CN117919401A - 一种抗rbd抗体或其抗原结合片段的稳定的药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗RBD抗体或其抗原结合片段的稳定的药物组合物。本发明的药物组合物包含一种抗RBD抗体或其抗原结合片段、缓冲剂如组氨酸‑盐酸组氨酸等。本发明的药物组合物杂质少且稳定性高，在储存数月之后依然显示出较高的抗体稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗RBD抗体或其抗原结合片段的稳定的药物组合物。
背景技术
在德尔塔变异毒株中突变的氨基酸残基数量为18个，而在新毒株奥密克戎中则有43个。这些变异多样化，且大部分位于与人体细胞相互作用的区域。由于病毒变异率高，传播范围广，大量的疫苗和药物也在大量研发，疫苗和抗体药物出现耐药以及脱靶风险提高，这也给新型抗体药物以及疫苗研发提出更高要求，也提供了更多机遇。
新冠病毒具有四个结构蛋白，结构蛋白介导病毒粒子的组装与感染。N蛋白组成了基因组外的核衣壳，随后在外层还有膜蛋白(M)，刺突蛋白(S)，包膜蛋白(E)所组成的病毒囊膜结构。
新冠病毒的S蛋白为病毒表面的一类标志性跨膜蛋白，是由3个相同的亚基通过非共价键的方式结合形成的同源三聚体，其相对分子质量为141178，含有1273个氨基酸。S蛋白主要由信号肽、N端结构域、受体结合结构域(RBD)、融合肽段、七肽重复序列(heptadrepeat，HR)1、HR2、跨膜结构域、胞质结构域等构成，同时具有S1/S2与S2两个切割位点。相关研究显示，HR1和HR2会在S1的RBD与靶细胞的ACE2结合后，形成融合核心(6-HB)，提高病毒融合和感染的效率。
新冠病毒的细胞受体血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)是肾素-血管紧张素系统的主要活性肽。目前认为，在新冠病毒感染中，ACE2为病毒进入细胞的主要受体。ACE2作为含锌羧肽酶的Ⅰ型跨膜蛋白，多表达于肾脏、心脏和男性生殖系统，同时也在肺、小肠和肝脏等组织中表达。刺突蛋白在病毒入侵过程中起着主要的作用，并且S蛋白为主要免疫原。该蛋白会刺激机体产生大量抗体，这些抗体会结合到S蛋白表面，阻断病毒与宿主识别，抑制病毒蛋白剪切变构，从而抑制病毒入侵。S蛋白在病毒表面常以三聚体形式聚集。S蛋白为同源三聚体，C端锚定于病毒膜上，S蛋白是冠状病毒进入细胞的关键，所以它是一个有吸引力的抗病毒靶点。抗RBD的抗体可以阻碍S蛋白三聚体形成和/或阻碍S蛋白与宿主ACE2结合，从而抑制病毒入侵。
但对于抗体而言，普遍存在杂质较多，稳定性差，存放过程中容易发生变性或者主峰含量下降较快等难题。目前市面上还没有解决这一难题的普适性的药物组合物，尤其是针对双特异性抗RBD抗体并没有公开报道。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明在研发出的双特异性抗RBD抗体的前提下，结合实际临床需求和特点，研发出了杂质少，稳定性高，在储存数月之后依然显示出较高的抗体稳定性的双特异性抗RBD抗体的药物组合物。
本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含抗RBD抗体或其抗原结合片段，其中所述抗RBD抗体为可特异性结合RBD的抗体；以及缓冲剂。
在一个实施方案中，所述缓冲剂选自柠檬酸盐、组氨酸盐缓冲剂，优选为柠檬酸-柠檬酸钠和组氨酸/盐酸组氨酸缓冲剂。在一个实施方案中，所述缓冲剂的pH为约5.5至约6.5，优选为约6.0。
在一个实施方案中，所述缓冲剂的浓度为约5mM至约30mM，优选为约5mM至约20mM，更优选为约15mM至约20mM。
在一个实施方案中，所述抗RBD抗体或其抗原结合片段的浓度为约20mg/mL至约100mg/mL，优选为约30mg/mL至约60mg/mL。
在一个实施方案中，所述药物组合物还包括醇，优选为山梨糖醇或甘露醇，更优选为山梨糖醇。在一个实施方案中，所述醇的浓度为约30mg/mL至约60mg/mL，优选为约40mg/mL至约50mg/mL。
在一个实施方案中，所述药物组合物还包括表面活性剂，优选为吐温系列，更优选为吐温20或吐温80，更优选为吐温80。在一个实施方案中，所述表面活性剂的浓度为约0.1g/L至约0.4g/L，更优选为约0.2g/L至约0.3g/L。
在一个实施方案中，所述药物组合物是一种冻干制剂。在一个实施方案中，所述冻干制剂由本文所述的药物组合物经冷冻干燥获得。
在一个实施方案中，所述药物组合物是一种液体制剂。在一个实施方案中，所述液体制剂由本文所述的药物组合物经无菌灌装获得。
在一个实施方案中，所述抗RBD抗体或其抗原结合片段包含第一抗体或其抗原结合片段和第二抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗体或其抗原结合片段与所述第二抗体或其抗原结合片段能够结合冠状病毒刺突蛋白的不同表位。
在一个实施方案中，所述第一抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在一个实施方案中，所述第二抗体为scFv片段。在一个实施方案中，所述scFv片段连接在第一抗体或其抗原结合片段的轻链N端。在一个实施方案中，所述scFv片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。在一个实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段的轻链和所述第二抗体或其抗原结合片段之间的连接子序列如SEQ ID NO:4所示。
在一个实施方案中，所述第一抗体的轻链、连接子和所述第二抗体的全长序列如SEQ ID NO:5所示。
在一个实施方案中，所述药物组合物可用于制备治疗或抑制肿瘤细胞增殖或转移的疾病或病症的药物。在一个实施方案中，所述疾病或病症为癌症。在一个实施方案中，所述癌症选自肾肿瘤、胰腺肿瘤、头颈部肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、结肠肿瘤、胃肿瘤和卵巢肿瘤、肺肿瘤和皮肤肿瘤中的一种或多种。
本发明的药物组合物更利于生产和给药，性能更稳定，杂质少，储存之后展现了很高的抗体稳定性。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是保持抗体活性成分的稳定性，促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
本文中，“药物组合物”和“制剂”并不互相排斥。
本发明中所述药物组合物的溶液形式，若无特殊说明，其中的溶剂均为水。
“冻干制剂”表示液体或溶液形式的药物组合物或液体或溶液制剂经真空冷冻干燥步骤之后获得的制剂或药物组合物。
“缓冲剂”指通过其酸-碱共轭组分的作用而耐受pH变化的缓冲剂。“组氨酸盐缓冲剂”是包含组氨酸根离子的缓冲剂，包括组氨酸/醋酸，组氨酸/盐酸组氨酸缓冲体系。
本文所用术语“约”是指数值在由本领域一般技术人员所测定的具体值的可接受误差范围内，所述数值部分取决于怎样测量或测定(即测量体系的限度)。例如，在本领域每一次实行中“约”可意味着在1内或超过1的标准差。或者，“约”可意味着至多20％的范围。除非另外说明，否则当具体值在本申请和权利要求中出现时，“约”的含义应该假定为在该具体值的可接受误差范围内。
本发明所述的药物组合物能够达到一种稳定的效果：其中的抗体在贮藏后基本上保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的药物组合物，优选地，药物组合物在贮藏后基本上保留其物理和化学稳定性以及其生物学活性。贮藏期一般基于药物组合物的预定保存期来选择。目前有多种测量蛋白质稳定性的分析技术，可测量在选定温度贮藏选定时间段后的稳定性。
本发明的术语“表位”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
具体实施方式
本发明的抗体制剂处方开发过程包括缓冲体系筛选、添加物筛选、表面活性剂筛选、初步原辅料相容性以及稳定性研究。以下SEC-HPLC(size exclusion-highperformance liquid chromatography)表示体积排阻-高效液相色谱，其中HMW，LMW分别表示高分子量、低分子量。
实施例1：基因合成与表达载体的构建
采用pcDNA3.1-G418载体作为表达所述多功能抗体的轻链和重链的专用载体pcDNA3.1-G418载体含有重链所使用的启动子CMV Promoter、真核筛选标记G418标签和原核筛选标签Ampicilline。基因合成得到抗体表达轻链和重链的核苷酸序列，用HindIII和XhoI对载体和目的片段进行双酶切，回收后通过DNA连接酶进行酶连，并转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑选出阳性克隆并进行质粒提取和酶切验证，获得含所述抗体重链、轻链重组质粒，分别为pcDNA3.1-G418-1、pcDNA3.1-G418-2。
实施例2：质粒抽提
根据《分子克隆实验指南》(2002年，科学出版社)所述方法将含有上述各目的基因的重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，将转化细菌涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上培养，挑选质粒克隆至液体LB培养基中培养，260rpm摇菌14小时，由无内毒素质粒大抽试剂盒抽提质粒，用无菌水溶解并用核酸蛋白定量仪进行浓度测定。
实施例3：质粒转染、瞬转表达与抗体纯化
在37℃、8％CO2、120rpm下培养ExpiCHO至细胞密度6×106cells/ml。使用脂质体分别将构建的载体PCDNA3.1-G418-6-1、PCDNA3.1-G418-6-2转染到上述细胞中，转染质粒浓度为1μg/μL，脂质体浓度参照ExpiCHOTM Expression System试剂盒确定，在32℃、5％CO2，110rpm下培养7-10天。转染18-22h之后和5-8天之间分别补料一次。4000rpm离心上述培养产物，0.22μm滤膜过滤并收集培养基上清液，采用ProteinA、离子柱纯化所得的抗体蛋白并收集洗脱液。
ProteinA、离子柱纯化的具体操作步骤为：细胞培养液经过高速离心后取上清，利用博格隆的ProteinA层析柱进行亲和层析。层析使用平衡缓冲液为1×PBS(pH7.4)，细胞上清上样结合后利用PBS洗涤至紫外线回到基线，然后利用洗脱缓冲液0.05M醋酸钠(pH3.5)洗脱目的蛋白，利用Tris调节pH至中性保存。将亲和层析所得产物调节pH至低于或者高于pI1-2个pH单位，适当稀释以控制样本电导在5ms/cm以下。利用合适的对应pH缓冲液如磷酸缓冲液、醋酸缓冲液等条件，利用本领域内常规的离子交换层析方法如阴离子交换或者阳离子交换进行对应pH条件下NaCl梯度洗脱，根据SDS-PAGE及SEC-HPLC选择目的蛋白所在的收集管合并保存。
实施例4：缓冲体系筛选
用抗体制剂常用的缓冲盐设计2组不同pH值的缓冲溶液(见表1)。将本发明涉及的抗体原液经过超滤换液至不同pH值的缓冲溶液、进行除菌过滤、无菌分装。用分装的样品进行25℃稳定性实验，定期取样，进行性状、分子排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)等检测。比较稳定性所获得的数据，总结数据之间的关联性，选择有利于本发明涉及的抗体稳定性的pH值的缓冲溶液。
表1缓冲体系筛选研究方案
对12组缓冲体系在不同考察条件下不同取样点进行取样检测分析，结果见表2。
表2缓冲体系筛选检测结果
注:考察条件为25±2℃；W为考察周期，1W＝1周。
纯度考察项中SEC-HPLC的评价结果显示，组氨酸-盐酸组氨酸缓冲体系对应的F7、F10和F11的本发明涉及的样品在25℃放置4周后，主峰比例仍能保持在93％以上。表明该缓冲体系下本发明涉及的样品能在宽泛的pH范围内保持稳定的状态。
综上所述，选择pH值为6.0的20mM组氨酸/盐酸组氨酸缓冲体系作为本发明涉及的项目制剂处方的缓冲体系。
实施例5：辅料(糖)筛选
用20mM组氨酸/盐酸组氨酸，pH值为6.0的缓冲溶液，添加不同辅料，如海藻糖、蔗糖制成不同处方的样品，将抗体蛋白换液至相应处方中，进行除菌过滤、无菌分装。用分装的样品进行25℃稳定性实验，在1周、3周、4周取样进行分子排阻高效液相色谱(SEC—HPLC)等检测。比较稳定性检测数据，选择有利于抗体稳定性的处方。
制剂处方筛选方案及7组制剂处方评价数据统计表见表3和表4。
表3制剂处方筛选方案
表4处方筛选检测结果汇总表
注：考察条件为25℃；W为考察周期，1W＝1周。
纯度考察项中SEC-HPLC的评价结果看出，F13-15下的样品在该考察条件指标均不稳定，而F16的样品在存放4周后，最高峰的含量能保持在92.70％以上。
样品在25℃条件下放置4周，随着时间的增加，F13、F14中的本发明涉及的样品的聚体和小分子片段的含量呈现逐渐增加的趋势，主峰比例明显下降，表明本发明涉及的样品在添加蔗糖的缓冲液中不稳定；F15和F16的本发明涉及的样品的抗体添加的量不同，添加的糖类均为海藻糖；样品在25℃条件下放置4周，F16的缓冲液中更稳定，纯度下降幅度最小，表明抗体制剂的稳定剂为海藻糖，抗体浓度为60mg/mL。
因此，综合考虑选择135mM海藻糖为本发明涉及的制剂处方的添加物。
实施例6：辅料(氨基酸)筛选
用20mM组氨酸/盐酸组氨酸，pH值为6.0的缓冲溶液，添加不同辅料，如甘露醇/山梨糖醇制成不同处方的样品，将抗体蛋白换液至相应处方中，进行除菌过滤、无菌分装。用分装的样品进行25℃稳定性实验，在1-4周取样进行分子排阻高效液相色谱(SEC—HPLC)等检测。比较稳定性检测数据，选择有利于抗体稳定性的处方。
表7制剂处方筛选方案
表8处方筛选检测结果汇总表
注：考察条件为25℃；W为考察周期，1W＝1周。
纯度考察项中SEC-HPLC的评价结果看出，F21-F24的样品在存放3周后，最高峰的含量能保持在91.03％以上，整体主峰含量较高。因此，综合考虑，盐酸精氨酸和甘氨酸均可为本发明涉及的制剂处方的添加物进入下一轮筛选。
实施例7：加入盐和抗氧化剂后的筛选
用20mM组氨酸/盐酸组氨酸，pH值为6.0的缓冲溶液，添加不同辅料，抗氧化剂如EDTA·2Na和盐类如氯化钠制成不同处方的样品，将抗体蛋白换液至相应处方中，进行除菌过滤、无菌分装。用分装的样品进行25℃稳定性实验，在1-4周取样进行分子排阻高效液相色谱(SEC—HPLC)等检测。比较稳定性检测数据，选择有利于抗体稳定性的处方。具体如表9和表10所示。
表9制剂处方筛选方案
表10处方筛选检测结果汇总表
注：考察条件为25℃；W为考察周期，1W＝1周。
纯度考察项中SEC-HPLC的评价结果看出，F25-F28的样品在存放4周后，F25和F26最高峰的含量能保持在95.68％以上，整体主峰含量较高。因此，综合考虑，EDTA·2Na可为本发明涉及的制剂处方的添加物进入下一轮筛选。
实施例8：表面活性剂筛选
用20mM组氨酸-盐酸组氨酸、135mM海藻糖、pH值为6.0的缓冲溶液，不同种类的表面活性剂(吐温80、吐温20)制成不同处方的样品，将抗体蛋白换液至相应处方中，进行除菌过滤、无菌分装。
4组表面活性剂评价数据统计表见下表11和12。
表11制剂处方筛选方案
表12
实施例9：综合辅料筛选
20mM组氨酸-盐酸组氨酸，pH6.0，抗体浓度60mg/mL为固定用量，各处方的筛选方案如表13所示。数据统计表见下表13和14。
表13制剂处方筛选方案
表14
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纯度考察项中SEC-HPLC的评价结果看出，F35-F42的样品在存放4周后，整体主峰含量较高，均在94.96％以上。但放置8周后，仅有F35和36主峰含量在94.28％以上，其他主峰含量下降较多。因此F35和F36较为理想。在放置第12周后，对F35和F36进行考察，发现F36的主峰含量更高，因此，F36作为最优的处方。
Claims (10)
1.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含抗RBD抗体或其抗原结合片段，其中所述抗RBD抗体为可特异性结合RBD的抗体；以及缓冲剂，所述缓冲剂选自柠檬酸盐、组氨酸盐缓冲剂，所述缓冲剂的pH为约5.5至约6.5。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述缓冲剂的浓度为约5mM至约30mM。
3.根据权利要求1-2任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述抗RBD抗体或其抗原结合片段的浓度为约20mg/mL至约100mg/mL。
4.根据权利要求1-3任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括醇，所述醇的浓度为约30mg/mL至约60mg/mL。
5.根据权利要求1-4任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括表面活性剂，所述表面活性剂的浓度为约0.1g/L至约0.4g/L。
6.根据权利要求1-5任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物是一种冻干制剂，所述冻干制剂由权利要求1至5任一项所述的药物组合物经冷冻干燥获得。
7.根据权利要求1-5任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物是一种液体制剂，所述液体制剂由权利要求1至5任一项所述的药物组合物经无菌灌装获得。
8.根据权利要求1-7任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述抗RBD抗体或其抗原结合片段包含第一抗体或其抗原结合片段和第二抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗体或其抗原结合片段与所述第二抗体或其抗原结合片段能够结合冠状病毒刺突蛋白的不同表位。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述第一抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
10.根据权利要求8-9任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述第二抗体为scFv片段，所述scFv片段连接在第一抗体或其抗原结合片段的轻链N端，所述scFv片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
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