CN117929367A - 一种基于双酶催化的纳米pet塑料比色检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于双酶催化的纳米PET塑料比色检测方法，涉及分析检测技术领域。所述检测方法包括以下步骤：（1）取待测样品，调节pH值为5.2‑6.2，得待测样品溶液；（2）待测样品溶液中加入角质酶和脂肪酶，孵育，得孵育液；（3）将孵育液离心，得上清液；（4）将上清液与溴甲酚紫溶液混合，反应，得反应液；（5）测定反应液在430nm和590nm处的吸光光度值，计算OD₄₃₀/OD₅₉₀的比值；（6）将比值代入标准曲线，计算待测样品中纳米PET塑料浓度。本发明的检测方法能够简单、快速地测定出纳米PET含量，准确性高，测定成本低，具有良好的经济价值。

Description

一种基于双酶催化的纳米PET塑料比色检测方法

技术领域

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种基于双酶催化的纳米PET塑料比色检测方法。

背景技术

废弃PET塑料在太阳辐射、机械力和生物新陈代谢的作用下分解成更小的塑料碎片，形成微塑料（粒径为1μm-5mm）和纳米塑料（粒径为1nm-1μm），对人类健康构成极大威胁。与微塑料相比，纳米塑料尺寸更小、反应活性更高、流动性更大，因此毒性也更高。纳米PET塑料可穿过细胞膜，在血液中循环并渗透到其他器官，显示出细胞毒性和遗传毒性。此外，由于其较小的比表面，可以吸附和浓缩环境中更多的有毒污染物（持久性有机污染物、重金属等），从而表现出更强的毒性。

目前纳米塑料的检测方法主要有热解-气相色谱-质谱法（Py-GC/MS），如中国发明专利CN113109464B公开了一种用于定量分析环境水体中纳塑料的方法，该方法包括以下步骤：(1)采用蛋白质与环境水体中纳塑料结合形成蛋白冠的方法提取水中纳塑料；(2)采用盐析沉淀的方法使步骤(1)所得蛋白冠沉淀；(3)采用裂解气相色谱-质谱法对步骤(2)所得沉淀进行定量分析。此外相关检测方法还包括热解吸-质子转移反应-质谱法（TD-PTR/MS）、表面增强拉曼散射法（SERS）、扫描电镜法（SEM）和透射电镜法（TEM）。但这些方法有很多局限性，如需要大型高精尖仪器，需要熟练的技术人员操作，需要复杂的样品前处理，检测时间长、成本高等。

因此，迫切需要开发一种方便、快速、可靠且测定成本低的纳米PET塑料检测方法。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种基于双酶催化的纳米PET塑料比色检测方法，利用比色法即能够简单、快速地测定出纳米PET塑料的含量，准确性高，测定成本低，具有良好的经济价值。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一方面在于提供了一种基于双酶催化的纳米PET塑料比色检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

A1:取待测样品，调节pH值为5.2-6.2，得待测样品溶液；

A2:待测样品溶液中加入角质酶和脂肪酶，孵育，得孵育液；

A3:将孵育液离心，得上清液；

A4:将上清液与溴甲酚紫溶液混合，反应，得反应液；

A5:测定反应液在430nm和590nm处的吸光光度值，计算OD₄₃₀/OD₅₉₀的比值；

A6:将比值代入标准曲线，计算待测样品中纳米PET塑料浓度。

优选地，所述步骤A1中pH值为5.8-6.0，优选5.93。

优选地，所述步骤A1中待测样品是环境水样或食品样本。

进一步优选地，所述环境水样为湖水，所述食品样本选自啤酒、牛奶、蜂蜜、食盐或蛤蜊。

更进一步优选地，所述待测样品为环境水样或食品样本经进一步预处理得到，其中预处理具体为：湖水经过滤，蜂蜜或食盐溶解于超纯水，蛤蜊采用碱消化法消解。

优选地，所述步骤A1中调节pH的试剂为稀盐酸或氢氧化钠。

优选地，所述步骤A2中角质酶来源于黑曲霉菌（Humicola insolens），终浓度为80-150 μg/mL，脂肪酶来源于南极假丝酵母（Candida antarctica），终浓度为130-210 μg/mL。其中角质酶终浓度为100 μg/mL、脂肪酶终浓度为160 μg/mL为最佳。

优选地，所述步骤A2中，孵育为磁力搅拌孵育，孵育温度为35-45 ℃，孵育时间为1-3 h。

优选地，所述步骤A4中，溴甲酚紫溶液的浓度为1-3 mg/mL，上清液与溴甲酚紫溶液的体积比为10-20:1，反应20-40min。

优选地，所述步骤A6中标准曲线通过以下步骤建立：

B1:取系列浓度纳米PET塑料标准品，调节pH值为5.2-6.2，得系列浓度纳米PET塑料标准品溶液；

B2:向纳米PET塑料标准品溶液中加入角质酶和脂肪酶，孵育，得孵育液；

B3:将孵育液离心，收集上清液；

B4:将上清液与溴甲酚紫溶液混合，反应，得反应液；

B5:测定反应液在430nm和590nm处的吸光光度值，计算OD₄₃₀/OD₅₉₀的比值；

B6:将纳米PET塑料标准品浓度与OD₄₃₀/OD₅₉₀比值回归，即得标准曲线。

进一步优选地，所述步骤B1中系列浓度纳米PET塑料标准品的制备步骤如下：

C1:称取直径为60-80毫米PET颗粒，加入到六氟异丙醇中，PET颗粒的质量与六氟异丙醇的体积比为15-25mg:1mL，涡旋至溶解；

C2:将该溶液在150-160W超声波功率下超声，加到冰超纯水中，形成乳白色悬浮液；

C3:将悬浮液涡旋后去除沉淀，在55-65℃下旋蒸25-35分钟，得到的溶液在15000-16000 rpm转速下离心8-12分钟，收集离心后的沉淀物，得到合成的纳米PET；

C4:纳米PET悬浮在超纯水中，得到纳米PET母液，超纯水稀释，得到系列浓度的纳米PET塑料标准品。

优选地，所述步骤C2中超声时间为20-30min。

优选地，所述步骤C2中冰超纯水的体积为所述六氟异丙醇体积的4-6倍。

优选地，所述步骤C4中系列浓度的纳米PET塑料标准品的浓度范围为0-2 mg/mL。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：（1）本发明首次提出了一种基于双酶催化纳米PET塑料，通过酸碱指示剂显色检测纳米PET塑料的比色快速检测方法；（2）较传统的检测方法，本发明不需要昂贵的设备，测定成本低；检测时间短，全程只需要3个多小时；操作简单便捷；方法可靠，检测限LOD值为22.84 μg/mL，实际样本中的平均回收率为95.61%，平均变异系数为6.83%；（3）本发明检测方法除了利用酶标仪进行准确定量外，还具有裸眼检测能力，裸眼检出限为31 μg/mL。本发明的检测方法利用角质酶和脂肪酶对溶液样品进行孵育后，利用比色法即能够简单、快速地测定出纳米PET塑料的含量，准确性高，测定成本低，具有良好的经济价值。

附图说明

图1不同超声时间对纳米PET尺寸的影响；

图2不同时间经角质酶和脂肪酶处理后的纳米PET残留量；

图3角质酶和不同浓度的脂肪酶联合水解2小时后，纳米PET溶液中对苯二甲酸（TPA）、对苯二甲酸单（2-羟乙基）酯（MHET）和对苯二甲酸二（2-羟乙基）酯（BHET）的百分含量变化图；

图4不同初始浓度的纳米PET溶液经双酶水解后的液相色谱图；

图5对苯二甲酸峰面积与不同浓度纳米PET的线性回归直线图；

图6不同温度、不同pH值下角质酶和脂肪酶的活性；

图7标准曲线示意图；

图8湖水样本中的标准曲线示意图；

图9啤酒样本中的标准曲线示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中己有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。

实施例1制备纳米PET塑料标准品

合成步骤如下：

1）称取100 mg的PET颗粒（直径约为70毫米），加入到5 mL的六氟异丙醇中，涡旋至溶解；

2）将该溶液在154 W超声波功率下超声，缓慢滴加到20 mL的冰超纯水中，形成乳白色悬浮液；

3）将悬浮液涡旋15分钟后去除沉淀，然后在60℃下旋蒸30分钟；

4）得到的溶液在15500 rpm转速下离心10分钟，收集合成的纳米PET，重新悬浮在1mL超纯水中。

结果如图1所示，不同尺寸的纳米PET通过调控不同的超声时间制备，本发明超声时间为20-30min。

实施例2双酶催化纳米PET产生对苯二甲酸

实验过程：

1）超纯水体系中分别加入终浓度为1 mg/mL纳米PET、1 mg/mL纳米PET+100 μg/mL角质酶、1 mg/mL纳米PET+100 μg/mL角质酶+160 μg/mL脂肪酶。三个实验组分别在40℃条件下磁力搅拌孵育2小时，然后测定孵育液的pH。

2）超纯水体系中加入终浓度为1 mg/mL纳米PET+100 μg/mL角质酶+160 μg/mL脂肪酶，然后在40℃条件下磁力搅拌分别孵育1小时、2小时、4小时、8小时。孵育液经15500rpm离心10分钟，去掉上清，沉淀重新悬浮在1 mL超纯水中，恒重法分别测定四个实验组的纳米PET质量。

3）超纯水体系中加入终浓度为1 mg/mL纳米PET+50 μg/mL角质酶+系列终浓度的脂肪酶，其中脂肪酶终浓度系列分别为0、2、5、8、14、20、40 μg/mL。7个实验组均在40℃条件下磁力搅拌孵育2小时，孵育液经15500 rpm离心10分钟，收集上清液，进行高效液相色谱分析，计算纳米PET溶液中对苯二甲酸（TPA）、对苯二甲酸单（2-羟乙基）酯（MHET）和对苯二甲酸二（2-羟乙基）酯（BHET）的百分比。

4）超纯水体系中加入系列终浓度的纳米PET+终浓度为100 μg/mL角质酶+终浓度为160 μg/mL脂肪酶，其中纳米PET系列终浓度分别为0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6、51.2 μg/mL。8个实验组均在40℃条件下磁力搅拌孵育2小时。孵育液经15500 rpm离心10分钟，收集上清液进行高效液相色谱分析。

结果：

步骤1）结果如表1所示。

表1不同酶反应条件下反应体系中pH值的变化

根据表1的结果，用角质酶降解纳米PET时，样品溶液的pH值从6.6降至5.0，而用角质酶和脂肪酶联合降解纳米PET时，pH值明显降低至4.2，表明脂肪酶能有效水解对苯二甲酸单（2-羟乙基）酯（MHET）生成更多的对苯二甲酸。

步骤2）结果如图2所示，经过角质酶和脂肪酶处理1、2、4、8小时后，纳米PET的残留量分别为77%、55%、28%和15%，表明角质酶和脂肪酶的协同催化效率很高。

步骤3）结果如图3所示，当脂肪酶的终浓度从2 μg/mL增加到40 μg/mL时，对苯二甲酸单（2-羟乙基）酯（MHET）的量逐渐减少，而对苯二甲酸（TPA）的量逐渐增加，对苯二甲酸二（2-羟乙基）酯（BHET）的量基本不变，这表明脂肪酶可以促进纳米PET在水解反应中生成对苯二甲酸。

步骤4）结果如图4所示，当纳米PET的终浓度增大时，所产生的对苯二甲酸的量也不断增大；且对苯二甲酸的生成量与纳米PET的终浓度呈良好的线性关系，表明对苯二甲酸的生成量可以反映纳米PET的实际浓度（如图5所示）。

实施例3角质酶和脂肪酶最适反应条件的优化

考察不同温度对角质酶和脂肪酶催化活性的影响：4-硝基苯丁酸酯作为角质酶和脂肪酶活性检测的底物。将250 mg的曲拉通X-100溶于20 mL的磷酸缓冲溶液（50 mM，pH7.0）中，然后在磁力搅拌器上以250转/分的转速搅拌15分钟（室温），直到表面活性剂完全溶解；将2 μL的4-硝基苯丁酸酯溶于1 mL的丙酮，然后加入到上述曲拉通X-100溶液中，混合溶液搅拌10分钟，得到底物溶液；将角质酶或脂肪酶（200 μL，0.04 mg/mL）置于25-100℃的水浴中孵育30分钟；然后将20 μL的酶溶液与480 μL的底物溶液混合；用紫外可见分光光度计即时监测混合物在348nm波长处的吸光度。不同温度下角质酶的活性如图6中的A所示，不同温度下脂肪酶的活性如图6中的B所示。

考察不同pH对角质酶和脂肪酶催化活性的影响：用上述同样的方法制得底物溶液；在磷酸钠缓冲液（200 μL，10 mM， pH 2-9）中加入酶（2 μL，4 mg/mL），在25℃孵育2小时；然后将20 μL的酶缓冲溶液与480 μL的底物溶液混合；用紫外可见分光光度计即时监测混合物在348nm波长处的吸光度。不同pH值下角质酶的活性如图6中的C所示，不同pH值下脂肪酶的活性如图6中的D所示。

根据图6的结果可知，在pH值3-8范围内，角质酶和脂肪酶都具有很高的活性。角质酶在40-80℃时表现出良好的活性，而脂肪酶的温度超过50℃时活性急剧下降。因此，选择35-45℃作为双酶催化系统的反应温度。

实施例4角质酶和脂肪酶浓度的优化

步骤如下：

1）超纯水体系中加入终浓度为1 mg/mL纳米PET+系列终浓度角质酶+系列终浓度脂肪酶，其中，角质酶终浓度分别为50、100、150、200 μg/mL，脂肪酶的终浓度分别为110、160、210、260 μg/mL，在40℃条件下磁力搅拌孵育2小时，得孵育液；

2）将孵育液经过16000 rpm离心10分钟后收集上清液；

3）将上清液（100 μL）与溴甲酚紫（BCP）溶液（5 μL，2 mg/mL）在96孔板内混合，在室温条件下反应30分钟；

4）利用酶标仪测量反应后溶液在430nm和590nm处的吸光度值，计算OD₄₃₀/OD₅₉₀的比值。然后计算B/B₀值（B代表实验组的OD₄₃₀/OD₅₉₀值，B₀代表对照组的OD₄₃₀/OD₅₉₀值）。

所述对照组实验步骤如下：

1）超纯水体系中（不含纳米PET）加入系列终浓度角质酶和系列终浓度脂肪酶，其中，角质酶终浓度分别为50、100、150、200 μg/mL，脂肪酶的终浓度分别为110、160、210、260μg/mL，在40℃条件下磁力搅拌孵育2小时，得孵育液；

2）将孵育液经过16000 rpm离心10分钟后收集上清液；

3）将上清液（100 μL）与溴甲酚紫（BCP）溶液（5 μL，2 mg/mL）在96孔板内混合，在室温条件下反应30分钟；

4）利用酶标仪测量反应后溶液在430nm和590nm处的吸光度值，计算OD₄₃₀/OD₅₉₀的比值。

通过棋盘格实验优化纳米PET水解反应中角质酶和脂肪酶的浓度，实验结果如表2所示。

表2角质酶和脂肪酶浓度的优化

如上表所示，当双酶系统中角质酶浓度为80-150 μg/mL，脂肪酶浓度为130-210 μg/mL，根据数据趋势，可知B/B₀值均在20以上。其中角质酶浓度为100 μg/mL、脂肪酶浓度为160 μg/mL为最佳，B/B₀值达到了27.59，表明在此浓度下，两种酶对纳米PET的协同催化活性最好。

实施例5样品溶液初始pH值的优化。

步骤如下：

1）超纯水体系中加入终浓度为100 μg/mL的角质酶和160 μg/mL的脂肪酶，不加入纳米PET，通过加入盐酸和氢氧化钠调节溶液pH值为4.99-6.26，在40℃条件下磁力搅拌孵育2小时，得孵育液；

2）按照实施例4中同样的方法测量溶液在430nm和590nm处的吸光度值，计算OD₄₃₀/OD₅₉₀的比值。

实验结果如表3所示。

表3样品溶液初始pH值的优化

当pH值从6.26逐渐降至5.93时，溴甲酚紫溶液的颜色从紫色变为青色，当pH值进一步降低到4.99时，溴甲酚紫溶液的颜色由青色变为明亮的黄色。当pH值为5.93时，OD₄₃₀/OD₅₉₀的值约为1（OD₄₃₀值为1.12，OD₅₉₀值为1.14），表明溴甲酚紫的颜色达到了平衡敏感点。

实施例6标准曲线的建立

步骤如下：

1）配制1 mL浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2 mg/mL纳米PET塑料标准品溶液，调节pH为5.93；

2）向各标准品溶液中加入250 μL的600 μg/mL角质酶和250 μL的960 μg/mL脂肪酶，使角质酶和脂肪酶的终浓度分别为100 μg/mL和160 μg/mL，在40℃条件下磁力搅拌孵育2小时，得孵育液；

3）将孵育液经过16000 rpm离心10分钟后收集上清液；

4）将上清液（100 μL）与溴甲酚紫（BCP）溶液（5 μL，2 mg/mL）在96孔板内混合，在室温条件下反应30分钟；

5）利用酶标仪测量反应后溶液在430nm和590nm处的吸光度值，计算OD₄₃₀/OD₅₉₀的比值；

6）建立纳米PET塑料浓度与OD₄₃₀/OD₅₉₀比值的标准曲线。

结果如图7所示，本方法纳米PET塑料的标准曲线方程为y=18.973-18.346/(1+(x/0.119)^2.603)，其中x为纳米PET塑料浓度，y为OD₄₃₀/OD₅₉₀比值，相关系数R²=0.983，检测限LOD为22.84 μg/mL。

实施例7检测方法的建立

步骤如下：

1）取待测样品溶液1 mL，调节样品pH为5.93；

2）向样品中加入250 μL的600 μg/mL角质酶和250 μL的960 μg/mL脂肪酶，使角质酶和脂肪酶的终浓度分别为100 μg/mL和160 μg/mL，在40℃条件下磁力搅拌孵育2小时，得孵育液；

3）将孵育液经过16000 rpm离心10分钟后收集上清液；

4）将上清液（100 μL）与溴甲酚紫（BCP）溶液（5 μL，2 mg/mL）在96孔板内混合，在室温条件下反应30分钟；

5）利用酶标仪测量反应后溶液在430nm和590nm处的吸光度值，计算OD₄₃₀/OD₅₉₀的比值；

6）将比值代入标准曲线，计算得到待测溶液样品中纳米PET塑料浓度。

实施例8检测方法的特异性实验

步骤如下：

1）分别配制1 mL的40 μg/mL、60 μg/mL、120 μg/mL的纳米PP、纳米PVC、纳米PS、纳米PE样品溶液，调节样品pH为5.93；

2）按照实施例7建立的方法检测其中纳米塑料的含量。

结果如表4所示，样品溶液中均未检出纳米塑料，表明本方法具有良好的特异性。

表4检测不同种类纳米塑料信息

实施例9检测不同尺寸的纳米PET

步骤如下：

1）分别配制1 mL的40μg/mL、60μg/mL、120μg/mL尺寸为10nm、100nm、1μm的PET样品溶液，调节样品pH为5.93；

2）按照实施例7建立的方法检测其中纳米PET的含量。

结果如表5所示。

表5不同尺寸纳米PET样品中加标回收率信息

对于不同尺寸的纳米PET，本方法均能检出，对上述样品的回收率在87.43%-108.72%的范围内，CV在3.97%-9.01%的范围内，准确性高。

实施例10基于双酶催化的纳米PET塑料比色检测实例

以湖水、啤酒、牛奶、蜂蜜、食盐、蛤蜊为样品。样品经过预处理后得到样品溶液，然后向其中加入一定量的纳米PET，按照实施例7的方法计算待测样品溶液中纳米PET的浓度，每份样品测定三次，计算CV和回收率。所述预处理方法为：湖水经过滤后；啤酒和牛奶无需预处理；分别取100 mg蜂蜜和食盐溶解在1 mL超纯水中得到蜂蜜和食盐的溶液样品；蛤蜊采用碱消化法消解后得到。

所述碱消化法是中国发明专利申请CN 112229921 A所公开的方法。

实际样品湖水、啤酒、牛奶、蜂蜜、食盐、蛤蜊中加标回收率信息见表6。湖水及啤酒的标准曲线如图8、图9所示。由表6可知，本发明的检测方法对上述样品的回收率在81.23%-110.15%的范围内，CV在2.64%-10.86%的范围内，准确性高，有较好的应用前景。

表6实际样品中加标回收率信息

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种基于双酶催化的纳米PET塑料比色检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：

A1:取待测样品，调节pH值为5.2-6.2，得待测样品溶液；

A2:待测样品溶液中加入角质酶和脂肪酶，孵育，得孵育液；

A3:将孵育液离心，得上清液；

A4:将上清液与溴甲酚紫溶液混合，反应，得反应液；

A5:测定反应液在430nm和590nm处的吸光光度值，计算OD₄₃₀/OD₅₉₀的比值；

A6:将比值代入标准曲线，计算待测样品中纳米PET塑料浓度。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤A1中pH值为5.8-6.0。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤A1中待测样品为环境水样或食品样本。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述环境水样为湖水，所述食品样本选自啤酒、牛奶、蜂蜜、食盐或蛤蜊。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤A1中调节pH的试剂为稀盐酸或氢氧化钠。

6. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤A2中角质酶来源于黑曲霉菌，终浓度为80-150 μg/mL，脂肪酶来源于南极假丝酵母，终浓度为130-210 μg/mL。

7. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤A2中，孵育为磁力搅拌孵育，孵育温度为35-45 ℃，孵育时间为1-3 h。

8. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤A4中，溴甲酚紫溶液的浓度为1-3 mg/mL，上清液与溴甲酚紫溶液的体积比为10-20:1，反应20-40min。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤A6中标准曲线通过以下步骤建立：

B1:取系列浓度纳米PET塑料标准品，调节pH值为5.2-6.2，得系列浓度纳米PET塑料标准品溶液；

B2:向纳米PET塑料标准品溶液中加入角质酶和脂肪酶，孵育，得孵育液；

B3:将孵育液离心，收集上清液；

B4:将上清液与溴甲酚紫溶液混合，反应，得反应液；

B5:测定反应液在430nm和590nm处的吸光光度值，计算OD₄₃₀/OD₅₉₀的比值；

B6:将纳米PET塑料标准品浓度与OD₄₃₀/OD₅₉₀比值回归，即得标准曲线。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述步骤B1中系列浓度纳米PET塑料标准品的制备步骤如下：

C1:称取直径为60-80毫米PET颗粒，加入到六氟异丙醇中，PET颗粒的质量与六氟异丙醇的体积比为15-25mg:1mL，涡旋至溶解；

C2:将该溶液在150-160W超声波功率下超声，加到冰超纯水中，形成乳白色悬浮液；

C3:将悬浮液涡旋后去除沉淀，在55-65℃下旋蒸25-35分钟，得到的溶液在15000-16000 rpm转速下离心8-12分钟，收集离心后的沉淀物，得到合成的纳米PET；

C4:纳米PET悬浮在超纯水中，得到纳米PET母液，超纯水稀释，得到系列浓度的纳米PET塑料标准品。