CN117940572A - 一种用于治疗或预防非洲猪瘟的重组prrsv及其药物组合物 - Google Patents

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Abstract

一种用于治疗或预防非洲猪瘟的重组猪呼吸和繁殖综合症病毒(PRRSV)，所述重组PRRSV包含在PRRSV基因组上插入的干扰RNA表达框架，所述干扰RNA表达框架包含干扰RNA与TRS序列；其中所述干扰RNA为干扰RNA一端或两端带有具有RNA切割活性的RNA序列，其中当在干扰RNA一端带有具有RNA切割活性的RNA序列时，优选在干扰RNA另一端带有被RNA酶所识别的特征RNA序列；所述干扰RNA为所述致病病毒的干扰RNA；优选非洲猪瘟病毒的干扰RNA。重组PRRSV能够有效预防或治疗非洲猪瘟疾病，该重组PRRSV感染猪体后可抑制非洲猪瘟病毒的繁殖，从而达到预防或者治疗的目的。

Description

一种用于治疗或预防非洲猪瘟的重组PRRSV及其药物组合物 技术领域
本发明涉及兽医领域，具体为动物疫病预防和治疗，特别涉及用于治疗或预防非洲猪瘟的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及其药物组合物。
背景技术
非洲猪瘟病毒(ASFV)是高度致死性疾病非洲猪瘟(ASF)的病原，感染家猪和野猪，可造成重大的经济损失。目前没有可用的ASFV疫苗，目前的防控方法主要是对受影响地区的动物进行检疫和扑杀。ASFV发现于非洲，在软蜱，疣猪和灌木丛之间进行“森林循环”，该循环内不发生ASFV感染导致的疫病。另一方面，ASFV对家猪和野猪高度致死。该病具有高度传染性，对全球养猪业构成了严重威胁。自2007年ASF侵入高加索地区以来，强毒力的基因II型ASFV株持续传播并扩散到东欧和俄罗斯，并于最近进入西欧、中国和东南亚各国。
基于主要衣壳蛋白p72可将ASFV划分为24种基因型，基于病毒血凝素CD2样蛋白质(CD2v)和C型凝集素则可将其分为8种血清型。在欧洲、俄罗斯和中国流行的ASFV被鉴定为强毒力的基因II型毒株。ASFV具有高度传染性，在环境中稳定存在，极易通过感染猪的肉制品和污染物传播。因此，ASFV对全球养猪业构成了重大威胁，亟需研发ASFV疫苗。
基于非洲猪瘟对养殖业有巨大的影响，全球都在研发非洲猪瘟疫苗或药物。
灭活疫苗或自然弱毒疫苗最早开始尝试但是已被证实无效。
亚单位疫苗方面，用重组p30或p54蛋白免疫猪后可以诱导中和抗体 的产生，但不能提供针对急性ASF感染的保护；相比之下，同时免疫p30和p54蛋白或两种蛋白的嵌合体可以提供部分保护。用杆状病毒表达系统制备的ASFV结构蛋白p72、p30和p54等，以蛋白复合物作为抗原免疫动物后仍不能提供有效的免疫攻毒保护，说明仅仅依靠上述抗原刺激产生的中和抗体很难获得理想的免疫保护效果。因此，需要研究鉴定更多的ASFV保护性抗原、开发新型免疫佐剂以及采用DNA首免蛋白质加强免疫策略，以提高ASFV基因工程亚单位疫苗的免疫效力。
改良活病毒疫苗已经取得了更大的成功，一些ASFV毒株在缺失单个或多个毒力基因或免疫抑制基因后，如TK(K196R)、9GL(B119L)、CD2v(EP402R)、DP148R、NL(DP71L)、UK(DP96R)和多基因家族360和505(MGF 360/505)，缺失毒株接种宿主毒力减弱且可诱导产生针对同源母本毒株或异源毒株的特异性免疫保护，免疫后可以抵抗亲本毒株的攻击，具有同源保护作用；然而，这种保护通常仅针对相同基因型的同源毒株，而不是异源病毒攻击。
此外，弱毒活疫苗常引起相关的不良反应，如皮肤病变和关节肿胀等副作用，阻碍了它们作为疫苗的进一步发展。活病毒疫苗也可引起慢性或持续性感染并有可能恢复毒力。弱毒活疫苗的另一个问题是缺乏稳定的细胞系扩增病毒。
总体来说，目前还没有能够预防或治疗非洲猪瘟疾病的相对安全有效的产品。
发明内容
针对现有技术的现状，本发明提供了一种能够有效预防或治疗非洲猪瘟疾病的重组PRRSV(猪呼吸和繁殖综合症病毒)，该病毒感染猪体后可抑制非洲猪瘟病毒的繁殖，从而达到预防或者治疗的目的。
本发明提供了一种用于治疗或预防非洲猪瘟的重组PRRSV(猪呼吸和繁殖综合症病毒)，所述病毒包含在PRRSV基因组上插入的干扰RNA表达框架，所述干扰RNA表达框架包含干扰RNA与TRS序列；其中
所述干扰RNA为干扰RNA一端或两端带有具有RNA切割活性的RNA序列；其中当在干扰RNA一端带有具有RNA切割活性的RNA序列时，优选在干扰RNA另一端带有被RNA酶所识别的特征RNA序列；
所述干扰RNA为所述致病病毒的干扰RNA；优选非洲猪瘟病毒的干扰RNA。
本发明中，作为示例性的说明，可以仅在干扰RNA序列的一端带有具有RNA切割活性的RNA序列；也可以在干扰RNA序列的两端同时带有具有RNA切割活性的RNA序列；还可以在干扰RNA序列的一端带有具有RNA切割活性的RNA序列，另一端带有被RNA酶所识别的特征RNA序列。
本发明中，作为实施方案之一，所述TRS包括TRS2、TRS3、TRS4、TRS5、TRS6或TRS7；优选TRS6。
本发明中，作为实施方案之一，所述TRS序列由选自SEQ ID NO:159～SEQ ID NO:164中任一所示的序列转录后获得。
本发明中，作为实施方案之一，所述具有RNA切割活性的RNA序列为核酶，所述核酶选自丁型肝炎病毒(HDV)核酶、锤头型(HH)核酶、发卡核酶、Varkud卫星核酶、CPEB3核酶、CoTC核酶、或窦状芽孢杆菌glmS核酶，或它们中两种或两种以上组合。
本发明中，作为实施方案之一，所述在干扰RNA的两端各插入不同的核酶；优选所述不同的核酶分别为丁型肝炎病毒核酶和锤头型核酶。
本发明中，作为实施方案之一，所述被RNA酶所识别的特征RNA序列选自苯丙氨酸tRNA或csy4识别位点。
本发明中，作为实施方案之一，所述被RNA酶所识别的特征RNA序列由选自SEQ ID NO:156～SEQ ID NO:158中任一所示的序列转录后获得。
本发明中，作为实施方案之一，干扰RNA表达框架在干扰RNA的两端分别插入两种不同的核酶。
本发明中，作为实施方案之一，所述每个干扰RNA为一端或两端带有具有RNA切割活性的RNA序列；其中当在干扰RNA一端带有具有RNA切割活性的RNA序列时，优选在干扰RNA另一端带有被RNA酶所识别的 特征RNA序列。
本发明中，作为实施方案之一，干扰RNA表达框架在干扰RNA的一端插入tRNA或csy4识别位点，另一端插入HH或HDV核酶。
本发明中，作为实施方案之一，干扰RNA表达框架在干扰RNA的一端插入HH或HDV核酶与Csy4外源性酶的组合；另一端插入csy4识别位点。
本发明中，作为实施方案之一，所述干扰RNA表达框架包含一个、两个或两个以上的干扰RNA。
本发明中，作为实施方案之一，所述干扰RNA的形式为siRNA、saiRNA、G1、D1、D1L、shRNA或shRNAL，优选siRNA、shRNA，最佳shRNA。
本发明中，作为实施方案之一，所述干扰RNA的靶基因选自非洲猪瘟病毒的如下基因：O174L、EP296R、E165R、K196R、EP152R、CP204L、A240L、MGF360-9L、MGF360-10L、MGF360-11L、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L、MGF360-18R、MGF505-1R、MGF505-2R、MGF505-3R、S273R、CP530R、B646L、NP419L、G1211R、F1055L、NP1450L、EP1242L、I243L、D250R、P1192R、M448R、或pA104R。作为示例性的说明，所述干扰RNA的靶基因选自非洲猪瘟病毒的F1055L、E165R、K196R或EP152R基因。
本发明中，作为实施方案之一，所述干扰RNA具有SEQ ID NO:47～SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:118～SEQ ID NO:144中任一所示的序列，优选SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53～SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74～SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:118～SEQ ID NO:122、或SEQ ID NO:124～SEQ ID NO:144中任一所示的序列。作为示例性的说明，所述干扰RNA具有SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:121所示的序列。
本发明中，作为实施方案之一，所述干扰RNA表达框架进一步包含在干扰RNA序列与TRS序列之间插入的绿色荧光蛋白基因(EGFP)或Csy4外源性酶，或它们的组合。
本发明中，作为实施方案之一，所述重组PRRSV中的干扰RNA表达 框架选自具有如下序列特征的序列：TRS6-EGFP-HDV-siRNA–HH；TRS6-EGFP-HDV-siRNA-HHL；TRS6-EGFP-HDV-G1-HH；TRS6-EGFP–HH-shRNA-HDV；TRS6-EGFP–HH-shRNAL-HDV；TRS6-EGFP-HDV-D1-HH；TRS6-EGFP-HDV-D1L-HH；TRS6-EGFP-HDV-shRNA-HH；TRS6-EGFP-HDV-shRNAL-HH；TRS6-EGFP-HDV-HDV-shRNA-HH-HH；TRS6–HDV-shRNA-HH；TRS6-EGFP-HDV-shRNA-HH-HDV-shRNA–HH；TRS6–HDV-HDV-shRNA-HH；TRS6–HDV-shRNA-HHL；TRS6-EGFP-HDV-shRNA-HH-HDV-shRNA–HH-HDV-shRNA–HH；TRS6-EGFP-(HDV-shRNA–HH)*5；TRS6-EGFP-HDV-shRNA-RNAtRNA；或TRS6-Csy4(外源性酶)-HDV-shRNA-csy4(识别位点)，优选TRS6-EGFP-HDV-shRNA-HH；TRS6-EGFP-HDV-shRNAL-HH；TRS6–HDV-shRNA-HHL；TRS6–HDV-shRNA-HH；TRS6-EGFP-HDV-shRNA-HH-HDV-shRNA–HH；TRS6-EGFP-HDV-shRNA-HH-HDV-shRNA–HH-HDV-shRNA–HH；TRS6-EGFP-(HDV-shRNA–HH)*5，最佳TRS6–HDV-shRNA-HHL。
本发明中，作为实施方案之一，所述重组PRRSV中的干扰RNA表达框架的序列是由选自如下任一所示的序列转录后获得的：SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:34～SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:110～111；优选SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46，最佳SEQ ID NO:44。
本发明中，作为实施方案之一，所述重组PRRSV中的干扰RNA表达框架可不含EGFP，选自具有如下序列特征的序列：TRS6-HDV-siRNA–HH；TRS6-HDV-siRNA-HHL；TRS6-HDV-G1-HH；TRS6-HDV-D1-HH；TRS6-HDV-D1L-HH；TRS6-HDV-shRNAL-HH；TRS6-HDV-HDV-shRNA-HH-HH；TRS6-HDV-shRNA-HH-HDV-shRNA–HH；TRS6-HDV-shRNA-HH-HDV-shRNA–HH-HDV-shRNA–HH；TRS6-(HDV-shRNA–HH)*5；或TRS6-HDV-shRNA-tRNA，优选TRS6-(HDV-shRNA–HH)*5。
本发明中，作为实施方案之一，所述重组PRRSV中的干扰RNA表达框架的序列是由选自如下任一所示的序列转录后获得的：SEQ ID NO:145～SEQ ID NO:155；优选SEQ ID NO:154。
本发明中，作为实施方案之一，所述重组PRRSV应用TRS6–HDV-shRNA-HHL表达框架，其中的干扰RNA选自QBH90535.1-siRNA-169(靶点F1055L)、QBH90538.1-siRNA-38(靶点K196R)、或QBH90618.1-siRNA-110(靶点E165R)，所述干扰RNA表达框架选自具有如下序列特征的序列：TRS6-HDV-QBH90618.1-shRNA-HHL、TRS6-HDV-QBH90538.1-shRNA-HHL、或TRS6-HDV-QBH90535.1-shRNA-HHL。
本发明中，作为实施方案之一，所述重组PRRSV中的干扰RNA表达框架的序列是由选自如下任一所示的序列转录后获得的：SEQ ID NO:165～SEQ ID NO:167。
本发明还提供了前述重组PRRSV在制备治疗或预防非洲猪瘟的药物中的应用。
本发明还提供了一种前述重组PRRSV的制备方法，所述方法包括：
1)选择非洲猪瘟病毒繁殖代谢必需的基因作为靶基因，根据靶基因序列设计干扰RNA序列，化学合成siRNA oligo，体外验证siRNA oligo对靶基因的干扰活性；
2)根据siRNA序列设计shRNA序列；
3)在siRNA序列或shRNA序列的一端或两端插入核酶；然后将所得RNA序列对应的DNA序列构建到PRRSV病毒表达载体；其中，
当在siRNA序列或shRNA序列一端插入核酶时，优选另一端端插入tRNA或csy4识别位点；
进一步优选在siRNA序列或shRNA序列两端均插入核酶；
4)通过病毒拯救获得重组PRRSV。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述重组PRRSV中，干扰RNA表达框架与PRRSV通过AsisI和MluI酶切位点相连接。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤2)进一步包括：以siRNA 互补序列作为正义链，使用shRNA常用的loop环(TTCAAGAGA)、mir30 loop环序列(GTGAAGCCACAGATG)、或mir155 loop环序列(GTTTTGGCCACTGACTGAC)作为shRNA loop序列，siRNA序列作为反义链，3’末端添加两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述shRNA loop序列选自SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:116、或SEQ ID NO:117。
本发明还提供一种治疗或预防非洲猪瘟的药物组合物，所述药物组合物包含前文任一所述的重组PRRSV。
定义
本发明中，siRNA是小干扰RNA；saiRNA是可被Ago2识别加工的RNA序列；shRNA 是短发卡RNA；G1，D1，D1L是shRNA的优化序列，有不同的RNA loop环和配对区，并延长了shRNA两端序列；shRNAL是加长的shRNA，末端添加4个T。
TRS为转录调控序列。
本发明中涉及到的干扰RNA表达框架的DNA序列的非限制性示例如下表所示：
本发明中涉及到的干扰RNA序列的非限制性示例如下表所示：
本发明中涉及的其他序列如下表所示，其中SEQ ID NO:156～SEQ ID NO:158分别依次为苯丙氨酸tRNA、Csy4外源性酶、csy4识别位点的cDNA序列：
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
选择非洲猪瘟病毒上相对比较保守的靶点，因此对非洲猪瘟病毒的变异株仍然有抑制效果；
非洲猪瘟基因工程弱毒苗虽然比传代致弱的弱毒苗稳定性好，但是并不能够完全解决弱毒苗变异返毒的风险，本发明技术没有使用任何的非洲猪瘟病毒，因此安全性要优于基因工程弱毒苗，通过选择安全的猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)，可以解决非洲猪瘟病毒疫苗副作用的问题；
本发明选用的PRRSV，与非洲猪瘟病毒有相同的靶细胞，因此本发明获得的重组PRRSV药物可以大大增加对非洲猪瘟病毒的抑制率。
附图说明
图1：实施例3中P0-P3代包装病毒的荧光和病变情况。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1干扰RNA序列筛选
本发明通过对国内流行非洲猪瘟病毒的序列比对和蛋白功能分析，筛选出具有高度保守性的关键基因，涉及非洲猪瘟病毒复制，免疫逃逸，结构等功能。靶基因及编码蛋白如下：
靶基因 靶基因编码蛋白
O174L QBH90585.1
EP296R QBH90621.1
E165R QBH90618.1
K196R QBH90538.1
EP152R QBH90544.1
CP204L QBH90581.1
A240L QBH90523.1
MGF360-9L QBH90504.1
MGF360-10L QBH90505.1
MGF360-11L QBH90506.1
MGF360-12L QBH90508.1
MGF360-13L QBH90509.1
MGF360-14L QBH90510.1
MGF360-18R QBH90643.1
MGF505-1R QBH90507.1
MGF505-2R QBH90511.1
MGF505-3R QBH90512.1
MGF505-4R QBH90514.1
B119L QBH90562.1
DP96R QBH90645.1
I329L QBH90628.1
S273R QBH90599.1
CP530R QBH90582.1
B646L QBH90570.1
NP419L QBH90588.1
G1211R QBH90578.1
F1055L QBH90535.1
NP1450L QBH90587.1
EP1242L QBH90541.1
I243L QBH90626.1
D250R QBH90590.1
P1192R QBH90600.1
M448R QBH90549.1
pA104R QBH90522.1
化学全合成靶基因序列，通过PCR方法在靶基因上下游引物分别加上SacI和XhoI酶切位点及保护碱基，之后用SacI和XhoI双酶切PCR片段和pmiGLO载体，连接后获得带有目的基因的载体。
针对每个靶基因，设计了3条干扰RNA序列，在干扰序列3’末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为小干扰核酸序列的反义链，在此干扰序列的互补序列的3’末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为小干扰核酸序列的正义链，化学合成oligo。
siRNA oligo体外验证：
1. 293T细胞在10cm培养基中培养至80-90％融合时，倾去培养液，用3ml PBS洗涤细胞两次。
2.加1ml Trypsin-EDTA溶液,混匀后，小心吸去胰酶溶液，37℃放置2-3分钟。
3.加入2ml完全培养基，吹打使细胞形成单细胞悬液。
4.血球计数板计数，按照每孔约1×10 5的细胞量接种于24孔板。
5.每1OD260oligo用125μl DEPC-H 2O溶解，终浓度约为20μM。
6.Lipo2000的转染方法：每组三个重复孔的转染方法：在1.5ml EP管 中加入150μl Opti-MEM I(50μl/well*3well)，再加入靶基因质粒60ng(每孔20ng)，以及相对应的oligo 1.5ul(每孔10pmol/500ul，即20nM转染)，混匀；在另一1.5ml EP管中加入150μl Opti-MEM I(50μl/well*3well)，以及6ul的转染试剂lipo2000，混匀，静置5min后将两者混匀，共300ul体积，室温静置20min。
7.期间将前一天铺好的24孔板中培养基移除，按400μl/孔加入培养基；20min静置时间到后，将转染混合物分别加入到以上的24孔板中，100μl/孔，设3重复，将孔板摇匀，在培养箱中温育6小时。
8.移除转染液，用PBS漂洗后，加入培养基继续培养。
9.在转染24h后收取细胞，参照promega双荧光素酶试剂盒说明书做双荧光素酶检测。
表1干扰率验证结果
实施例2 PRRSV病毒表达载体的构建
shRNA序列合成：由单链的siRNA制备相应的shRNA步骤如下：以 siRNA互补序列作为正义链，TTCAAGAGA(SEQ ID NO:112)或mir30 loop序列(SEQ ID NO:116)或mir155 loop序列(SEQ ID NO:117)作为shRNA loop序列，siRNA序列作为反义链，3’末端添加两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸。
PRRSV-shRNA病毒表达载体：
pBAC-PRRSV-TRS6-EGFP(绿色荧光蛋白)载体构建参照文献(chengbao wang,A novel porcine reproductive and respiratory syndrome virus vector system that stably expresses enhanced green fluorescent protein as a separate transcription unit,Veterinary Research,2013)。化学合成TRS6(转录调控序列6)+EGFP+shRNA片段，通过PCR方法扩增TRS6+EGFP+shRNA，引物两端添加AsisI和MluI酶切位点。AsisI和MluI双酶切PCR产物，连接到AsisI和MluI双酶切的pBAC-PRRSV-TRS6-EGFP载体，获得带有shRNA片段的蓝耳病毒表达载体pBAC-PRRSV-TRS6-EGFP-shRNA。
PRRSV-RFP-靶基因病毒表达载体：
化学合成TRS6+RFP(红色荧光蛋白)+非洲猪瘟靶基因序列，通过PCR方法扩增TRS6+RFP+非洲猪瘟靶基因序列，引物两端添加AsisI和MluI酶切位点。AsisI和MluI双酶切PCR产物，连接到AsisI和MluI双酶切的pBAC-PRRSV-TRS6-EGFP载体，获得带有RFP+靶基因的蓝耳病毒表达载体PRRSV-RFP-靶基因。RFP和靶基因融合表达，这样通过RFP的荧光强度可以判断靶基因被抑制的程度。
AsisI和MluI酶切、酶连参照《分子克隆实验指南》的常规条件：AsisI和MluI内切酶在CutSmart Buffer的环境中，37℃酶切过夜；连接条件为T4连接酶在T4 DNA ligase buffer环境中，16℃条件下连接过夜。
实施例3 PRRSV重组病毒拯救
将状态良好的Marc-145细胞铺6孔板，铺板的密度5×10 5个/ml，每孔加入2ml的DMEM完全培养基，放置37℃CO2培养箱中培养12h；第二天细胞融合度达到约80％左右，将上清培养基弃去，用PBS洗涤两遍，加入含有3％FBS的DMEM维持液；选用Attractene转染试剂，每孔的计量为100μl的opti-MEM中加入1.2μg的质粒和4.5μl的转染试剂，分别将 PRRSV-shRNA病毒表达载体和PRRSV-RFP-靶基因病毒表达载体进行转染，转染进细胞后，载体就开始转录病毒基因组，表达病毒繁殖所需的蛋白，转染96h后细胞形态改变，有空泡等病变，荧光显微镜下可以观察到明显的绿色荧光(PRRSV-shRNA病毒表达载体)或红色荧光(PRRSV-RFP-靶基因病毒表达载体)，记为P0代；以感染复数为0.1的P0代病毒液感染Marc-145细胞；生长72h后细胞形态改变，有空泡等病变，荧光显微镜下可以观察到明显的绿色荧光(shRNA病毒表达载体)或红色荧光(RFP-靶基因病毒表达载体)，将细胞放入-20℃冰箱进行反复冻融三次，将细胞破碎让病毒释放出来；将反复冻融的细胞转移到离心管中800g离心5min，记为P1代病毒；再将P1代病毒进行传代依次传至P3代病毒，将P3代病毒反复冻融离心后将病毒保存至-80℃冰箱中。
如图1所示，P0代是病毒表达载体转染后的第一代，已经可以看到少量绿色和红色荧光，表明重组病毒已经获得拯救，随着传代次数的增加，病毒滴度不断增加，P2和P3代绿色荧光和红色荧光已经很强了，病毒滴度也基本达到了最高峰。
实施例4体外干扰活性和干扰RNA产物测定
本研究的主要目的是寻找治疗或预防非洲猪瘟的药物，非洲猪瘟病毒的靶细胞是猪肺泡巨噬细胞，因此本研究的干扰活性测试在猪肺泡巨噬细胞中进行，以QBH90544.1-siRNA-15为例。
将状态良好的猪肺泡巨噬细胞铺6孔板，铺板的密度1×10 6个/ml，每孔加入2ml的RPMI-1640完全培养基，放置37℃CO 2培养箱中培养12h；第二天细胞融合度达到约80％左右，将上清培养基弃去，用PBS洗涤两遍，加入含有3％FBS的RPMI-1640维持液。为了排除病毒相互抑制对干扰率测试的影响，将不含有靶基因和干扰RNA的PRRSV病毒作为对照。将靶病毒PRRSV-TRS6-RFP-靶基因、PRRSV病毒和P3代PRRSV-TRS6-shRNA的病毒液提取RNA，用RT-PCR进行病毒滴度测定。
病毒滴度测定具体步骤为：
1.引物探针设计
参考目前通用的一步法RT-qPCR探针引物设计原则，使用南京金斯瑞生物科技引物探针设计软件设计RT-qPCR的引物与探针，引物及探针的设计区域为蓝耳病毒ORF1a框架区域，扩增条带大小为85bp，设计结果如下：
PRRSV-F:GTTGAGCCCAATACGTCACC(Tm:56.03)
PRRSV-R:TCTTTCCAGCACCGTACCAT(Tm:56.03)
PRRSV-pro:FAM-ACTGCCAAACCGGAAGATCTTCCCA-TAMRA(Tm:62.15)
2.病毒RNA提取
使用上海生工公司试剂盒对病毒液进行RNA提取(病毒液为将经过病毒侵染的细胞液进行反复冻融后离心，去除细胞沉淀物)。
将病毒液混匀后，取0.1～0.2mL病毒液样品于RNase-free的1.5mL离心管中。向离心管中加入0.6mL Buffer Rlysis-VG，振荡30s混匀后室温放置10min。加入0.6mL无水乙醇，盖上管盖并涡旋振荡15sec。短暂离心后将700μl溶液转移到离心吸附柱中，室温放置2min，12,000rpm室温离心1min，弃穿透液，把吸附柱放回收集管中。将剩余溶液短暂离心后全部转移离心吸附柱中，室温放置2min，12,000rpm室温离心1min，弃穿透液，把离心吸附柱放回收集管中。加入500μl RPE Solution到离心吸附柱中，12,000rpm室温离心1min，弃穿透液，把离心吸附柱放回收集管中。重复上述步骤1次。12,000rpm室温离心2min，弃含穿透液的离心管。将离心吸附柱套入到一个新的RNase-free的1.5mL离心管中，在离心吸附柱的滤膜的中部加入30～100μlDEPC-treated ddH 2O，然后室温放置2min。12,000rpm室温离心2min，收集管中的样品即为病毒RNA。
将提取的病毒RNA进行浓度与纯度测量，OD260/OD280比值为2.0左右为纯度较好的RNA样品。
3.逆转录与qPCR
使用NEB一步法RT-qPCR试剂盒进行RT-qPCR扩增。
以步骤2中提取的病毒RNA为模板(并以水作为阴性对照)，按照以下体系进行配置RT-qPCR体系，每个样品做3个复孔，将配置好的体系放于8联管或96孔板中：
Luna universal probe one-step reaction mix(2*) 10ul
Luna warmstart rt enzyme mix(20*) 1ul
PRRSV-F(10uM) 0.8ul
PRRSV-R(10uM) 0.8ul
PRRSV-pro(10uM) 0.4ul
Template ≤1ug
Nuclease-free Water To 20ul
将8联管或96孔板中置于赛默飞7500荧光PCR仪器中，选择TaqMan中quantitation standard curve ROX程序，以ROX荧光作为参比荧光，FAM荧光作为报告荧光，TAMRA作为淬灭荧光，并设置好孔径的位置，按以下条件进行程序设置后进行RT-PCR。
4.实验结果分析
RT-PCR结果的CT值可代表病毒相对滴度，CT值相差n则代表拷贝数相差2 n。
以病毒滴度最小的作为标准，将PRRSV-TRS6-RFP-靶基因、PRRSV对照和P3代PRRSV-TRS6-shRNA病毒滴度调成一致后进行双病毒接毒；每种病毒接10μl到6孔板中，共设5个实验组，用实验组1空孔作为空白对照孔，实验组2孔接上PRRSV-TRS6-RFP-靶基因病毒，实验组3孔中加入PRRSV-TRS6-RFP-靶基因病毒和PRRSV对照病毒，实验组4孔加入PRRSV-TRS6-RFP-靶基因病毒和P3代PRRSV-TRS6-shRNA病毒，实验组5孔细胞先转染siRNA标准品，然后再接入PRRSV-TRS6-RFP-靶基因病毒，实验组2-5孔板各做两个平行，接毒72h后其中一个6孔板进行反复冻融后转移到离心管中离心，吸取100μl裂解液加入到96孔板中用激发光和发射 光分别为580和610的波长测定红光值，根据红光值的减少来评估干扰率；
另一个6孔板测定干扰RNA产物，弃去孔板中的上清，用PBS洗涤两次后，用含有EDTA的胰酶消化1min，弃去胰酶加入1ml的DMEM培养基将细胞吹散加入到1.5ml离心管中，用PBS洗涤两次，弃去残留的PBS，加入450ul buffer RLT涡旋30s，加入140ul混匀，在室温孵育3min；将溶解产物放于gDNA收集管中8000rpm/min离心30s收集上清液；加入1体积异丙醇混合均匀，将样品转移到RNeasy Mini column，8000×g离心15秒，弃去上清液；加入700ul Buffer RWT 8000×g离心15秒，去上清液；加入500ul Buffer RPE 8000×g离心15秒，去上清液，再重复一次此步骤后空离1min；加入35ul RNeasy water，放置1min，12000×g离心1min收集滤液；测定浓度后将浓度稀释一样；以样品稀释后浓度作为模板，以标准品10-5作为阳性对照，PRRSV-TRS6-RFP-90544.1和PRRSV-TRS6-EGFP共接毒的孔作为阴性对照，使用锐博加"A"法试剂盒进行加"A"，体系为RNA模板7ul，5*poly(A)polymerase Buffer 2ul，poly(A)polymerase 1ul，将上述体系混匀后37℃反应1h；反应后进行反转录，体系为RTase mix 4ul，5*RTase buffer 4ul，miDETECT A Track Uni-RT primer 2ul和poly(A)Tailing产物10ul，将上述体系混匀后42℃反应1h，然后放于2℃反应10min；反转录后进行qPCR，体系为miDETECT A Track miRNA Forward Primer(10uM)0.5ul，miDETECT A Track miRNA Uni-Reverse Primer(10uM)0.5ul，2*SYBR Green Mix 10ul，cDNA 2ul，用RNase-free water将体系补充到20ul混合均匀，首先95℃10min，再95℃2s和60℃30s进行40个循环。
实验组2是单独含有靶基因病毒，实验组3是靶基因病毒和普通PRRSV病毒双病毒接毒，目的是为了评估双病毒接毒对红色荧光值的影响，实验组4是靶基因病毒和干扰病毒双病毒接毒，实验组5是siRNA标准品转染后再接靶基因病毒。
siRNA标准品干扰率计算公式：(实验组2红光值-实验组5红光值)/(实验组2红光值-空白红光值)*100％；
以标准品干扰率作为基准100％，计算干扰病毒的相对干扰率：((实验组3红光值-实验组4红光值)/(实验组3红光值-空白红光值))/标准品干 扰率*100％。
表2 PAM细胞上干扰率及干扰RNA测试结果
以QBH90544.1-siRNA-15为例，按照上述的干扰率测定方法，比较了含有不同RNA表达框架的重组PRRSV的相对干扰率情况，具体结果如下表3。
含有以下序列特征的重组PRRSV构建参照实施例2PRRSV-shRNA病毒表达载体部分。以TRS6-HDV-shRNA-HHL为例，化学合成HDV-shRNA-HHL，通过PCR方法扩增HDV-shRNA-HHL，引物两端添加AsisI-TRS6和MluI酶切位点。AsisI和MluI双酶切PCR产物，连接到AsisI和MluI双酶切的pBAC-PRRSV-TRS6-EGFP载体，获得带有HDV-shRNA-HHL片段的蓝耳病毒表达载体。
表3
上表的序列特征中，siRNA是小干扰RNA；saiRNA是可被Ago2识别加工的RNA序列；shRNA 是短发卡RNA；G1，D1，D1L是shRNA的优化序列，有不同的RNA loop环和配对区，并延长了shRNA两端序列；shRNAL是加长的shRNA，末端添加4个T。Intron代表内含子加工序列。HDV是丁型肝炎病毒核酶,HH是锤头型核酶，HHL是配对序列从6个碱基延长到10个碱基的锤头型核酶。
序号1是直接把常规的shRNA插入到PRRSV病毒基因组中，这种表达框架未检测到干扰率，推测是PRRSV病毒表达出的shRNA加工效率过低导致无法产生有效的干扰RNA。
框架2-21对shRNA内部匹配度，loop环序列，两端延伸序列作了优化来增加Drosha的加工效率，并考虑使用内含子切割代替Drosha切割方式，结果仍不理想；
框架31在细胞质中外源表达Drosha，但是由于Drosha蛋白过于大，无法包装出病毒；
剩余的框架都是使用了两端自剪切核酶，HDV是丁型肝炎病毒核酶，HH是锤头型核酶，这两种核酶都可以在RNA特定位点自我切割，将shRNA释放出来。考虑到病毒基因组稳定性，设计负链的识别序列，这样可以避免基因组正链被核酶切断，对病毒稳定性破坏更小。
序号23、24、26、36-46是核酶设计到负链上的框架，都具有一定的干扰率；序号22、25、27-30、32-35是核酶设计到正链上的框架，都没有获得理想的结果。
实施例5重组PRRSV对非洲猪瘟病毒的抑制试验
前期的研究已经证明优化后的携带核酶框架序列的PRRSV可以在靶细胞猪肺泡巨噬细胞中对相应的靶基因产生较高的干扰效率，为了更加充分证明非洲猪瘟治疗药物的有效率，继续在靶细胞上开展了对非洲猪瘟病毒的抑制研究。以QBH90535.1-siRNA-169(靶点F1055L)、QBH90538.1-siRNA-38(靶点K196R)、QBH90618.1-siRNA-110(靶点E165R)为例，验证表达这三个干扰RNA产物的重组PRRSV对非洲猪瘟病毒的抑制情况。
由实施例4可知，最优的干扰RNA表达框架为TRS6–HDV-shRNA-HHL，应用TRS6–HDV-shRNA-HHL的表达框架，参照实施例2的PRRSV病毒表达载体的构建方法，分别构建了能够表达F1055L、K196R、E165R干扰RNA产物的PRRSV载体：pBAC-PRRSV-TRS6-HDV-QBH90535.1-shRNA-HHL(以QBH90535.1-siRNA-169为基础合成QBH90535.1-shRNA)、pBAC-PRRSV-TRS6-HDV-QBH90538.1-shRNA-HHL(以QBH90538.1-siRNA-38为基础合成QBH90538.1-shRNA)、pBAC-PRRSV-TRS6-HDV-QBH90618.1-shRNA-HHL(以QBH90618.1-siRNA-110为基础合成QBH90618.1-shRNA)，之后按照实施例3的病毒拯救方法分别获得了三个表达干扰RNA产物的重组PRRSV：PRRSV-TRS6-HDV-QBH90535.1-shRNA-HHL、PRRSV-TRS6-HDV- QBH90538.1-shRNA-HHL、PRRSV-TRS6-HDV-QBH90618.1-shRNA-HHL。
从液氮中取出PAM细胞立即放入37℃水浴中轻轻转动冻存管，冻存管口和盖子不要碰到水，直到冻存管内仅剩余一小块冰芯，使细胞迅速解冻。用70％乙醇擦拭冻存管外部后将冻存管转移到生物安全柜中，将解冻的细胞逐滴转移到装有10ml经过预热的完全生长培养基中800g离心5min。将离心的上清弃去，加入完全培养基将细胞密度调至为1.5×106左右铺24孔板，将放入CO2培养箱中培养过夜后用PBS洗涤后换成新鲜的完全培养基。分别取12.5ul的P3代PRRSV-TRS6-HDV-QBH90535.1-shRNA-HHL、PRRSV-TRS6-HDV-QBH90538.1-shRNA-HHL、PRRSV-TRS6-HDV-QBH90618.1-shRNA-HHL接种于24孔板中，放置37℃CO2培养箱中培养72h，细胞反复冻融后进行miRNA产物测定(测定方法同实施例4)，均成功检测到干扰病毒及产物。
另分别取12.5ul的P3代PRRSV-TRS6-HDV-QBH90535.1-shRNA-HHL、PRRSV-TRS6-HDV-QBH90538.1-shRNA-HHL、PRRSV-TRS6-HDV-QBH90618.1-shRNA-HHL、对照病毒PRRSV-TRS6-EGFP与25ul ASFV病毒同时接种于24孔板中，放置37℃CO2培养箱中培养72h，细胞进行反复冻融后测定ASFV滴度，结果见表4。三个携带核酶框架和干扰RNA序列的重组PRRSV在靶细胞肺泡巨噬细胞上均对非洲猪瘟病毒产生了明显的抑制效果。
表4
重组PRRSV 非洲猪瘟病毒滴度(CT值)
PRRSV-TRS6-HDV-QBH90618.1-shRNA-HHL 25.43
PRRSV-TRS6-HDV-QBH90538.1-shRNA-HHL 25.67
PRRSV-TRS6-HDV-QBH90535.1-shRNA-HHL 25.74
PRRSV-TRS6-EGFP 23.65
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (22)

  1. 一种用于治疗或预防非洲猪瘟的重组PRRSV，其特征在于，所述重组PRRSV包含在PRRSV基因组上插入的干扰RNA表达框架，所述干扰RNA表达框架包含干扰RNA与TRS序列；其中
    所述干扰RNA为干扰RNA一端或两端带有具有RNA切割活性的RNA序列；其中，
    当在干扰RNA一端带有具有RNA切割活性的RNA序列时，优选在干扰RNA另一端带有被RNA酶所识别的特征RNA序列；
    所述干扰RNA为所述致病病毒的干扰RNA；优选非洲猪瘟病毒的干扰RNA。
  2. 根据权利要求1所述的重组PRRSV，其特征在于，所述TRS包括TRS2、TRS3、TRS4、TRS5、TRS6或TRS7；优选为TRS6。
  3. 根据权利要求1所述的重组PRRSV，其特征在于，所述具有RNA切割活性的RNA序列为核酶，所述核酶选自丁型肝炎病毒(HDV)核酶、锤头型(HH)核酶、发卡核酶、Varkud卫星核酶、CPEB3核酶、CoTC核酶、或窦状芽孢杆菌glmS核酶，或它们中的两种或两种以上组合。
  4. 根据权利要求1所述的重组PRRSV，其特征在于，所述干扰RNA的两端各带有不同的核酶。
  5. 根据权利要求1所述的重组PRRSV，其特征在于，所述在干扰RNA的两端分别带有丁型肝炎病毒核酶和锤头型核酶。
  6. 根据权利要求1所述的重组PRRSV，其特征在于，所述被RNA酶所识别的特征RNA序列选自苯丙氨酸tRNA或csy4识别位点。
  7. 根据权利要求1所述的重组PRRSV，其特征在于，所述干扰RNA表达框架包含一个、两个或两个以上的干扰RNA；
    所述每个干扰RNA一端或两端带有具有RNA切割活性的RNA序列；其中当在干扰RNA一端带有具有RNA切割活性的RNA序列时，优选在干扰RNA另一端带有被RNA酶所识别的特征RNA序列。
  8. 根据权利要求1所述的重组PRRSV，其特征在于，所述干扰RNA 的形式为siRNA、saiRNA、G1、D1、D1L、shRNA、或shRNAL；优选siRNA、shRNA；最佳shRNA。
  9. 根据权利要求1所述的重组PRRSV，其特征在于，所述干扰RNA的靶基因选自非洲猪瘟病毒的如下基因：O174L、EP296R、E165R、K196R、EP152R、CP204L、A240L、MGF360-9L、MGF360-10L、MGF360-11L、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L、MGF360-18R、MGF505-1R、MGF505-2R、MGF505-3R、S273R、CP530R、B646L、NP419L、G1211R、F1055L、NP1450L、EP1242L、I243L、D250R、P1192R、M448R、或pA104R；优选F1055L、E165R、K196R。
  10. 根据权利要求1所述的重组PRRSV，其特征在于，所述干扰RNA具有SEQ ID NO:47～SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:118～SEQ ID NO:144中任一所示的序列，优选SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53～SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74～SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:118～SEQ ID NO:122、或SEQ ID NO:124～SEQ ID NO:144中任一所示的序列。
  11. 根据权利要求1所述的重组PRRSV，其特征在于，所述干扰RNA表达框架进一步包含在干扰RNA序列与TRS序列之间插入绿色荧光蛋白基因(EGFP)或Csy4外源性酶、或它们的组合。
  12. 根据权利要求1所述的重组PRRSV，其特征在于，所述重组PRRSV中的干扰RNA表达框架选自具有如下序列特征的序列：TRS6-EGFP-HDV-siRNA–HH；TRS6-EGFP-HDV-siRNA-HHL；TRS6-EGFP-HDV-G1-HH；TRS6-EGFP–HH-shRNA-HDV；TRS6-EGFP–HH-shRNAL-HDV；TRS6-EGFP-HDV-D1-HH；TRS6-EGFP-HDV-D1L-HH-；TRS6-EGFP-HDV-shRNA-HH；TRS6-EGFP-HDV-shRNAL-HH；TRS6-EGFP-HDV-HDV-shRNA-HH-HH；TRS6–HDV-shRNA-HH；TRS6-EGFP-HDV-shRNA-HH-HDV-shRNA–HH；TRS6–HDV-HDV-shRNA-HH；TRS6–HDV-shRNA-HHL；TRS6-EGFP-HDV-shRNA-HH-HDV-shRNA–HH-HDV-shRNA–HH；TRS6-EGFP-(HDV-shRNA–HH)*5；TRS6-EGFP-HDV-shRNA-tRNA；或TRS6-Csy4(外源性酶)-HDV-shRNA-csy4(识别位点)，优选TRS6-EGFP- HDV-shRNA-HH；TRS6-EGFP-HDV-shRNAL-HH；TRS6–HDV-shRNA-HHL；TRS6–HDV-shRNA-HH；TRS6-EGFP-HDV-shRNA-HH-HDV-shRNA–HH；TRS6-EGFP-HDV-shRNA-HH-HDV-shRNA–HH-HDV-shRNA–HH；TRS6-EGFP-(HDV-shRNA–HH)*5，最佳TRS6–HDV-shRNA-HHL。
  13. 根据权利要求1所述的重组PRRSV，其特征在于，所述重组PRRSV中的干扰RNA表达框架的序列是由选自如下任一所示的序列转录后获得的：SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:34～SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:110～111；优选SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46，最佳SEQ ID NO:44。
  14. 根据权利要求1所述的重组PRRSV，其特征在于，所述重组PRRSV中的干扰RNA表达框架选自具有如下序列特征的序列：TRS6-HDV-siRNA–HH；TRS6-HDV-siRNA-HHL；TRS6-HDV-G1-HH；TRS6-HDV-D1-HH；TRS6-HDV-D1L-HH；TRS6-HDV-shRNAL-HH；TRS6-HDV-HDV-shRNA-HH-HH；TRS6-HDV-shRNA-HH-HDV-shRNA–HH；TRS6-HDV-shRNA-HH-HDV-shRNA–HH-HDV-shRNA–HH；TRS6-(HDV-shRNA–HH)*5；或TRS6-HDV-shRNA-tRNA，优选TRS6-(HDV-shRNA–HH)*5。
  15. 根据权利要求1所述的重组PRRSV，其特征在于，所述重组PRRSV中的干扰RNA表达框架的序列是由选自如下任一所示的序列转录后获得的：SEQ ID NO:145～SEQ ID NO:155；优选SEQ ID NO:154。
  16. 根据权利要求1所述的重组PRRSV，其特征在于，所述重组PRRSV中的干扰RNA表达框架选自具有如下序列特征的序列：TRS6-HDV-QBH90618.1-shRNA-HHL、TRS6-HDV-QBH90538.1-shRNA-HHL、或TRS6-HDV-QBH90535.1-shRNA-HHL。
  17. 根据权利要求1所述的重组PRRSV，其特征在于，所述重组PRRSV中的干扰RNA表达框架的序列是由选自如下任一所示的序列转录后获得的：SEQ ID NO:165～SEQ ID NO:167。
  18. 权利要求1～17任一所述的重组PRRSV在制备治疗或预防非洲猪瘟的药物中的应用。
  19. 权利要求1～17任一所述的重组PRRSV的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
    1)选择非洲猪瘟病毒繁殖代谢必需的基因作为靶基因，根据靶基因序列设计干扰RNA序列，化学合成siRNA oligo，体外验证siRNA oligo对靶基因的干扰活性；
    2)根据siRNA序列设计shRNA序列；
    3)在siRNA序列或shRNA序列一端或两端插入核酶；然后将该所得RNA序列对应的DNA序列构建到PRRSV病毒表达载体，其中，
    当在siRNA序列或shRNA序列一端插入核酶时，优选另一端插入tRNA或csy4识别位点；
    进一步优选在siRNA序列或shRNA序列两端均插入核酶；
    4)通过病毒拯救获得重组PRRSV。
  20. 根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述步骤2)进一步包括：以siRNA互补序列作为正义链，使用shRNA常用的loop环(TTCAAGAGA)、mir30 loop环序列(GTGAAGCCACAGATG)或mir155 loop环序列(GTTTTGGCCACTGACTGAC)作为shRNA loop序列，siRNA序列作为反义链，3’末端添加两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸。
  21. 根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述shRNA loop序列选自SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:116、或SEQ ID NO:117。
  22. 一种治疗或预防非洲猪瘟的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1～17任一所述的重组PRRSV。
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