质密切相关。CD8+T细胞耗竭呈现出高浸润ICF特征的显著下调和非实质细胞中TNF的减少。GSEA，mRNA原位杂交，和用抗PD1预防性处理的NASH小鼠中产生的肿瘤的组织学证实了这些数据，发现CD8+T细胞丰度增加，炎症相关信号传导、细胞凋亡和TGFβ信号传导富集。抗PD-1处理导致p62表达增加，已知p62导致肝癌发生。阵列比较基因组杂交表明，抗PD-1处理小鼠或对照组的肿瘤之间的染色体缺失或扩增没有显著差异。总之，肝脏或外周血来源的CD8+PD-1+T细胞在NASH期间未导致肿瘤消退，但与HCC的发展相关，甚至可以通过抗PD-1免疫疗法来增强HCC的发展。
为了阐明抗PD-1处理后NASH中CD8+PD-1+T细胞的促肿瘤能力，分析肝脏或外周血来源的T细胞区室与炎症和肝癌发生的相关性。通过scRNA-Seq对CD8+PD-1+与CD8+T细胞进行比较，发现了与效应功能(例如GzmA/B/K、Prf1、Ccl3/4/5增加，SELL、Klf2减少)、衰竭-(例如Pdcd1、Tigit、Tox，Il-7r减少、Tcf7)和组织驻留(例如Cxcr6、Mki-67low)相关的基因的共表达(图2a-b)。重要的是，抗PD-1后NASH小鼠肝脏或外周血来源的CD8+PD-1+T细胞的转录组谱没有差异(图2c)，这表明T细胞数量而不是其功能属性被改变。RNA速度印迹分析证实了这些数据(图2d)。类似的标志物模式(例如IL-7r、SELL、Tcf7、Ccl5、Ccl3、Pdcd1、Cxcr6、FasL、Rgs1)与接受对照IgG或抗PD-1的NASH小鼠的潜伏时间和总体转录活性相关(图2d,e)。对从NASH肝脏中分离的CD8+或CD8+PD-1+T细胞进行的基于质谱的分析证实，抗PD-1处理后T细胞没有发生表型变化(图2f)。
为了进一步表征PD-1+CD8+T细胞的转录组谱，对高参数流式细胞术数据进行UMAP分析，剖析CD8+PD-1+和CD8+PD-1-子集(图2g)。这揭示了CD8+PD-1+细胞共表达高水平的效应标志物(例如GzmB、IFNγ、TNF)和耗竭标志物(例如Eomes、PD-1、Ki-67low)。特别地，抗PD-1处理后CD8+PD-1+TNF+细胞更富集(图2h)。卷积神经网络分析和手动门控验证了这一结果(图2i)。CD8+PD-1+T细胞在抗PD-1处理的NASH小鼠中不增殖，这得到体外实验(其中抗PD-1处理导致T细胞数量在不增殖的情况下增加)的支持。值得注意的是，NASH中CD8+PD-1+T细胞的Foxo1水平降低，表明组织驻留表型增强，可能与效应功能增强相组合，这由CD8+PD-1+T细胞中钙水平更高表明。ScRNA-Seq分析进一步揭示了NASH中CD8+PD-1+T细胞的组织驻留特征(图2b)。因此，在NASH中进行抗PD1免疫疗法后，CD8+PD-1+T细胞在肝脏中大量蓄积，揭示了驻留样T细胞特征，CD44、CXCR6、EOMES、TOX、CD244low共表达增加，但缺乏TCF1/TCF7、CD62L、Tbet和CD127的表达。与先前的结果一致，CD4+PD-1+T细胞区室发生改变。总之，抗PD1免疫疗法增加肝脏中具有驻留特征的CD8+PD1+T细胞的丰度。
为了研究在预防性抗PD-1处理环境中驱动NASH-HCC转变增加的机制，NASH累及的小鼠接受联合处理。与单独的抗PD-1处理相比，抗CD8/抗PD-1或抗TNF/抗PD-1抗体处理均改善肝脏损害、肝脏病理学和肝脏炎症(图2j，k)。与单独的抗PD-1处理相比，两种联合处理均降低肝癌发病率(图2l，m)。相反，抗CD4/抗PD-1处理并没有降低肝癌发病率、NAFLD评分、表达TNF的肝脏或外周血来源的CD8+或CD8+PD1+CXCR5+T细胞的量(图2j-m)。然而，观察到每个肝脏的肿瘤数量和肿瘤大小减少，这表明CD4+T细胞或调节性T细胞的耗竭可能有助于肿瘤控制。相反，我们发现肿瘤发生率与抗PD-1处理、ALT、NAS、肝脏或外周血来源的CD8+PD-1+T细胞的数量以及TNF表达直接相关。总之，这些数据表明CD8+PD1+T细胞缺乏免疫监视并具有组织损害功能(另见Dudek等人，2020)，抗PD1处理增加这种功能，并可能导致抗PD1处理对NASH中HCC发展的不利影响。
在下表1和表2中，总结了表征肝脏或外周血来源的自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞群的基因：
表1：肝脏驻留或外周血来源的肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞的基因特征
表2：表征肝脏驻留或外周血来源的肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞的特征的重要特征基因
与CD8+T细胞相比上调 与CD8+T细胞相比下调
TOX KLF2
CXCR6 IL-7R
TNFα TCF7
LAG3 Foxo1
颗粒酶B SELL
TIGIT
实施例4：NASH患者中增强的肝脏驻留样CD8+PD1+T细胞
为了探索在人NASH中是否观察到肝脏免疫细胞特征的类似变化，对来自健康或NAFLD/NASH累及的肝脏的CD8+T细胞进行研究。在三个独立的NASH患者队列中，我们通过流式细胞术和CYTOF发现具有驻留表型的肝脏或外周血来源的CD8+PD-1+T细胞富集。肝脏或外周血来源的CD8+PD-1+T细胞数量与体重指数和肝脏损害直接相关。为了探索来自NASH肝脏的小鼠和人T细胞之间的相似性，通过scRNAseq分析来自NAFLD/NASH患者的肝脏CD8+PD-1+T细胞，其鉴定了NASH小鼠肝脏T细胞中也发现的基因表达特征(例如PDCD1、GZMB、TOX、CXCR6、RGS1、SELL)。差异表达基因在患者和小鼠来源的肝脏或外周CD8+PD-1+T细胞之间直接相关。速度印迹分析显示了表达TCF7、SELL、IL-7R的CD8+T细胞作为根细胞，以及CD8+PD-1+T细胞，其表明了CD8+T细胞向CD8+PD-1+T细胞的局部发育轨迹。小鼠和人NASH CD8+PD-1+T细胞中基因表达量和速度大小(表明转录活性)增加。NAFLD/NASH患者沿潜伏期的标志物表达(例如IL-7R、SELL、TCF7、CCL5、CCL3、PDCD1、CXCR6、RGS1、KLF2)与对照组相比不同，并且与NASH小鼠的CD8+T细胞表达模式相关。因此，scRNAseq分析表明，NAFLD/NASH患者中存在驻留样肝脏CD8+PD-1+T细胞群，其与来自NASH小鼠的肝脏或外周血来源的CD8+PD-1+T细胞具有相同的基因表达模式。
在下表3中，列出了基因，其中所述基因的表达随时间变化并且指示成为肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞的、肝驻留或外周血来源的根CD8+T细胞。
表3：
随时间上调 随时间下调
TOX KLF2
CXCR6 IL-7R
TNFα TCF7
LAG3 Foxo1
颗粒酶B SELL
TIGIT
NASH严重程度的不同阶段被认为预示肝癌的发展。事实上，NASH中纤维化的不同阶段(F0-F4)与Pdcd1、CCL2、IP10、TNF的表达直接相关，并且纤维化程度与CD4+、PD-1+和CD8+T细胞的数量直接相关(图3a-c)。此外，PD-1+细胞在健康肝脏中不存在，但在NASH或NASH-HCC中增加，其在潜在的纤维化水平上没有差异。物种特异性效应，例如缺乏肝硬化或耗尽NASH(一些NASH-HCC患者中发现的病况)及其对免疫疗法的可能影响，可能使从临床前NASH模型转化成人NASH变得困难。然而，与病毒性肝炎中的HCC患者相比，在接受抗PD-1治疗的NASH诱发HCC患者的肿瘤组织中，发现肿瘤内PD-1+细胞数量增加。因此，在人NASH组织中发现了共享的基因表达谱，并且非常规活化的肝脏或外周血来源的CD8+PD-1+T细胞丰度增加。
实施例5：NASH-HCC患者对免疫疗法缺乏应答
为了探索抗PD-1/抗PD-L1治疗后NASH免疫监视中断的概念，对三项评估晚期HCC患者免疫疗法的大型随机对照III期研究进行荟萃分析(CheckMate-4591；IMbrave1505；KEYNOTE-24010)。虽然免疫疗法改善总体人群的生存率(HR 0.77；95％CI 0.63-0.94)，但在HBV(n＝574；p＝0.0008)和HCV相关的HCC患者(n＝345；p＝0.04)中优效于对照臂，但在非病毒性HCC中则没有(n＝737；p＝0.39)(图3e)。病毒性病因(HBV和HCV感染)导致肝脏损害和HCC的患者显示出检查点抑制获益[HR：0.64；95％CI 0.48-0.94]，而非病毒性病因HCC患者则没有([HR：0.92；95％CI 0.77-1.11]；交互作用p＝0.03(图3e))。与索拉非尼治疗的对照臂(n＝1243)相比，一线治疗的亚组分析证实，免疫疗法在HBV相关的(n＝473；p＝0.03)和HCV相关的HCC患者(n＝281；p＝0.03)中更优效，但在非病毒性HCC中则没有(n＝489；p＝0.62)。已知结果来自对试验的荟萃分析，所述试验包括不同的治疗方案和无法区分酒精性肝病和NAFLD/NASH的肝脏损害的异质性。尽管如此，这项荟萃分析的结果支持根据肝脏损害和随后发生的HCC的病因对患者进行分层以确定那些对治疗有良好应答的患者的观点。
为了具体表征抗PD-(L)1免疫疗法对潜在肝病的作用，对130名HCC患者进行研究(NAFLD患者n＝13，患有其他病因的患者n＝117)。NAFLD与免疫疗法后总体生存期缩短相关(5.4(95％CI，1.8-9.0)个月vs.11.0(95％CI，7.5-14.5)个月(p＝0.023))，尽管NAFLD患者发生大血管肿瘤侵袭的频率较低(23％vs.49％)，并且免疫疗法更常被用作一线疗法(46％vs.23％)(图3f)。对与预后相关的潜在混杂因素(包括肝脏损害严重程度、大血管肿瘤侵袭、肝外转移、体力状态和甲胎蛋白(AFP))进行校正后，NAFLD仍与抗PD1治疗后HCC患者生存期缩短独立相关(HR 2.6(95％CI，1.2-5.6；p＝0.017)。这在118名接受PD-(L)1靶向免疫疗法治疗的HCC患者的另一队列中得到验证(NAFLD n＝11，患有其他病因的患者n＝107)。与其他肝脏损害病因相比(中位OS17.7个月，95％CI 8.8-26.5，p＝0.034)，NAFLD再次与HCC患者生存期缩短相关(中位8.8个月，95％CI 3.6-12.4)(图3g)。鉴于两个队列中NAFLD患者的数量相对较少，这些数据需要前瞻性验证。然而，总之，这些结果表明患有潜在NASH的患者并未从检查点抑制治疗中获益。
肝癌主要在慢性炎症的基础上发展。后者可以通过免疫疗法活化，以诱导肝癌患者子集的肿瘤消退。然而，HCC免疫疗法的应答者的身份尚不清楚。目前的数据确定肝脏损害和癌症的非病毒病因(即NASH)，作为用免疫检查点抑制剂治疗的患者的不利结局的预测因子。与非病毒性肝癌患者相比，病毒性肝癌患者对免疫疗法的应答更好，这可能是由于病毒抗原的数量或质量或不同的肝脏微环境，可能不损害免疫监视。目前的结果对患有其他器官部位癌症(例如黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌)且因全身应用免疫疗法而面临肝脏损害和发展为肝癌风险的NALFD/NASH肥胖患者也有关联。总体上，对于个性化癌症疗法的未来试验设计，提供了根据肝脏损害和癌症的病因对HCC患者分层的全面机制见解和合理的基础。
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Claims (16)

1.一种用于评估有需要的受试者中与免疫疗法相关的治疗应答的方法，其包括以下步骤：
(a)确定需要免疫疗法的受试者的样品中(i)表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)PD-1阳性(+)T细胞或(ii)其CD8+T细胞前体；和
(b)基于(i)所述表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞或(ii)所述其CD8+T细胞前体的存在、不存在或丰度，评估与免疫疗法相关的治疗应答。
2.一种用于评估有需要的受试者中与免疫疗法相关的治疗应答的方法，其包括以下步骤：
(a)确定在包含需要免疫疗法的受试者的成像数据的数据集中指示(i)表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8阳性(+)PD-1阳性(+)T细胞或(ii)其CD8+T细胞前体的存在、不存在或丰度的数据；和
(b)基于(i)所述表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞或(ii)所述其CD8+T细胞前体的存在、不存在或丰度，评估与免疫疗法相关的治疗应答。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述治疗应答是不存在治疗应答或是不良治疗应答。
4.根据权利要求3所述的方法，其中存在(i)所述表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞或(ii)所述其CD8+T细胞前体指示不存在与免疫疗法相关的治疗应答或指示与免疫疗法相关的不良治疗应答。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述治疗应答是治疗有效的治疗应答。
6.根据权利要求5所述的方法，其中不存在(i)所述表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞或(ii)所述其CD8+T细胞前体指示与免疫疗法相关的治疗有效的治疗应答。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述受试者患有或疑似患有非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)或全身性肥胖(代谢综合征)。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述治疗应答是不良肝脏副作用。
9.根据权利要求8所述的方法，其中存在(i)所述表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞或(ii)所述其CD8+T细胞前体指示与免疫疗法相关的不良肝脏副作用。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述免疫疗法涉及PD-1和/或PD-L1靶向免疫疗法。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中与对照CD8+T细胞相比，所述表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞表现出选自由以下组成的组的至少一种生物标志物的表达增加：TOX、CXCR6、TNFα、LAG3、GZMB(颗粒酶B)和TIGIT，更优选地，CXCR6和TOX。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中与对照CD8+T细胞相比，所述表现出活化和耗竭特征的肝脏自身侵袭性CD8+PD-1+T细胞表现出选自由以下组成的组的至少一种生物标志物的表达减少：KLF2、IL-7R、TCF7、Foxo1和SELL。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述CD8+T细胞前体由选自由以下组成的组的至少一种生物标志物表征：TCF7、SELL和IL-7R。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述CD8+T细胞前体表现出选自由以下组成的组的至少一种生物标志物的表达随时间的变化：TOX、CXCR6、TNFα、LAG3、GZMB(颗粒酶B)TIGIT、KLF2、IL-7R、TCF7、Foxo1和SELL，更优选地，CXCR6和TOX。
15.根据权利要求14所述的方法，其中(i)如果所述至少一种生物标志物选自由KLF2、IL-7R、TCF7、Foxo1和SELL组成的组，则所述变化是表达随时间减少；和(ii)如果所述至少一种生物标志物选自由TOX、CXCR6、TNFα、LAG3、GZMB(颗粒酶B)和TIGIT组成的组，更优选地，CXCR6和TOX，则所述变化是表达随时间增加。
16.用于对受试者建议免疫疗法的方法，其包括通过实施权利要求1至15中任一项所述的方法来评估所述受试者对免疫疗法的治疗应答，并且，如果受试者经评估无非治疗应答、无不良治疗应答、有治疗有效的治疗应答和/或无不良肝脏副作用，则对所述受试者建议免疫疗法。
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