CN117925741A - 辛弗林合成方法及其合成辛弗林的工程菌 - Google Patents
辛弗林合成方法及其合成辛弗林的工程菌 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117925741A CN117925741A CN202410087585.9A CN202410087585A CN117925741A CN 117925741 A CN117925741 A CN 117925741A CN 202410087585 A CN202410087585 A CN 202410087585A CN 117925741 A CN117925741 A CN 117925741A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tyrosine
- synephrine
- bacteria
- pet28a
- phenylethanolamine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 title claims abstract description 9
- YRCWQPVGYLYSOX-UHFFFAOYSA-N synephrine Chemical compound CNCC(O)C1=CC=C(O)C=C1 YRCWQPVGYLYSOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 92
- 229960003684 oxedrine Drugs 0.000 title claims description 46
- 238000012545 processing Methods 0.000 title description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims abstract description 33
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 33
- 102100028917 Phenylethanolamine N-methyltransferase Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 108010015720 Dopamine beta-Hydroxylase Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 102100033156 Dopamine beta-hydroxylase Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 108010002822 Phenylethanolamine N-Methyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 108010035075 Tyrosine decarboxylase Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 28
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 6
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 5
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 5
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 5
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 claims description 4
- 102100030310 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Human genes 0.000 claims description 3
- 108050005273 Amino acid transporters Proteins 0.000 claims description 3
- 102000034263 Amino acid transporters Human genes 0.000 claims description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 101000773083 Homo sapiens 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 claims description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 abstract description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 abstract description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- DZGWFCGJZKJUFP-UHFFFAOYSA-N tyramine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C=C1 DZGWFCGJZKJUFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 10
- 101100208389 Arabidopsis thaliana TYRDC gene Proteins 0.000 description 9
- 101150078923 TYDC gene Proteins 0.000 description 9
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 9
- 101001123678 Homo sapiens Phenylethanolamine N-methyltransferase Proteins 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- QHGUCRYDKWKLMG-QMMMGPOBSA-N (R)-octopamine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C=C1 QHGUCRYDKWKLMG-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QHGUCRYDKWKLMG-MRVPVSSYSA-N Octopamine Natural products NC[C@@H](O)C1=CC=C(O)C=C1 QHGUCRYDKWKLMG-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 229960001576 octopamine Drugs 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 229960003732 tyramine Drugs 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- KWGRBVOPPLSCSI-WPRPVWTQSA-N (-)-ephedrine Chemical compound CN[C@@H](C)[C@H](O)C1=CC=CC=C1 KWGRBVOPPLSCSI-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 4
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000183685 Citrus aurantium Species 0.000 description 3
- 235000007716 Citrus aurantium Nutrition 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 2
- 241000965476 Darksidea beta Species 0.000 description 2
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- KWGRBVOPPLSCSI-UHFFFAOYSA-N d-ephedrine Natural products CNC(C)C(O)C1=CC=CC=C1 KWGRBVOPPLSCSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 229960002179 ephedrine Drugs 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 2
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- ARGKVCXINMKCAZ-UHFFFAOYSA-N neohesperidine Natural products C1=C(O)C(OC)=CC=C1C1OC2=CC(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)OC3C(C(O)C(O)C(C)O3)O)=CC(O)=C2C(=O)C1 ARGKVCXINMKCAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 235000007682 pyridoxal 5'-phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011589 pyridoxal 5'-phosphate Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- PAFLSMZLRSPALU-MRVPVSSYSA-N (2R)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)lactic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 PAFLSMZLRSPALU-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 1
- 239000001100 (2S)-5,7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-4-one Substances 0.000 description 1
- UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N (R)-adrenaline Chemical compound CNC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182837 (R)-adrenaline Natural products 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000221955 Chaetomium Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 238000005618 Fries rearrangement reaction Methods 0.000 description 1
- QUQPHWDTPGMPEX-UHFFFAOYSA-N Hesperidine Natural products C1=C(O)C(OC)=CC=C1C1OC2=CC(OC3C(C(O)C(O)C(COC4C(C(O)C(O)C(C)O4)O)O3)O)=CC(O)=C2C(=O)C1 QUQPHWDTPGMPEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 1
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N S-adenosyl-L-methioninate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[S+](CC[C@H](N)C([O-])=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N 0.000 description 1
- PAFLSMZLRSPALU-UHFFFAOYSA-N Salvianic acid A Natural products OC(=O)C(O)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 PAFLSMZLRSPALU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- 229930003270 Vitamin B Natural products 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001570 ademetionine Drugs 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 150000003797 alkaloid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 102000004305 alpha Adrenergic Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000861 alpha Adrenergic Receptors Proteins 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- DFNYGALUNNFWKJ-UHFFFAOYSA-N aminoacetonitrile Chemical compound NCC#N DFNYGALUNNFWKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- QUQPHWDTPGMPEX-UTWYECKDSA-N aurantiamarin Natural products COc1ccc(cc1O)[C@H]1CC(=O)c2c(O)cc(O[C@@H]3O[C@H](CO[C@@H]4O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]4O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]3O)cc2O1 QUQPHWDTPGMPEX-UTWYECKDSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 102000012740 beta Adrenergic Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010079452 beta Adrenergic Receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000000035 biogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- APSNPMVGBGZYAJ-GLOOOPAXSA-N clematine Natural products COc1cc(ccc1O)[C@@H]2CC(=O)c3c(O)cc(O[C@@H]4O[C@H](CO[C@H]5O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]5O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]4O)cc3O2 APSNPMVGBGZYAJ-GLOOOPAXSA-N 0.000 description 1
- 238000013373 clone screening Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.[Cu+2].[O-]S([O-])(=O)=O JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 229960005139 epinephrine Drugs 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940025878 hesperidin Drugs 0.000 description 1
- VUYDGVRIQRPHFX-UHFFFAOYSA-N hesperidin Natural products COc1cc(ccc1O)C2CC(=O)c3c(O)cc(OC4OC(COC5OC(O)C(O)C(O)C5O)C(O)C(O)C4O)cc3O2 VUYDGVRIQRPHFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QUQPHWDTPGMPEX-QJBIFVCTSA-N hesperidin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC=C1[C@H]1OC2=CC(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@H]4[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O4)O)O3)O)=CC(O)=C2C(=O)C1 QUQPHWDTPGMPEX-QJBIFVCTSA-N 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000036543 hypotension Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- ARGKVCXINMKCAZ-UZRWAPQLSA-N neohesperidin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC=C1[C@H]1OC2=CC(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O[C@H]3[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O3)O)=CC(O)=C2C(=O)C1 ARGKVCXINMKCAZ-UZRWAPQLSA-N 0.000 description 1
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 description 1
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229960001327 pyridoxal phosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 1
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及生物技术领域，公开了辛弗林合成方法及其合成辛弗林的工程菌，该方法以酪氨酸为底物，通过酪氨酸脱羧酶、多巴胺β单加氧酶以及苯乙醇胺N‑甲基转移酶三个酶的催化下合成辛弗林，还可以将酪氨酸脱羧酶、多巴胺β单加氧酶以及苯乙醇胺N‑甲基转移酶的编码基因在合成酪氨酸的微生物中外源表达，获得以葡萄糖从头合成辛弗林的工程菌，实现生物合成辛弗林的技术路线。
Description
技术领域
本发明涉及发酵工程领域，具体涉及辛弗林合成方法，还涉及合成辛弗林的工程菌。
背景技术
辛弗林作为我国传统中药材枳实(Fructus Aurantii Immatures，FAI)中含量最高、最活跃的生物碱，是枳实中起主要药理作用的有效成分，具有升高血压、促进心血管兴奋等作用，因而常用于治疗低血压等病症。由于结构与肾上腺素、去甲肾上腺素以及麻黄碱相似，辛弗林还被发现能够加快心率，促进血液循环，氧化脂肪，增加能量水平，从而药理作用表现为肾上腺素α受体、心脏β受体兴奋剂，可代替麻黄碱作为一种中枢神经兴奋药使用并用于临床急救。同时研究表明辛弗林具有一定的抗氧化、降血糖、减肥功效作用。
目前，辛弗林的生产主要为化学合成法和物理提取法，由于辛弗林在枳实等作物中含量很低，采用提取方法存在提取成本高、含量低、污染大等问题；如中国专利CN115043889B报道从代代花中提取辛弗林，辛弗林含量仅为0.6％；中国专利CN105399787A公开了一种从柑橘皮、果中提取新橙皮苷、橙皮苷和辛弗林的方法，辛弗林含量收率也仅为2.5％，产品纯度和收率均很低。化学合成法主要包括直接酰化法、氨基乙腈法、Fries重排法等，苯酚为起始原料，也存在反应毒性大、环境污染等问题。因此需要开发高效的绿色生产方法。
合成生物学技术以低成本的葡萄糖等为原料，通过微生物底盘菌株合成目的产物，不仅反应条件温和、绿色环保，还具有高效、易于调控等优势。目前尚未有通过生物发酵的方法来生产辛弗林的研究出现。本发明以产酪氨酸的大肠杆菌为出发菌株，搭建一条从葡萄糖从头合成辛弗林的生物合成路线，从而实现绿色高效生物合成辛弗林。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种辛弗林合成方法；本发明的目的之二在于提供酪氨酸脱羧酶、多巴胺-β-单加氧酶和苯乙醇胺-N-甲基转移酶联合在产酪氨酸菌中重建辛弗林代谢途径中的应用；本发明的目的之三在于提供一种合成辛弗林的工程菌。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、辛弗林合成方法，以酪氨酸为底物，依次在酪氨酸脱羧酶、多巴胺-β-单加氧酶和苯乙醇胺-N-甲基转移酶催化下合成辛弗林。
2、酪氨酸脱羧酶、多巴胺-β-单加氧酶和苯乙醇胺-N-甲基转移酶联合在产酪氨酸菌中重建辛弗林代谢途径中的应用。
本发明优选的，所述酪氨酸脱羧酶的氨基酸如SEQ ID No.1所示；所述多巴胺-β-单加氧酶的氨基酸如SEQ ID No.2所示；所述苯乙醇胺-N-甲基转移酶的氨基酸如SEQ IDNo.3所示。
本发明优选的，编码表达所述酪氨酸脱羧酶的核苷酸如SEQ ID No.5所示；编码表达所述多巴胺-β-单加氧酶的核苷酸如SEQ ID No.6所示；编码表达所述苯乙醇胺-N-甲基转移酶的核苷酸如SEQ ID No.7所示。
本发明优选的，所述产酪氨酸菌选自酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌。
3、一种合成辛弗林的工程菌，所述工程菌以产酪氨酸菌株作为底盘菌，在底盘菌中同时表达酪氨酸脱羧酶、多巴胺-β-单加氧酶和苯乙醇胺-N-甲基转移酶，获得产辛弗林的工程菌。
本发明优选的，所述底盘菌为酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌。
本发明优选的，所述底盘菌为过表达酪氨酸转运蛋白TYRP以及芳香族氨基酸转运蛋白AROP的BAK11菌。
本发明优选的，所述工程菌由以下方法构建：将酪氨酸脱羧酶编码基因连接于pET28a质粒，得到MBP-TYDC-pet28a重组质粒，然后将多巴胺-β-单加氧酶编码基因扩增后通过重组整合入线性化MBP-TYDC-pet28a重组质粒中，EnaseⅡ连接后得到MTD-pet28a质粒，然后将苯乙醇胺-N-甲基转移酶编码基因通过重组整合入MTD-pet28a线性化质粒中，得到MTD-MP-pet28a重组质粒，转入BAK11(DE3)菌株，得到工程菌株BAK11-TAS。
本发明优选的，所述线性化MBP-TYDC-pet28a重组质粒是用SacⅠ和HindⅢ线性化；所述MTD-pet28a线性化质粒是用HindⅢ和XhoⅠ线性化。
本发明的有益效果在于：本发明公开了由酪氨酸生物转化为辛弗林的催化路线，实现了生物发酵法合成辛弗林的从无到有，并结合了高产酪氨酸的底盘菌株，从而实现了以廉价原料葡萄糖合成辛弗林的从头合成。该工程菌基于高产酪氨酸的底盘，异源表达酪氨酸脱羧酶、多巴胺β-单加氧酶以及苯乙醇胺N-甲基转移酶，实现微生物底盘能够以葡萄糖为原料从头合成辛弗林。同时本发明也适用于其他菌株如酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌等模式或其他非模式底盘微生物进一步改造酪氨酸生物合成途径，实现生物合成辛弗林的技术路线。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为所述工程菌的重组质粒构建示意图；
图2为SDS-PAGE电泳图(A：DβH蛋白和TYDC蛋白表达的SDS-PAGE电泳图；B：PNMT蛋白表达的SDS-PAGE电泳图)；
图3为MBP-DβH融合蛋白、MBP-TYDC融合蛋白表达和MBP-PNMT融合蛋白的SDS-PAGE电泳图；
图4为MTD共表达蛋白和MTD-MP共表达蛋白的SDS-PAGE电泳图；
图5为TYDC酶生物转化底物酪氨酸的HPLC图谱及产物酪胺的MS图谱(A：HPLC图谱；B：MS图谱)；
图6为DβH酶生物转化底物酪胺为章鱼胺的HPLC图谱；
图7为PNMT酶生物转化底物章鱼胺的HPLC图谱及产物辛弗林的MS图谱(A：HPLC图谱；B：MS图谱)；
图8为TYDC酶和DβH酶共表达后生物转化底物酪氨酸为产物章鱼胺的HPLC图谱；
图9为TYDC酶、DβH酶以及PNMT酶共表达后生物转化底物酪氨酸为产物辛弗林的HPLC图谱；
图10为酪氨酸脱羧酶、多巴胺β-单加氧酶以及苯乙醇胺N-甲基转移酶生物转化酪氨酸为辛弗林的反应途径示意图；
图11为重组工程菌利用葡萄糖从头合成辛弗林的代谢路径图；
图12为检测发酵液中辛弗林的HPLC图谱及MS图谱(A：HPLC图谱；B：MS图谱)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1、基于高产酪氨酸底盘菌株BAK11生产辛弗林的重组大肠杆菌构建
本发明受柑橘中的生物胺成分启发，结合相关成分的化学结构式以及文献调研，设计了从酪氨酸出发辛弗林的生物合成路线。
本发明以高产酪氨酸底盘BAK11-TA为出发菌株，因此只需要成功搭建由酪氨酸生物转化为辛弗林的外源途径，即可实现辛弗林以葡萄糖为原料的从头生物合成。
TYDC、DβH以及PNMT由苏州金唯智公司进行全基因合成并针对大肠杆菌的密码子偏好性进行密码子优化，优化后的基因序列分别如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6所示，编码的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示。首先将TYDC、DβH以及PNMT基因构建于pET21c载体，进行蛋白表达测试。具体构建过程为，根据同源重组原理设计引物后，进行目的片段TYDC、DβH以及PNMT的PCR扩增，扩增过程使用的引物如表1所示。
表1、目的片段PCR扩增引物
同时使用Takara公司的Quickcut NdeⅠ和BamHⅠ对质粒pET21c质粒进行双酶切，37℃水浴反应45min。对目的片段和载体进行DNA琼脂糖凝胶电泳，并进行产物纯化回收。对纯化后的目的片段和载体使用单片段克隆试剂盒进行重组连接，37℃水浴反应45min。反应结束后将整个反应体系转化于E.Coli DH10B感受态细胞中，静置30min后，添加液体LB培养基并于37℃摇床中，100rpm/min孵育1h，涂布于终浓度为100μg/mL羧苄青霉素的固体LB平板上进行阳性克隆筛选。随机挑选正确的阳性克隆，提取质粒后送测序分析，并分别命名为TYDC-pet21c、DβH-pet21c和PNMT-pet21c。将测序正确的转化子转化于E.Coli Rosetta感受态细胞中，得到菌株TYDC-pet21c-Rosetta、DβH-pet21c-Rosetta和PNMT-pet21c-Rosetta，对其转接至TB培养基后进行诱导表达，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行蛋白表达情况检测(图2)。
融合表达来自大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白(MBP)以增加异源蛋白的可溶性表达。因此分别构建了三个蛋白的可溶性表达质粒，构建过程同上。区别在于此次构建使用pet28a质粒，并用限制性内切酶Quickcut NcoⅠ和EcoRⅠ进行双酶切。重组连接则使用多片段克隆试剂盒进行连接，其余过程同上，融合蛋白的表达情况如图3。
共表达质粒构建过程也与之类似。具体过程为：在已构建的MBP-TYDC-pet28a的重组质粒基础之上，使用限制性内切酶Quickcut SacⅠ和Quickcut HindⅢ将其线性化，使用新的引物扩增目的片段DβH后，对二者进行产物回收并纯化，随即用于重组，通过单片段克隆试剂盒中的EnaseⅡ进行连接，进一步培养后得到的阳性转化子经质粒提取后送测序分析，即成功构建得到MTD-pet28a。随后，使用制性内切酶Quickcut HindⅢ和Quickcut XhoⅠ使MTD-pet28a重组质粒线性化，与纯化后的新扩增的PNMT片段进行重组连接，最终得到重组质粒MTD-MP-pet28a。转化底盘菌BAK11-TA菌株，获得含MTD-MP-pet28a的工程菌BAK11-TAS。BAK11-TA使用赵广荣教授团队发表的文章(Chromosome engineering ofEscherichia coli for constitutive production of salvianic acid A.MicrobialCell Factories,2017,16:84)中的工程菌BAK11(DE3)的基础之上，进一步过表达酪氨酸转运蛋白TYRP以及芳香族氨基酸转运蛋白AROP获得。使用SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白表达情况(图4)，质粒构建示意图如图1所示。扩增过程使用的引物如表2所示。
表2、目的片段PCR扩增引物
实施例2、用于蛋白表达检测和粗酶催化的相关工程菌的摇瓶培养
取实施例1中获得工程菌，在液体LB培养基中活化，转接1％种子液于含30mL TB培养基的250mL锥形瓶中，培养至OD600为0.6-0.8后，取出冰浴10min，向其中添加终浓度为0.1mM的IPTG，诱导培养14h。粗酶催化：收集诱导结束后的全部菌体，分别用ddH2O和50mM磷酸钠缓冲液pH 7.5或pH 8.0洗涤，并用缓冲液重悬。置于冰上，使用细胞破碎仪进行细胞破碎。破碎液4℃，10000rpm，离心10min，上清即为粗酶液，用于底物转化测试。
实施例3、粗酶催化检测酶的底物转化能力
粗酶催化反应按照以下反应体系进行：粗酶液1mL、底物(酪氨酸或酪胺或章鱼胺)2mM以及辅因子(磷酸吡哆醛或L-抗坏血酸和五水硫酸铜或S-腺苷甲硫氨酸)2mM或1mM。沸水浴10min终止反应，并添加500μL甲醇以溶解产物，于摇床中220rpm充分溶解30-60min，12000rpm离心10min，取上清液过0.22μm有机滤膜。利用液相色谱-质谱检测反应产物。仪器型号：岛津液相LC-20；进样量10μL；色谱柱：Dikma Diamosil Plus C18-A(5μm，250×4.6mm)；色谱条件：UV280 nm，柱温50℃；流动相：(A)水(含0.5％甲酸)，(B)甲醇；流速：0.5mL/min；洗脱程序：3％B洗脱30min。
液质联用检测结果显示(图5)，在MBP-TYDC-Rosetta的催化体系中，样品在13.5min出现与产物标品峰对应的峰，并且质谱表明该峰确为产物酪胺，表明TYDC确实能够转化酪氨酸。
液相色谱结果显示(图6)，在MBP-DβH-Rosetta的催化体系中，样品在7.8min出现与产物标品峰对应的峰，较对照组为新出现的峰，表明DβH确实能够转化酪胺。
液质联用检测结果显示(图7)，在MBP-PNMT-BAK11的催化体系中，样品在4.9min出现与产物标品峰对应的峰，并且质谱表明该峰确为产物辛弗林，表明PNMT确实能够转化章鱼胺。
液相色谱结果显示(图8)，在MTD-Rosetta的催化体系中，样品中底物酪氨酸出峰时间为12.3min，在13.5min有中间产物酪胺的出峰，在7.8min也确有终产物章鱼胺的出峰，表明TYDC蛋白和DβH蛋白均能在大肠杆菌中表达并表现出底物转化能力。
液相色谱结果显示(图9)，在MTD-MP-BAK11的催化体系中，添加酪氨酸为底物，的确有最终产物辛弗林的产物峰出现，表明共表达重组质粒MTD-MP-pet28a构建成功，蛋白均能表达并实现连续催化。
酪氨酸脱羧酶、多巴胺β-单加氧酶以及苯乙醇胺N-甲基转移酶生物转化酪氨酸为辛弗林的反应途径示意图(图10)。
实施例4、基于高产酪氨酸底盘菌株BAK11-TA生产辛弗林的摇瓶发酵验证
取实施例1中获得工程菌BAK11-TAS，在液体LB培养基中活化，添加终浓度为50μg/mL的硫酸卡那霉素，37℃条件下220rpm培养12h。随后转接1％于新的30mL LB培养基中，添加硫酸卡那霉素，37℃条件下220rpm培养12h做种子培养。再转接8％种子培养液于含有25mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，37℃培养12h后，降温至28℃进行低温诱导发酵，合成途径如图11所示。发酵时间为84h。发酵培养基的组成为：K2HPO4·3H2O1.32mM、NH4Cl 300mM、Mg Cl2·3H2O 0.523mM、K2 SO4 0.276mM、Fe SO4·7H2O 0.01mM、CaCl2 0.05mM、Tricine4mM、Cu SO4·5H2O 0.5mM、L-抗坏血酸0.5mM、PLP 0.5mM(单配)以及甲硫氨酸0.5mM，并添加维生素B1 0.075g/L，葡萄糖30g/L，酵母浸粉1g/L，蛋白胨2g/L以及微量元素溶液0.1％。HPLC检测辛弗林的产量，结果显示BAK11-TAS菌株产生773mg/L的辛弗林(图12)。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.辛弗林合成方法，其特征在于：以酪氨酸为底物，依次在酪氨酸脱羧酶、多巴胺-β-单加氧酶和苯乙醇胺-N-甲基转移酶催化下合成辛弗林。
2.酪氨酸脱羧酶、多巴胺-β-单加氧酶和苯乙醇胺-N-甲基转移酶联合在产酪氨酸菌中重建辛弗林代谢途径中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述酪氨酸脱羧酶的氨基酸如SEQ IDNo.1所示；所述多巴胺-β-单加氧酶的氨基酸如SEQ ID No.2所示；所述苯乙醇胺-N-甲基转移酶的氨基酸如SEQ ID No.3所示。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：编码表达所述酪氨酸脱羧酶的核苷酸如SEQ ID No.5所示；编码表达所述多巴胺-β-单加氧酶的核苷酸如SEQ ID No.6所示；编码表达所述苯乙醇胺-N-甲基转移酶的核苷酸如SEQ ID No.7所示。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述产酪氨酸菌选自酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌。
6.一种合成辛弗林的工程菌，其特征在于：所述工程菌以产酪氨酸菌株作为底盘菌，在底盘菌中同时表达酪氨酸脱羧酶、多巴胺-β-单加氧酶和苯乙醇胺-N-甲基转移酶，获得产辛弗林的工程菌。
7.根据权利要求6所述合成辛弗林的工程菌，其特征在于：所述底盘菌为酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌。
8.根据权利要求7所述合成辛弗林的工程菌，其特征在于：所述底盘菌为过表达酪氨酸转运蛋白TYRP以及芳香族氨基酸转运蛋白AROP的BAK11菌。
9.根据权利要求7所述合成辛弗林的工程菌，其特征在于：所述工程菌由以下方法构建：将酪氨酸脱羧酶编码基因连接于pET28a质粒，得到MBP-TYDC-pet28a重组质粒，然后将多巴胺-β-单加氧酶编码基因扩增后通过重组整合入线性化MBP-TYDC-pet28a重组质粒中，EnaseⅡ连接后得到MTD-pet28a质粒，然后将苯乙醇胺-N-甲基转移酶编码基因通过重组整合入MTD-pet28a线性化质粒中，得到MTD-MP-pet28a重组质粒，转入BAK11-TA菌株，得到工程菌BAK11-TAS。
10.根据权利要求9所述合成辛弗林的工程菌，其特征在于：所述线性化MBP-TYDC-pet28a重组质粒是用SacⅠ和HindⅢ线性化；所述MTD-pet28a线性化质粒是用HindⅢ和XhoⅠ线性化。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410087585.9A CN117925741A (zh) | 2024-01-22 | 2024-01-22 | 辛弗林合成方法及其合成辛弗林的工程菌 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410087585.9A CN117925741A (zh) | 2024-01-22 | 2024-01-22 | 辛弗林合成方法及其合成辛弗林的工程菌 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117925741A true CN117925741A (zh) | 2024-04-26 |
Family
ID=90762707
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410087585.9A Pending CN117925741A (zh) | 2024-01-22 | 2024-01-22 | 辛弗林合成方法及其合成辛弗林的工程菌 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117925741A (zh) |
-
2024
- 2024-01-22 CN CN202410087585.9A patent/CN117925741A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2021170097A1 (zh) | 新型黄酮羟基化酶、合成黄酮碳苷类化合物的微生物及其应用 | |
| CN108949852B (zh) | 一种利用全细胞催化制备木糖醇的方法 | |
| CN112813013B (zh) | 一种生产羟基酪醇的重组大肠杆菌及其应用 | |
| CN107460203B (zh) | 一种产红景天苷及其类似物的重组菌及构建方法及用途 | |
| KR20220125300A (ko) | 오르리스타트 중간체 제조를 위한 생물학적 효소의 용도 및 제조 방법 | |
| CN112063670A (zh) | 一种腺苷酸环化酶制备环磷酸腺苷的方法 | |
| CN110396508A (zh) | 源自Nocardia cyriacigeorgica的L-泛解酸内酯脱氢酶及应用 | |
| CN110229796B (zh) | 酮还原酶突变体及其在制备度洛西汀手性醇中间体及其类似物中的应用 | |
| CN107460152B (zh) | 产红景天苷及其类似物的重组菌、构建方法及用途 | |
| CN114891707B (zh) | 重组菌株及其全细胞催化生产胆红素的方法 | |
| CN111471736B (zh) | 制备c1,2-位脱氢甾体化合物的方法 | |
| CN114940964B (zh) | 工程菌及其高效催化cdca生产udca的方法 | |
| CN110004099B (zh) | 一种红景天苷的发酵生产方法 | |
| CN117925741A (zh) | 辛弗林合成方法及其合成辛弗林的工程菌 | |
| CN116064435A (zh) | 姜黄素还原酶CfcurA、编码基因及其应用 | |
| CN114277023B (zh) | 重组腈水合酶及其在耦合离子交换树脂制备烟酰胺中的应用 | |
| CN107287256B (zh) | 全细胞催化合成l-2-哌啶甲酸的方法 | |
| KR100679759B1 (ko) | 관능기에 의해 수식된 이차 대사산물을 생산하는형질전환체 및 신규 생합성 유전자 | |
| CN106906192B (zh) | 一种葡萄糖基转移酶及在合成藏红花酸葡萄糖酯中的应用 | |
| CN110396506A (zh) | 源自Nocardia asteroides的L-泛解酸内酯脱氢酶及其应用 | |
| CN114875087B (zh) | 以β-吲哚基丙氨酸为底物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法及其应用 | |
| CN114574454B (zh) | 一种短链脱氢酶及其突变体和应用 | |
| CN112280756B (zh) | 异亮氨酸羟化酶突变体及在(2s,3r,4s)-4-羟基异亮氨酸合成中的应用 | |
| CN114958894B (zh) | 一种基于CcmK2纤维状蛋白的亚精胺合成多酶复合体的构建方法及其应用 | |
| CN112063610B (zh) | 一种酪氨酸酚裂解酶突变体、工程菌及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |