CN117924519A - 靶向cd138的嵌合抗原受体 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了结构为CD138scFv‑CD8α‑4‑1BB‑CD3ζ的嵌合抗原受体。通过流式细胞术、脱颗粒分析实验、T细胞细胞因子分泌检测，证明该嵌合抗原受体修饰的T细胞对表达CD138的多发性骨髓瘤细胞有很强的杀伤作用，对不表达CD138的细胞几乎没有杀伤作用，有效防止了脱靶效应。本发明嵌合抗原受体CD138scFv‑CD8α‑4‑1BB‑CD3ζ可用于CD138+多发性骨髓瘤的治疗，以及与BCMA CAR‑T细胞的联合治疗。
Description
技术领域
本公开涉及细胞治疗领域，具体地，涉及一种靶向CD138的嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
嵌合抗原受体是含有与细胞活化结构域(如CD3ζ)和共刺激结构域(如CD28或4-1BB)偶联的抗原识别结构域的融合蛋白。通过CAR修饰的患者自身的T细胞，能够识别和攻击特定的肿瘤抗原，以非MHC限制的方式清除靶向的肿瘤细胞。CAR-T细胞疗法的出现彻底改变了血液系统恶性肿瘤的治疗。
多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一种恶性浆细胞肿瘤，通常表现为异常增殖的浆细胞在骨髓中大量增生，抑制了正常造血功能。免疫调节药物、蛋白酶体抑制剂以及靶向CD38抗体药物的开发和应用显著提高了多发性骨髓瘤患者的生存。然而，对这些药物产生耐药的患者，以及新诊断具有高危遗传学特征或一线治疗后早期复发的患者预后较差，亟需研究与开发新型治疗方法，以满足这部分患者的治疗需求，这些策略之一就是嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞疗法。两种靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的CAR-T细胞产品——idecabtagene vicleucel(ide-cel)和ciltacabtagene autoleucel(cilta-cel)，已获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准，用于复发/难治性MM患者的治疗；国内首款BCMA CAR-T产品CT103A也已成功上市。尽管BCMACAR-T细胞疗法的应用显著改善了难治复发MM患者的应答率，延长了无进展生存时间，但仍有许多患者在治疗后出现复发，其耐药机制可能与抗原逃逸、膜结合BCMA脱落等有关。因此MM治疗新靶点药物的研发将进一步改善复发难治MM患者的预后。
CD138(syndecan-1)属于syndecan家族，是细胞-基质和细胞-细胞相互作用所必需的。CD138与转移、肿瘤侵袭、血管生成、细胞增殖等不同阶段的致癌有关。它在恶性浆细胞表面广泛且高度表达，但是几乎不表达于其他的造血细胞，包括T细胞和B细胞。且与新诊断病例相比，CD138在复发难治患者中表达更多。此外，CD138的表达有助于骨髓瘤细胞的粘附，在恶性浆细胞的增殖和存活中发挥作用。因此CD138成为多发性骨髓瘤治疗的重要靶点，CD138CAR-T细胞治疗与其他疗法的联合应用，可进一步提高MM治疗的有效性，为MM患者提供新的治疗希望。
目前市场上的靶向CD138 CAR-T尚没有取得令人满意的治疗效果，无法满足临床治疗要求，因此急需研发一种新的靶向CD138 CAR-T产品解决上述问题。
发明内容
解决的技术问题：
本公开的一个方面，是针对现有技术中靶向CD138的嵌合抗原受体其对表达CD138的多发性骨髓瘤细胞的杀伤效果差，同时BCMA CAR-T治疗期间会因BCMA表达缺失或降低而产生复发或无效的问题，提供了一种CD138特异性的嵌合抗原受体，该CAR特异性结合到靶抗原上，并发挥针对多发性骨髓瘤的细胞毒效应。
具体地，在本公开的技术方案中，CD138+肿瘤细胞与CD138 scFv结合后可以激活CAR-T细胞，产生细胞毒效应；而CD138-细胞不能激活CAR-T细胞产生应答。因此，以CD138scFv为抗原识别区制备的CAR-T细胞在识别并杀伤CD138+肿瘤细胞的同时，对CD138-细胞不产生脱靶效应，从而解决了上述技术问题。
提供的技术方案：
一种靶向CD138的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括胞外区、跨膜区和胞内区，所述胞内区包含胞内信号转导区，所述胞外区包括特异性结合人CD138分子的结合结构域，所述结合结构域包括如SEQ ID No.1所示的重链可变区的CDRH1的氨基酸序列、如SEQID No.2所示的重链可变区的CDRH2的氨基酸序列、如SEQ ID No.3所示的重链可变区的CDRH3的氨基酸序列、如SEQ ID No.4所示的轻链可变区的CDRL1的氨基酸序列、如SEQ IDNo.5所示的轻链可变区的CDRL2的氨基酸序列和如SEQ ID No.6所示的轻链可变区的CDRL3的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有85％～99％同一性且与其具有相同生物学功能的序列。
在本公开的某些实施方式中，所述结合结构域包括如SEQ ID No.7所示的重链可变区的氨基酸序列和如SEQ ID No.8所示的轻链可变区的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有85％～99％同一性且与其具有相同生物学功能的序列。
在本公开的某些实施方式中，所述结合结构域为特异性结合人CD138分子的Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、FCL、dAb、单链抗体scFv、嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体；
优选地，在本公开的某些实施方式中，所述结合结构域为特异性结合人CD138分子的单链抗体scFv，所述单链抗体scFv包括如SEQ ID No.1所示的重链可变区的CDRH1的氨基酸序列、如SEQ ID No.2所示的重链可变区的CDRH2的氨基酸序列、如SEQ ID No.3所示的重链可变区的CDRH3的氨基酸序列、如SEQ ID No.4所示的轻链可变区的CDRL1的氨基酸序列、如SEQ ID No.5所示的轻链可变区的CDRL2的氨基酸序列和如SEQ ID No.6所示的轻链可变区的CDRL3的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有85％～99％同一性且与其具有相同生物学功能的序列。
进一步优选地，在本公开的一个实施方式中，所述结合结构域的氨基酸序列如SEQID No.9所示。
在本公开的某些实施方式中，所述胞外区还包括构建在所述嵌合抗原受体的氨基末端的信号肽或与所述信号肽具有90％以上同一性且与其具有相同生物学功能的序列；
优选地，所述信号肽为CD8α中的信号肽序列或GM-CSF；
更优选地，所述信号肽为如SEQ ID NO.10所示的信号肽。
在本公开的某些实施方式中，所述胞外区的结合结构域通过铰链区与所述跨膜区连接；
所述铰链区优选为CD8α中的铰链区序列；
所述跨膜区为选自以下蛋白质的跨膜结构域或与所述蛋白质具有90％以上同一性且与其具有相同生物学功能的序列：T细胞受体的α、β或ζ链、CD2、CD3ε、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD18、CD19、CD27、CD28、CD29、CD30、CD40、CD48、CD49a、CD49d、CD49f、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD69、CD79A、CD79B、CD84、CD96、CD100、CD103、CD134、CD137、CD150、CD158A、CD158B1、CD158B2、CD158C、CD158D、CD158F1、CD158F2、CD158K、CD160、CD162、CD226、CD229、CD244、CD247、CD258、CD268、CD270、CD272、CD276、CD279、CD314、CD319、CD335、CD336、CD337、CD352、CD353、CD355、CD357、LFA-1、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80、IL-2R beta、IL-2Rgamma、IL-7Ralpha、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS、SLP-76、PAG1/CBP、CD83配体、Fc gamma受体、整联蛋白、激活性NK细胞受体或Toll配体受体，或其组合；
优选地，所述跨膜区为CD8α中的跨膜区序列。
在本公开的某些实施方式中，所述胞内区还包括共刺激因子；
优选地，所述共刺激因子为通过选自以下蛋白质或与所述蛋白质具有90％以上同一性且与其具有相同生物学功能的序列获得的功能性信号结构域的一种或几种：整联蛋白、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1、4-1BB、B7-H3、CD278、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM、KIRDS2、SLAMF7、NKp80、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49α、IA4、CD49D、ITGA6、VLA6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11α、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、CD29、ITGB1、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、CD226、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、CD229、CD160、PSGL1、CD100、CD69、SLAMF6、SLAM、BLAME、CD162、LTBR、LAT、GADS或SLP-76；
更优选地，所述共刺激因子为CD28或4-1BB，或与其具有90％以上同一性且与其具有相同生物学功能的序列。
在本公开的某些实施方式中，所述胞内信号转导区为选自以下蛋白质或与所述蛋白质具有90％以上同一性且与其具有相同生物学功能的序列：4-1BB、B7-H3、BAFFR、BLAME、BTLA、CD100、CD103、CD160、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD276、CD28、CD29、CD3ζ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8alpha、CD8beta、CD96、CDS、CEACAM1、CRTAM、DAP-10、DNAM1、Fc gamma受体、GADS、GITR、HVEM、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Igalpha、IL2R beta、IL2R gamma、IL7R alpha、整联蛋白、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、LIGHT、LIGHT、LTBR、Ly9、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80、OX-40、PAG/Cbp、PD-1、PSGL1、SELPLG、SLAMF4、SLAMF6、SLAMF7、SLP-76、TNFR2、Toll配体受体、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6，或其组合；
优选地，所述胞内信号转导区为CD3ζ。
在本公开的一个实施方式中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，或与其具有90％以上同一性且与其具有相同生物学功能的序列。
本公开的另一个方面，是提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码上述嵌合抗原受体的氨基酸序列；
优选地，在本公开的一个实施方式中，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO.12所示，或与其具有90％以上同一性且与其具有相同生物学功能的序列。
本公开的另一个方面，是提供了一种载体，所述载体包含上述核酸分子的序列；
优选地，所述载体为质粒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体；
更优选地，所述载体中包含EF1α启动子序列。
本公开的另一个方面，是提供了一种分离的细胞，所述细胞中包含上述嵌合抗原受体、上述核酸分子或上述载体；
优选地，所述细胞为i)免疫应答细胞，优选为T细胞、NK细胞、NKT细胞或CTL细胞，更优选为T细胞；或ii)诱导多能干细胞(iPSC)。
进一步地，在本公开的某些实施方式中，所述细胞为自体或异体来源的T细胞；
优选地，所述细胞为自体来源的T细胞。
进一步地，在本公开的某些实施方式中，所述细胞为异体来源的T细胞，所述T细胞为通用型嵌合抗原受体T细胞；
优选地，所述T细胞缺失编码TCR、HLA、CD52、PD-1或CD7的基因。
本公开的另一个方面，是提供了上述嵌合抗原受体、上述核酸分子、上述载体或上述细胞在制备治疗CD138阳性血液肿瘤药物中的应用；
优选地，所述CD138阳性血液肿瘤为多发性骨髓瘤；
更优选地，所述CD138阳性血液肿瘤为复发或无效的CD138+多发性骨髓瘤。
本公开的另一个方面，是提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述嵌合抗原受体、上述核酸分子、上述载体或上述细胞。
有益效果：
本公开提供了结构为CD138 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ的嵌合抗原受体。通过流式细胞术、脱颗粒分析实验、T细胞细胞因子分泌检测，证明该嵌合抗原受体修饰的T细胞对表达CD138的多发性骨髓瘤细胞有很强的杀伤作用，对不表达CD138的细胞几乎没有杀伤作用，有效防止了脱靶效应。本发明嵌合抗原受体CD138 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ可用于CD138+多发性骨髓瘤的治疗，以及与BCMACAR-T细胞的联合治疗。
附图说明
图1为本公开实施例中鼠抗人CD138单克隆抗体scFv(VL-linker-VH方向)片段的PCR扩增电泳图，其中，1为5G2 scFv(735bp)泳道,M为2K Plus DNA Marker泳道；
图2为本公开实施例中慢病毒表达载CD138 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ限制性内切酶酶切片段电泳鉴定图，其中，M为2K Plus IIDNAMarker泳道；1为用核酸内切酶NheⅠ和NotⅠ双酶切慢病毒表达质粒CD138(5G2)scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ所得到的编码CD138 CAR(CD138scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ)的DNA片段(1417bp)和载体(7303bp)片段泳道；
图3为本公开实施例中慢病毒表达载体示意图，其中，逆时针序列是正向基因片段，顺时针序列为反向基因片段；
图4为利用流式细胞术检测本公开实施例中构建的CD138(5G2)scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞中CAR分子的表达结果图，其中，GFP为载体携带的标志蛋白的表达；CD138scFv为重组人CD138-Fc融合蛋白标记T细胞后用鼠抗人IgG Fc抗体标记的CD138 scFv在T细胞表面的表达；
图5为利用流式细胞术检测本公开实施例中人浆细胞瘤细胞系H929、人免疫球蛋白A骨髓瘤细胞系MM.1S及慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞中CD138靶抗原分子的表达强度结果图，其中，A为CD138表达强度峰图；B为CD138靶抗原分子的表达强度(specificfluorescence intensity,SFI)
图6为利用流式细胞术检测本公开实施例中T细胞与靶细胞共培养后残留的肿瘤细胞存活率结果图。其中，CD138 CAR-T为CD138(5G2)scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞的实验组；Vector-T为转染空载体的T细胞的对照组；A为CD138(5G2)scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞与CD138阳性的H929细胞系按效靶比1:1共培养24、48小时后残留的肿瘤细胞存活率流式示意图；B为CD138(5G2)scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞与CD138阳性的MM.1S细胞系按效靶比1:1共培养24、48小时后残留的肿瘤细胞存活率流式示意图；C为CD138(5G2)scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞与CD138阴性的K562细胞系按效靶比1:1共培养24、48小时后残留的肿瘤细胞存活率流式示意图；D为CD138(5G2)scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞与CD138阳性的H929、MM.1S以及CD138阴性的K562细胞系按效靶比2:1、1:1、1:2、1:4共培养24、48小时后残留的肿瘤细胞存活率结果图；
图7为本公开实施例中CD138(5G2)scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞对H929、MM.1S和K562(效靶比1:1)杀伤作用的脱颗粒检测结果图，其中，CD138CAR-T为CD138(5G2)scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞的实验组；Vector-T为转染空载体的T细胞的对照组；
图8为CD138(5G2)scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞的表型分析结果图，其中，CD138 CAR-T为CD138(5G2)scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞的实验组；Vector-T为转染空载体的T细胞的对照组；A为CD138 CAR-T、Vector-T细胞抑制性受体PD-1、LAG-3、TIM-3表达结果统计图；B为CD138 CAR-T、Vector-T细胞活化相关受体CD25、CD69表达结果统计图；C为CD138 CAR-T、Vector-T细胞CD8表达及细胞分群统计结果图；
图9为本公开实施例中CD138(5G2)scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞与H929和K562细胞系按效靶比1:1共培养48小时后，T细胞释放的细胞因子IL-2(左图)、IFN-γ(中图)、TNF-α(右图)水平结果图，其中，CD138 CAR-T为CD138(5G2)scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞的实验组；Vector-T为转染空载体的T细胞的对照组。
序列说明
SEQ ID NO.1为本公开嵌合抗原受体的结合结构域中重链可变区的CDRH1的氨基酸序列；
SEQ ID NO.2为本公开嵌合抗原受体的结合结构域中重链可变区的CDRH2的氨基酸序列；
SEQ ID NO.3为本公开嵌合抗原受体的结合结构域中重链可变区的CDRH3的氨基酸序列；
SEQ ID NO.4为本公开嵌合抗原受体的结合结构域中轻链可变区的CDRL1的氨基酸序列；
SEQ ID NO.5为本公开嵌合抗原受体的结合结构域中轻链可变区的CDRL2的氨基酸序列；
SEQ ID NO.6为本公开嵌合抗原受体的结合结构域中轻链可变区的CDRL3的氨基酸序列；
SEQ ID NO.7为本公开嵌合抗原受体的结合结构域中重链可变区的氨基酸序列；
SEQ ID NO.8为本公开嵌合抗原受体的结合结构域中轻链可变区的氨基酸序列；
SEQ ID NO.9为本公开嵌合抗原受体的结合结构域的氨基酸序列；
SEQ ID No.10为本公开嵌合抗原受体的信号肽的氨基酸序列；
SEQ ID No.11为本公开嵌合抗原受体的氨基酸序列。
具体实施方式
本发明公开了一种靶向CD138的嵌合抗原受体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。术语“一个(一种)”(“a”、“an”和“the”)包括复数指示物。术语“多个(多种)”是指两个(种)或更多个(种)。术语“如”、“例如”等旨在指示例性实施方案，而不意图限制本公开的范围。
在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。分子生物学常见术语的定义可见Lewin’s GENES XII，JocelynE.Krebs/Elliott S.Goldstein/Stephen T.Kilpatrick，出版Jones&Bartlett，2018。
嵌合抗原受体：
本公开中的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”或“Chimeric antigen receptor”，是一种重组多肽(或者人工融合蛋白)，其至少包含抗原结合结构域。该结构域通过铰链和跨膜结构域与信号激活部分相连接。抗原结合结构域可以为多种形式，例如，在本公开的某些实施方式中，所述抗原结合结构域为Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、FCL、dAb、单链抗体scFv、嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。其可以为单价的，也可以为多价的。本公开中的多价抗体包括至少两个本公开中所述的抗体或者抗原结合部分，其能够竞争性地结合人CD138分子，并产生与单价抗体不同的效果。所述多价抗体可以利用，例如，蛋白质融合、增加连接体、共价键或非共价键的方法获得。
在本公开的某些实施方式中，所述抗原结合结构域为特异性结合人CD138的scFv。所述scFv通常可以包含单个或重复个数的VL和VH序列，所述VL和VH序列包含所述CDRs。在本发明的某些实施方式中，所述特异性结合人CD138分子的scFv为一价抗体。在本发明的另一些实施方式中，所述轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的重复序列数可以为2或3。当所述重复序列数为2时，所述特异性结合CD38分子的scFv形成二价Diabody的形式；当所述重复序列数为3时，所述特异性结合CD38分子的scFv形成三价Triabody的形式。
基于本公开中的抗原结合结构域，可以形成多种结构的嵌合抗原受体。例如，第一代CAR是由一个抗原结合结构域与定位于胞内区的T细胞激活结构域通过跨膜区连接形成；第二代CAR在第一代CAR的基础上增加了共刺激分子；第三代CAR在第一代CAR的基础上增加了两个串联的共刺激分子，以提高T细胞增殖活性、细胞毒性，延长T细胞存活时间。
对嵌合抗原受体蛋白质分子的修饰：
在本公开的某些实施方式中，可以对嵌合抗原受体蛋白质分子进行氨基酸修饰，以产生不显著影响其性质的功能等效变体。此类修饰的例子包括氨基酸残基的保守性取代(替换)、不显著改变抗体的功能活性或使抗体对其靶抗原的亲和力成熟的一或多个氨基酸缺失或添加。互为保守性取代(替换)的氨基酸残基的例子可以为以下组中的氨基酸，1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；及8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)。
本公开中的术语“分离的”是指脱离了其天然环境或分离前存在的环境，与其他组分分开的物质或实体。例如，分离的蛋白质实质上没有来自它所源自的细胞或组织来源的细胞材料或其他蛋白质。所述分开的比例可以为，例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。分离的物质相对于它们分离前的物质而言，可能具有不同的纯度水平。
本公开中的术语“核酸分子”也可交换使用为“多核苷酸”，是指任何长度的核苷酸的链，且包括DNA或RNA。其可以包括任意已知的核苷酸类似物或经修饰的核苷酸或碱基。对于上述核酸分子的制备方法，可基于上述抗原识别区、铰链区、跨膜区以及胞内信号区等结构域的碱基序列，通过化学合成或PCR扩增等已知技术制备。通常，可以对编码上述结构域的氨基酸的密码子进行优化，以优化其在宿主细胞中的表达。上述碱基序列的信息可通过检索已知文献或NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等数据库来获得。
本公开中的术语“载体”具有一般的含义，其能够将所述核酸引入原核和/或真核宿主细胞中。在本公开的某些实施方式中，所述载体可以为直链载体，也可以为环状载体。可以为质粒等非病毒载体，也可以为病毒载体，还可以为利用转座子的载体。所述载体中可含有启动子、终止子等调控序列，以及耐药基因、报告基因等标记序列。另外，上述载体也可包含编码自杀基因的序列，可根据治疗过程，通过给予激活自杀基因的物质，从而控制体内CAR-T细胞的数目。
作为上述病毒载体，可以为质粒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等。在本发明的一个实施方式中，使用的是慢病毒表达载体。
T细胞：
在本公开的某些实施方式中，所述T细胞为人的T细胞。所述T细胞可以来自血液、骨髓等体液，也可以来自脾脏、胸腺、淋巴等组织，或者原发肿瘤、转移性肿瘤、癌性腹水等癌症组织，经分离、纯化后得到。作为优选，所述T细胞为自体T细胞。同时，所述T细胞可以为CD4+T细胞、CD8+T细胞、αβT细胞或γδT细胞，也可以为上述多种T细胞的混合物。
在本公开的另一些实施方式中，所述细胞为异体来源的T细胞，所述T细胞为通用型嵌合抗原受体T细胞。
为了得到所述通用型嵌合抗原受体T细胞，作为优选，在本公开的某些实施方式中，所述T细胞缺失编码TCR、HLA、CD52、PD-1或CD7的基因。
所述基因的缺失可以通过现有技术中合适的方法实现，例如，基因敲除。
药物组合物：
本公开中的术语“药物组合物”是指除含有本公开所述嵌合抗原受体以外，还包含至少一种其他物质的组合物。该其他物质可以为，例如，药学上可接受的载体、赋形剂、生理盐水、细胞培养基、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇以及它们的组合物、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、等渗剂，等。也可以为其他治疗药剂，例如，化学治疗药物：马法兰、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱，等；糖皮质激素类药物：泼尼松、地塞米松，等；免疫调节药物：沙利度胺、来那度胺、泊马度胺，等。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例：
实施例1：抗人CD138抗体的制备
1、小鼠杂交瘤单克隆抗体筛选
以人CD138蛋白阳性细胞系为免疫原，采用腹腔注射的方式免疫Balb/c小鼠，分别在初次免疫后的第2周、第4周、第6周、第8周进行加强免疫，在加强免疫后的第8天取小鼠尾血10μl置于90μlPBS中，室温静置1小时，4℃，12000rpm离心10分钟，收集血清；以PBS稀释尾血上清成不同浓度：1:200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1：12800。收集CD138阳性细胞，PBS洗1次，细胞计数，每个样品用1×106个细胞，将100μl不同稀释度的血清加入到细胞中，阴性对照组使用CD138阴性细胞，4℃孵育30min，PBS洗两次；以1:500的比例加入APC标记的抗小鼠F(ab)2二抗，室温避光孵育30min，PBS洗两次；细胞重悬于200μl PBS缓冲液中，流式细胞仪检测血清中抗体与细胞的结合百分率及荧光强度；以平均荧光强度为阴性对照两倍以上为有效效价，有效效价高于6400时，方可进行融合。融合前3天，对免疫小鼠通过尾静脉注射免疫原的方式进行冲击免疫。取成功免疫的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行细胞融合，融合时在37℃水浴的环境下，将PEG在1min之内加入脾脏细胞与骨髓瘤细胞细胞团之中，再在5min之内加入10ml无血清1640培养基。离心，弃去上清，用含有HAT的半固体培养基重悬细胞，并移液入10cm平皿(10ml/板)。在37℃、5％CO2条件下培养细胞。当所述克隆足够大时，挑取单克隆至每空铺满200μl完全培养基的96孔板中继续培养3-4天。以CD138阳性细胞系作为检测细胞。细胞显微镜下观察96孔板中细胞克隆足够大时，取对应孔上清液100μl，CD138阳性细胞共孵育，方法与检测效价相同。选择阳性孔，进行下一步克隆化培养。将筛选阳性的杂交瘤克隆从96孔板扩至24孔板培养3-5天，再次进行培养上清筛选检测，检测阳性的克隆再进行下一步的亚克隆培养，剩余细胞冻存。收集24孔板中杂交瘤细胞，细胞计数，将细胞密度调整为10个/mL；将细胞铺到96孔板中，每孔200μl，37℃、5％ CO2孵箱培养；培养10天左右，可见克隆形成，选取只有单个克隆的孔，吸取培养上清，检测方法同前，选取阳性克隆，扩至24孔板培养，再次上清检测后，选择阳性克隆进行第二轮的亚克隆培养，一般进行多轮亚克隆培养后，直至所有检测孔均为阳性为止，即获得稳定的杂交瘤细胞株。选取阳性杂交瘤培养上清，采用抗体亚型检测试纸检测抗体的亚型，本实施例中的单克隆抗体编号为5G2，为鼠源IgG1亚型，轻链为κ链。
2、腹水制备及纯化
无菌PBS溶液洗涤杂交瘤细胞，以5x106/500μl/只的细胞量腹腔注射到液体石蜡预致敏的Balb/c小鼠体内。7至10天后收集腹水，室温3000rpm，10min，收集上清。以终浓度为33％的饱和硫酸铵对抗体进行粗纯，在4℃环境下用PBS透析除盐24h，期间换液3次。粗纯后的抗体按照GE公司提供的纯化手册，利用AKTA蛋白纯化系统，经1ml Protein G纯化预装柱进行进一步的纯化。所得抗体纯品用于后续的抗体检测及功能实验。对抗体纯品进行BCA定量检测纯品抗体的蛋白浓度。取20ug蛋白进行SDS-PAGE电泳，可见纯品抗体在150kDa处有单一条带，经巯基乙醇还原后，在25kDa处和50kDa处分别有轻重链条带。
3、单克隆抗体效价检测
定量后5G2抗体纯品以终浓度200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6,25nM、3.2nM、1.6nM、0.8nM、0.4nM、0.2nM、0.1nM、0.05nM、0.025nM分别与2×105K562-CD138室温共孵育30min，PBS清洗2遍后加入APC标记的抗小鼠F(ab)2二抗1ul/孔，室温避光孵育30min，PBS洗两次；细胞重悬于200μlPBS缓冲液中，FACS测定荧光强度，统计Mean值。用数据分析软件GraphPad Prism 7计算抗体的Kd值。5G2的Kd值为0.8957×10-9M。
4、RT-PCR法克隆5G2可变区基因
总RNA提取，单链cDNA合成：
用TRIzol试剂提取5G2杂交瘤细胞株的总RNA,并以RNA为模板利用逆转录酶合成cDNA文库。RT-PCR扩增抗人CD138抗体重链(VH)、轻链(VL)可变区基因片段，引物序列如表1所示：
表1
配制PCR反应体系(50μl)如下：
cDNA:2μl；上游引物(10μM):2μl；下游引物(10μM):2μl；2X pfu DNA聚合酶:25μl；ddH2O:补足至50μl。反应条件：95℃预变性5min；重复如下循环35次：95℃30s，58℃30s，72℃1min；最后，72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳分离并回收VL、VH片段。将回收后的VL、VH片段与pMD19-T(simple)载体(Takara公司)通过T4连接酶(Takara公司)进行连接，得到pMD19-5G2 VL、pMD19-5G2 VH质粒。连接体系如下：VL PCR产物/VH PCR产物各70ng；pMD19-T(simple)载体1μl；Solution I连接反应液5μl；ddH2O补足至10μl。4℃连接过夜，连接产物转化入E.coli DH5α感受态细菌中，37℃过夜培养后，挑取单个菌落送检测序。
实施例2：SOE-PCR方法构建VL-linker-VH方向CD138 scFv片段：
以实施例1中获取的测序正确的pMD19-5G2 VL、pMD19-5G2 VH质粒为模板，SOE-PCR法扩增出CD138(5G2)scFv片段。
5G2 scFv：
P1：5'CTAGCTAGCGATGTTTTGATGACCCAAACTCCA 3'
P2：5'GAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCAGCCCGTTTGA
TTTCCAGCTT 3'
P3：5'GTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGAAGTG
AAGCTTGAGGAGTCTGG 3'
P4：5'CCGGAATTCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTC 3'
配制第一轮PCR反应体系，获得Nhe I-VL-linker片段(50μl)：2×Pfu PCR MasterMix(TianGen公司)：25μl；10μM P1+P2：2μl；pMD19-5G2 VL质粒：100ng；ddH2O：补足至50μl。反应条件：94℃预变性5分钟；重复如下循环32次：94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒；最后，72℃延伸10分钟；
配制第一轮PCR反应体系，获得linker-VH-EcoRⅠ片段(50μl)：2×Pfu PCR MasterMix(TianGen公司)：25μl；10μM P3+P4：2μl；pMD19-5G2 VH质粒：100ng；ddH2O：补足至50μl。反应条件：94℃预变性5分钟；重复如下循环32次：94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒；最后，72℃延伸10分钟；
琼脂糖凝胶电泳分离并回收Nhe I-VL-linker、linker-VH-EcoRⅠ片段；
配制第二轮PCR反应体系，获得CD138(5G2)scFv(VL-linker-VH方向)片段(50μl)：2×Pfu PCR Master Mix(TIANGEN公司)：25μl；10μM P1+P4：2μl；Nhe I-VL-linker片段：100ng；linker-VH-EcoRⅠ片段：100ng；ddH2O：补足至50μl。反应条件：94℃预变性5分钟；重复如下循环32次：94℃30秒，68℃90秒；最后，72℃延伸10分钟。
琼脂糖凝胶电泳分离并回收CD138(5G2)scFv片段。结果如图1所示。
实施例3：嵌合抗原受体载体的构建
1.采用Nhe I、EcoR I核酸内切酶酶切含有CD8α-4-1BB-CD3ζ片段的质粒，获得CD8α-4-1BB-CD3ζ片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。所述含有CD8α-4-1BB-CD3ζ片段的质粒(目的载体)可通过现有技术中任意合适的方法制得。
2.将实施例1中得到的CD138(5G2)scFv片段与目的载体进行连接，将构建的CD138(5G2)scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζCAR目的载体用Nhe I和NotⅠ进行酶切鉴定。结果如图2所示，酶切结果表明阳性克隆含有目的条带且测序鉴定正确。载体示意图如图3所示。
实施例4：嵌合抗原受体CD138(5G2)scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ慢病毒制备与转染
1.质粒提取：
取以上测序正确的菌液以1:100的比例加入新鲜的含有氨苄青霉素的LB液体培养基(20-30ml)，在37℃恒温摇床中以200rpm/min的速度震荡培养12-16小时，利用TIANGEN公司的无内毒素质粒提取试剂盒(DP118)提取质粒；
1)柱平衡步骤：向吸附柱CP4中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL，12,000rpm(～13,400g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
2)取菌液加入离心管中，12,000rpm(～13,400g)离心1min，尽量吸除上清。
3)向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl溶液P1(已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
4)向离心管中加入500μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
5)向离心管中加入500μl溶液P4，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，可见出现白色絮状沉淀，后室温放置10min左右，12,000rpm(～13,400g)离心10min。
6)将上一步收集的上清液分次加入过滤柱CS(过滤柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400g)离心2min，滤液收集在干净的2ml离心管中。
7)向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP4中(吸附柱放入收集管中)。吸附柱CP4的最大容积为700μl，根据需要分次过柱。
8)室温12,000rpm(～13,400g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
9)向吸附柱CP4中加入500μl去蛋白液PD，12,000rpm(～13,400g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。
10)向吸附柱CP4中加入600μl漂洗液PW(已加入无水乙醇)，室温静置2-5min，12,000rpm(～13,400g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。
11)向吸附柱CP4中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm(～13,400g)离心1min，倒掉收集管中的废液。
12)将吸附柱CP4重新放回收集管中，12,000rpm(～13,400g)离心2min，将吸附柱CP4开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
13)将吸附柱CP4置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300μl洗脱缓冲液TB或无菌双蒸水，室温放置2min，12,000rpm(～13,400g)离心1min将质粒溶液收集到离心管中。
14)提取的质粒溶液利用NanoDrop2000测定浓度、A260/A280、A260/A230。
15)质粒溶液于-20℃储存，以备后续转染使用。
2.慢病毒制备与浓缩：
1)胰酶消化处于对数生长期的293T细胞，将5×106个HEK293T细胞接种于10cm细胞培养皿(培养基为DMEM+15％FBS)，总体系为10ml。将细胞培养皿置于37℃、5％CO2的孵箱中培养24-36h。在细胞汇合度达到80-90％时，进行转染操作。
2)在15ml离心管中，用无血清DMEM培养基稀释DNA，转染体系如下：
上述混合体系配置后静置15min。吸弃10cm细胞培养皿中的培养基，加入7ml新鲜的含15％ FBS的DMEM培养基，将上述转染体系缓慢逐滴加入培养皿中，培养皿置于37℃、5％CO2孵箱培养，12h后更换全新的含15％FBS的DMEM培养基。
3)收集换液后48h的病毒原液，于4℃离心，3000rpm，15min，收集上清。
4)用0.45μm滤器过滤病毒上清，收集于超速离心管中，精密天平严格配平后，超速离心机离心，4℃，50000g，2h30min。
5)离心结束后，弃上清，加入100μl无血清培养基(KBM581)重悬病毒，分装于1.5mlEP管，-80℃储存备用。
实验例5：嵌合抗原受体CD138(5G2)scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ慢病毒修饰T细胞及其对白血病细胞的杀伤作用
1.血液肿瘤细胞系中CD138的表达水平：
H929、MM1S和K562细胞系均购自美国ATCC。分别培养后，各吸取5×105细胞悬液，PBS洗2次后，标记PerCP/Cy5.5抗人CD138单抗(Biolegend公司)，以标记PerCP/Cy5.5-isotype为对照组，冰上孵育30分钟。流式细胞术检测各细胞系CD138的表达水平，结果如图5所示。其中H929、MM1S和K562细胞系表达CD138及对应的同型对照的直方图如图5的A所示，其特异性荧光强度(specific fluorescence intensity,SFI)分别为22.89、46.22和0.72，结果如图5的B所示。结果表明，本实验例中所使用的各种细胞系除K562以外，均表达CD138。
2.CAR修饰的T细胞与H929、MM.1S和K562细胞系共培养后流式检测残留的肿瘤细胞：
将上述细胞按2×105细胞/孔接种24孔培养板，分别加入5×104(E:T＝1:4)、1×105(E:T＝1:2)、2×105(E:T＝1:1)、4×105(E:T＝2:1)浓度的CAR修饰的T细胞，将转染不含CAR的空载体T细胞(Vector-T)设为对照组，于孵箱中共培养，其中H929、MM.1S细胞过表达RFP。将共培养24或48小时后的细胞用APC抗人CD3单抗(Biolegend公司)标记T细胞，流式细胞术检测残留细胞。结果如图6所示，1)与Vector-T相比，CD138 CAR-T能明显杀伤CD138+靶细胞H929、MM.1S(图6的A、图6的B、图6的D)；2)与Vector-T相比，CD138 CAR-T对CD138-靶细胞K562没有杀伤作用(图6的C、图6的D)。结果证实CD138CAR-T对CD138+靶细胞有高效的特异性杀伤作用，同时，对不表达CD138的靶细胞没有表现出脱靶效应。
3.脱颗粒实验分析CAR修饰的T细胞的激活：
将CD138 CAR-T及Vector-T细胞分别与H929、MM.1S和K562细胞按照效靶比1:1进行共培养，并在共培养体系中加入anti-CD107a抗体和monensin；4h后应用流式细胞仪检测GFP+细胞表面CD107a的表达水平。结果如图7所示，CD138 CAR-T与H929、MM.1S共培养体系中，细胞激活百分率分别为25.78％、29.60％，Vector-T与H929、MM.1S共培养体系中，细胞激活百分率分别为6.13％、6.53％。与CD138+细胞系共培养后CD138 CAR-T与Vector-T的激活有显著差异(P<0.001)；而CD138 CAR-T和Vector-T与K562细胞共培养的激活百分比分别为6.06％、5.62％，二者无显著差异。
4.CAR修饰的T细胞的表型检测
在T细胞培养第7天，分别取～1×105细胞/管，通过流式细胞术进行以下表型检测：
1)Vector-T/CD138 CAR-T细胞抑制性受体表达检测：
收集细胞，标记anti-human APC/Cy7 PD-1、anti-human PE TIM3、anti-humanPE/Cy7 LAG3流式抗体，室温孵育15min，过量PBS洗涤细胞，重悬上机进行流式分析。图8的A为CD138 CAR-T、Vector-T抑制性受体表达结果统计图。整体而言，二者间无明显统计差异。
2)Vector-T/CD138 CAR-T细胞活化受体表达检测：
收集细胞，标记anti-human PE/Cy7 CD25(T细胞晚期活化标记抗体)、anti-humanPE CD69(T细胞早期活化标记抗体)流式抗体，室温孵育15min，过量PBS洗涤细胞，重悬上机进行流式分析。图8的B为CD138 CAR-T、Vector-T活化相关受体表达结果统计图。如图所示，CD138 CAR-T与Vector-T在活化相关受体的表达方面无明显差异。
3)Vector-T/CD138 CAR-T细胞CD8表达及CD45RA、CCR7细胞分群检测：
收集细胞，标记anti-human PerCP CD8、anti-human APC/Cy7 CD45RA、anti-human PE CCR7流式抗体，室温孵育15min，过量PBS洗涤细胞，重悬上机进行流式分析。图8的C为Vector-T/CD138 CAR-T细胞CD8表达及细胞分群统计结果，整体而言，细胞分群在各组间无明显差异。
5.免疫荧光法检测多发性骨髓瘤细胞系与CAR-T细胞共培养上清中细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α的水平：
分别将H929和K562细胞系按照2×105细胞/孔接种24孔板。按每孔2×105细胞分别加入CD138 CAR-T及Vector-T细胞，补充培养液至1ml于孵箱中共培养48小时后。采用细胞因子联合检测试剂盒(杭州赛基生物)对共培养上清进行检测(具体步骤见细胞因子联合检测试剂盒说明书)。结果如图9所示，表达CD138的骨髓瘤细胞系H929与CAR-T共培养上清中IL-2、IFN-γ、TNF-α细胞因子水平均较Vector-T组有显著性升高，但在不表达CD138的K562细胞的共培养上清中的IL-2、IFN-γ、TNF-α水平较低。结果表明，CAR-T在表达CD138的肿瘤细胞刺激下，能够分泌Th1类细胞因子。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (16)
1.一种靶向CD138的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括胞外区、跨膜区和胞内区，所述胞内区包含胞内信号转导区，其特征在于，所述胞外区包括特异性结合人CD138分子的结合结构域，所述结合结构域包括如SEQ ID No.1所示的重链可变区的CDRH1的氨基酸序列、如SEQ ID No.2所示的重链可变区的CDRH2的氨基酸序列、如SEQ ID No.3所示的重链可变区的CDRH3的氨基酸序列、如SEQ ID No.4所示的轻链可变区的CDRL1的氨基酸序列、如SEQ IDNo.5所示的轻链可变区的CDRL2的氨基酸序列和如SEQ ID No.6所示的轻链可变区的CDRL3的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有85％～99％同一性且与其具有相同生物学功能的序列。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述结合结构域包括如SEQ IDNo.7所示的重链可变区的氨基酸序列和如SEQ ID No.8所示的轻链可变区的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有85％～99％同一性且与其具有相同生物学功能的序列。
3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述结合结构域为特异性结合人CD138分子的Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、FCL、dAb、单链抗体scFv、嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体；
优选地，所述结合结构域为特异性结合人CD138分子的单链抗体scFv，所述单链抗体scFv包括如SEQ ID No.1所示的重链可变区的CDRH1的氨基酸序列、如SEQ ID No.2所示的重链可变区的CDRH2的氨基酸序列、如SEQ ID No.3所示的重链可变区的CDRH3的氨基酸序列、如SEQ ID No.4所示的轻链可变区的CDRL1的氨基酸序列、如SEQ ID No.5所示的轻链可变区的CDRL2的氨基酸序列和如SEQ ID No.6所示的轻链可变区的CDRL3的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有85％～99％同一性且与其具有相同生物学功能的序列。
4.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。
5.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞外区还包括构建在所述嵌合抗原受体的氨基末端的信号肽或与所述信号肽具有90％以上同一性且与其具有相同生物学功能的序列；
优选地，所述信号肽为CD8α中的信号肽序列或GM-CSF；
更优选地，所述信号肽为如SEQ ID NO.10所示的信号肽。
6.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞外区的结合结构域通过铰链区与所述跨膜区连接；
所述铰链区优选为CD8α中的铰链区序列；
所述跨膜区为选自以下蛋白质的跨膜结构域或与所述蛋白质具有90％以上同一性且与其具有相同生物学功能的序列：T细胞受体的α、β或ζ链、CD2、CD3ε、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD18、CD19、CD27、CD28、CD29、CD30、CD40、CD48、CD49a、CD49d、CD49f、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD69、CD79A、CD79B、CD84、CD96、CD100、CD103、CD134、CD137、CD150、CD158A、CD158B1、CD158B2、CD158C、CD158D、CD158F1、CD158F2、CD158K、CD160、CD162、CD226、CD229、CD244、CD247、CD258、CD268、CD270、CD272、CD276、CD279、CD314、CD319、CD335、CD336、CD337、CD352、CD353、CD355、CD357、LFA-1、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80、IL-2R beta、IL-2Rgamma、IL-7Ralpha、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS、SLP-76、PAG1/CBP、CD83配体、Fc gamma受体、整联蛋白、激活性NK细胞受体或Toll配体受体，或其组合；
优选地，所述跨膜区为CD8α中的跨膜区序列。
7.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内区还包括共刺激因子；
优选地，所述共刺激因子为通过选自以下蛋白质或与所述蛋白质具有90％以上同一性且与其具有相同生物学功能的序列获得的功能性信号结构域的一种或几种：整联蛋白、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1、4-1BB、B7-H3、CD278、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM、KIRDS2、SLAMF7、NKp80、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49α、IA4、CD49D、ITGA6、VLA6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11α、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、CD29、ITGB1、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、CD226、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、CD229、CD160、PSGL1、CD100、CD69、SLAMF6、SLAM、BLAME、CD162、LTBR、LAT、GADS或SLP-76；
更优选地，所述共刺激因子为CD28或4-1BB，或与其具有90％以上同一性且与其具有相同生物学功能的序列。
8.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号转导区为选自以下蛋白质或与所述蛋白质具有90％以上同一性且与其具有相同生物学功能的序列：4-1BB、B7-H3、BAFFR、BLAME、BTLA、CD100、CD103、CD160、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD276、CD28、CD29、CD3ζ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8alpha、CD8beta、CD96、CDS、CEACAM1、CRTAM、DAP-10、DNAM1、Fc gamma受体、GADS、GITR、HVEM、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Ig alpha、IL2R beta、IL2R gamma、IL7R alpha、整联蛋白、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、LIGHT、LIGHT、LTBR、Ly9、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80、OX-40、PAG/Cbp、PD-1、PSGL1、SELPLG、SLAMF4、SLAMF6、SLAMF7、SLP-76、TNFR2、Toll配体受体、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6，或其组合；
优选地，所述胞内信号转导区为CD3ζ。
9.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，或与其具有90％以上同一性且与其具有相同生物学功能的序列。
10.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1～9任意一项中所述的嵌合抗原受体的氨基酸序列。
11.一种载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求10所述的核酸分子的序列；
优选地，所述载体为质粒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体；
更优选地，所述载体中包含EF1α启动子序列。
12.一种分离的细胞，其特征在于，所述细胞中包含如权利要求1～9任意一项中所述的嵌合抗原受体、如权利要求10所述的核酸分子或如权利要求11所述的载体；
优选地，所述细胞为i)免疫应答细胞，优选为T细胞、NK细胞、NKT细胞或CTL细胞，更优选为T细胞；或ii)诱导多能干细胞(iPSC)。
13.根据权利要求12所述的分离的细胞，其特征在于，所述细胞为自体或异体来源的T细胞；
优选地，所述细胞为自体来源的T细胞。
14.根据权利要求13所述的分离的细胞，其特征在于，所述细胞为异体来源的T细胞，所述T细胞为通用型嵌合抗原受体T细胞；
优选地，所述T细胞缺失编码TCR、HLA、CD52、PD-1或CD7的基因。
15.如权利要求1～9任意一项中所述的嵌合抗原受体、如权利要求10所述的核酸分子、如权利要求11所述的载体或如权利要求12所述的细胞在制备治疗CD138阳性血液肿瘤药物中的应用；
优选地，所述CD138阳性血液肿瘤为多发性骨髓瘤；
更优选地，所述CD138阳性血液肿瘤为复发或无效的CD138+多发性骨髓瘤。
16.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1～9任意一项中所述的嵌合抗原受体、如权利要求10所述的核酸分子、如权利要求11所述的载体或如权利要求12所述的细胞。
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