CN116650639A - 一种双特异性抗体组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种双特异性抗体组合物，所述药物组合物包含双特异性抗体、蛋白稳定剂、缓冲剂和赋形剂；其中，所述缓冲剂为组氨酸和/或盐酸组氨酸缓冲剂。本发明中的双特异性抗体组合物在储存数月之后依然显示出较高的蛋白质稳定性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种双特异性抗体组合物。
背景技术
巨噬细胞发挥吞噬效应需要两个信号同时起作用：一个是靶向细胞表面的“吃我”信号的激活，另一个是同一细胞表面“别吃我”信号的失活。任何一个信号的缺少都不足以引发吞噬效应的发生。CD24是一类“别吃我”信号，肿瘤细胞高表达CD24，通过与巨噬细胞表面的Siglec-10结合，释放“别吃我”信号，从而防止肿瘤细胞被巨噬细胞吞噬。CD24在很多肿瘤细胞高表达，属于肿瘤相关抗原(TAA)，特异性识别CD24和4-1BB的双特异性抗体能够在肿瘤微环境中特异性激活4-1BB，降低毒性。
4-1BB(CD137，TNFRSF9)是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRS)的一种跨膜蛋白质。4-1BB在细胞表面以单体或二聚体形式表达，与其配体(4-1BBL)结合后通过三聚体化以进行信号传导，是CD8+和CD4+T细胞、调节性T细胞(Tregs)、NK细胞和NKT细胞、B细胞和中性粒细胞等的共刺激分子。在T细胞上，4-1BB并非组成型表达，而是在T细胞受体(TCR)激活后诱导的，通过其天然配体4-1BBL或抗体激动剂的刺激，经由TNFR相关因子(TRAF)-2和TRAF-1进行信号传导。4-1BB的早期信号传导涉及K-63的多泛素化，激活核因子(NF)-κB和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径，信号传导导致T细胞的共刺激，细胞增殖，细胞因子产生，成熟和CD8+T细胞存活延长。
针对CD24和4-1BB构建的双特异性抗体能够特异性识别CD24和4-1BB，激活4-1BB的信号通路，激活CD8+T细胞，刺激T细胞增殖并分泌细胞因子，特异性杀伤表达CD24的肿瘤细胞；通过抗CD24抗体特异性结合表达CD24的肿瘤细胞，解除“别吃我”信号；还可以将双特异性抗体富集至肿瘤微环境中，抗4-1BB抗体为4-1BB激活抗体，可以模拟天然4-1BBL形成“三聚体”，特异性激活CD8+T细胞，激活PBMC中表达4-1BB的T、NK细胞，分泌IL-2和IFN-γ，达到靶向杀伤肿瘤细胞的作用。因此，为了实现双特异性抗体的临床潜力，需在保存和施用期间维持所述双特异性抗体的生物学活性。化学和物理的不稳定性会促使生物学活性的降低。由于水和温度的变化，双特异性抗体可能发生凝聚、氧化、脱酰胺或水解，保持双特异性抗体生物学活性的一种方法是通过冻干来稳定抗体制剂。因此，需要研发针对CD24和4-1BB构建的双特异性抗体的稳定冻干制剂。
发明内容
在本申请中，发明人开发了一种更利于生产和给药，性能更稳定的包含双特异性抗体的组合物。本发明的制剂稳定，生物相容性好，杂质少，储存数月之后展现了很高的蛋白质稳定性。解决了蛋白质药物的分子量大，结构复杂，容易降解、聚合或发生不希望发生的化学修饰等而变得不稳定的技术问题，使抗体适合于给药，发挥更好的治疗效果。
本发明提供了一种双特异性抗体组合物，所述组合物包含双特异性抗体、蛋白稳定剂、缓冲剂和赋形剂，其中，所述缓冲剂为组氨酸和/或盐酸组氨酸缓冲剂，所述双特异性抗体包含：(a)特异性结合CD24的第一抗体或其抗原结合片段，和(b)特异性结合4-1BB的第二抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述缓冲剂的pH为5.5～6.5；优选地，所述缓冲剂的pH为6.0。
在一些实施方案中，所述缓冲剂浓度为5mM～35mM；优选地，所述缓冲剂浓度为20mM。
在一些实施方案中，所述蛋白稳定剂为聚山梨酯；更优选地，所述蛋白稳定剂为聚山梨酯80。
在一些实施方案中，所述蛋白稳定剂的浓度为0.1g/L～0.3g/L；优选地，所述蛋白稳定剂的浓度为0.2g/L。
在一些实施方案中，所述赋形剂选自海藻糖、蔗糖、甘露醇；优选地，所述赋形剂为海藻糖。
在一些实施方案中，所述赋形剂的浓度为100mM～200mM；优选地，所述赋形剂的浓度为135mM。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体的浓度为1g/L～100g/L；优选地，所述双特异性抗体的浓度为10g/L～30g/L；更优选地，所述双特异性抗体的浓度为20g/L。
本发明还提供一种双特异性抗体组合物，所述组合物包含：(a)10g/L～30g/L的双特异性抗体，(b)5mM～35mM的组氨酸和/或盐酸组氨酸缓冲剂，pH为5.5～6.5，(c)100mM～200mM的海藻糖，和(d)0.1g/L～0.3g/L的聚山梨酯80；其中，所述双特异性抗体包含：(a)特异性结合CD24的第一抗体或其抗原结合片段；和(b)特异性结合4-1BB的第二抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供一种双特异性抗体组合物，所述组合物包含：(a)20g/L的双特异性抗体，(b)20mM的组氨酸和/或盐酸组氨酸缓冲剂，pH为6.0，(c)135mM的海藻糖，和(d)0.2g/L的聚山梨酯80；其中，所述双特异性抗体包含：(a)特异性结合CD24的第一抗体或其抗原结合片段；和(b)特异性结合4-1BB的第二抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体的第一抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，第二抗体或其抗原结合片段包含scFv；其中，所述scFv连接于第一抗体或其抗原结合片段的重链C端。
在一些实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3的氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及包含如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，所述第一抗体包含如SEQ ID NO:13所示的重链可变区VH，如SEQ ID NO:14所示的轻链可变区VL。
在一些实施方案中，所述scFv包含如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及包含如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQID NO:12的氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，所述scFv包含如SEQ ID NO:15所示的重链可变区VH，如SEQID NO:16所示的轻链可变区VL。
在一些实施方案中，所述组合物为冻干制剂。
术语
术语“特异性”表示参与特异性结合的分子之一不显示任何与不同于结合伙伴分子中的一个或数个的分子的显著结合。此外，在含抗体可变区的结构域对抗原中的多个表位中的特定表位具有特异性时，也使用该术语。当含抗体可变区的结构域所结合的表位被包含在数个不同抗原中时，包含含抗体可变区的结构域的抗原结合分子可以结合具有所述表位的各种抗原。
术语“scFv”片段是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单一多肽链中。所述Fv多肽可以进一步在VH与VL结构域之间包含多肽接头，所述多肽接头使scFv能够形成抗原结合所希望的结构。Fc结构域可以是本领域已知的或本文所述的任何合适的Fc结构域。
术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A.等人，((1991)Sequences of proteins ofimmunological interest.NIH Publication 91-3242)提供。如本文中一些实施方案中使用的，CDR可以以Kabat规则定义轻链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，以及重链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)。
术语“连接子”或用于连接两个蛋白质结构域中间的“L1”指连接性多肽序列，用于连接蛋白质结构域，具有一定的柔性，接头的使用不会使蛋白质结构域原有的功能丧失。
术语抗体的“可变区”是指单独的或组合的抗体轻链的可变区(VL)或抗体重链的可变区(VH)。如在本领域中已知的，重链和轻链的可变区各自由通过3个互补决定区(CDR)(也称为高变区)连接的4个框架区(FR)组成。每一条链中的CDR通过FR紧密地保持在一起并且与来自另一条链的CDR一起促成抗体的抗原结合部位的形成。
附图说明
图1为双特异性抗体的结构示意图。示意图中IgG部分为抗CD24抗体(抗CD24IgG)，将抗4-1BB抗体的轻重链可变区通过连接子L1(GGGGSGGGGSGGGGS)连接，可形成scFv(VH4-1BB-L1-VL4-1BB)，抗4-1BB scFv部分由连接子L1(GGGGSGGGGSGGGGS)连接在抗CD24 IgG重链的C末端。
具体实施方式
实施例1核苷酸序列的获得与优化
特异性识别CD24和4-1BB的双特异性抗体的结构如图1所示。双特异性抗体的重链中抗CD24抗体重链HCDR1、HCDR2、HCDR3序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3所示，重链中抗4-1BB抗体scFv的重链可变区(VH)HCDR1、HCDR2、HCDR3序列分别如SEQID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示，重链中抗4-1BB抗体scFv的轻链可变区(VL)LCDR1、LCDR2、LCDR3序列分别如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示，抗CD24抗体轻链LCDR1、LCDR2、LCDR3序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。抗CD24抗体重链与抗4-1BB抗体scFv的连接采用(GGGGS)3连接肽，scFv中VH和VL的连接采用(GGGGS)3连接肽。双特异性抗体的重链序列如SEQ ID NO:17所示，轻链序列如SEQ IDNO:18所示。
将上述各目标氨基酸序列转化为核苷酸序列，并针对可能影响抗体在哺乳动物细胞中表达的一系列参数：密码子偏好性、GC含量(即DNA的4种碱基中鸟嘌呤G和胞嘧啶C所占的比率)、CpG岛(即CpG双核苷酸在基因组中密度较高的区域)、mRNA的二级结构、拼接位点、前成熟PolyA位点、内部Chi位点(基因组中一段短的DNA片段，在该位点附近发生同源重组的几率增加)或者核糖体结合位点、RNA不稳定序列、反向重复序列及可能干扰克隆的限制性酶切位点等进行优化；同时增加了可能会提高翻译效率的相关序列，例如Kozak序列、SD序列，以及终止密码子。设计得到分别编码上述蛋白质的重链基因和轻链基因，另外在重链和轻链的5’端分别设计上根据氨基酸序列优化而得的编码信号肽的核苷酸序列；此外，还对轻链和重链核苷酸序列的3’端分别加上终止密码子。
实施例2基因合成与表达载体的构建
采用pcDNA3.1-G418载体作为表达所述蛋白质的轻链和重链的专用载体。pcDNA3.1-G418载体含有重链所使用的启动子CMV Promoter、真核筛选标记G418标签和原核筛选标签Ampicilline。基因合成分别得到蛋白质表达的重链、轻链编码基因的核苷酸序列(即目的基因)，用HindIII和XhoI对载体和目的片段进行酶切，回收后通过DNA连接酶进行酶连，并转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑选出阳性克隆并进行质粒提取和酶切验证，获得含所述蛋白质重链、轻链编码基因的重组质粒。
实施例3质粒抽提
将含有上述各目的基因的重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，将转化细菌涂布在含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上培养，挑选质粒克隆至液体LB培养基中培养，260rpm摇菌14h，由无内毒素质粒大抽试剂盒抽提质粒，用无菌水溶解并用核酸蛋白定量仪进行浓度测定。
实施例4质粒转染、瞬转表达与蛋白质纯化
在37℃、8％CO2、100rpm下培养ExpiCHO至细胞密度6×106个/mL。使用脂质体分别将构建的载体质粒按照质量浓度1:1:1转染到上述细胞中，转染质粒浓度为1mg/mL，脂质体浓度参照ExpiCHOTM Expression System试剂盒确定，在32℃、5％CO2，100rpm下培养7-10天。转染18-22h之后和第5天之间分别补料一次。将上述培养产物置于离心机中，以4000g转速离心，0.22μm滤膜过滤并收集培养基上清液，采用ProteinA、离子柱纯化所得的蛋白并收集洗脱液。
ProteinA、离子柱纯化的具体操作步骤为：细胞培养液经过高速离心后取上清，利用GE的ProteinA层析柱进行亲和层析。层析使用平衡缓冲液为1×PBS(pH7.4)，细胞上清上样结合后利用PBS洗涤至紫外线回到基线，然后利用洗脱缓冲液0.1M甘氨酸(pH3.0)洗脱目的蛋白，利用Tris调节pH至中性保存。将亲和层析所得产物调节pH至低于或者高于等电点1-2个pH单位，适当稀释以控制样本电导在5ms/cm以下。利用合适的对应pH缓冲液如磷酸缓冲液、醋酸缓冲液等条件，利用本领域内常规的离子交换层析方法如阴离子交换或者阳离子交换进行对应pH条件下NaCl梯度洗脱，根据SDS-PAGE选择目的蛋白所在的收集管合并保存。然后，将纯化后所得的洗脱液超滤换液至缓冲液中。
实施例5组合物处方筛选
将本发明涉及的双特异性抗体原液经过超滤换液至不同缓冲液浓度、pH值、聚山梨酯80浓度，进行除菌过滤、无菌分装。进行-80℃反复冻融试验、25℃加速稳定性实验和40℃加速稳定性实验，定期取样，进行性状、分子排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)等检测。比较稳定性所获得的数据，总结数据之间的关联性，选择有利于本发明涉及的双特异性抗体稳定性的组合物处方。
表1缓冲体系筛选研究方案
对7组缓冲体系在三个不同考察条件下不同取样点进行取样检测分析，结果见表3、4、5。其中，HMW指大分子聚体杂质，LMW指小分子片段杂质，Main指双特异性抗体，ND指未检出。
表2初始样品纯度信息表
表3冻融稳定性实验结果
表4 25℃稳定性实验结果
表5 40℃稳定性实验结果
结果如表2、3、4、5所示，本发明涉及的双特异性抗体在冻融实验条件下，大分子聚体杂质及小分子片段杂质未产生明显变化；在25℃条件下，静置2周时的大分子聚体杂质及小分子片段杂质未产生明显变化，静置3周后，小分子片段杂质明显增加；在40℃条件下，静置2周时的抗体纯度少量下降，大分子聚体杂质及小分子片段杂质少量增加，静置3周时的大分子聚体杂质及小分子片段杂质大量增加，明显低于质控标准。
稳定性实验数据可以看出，本发明涉及的双特异性抗体在20mM组氨酸/盐酸组氨酸、135mM海藻糖、0.2g/L聚山梨酯80(pH6.0)的处方中反复冻融和25℃下2周稳定性好，但高温破坏条件下不稳定。
实施例6冻干制剂的制备
将纯化后的蛋白质用超滤膜包进行超滤置换浓缩，超滤至组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液中，再与含一定比例的海藻糖、聚山梨酯80，pH6.0组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液混合，使得混合后各组分的浓度如表6所示。
表6冻干前溶液组分
| 成分 | 浓度 |
| 双特异性抗体 | 20g/L |
| 组氨酸 | 1.72g/L |
| 一水合盐酸组氨酸 | 1.87g/L |
| 二水合海藻糖 | 51.35g/L |
| 聚山梨酯80 | 0.2g/L |
充分混匀后，分装至冻干用注射剂瓶中，按2mL/瓶分装，进行冷冻干燥。冷冻干燥程序如下：
(1)预冻阶段：0℃保持60min；-45℃预冻保持2h；
(2)升华阶段：设置真空度在10Pa，程序升温，升温至-10℃，保持1h；升温至-5℃，保持26h；升温至0℃，保持5h；升温至5℃，保持2h；
(3)解析干燥：升温至25℃，10Pa压力下保持4h，5Pa压力下再保持2h；
(4)冻干结束，压塞出箱，再手动轧盖，4℃保存。
实施例7成品冻干制剂稳定性实验
1.复溶液稳定性试验
取成品冻干制剂，加0.9％氯化钠注射液(生产厂家：安徽双鹤药业有限责任公司)2mL复溶，考察室温条件放置，复溶液的稳定性。考察条件具体为：室温放置，分别于2、4、8、24小时取样检测。
表7复溶液稳定性结果
结果表明：复溶液在室温条件下放置24小时，各项检测指标均无明显变化，室温条件下放置24小时稳定。
2.影响因素试验
取成品冻干制剂，分别进行高温高湿、光照稳定性试验。考察条件为：在高温高湿(40℃，75％RH)条件下放置2个月，分别于1、2月取样检测；在光照(总强度不少于1.2×106Lux/·h，近紫外能量不少于200w·h/m2)条件下放置，于第12天取样检测。
表8影响因素稳定性结果
在40℃的条件下放置2个月，各项检测指标与0天相较，均无明显变化。在光照总强度不少于1.2×106Lux/·h，近紫外能量不少于200w·h/m2条件下放置，SEC-HPLC检测主峰纯度略有下降，大分子聚体略有增加；CEX-HPLC检测主峰纯度略有下降，碱性峰含量略有增长，其它各项检测结果均无明显变化。
3.加速试验和长期试验
加速试验：将成品冻干制剂于25℃±2℃、60％RH±5％RH条件下正置放置6个月，于3、6月取样检测。
长期试验：将成品冻干制剂于5℃±3℃条件下正置放置6个月，于3、6月取样检测。
表9加速、长期稳定性结果
结果表明，加速条件下正置放置6个月，各检测项与0天相较无明显变化。长期条件下正置放置6个月，各检测项与0天相较无明显变化。
综上，本发明涉及的双特异性抗体的冻干成品在20mM组氨酸/盐酸组氨酸、135mM海藻糖、0.2g/L聚山梨酯80(pH6.0)处方中具有较高的稳定性。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。
Claims (10)
1.一种双特异性抗体组合物，其特征在于，所述组合物包含双特异性抗体、蛋白稳定剂、缓冲剂和赋形剂，其中，所述缓冲剂为组氨酸和/或盐酸组氨酸缓冲剂，所述双特异性抗体包含：(a)特异性结合CD24的第一抗体或其抗原结合片段，和(b)特异性结合4-1BB的第二抗体或其抗原结合片段。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述缓冲剂的pH为5.5～6.5。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述缓冲剂浓度为5mM～35mM。
4.根据权利要求1-3任一项所述的组合物，其特征在于，所述蛋白稳定剂为聚山梨酯。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述蛋白稳定剂的浓度为0.1g/L～0.3g/L。
6.根据权利要求1-5任一项所述的组合物，其特征在于，所述赋形剂选自海藻糖、蔗糖、甘露醇。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述赋形剂的浓度为100mM～200mM。
8.根据权利要求1-7任一项所述的组合物，其特征在于，所述双特异性抗体的浓度为1g/L～100g/L。
9.根据权利要求1-8任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含：
(a)1g/L～100g/L的双特异性抗体，
(b)5mM～35mM的组氨酸和/或盐酸组氨酸缓冲剂，pH为5.5～6.5，
(c)100mM～200mM的海藻糖，和
(d)0.1g/L～0.3g/L的聚山梨酯80。
10.根据权利要求1-9任一项所述的组合物，其特征在于，所述第一抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，第二抗体或其抗原结合片段包含scFv；其中，所述scFv连接于第一抗体或其抗原结合片段的重链C端；优选地，所述第一抗体或其抗原结合片段包含如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及包含如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；且所述scFv包含如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及包含如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
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