CN117907596A

CN117907596A - 一种乳腺癌早期诊断标志物、试剂盒及其应用

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Publication number: CN117907596A
Application number: CN202410315948.XA
Authority: CN
Inventors: 张瑾; 房冉; 程霓虹; 张海峰
Original assignee: Zhejiang Baidi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Baidi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2024-03-20
Filing date: 2024-03-20
Publication date: 2024-04-19

Abstract

本发明涉及一种乳腺癌早期诊断标志物、试剂盒及其应用。具体地，本发明以C1q肿瘤坏死因子相关蛋白6(CTRP6)作为乳腺癌非侵入性诊断生物标志物，还提供了相关检测试剂、试剂盒及其应用。本发明通过检测循环CTRP6的表达水平对乳腺癌潜在患者实现早期筛查，更准确、快速和经济。

Description

一种乳腺癌早期诊断标志物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物标志物技术领域，尤其涉及一种乳腺癌早期诊断标志物及其应用。

背景技术

乳腺癌(BC)是一种由乳腺上皮细胞转化而来的异质性极强的肿瘤。早期发现和治疗可以提高患者的生存率，降低死亡率。因此，开发更有效的筛查、诊断和预后技术来检测乳腺癌是至关重要的。

目前乳腺癌筛查使用的主要技术包括：

乳腺X线摄影（乳腺X光）：也称为乳腺X线检查或乳腺X线照片，是一种常见的筛查方法，通过拍摄乳房的X光照片来检测异常。然而，乳腺X线摄影可能会产生假阳性结果，需要进一步进行其他检查来确认。

乳腺超声检查：乳腺超声检查使用声波来创建乳腺组织的图像，可以帮助鉴别囊性和实质性肿块，并对乳腺肿块进行评估。然而，乳腺超声检查的准确性受到操作者经验的影响。

乳腺磁共振成像（MRI）：乳腺MRI使用磁场和无线电波来创建详细的乳腺图像。它可以帮助检测早期的乳腺癌，尤其对于高风险人群。然而，乳腺MRI成本高昂，不适用于所有人群。

乳腺活检：乳腺活检是通过取得乳腺组织样本来进行病理学检查，以确定是否存在癌症细胞。乳腺活检可以通过穿刺活检、针吸活检或手术活检等方式进行。然而，乳腺活检是一种侵入性的过程，可能会引起不适和并发症。

上述技术存在的局限性：

①假阳性和假阴性结果：乳腺癌筛查技术可能会产生假阳性或假阴性结果。假阳性结果是指在筛查中显示为异常，但实际上并非癌症的结果。假阴性结果是指在筛查中显示为正常，但实际上存在癌症的结果。这些错误结果可能导致进一步的不必要检查或漏诊。

②限制于特定人群：某些筛查技术可能适用于特定人群，例如乳腺MRI对于高风险人群更为适用。然而，并非所有人都能够接受或承担这些技术。

③成本和资源限制：一些筛查技术，如乳腺MRI和乳腺活检，成本较高且需要特定的设备和专业人员。这可能限制了其在某些地区或资源有限的环境中的应用。

④不适用于早期癌症检测：某些筛查技术可能对早期癌症的检测能力有限，因为早期癌症可能在图像上不易被发现或被误判为正常。

综上所述，乳腺癌筛查技术在准确性、适用性和成本方面仍存在一些局限性，需要进一步的研究和改进。

C1q肿瘤坏死因子相关蛋白6 (CTRP6)或(C1qTNF6)是脂联素的类似物，属于补体C1q肿瘤坏死因子相关蛋白(CTRPs)家族。CTRP6主要表达于脂肪组织、肺、心脏、胃、子宫和胎盘，在炎症、细胞增殖和分化、细胞凋亡和纤维化等多种生物过程中发挥重要作用。先前的研究表明，CTRP6可能在致癌过程中发挥作用。最初发现CTRP6在肝细胞癌、胃癌、肺癌、肾细胞癌和膀胱癌中过度表达并可能促进肿瘤进展。其他研究报道了CTRP6的抑瘤功能，发现它对卵巢癌细胞的增殖和迁移有抑制作用，并显著抑制口腔鳞状细胞癌细胞的生长和侵袭，但其在乳腺癌中的表达水平和作用尚不清楚。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种以C1q肿瘤坏死因子相关蛋白6(CTRP6)作为乳腺癌非侵入性诊断生物标志物，通过检测循环CTRP6的表达水平对乳腺癌潜在患者实现早期筛查，更准确、快速和经济。

本发明提供了一种用于乳腺癌早期诊断的生物标志物，所述生物标志物为CTRP6mRNA或CTRP6蛋白质。

本发明还提供了一种用于检测所述生物标志物的试剂，所述试剂包括CTRP6 mRNA的检测引物或抗CTRP6抗体。

在一些实施方式中，所述试剂还包括PCR反应试剂或ELISA检测试剂。

本发明还提供了一种用于乳腺癌早期诊断的试剂盒，所述试剂盒包括前述的试剂。

本发明还提供了前述试剂在制备用于乳腺癌早期诊断的试剂盒中的应用。

在一些实施方式中，所述试剂盒通过检测循环CTRP6的表达水平来实现对乳腺癌的早期诊断，包括从受试者血清样本中检测CTRP6 mRNA或蛋白的表达水平；通过比较受试者的CTRP6 mRNA或蛋白表达水平（mRNA≤0.62；蛋白≤21.0 ng/ml），确定是否存在乳腺癌的风险。

在一些实施方式中，检测CTRP6 mRNA或蛋白的表达水平的方法包括PCR法或ELISA法。

在一些实施方式中，所述PCR为qRT-PCR。

本发明还提供了使用所述的生物标志物进行乳腺癌早期诊断的方法，包括如下步骤：采集受试者血清样本，检测所述血清样本中的CTRP6 mRNA或蛋白的表达水平；通过比较受试者的CTRP6 mRNA或蛋白表达水平（mRNA≤0.62；蛋白≤21.0 ng/ml），确定受试者是否存在乳腺癌的风险；若循环CTRP6的表达水平低，则患乳腺癌的风险高，反之，则患乳腺癌的风险低，可用于临床乳腺癌的辅助诊断，具有良好的临床应用前景。

与传统的乳腺癌筛查技术相比，本发明的优点和积极效果是：

高灵敏度和特异性：CTRP6作为早期诊断标志物，可以准确地检测乳腺癌的发生和发展，提高了筛查的准确性。

早期癌症检测：通过检测CTRP6的表达水平，可以实现对早期乳腺癌的敏感检测，提高了早期诊断的机会。

个性化诊断：CTRP6的检测可以帮助医生更好地了解患者的病情，为个性化治疗提供指导。

本发明通过研究CTRP6在乳腺癌细胞中的生物学功能和临床表达特征，为乳腺癌早期诊断提供了新的标志物和方法，有望为乳腺癌个性化治疗提供指导。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为不同浓度CTRP6对MCF7细胞活力的影响。

图2为不同浓度CTRP6处理mcf7细胞对IL-6、TNF-α、VEGF表达水平的影响。

图3为乳腺癌患者和对照组炎症因子和VEGF的表达情况。

图4为CTRP6 mRNA和蛋白在乳腺癌患者和对照组中的表达情况。

图5为乳腺癌预测的ROC曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明通过实验验证、临床样本分析、数据统计和模型构建方法，研究了循环CTRP6的水平，并评估了其作为乳腺癌潜在诊断生物标志物的作用。

实施例1 细胞水平研究CTRP6对MCF-7细胞增殖的影响。

为探讨重组人CTRP6蛋白对MCF-7细胞（购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，SCSP- 531）活力的影响，本发明采用不同浓度的CTRP6 (0、1.25、2.5、5µg /ml)与MCF-7细胞孵育24h。CTRP6蛋白产生显著的存活抑制作用。将生长抑制的百分比与未处理细胞(对照细胞)进行比较。24h后检测细胞活力，结果如图1所示，CTRP6抑制细胞增殖呈浓度依赖性(P<0.0001)。1.25µg /ml浓度的CTRP6降低至68.20%（P<0.001），CTRP6浓度为2.5µg/ml时，细胞活力降低至46.87%，P值< 0.0001;浓度为5µg /ml时，细胞活力降低至24.70%，P值< 0.0001。单因素方差分析显示，随着重组CTRP6浓度的增加，平均细胞活力在24 h内存在显著差异(P＜0.0001) (n = 3/组)。***， p＜ 0.001;****，与对照组相比P＜0.0001。CTRP6: C1q肿瘤坏死因子相关蛋白。定量数据以mean±SD表示。显著性以p＜0.05定义。

实施例2 细胞水平研究CTRP6对MCF细胞系炎症因子表达的影响。

为了确定CTRP6对MCF-7细胞系VEGF及炎症因子(IL-6、TNF-α)表达水平的影响，本发明将培养的MCF-7细胞分别用不同浓度的人CTRP6重组蛋白(0、1.25、2.5、5µg/ml)处理，检测CTRP6是否能诱导或抑制IL-6、TNF-α及VEGF mRNA表达。处理24 h后，利用GAPDH对表达数据进行归一化，单因素方差分析显示，CTRP6降低IL-6、TNF-α mRNA表达，但差异无统计学意义(P> 0.05); CTRP6剂量依赖性抑制VEGF mRNA表达，差异有统计学意义(P=0.0016)。结果如图2所示，图2中的A为qRT-PCR分析IL-6基因表达。图2中的B为qRT-PCR分析TNF-α基因表达。图2中的C为qRT-PCR分析VEGF mRNA表达。CTRP6在1.25µg/ml浓度下将VEGF mRNA表达量降低至0.55, P值=0.02; CTRP6在2.5µg/ml浓度下将VEGF mRNA表达量降低至0.34,P值=0.003; CTRP6在5µg/ml浓度下将VEGF mRNA表达量降低至0.19, P值< 0.001。Ns =无统计学意义;*， p＜0.05;**， p＜0.01;与对照组相比，***，P＜0.001。IL-6:白细胞介素6;TNF-α:肿瘤坏死因子α; VEGF:血管内皮生长因子; CTRP6: C1q肿瘤坏死因子相关蛋白定量数据以mean±SD表示。显著性以p＜0.05定义。

结论：使用指定浓度的重组CTRP6处理MCF-7细胞24 h后，VEGF mRNA表达显著降低，但IL-6 mRNA和TNF-α mRNA表达无显著降低(n = 3/组)。

实施例3 体内研究乳腺癌患者与健康对照炎症因子及VEGF的表达水平。

RT-qPCR法检测炎症因子及VEGF表达：

1.利用核酸提取仪或商品化核酸提取试剂盒对采集的乳腺癌患者和正常健康对照样品进行RNA提取，并用分光光度计检测RNA浓度；

2.去除基因组DNA反应体系配制及反应程序：

42℃ 2 min

4℃ ∞

3.反转录反应体系配制及反应程序：

37℃ 15 min

85℃ 5 sec

4℃ ∞

RT-qPCR反应体系及反应程序：

RT-qPCR扩增引物：

IL-6 Forward GATGAGTACAAAAGTCCTGATCCA

Reverse CTGCAGCCACTGGTTCTGT

TNF-a Forward TGTAGCCCATGTTGTAGCAAACC

Reverse GAGGACCTGGGAGTAGATGAGGTA

VEGF Forward TGCAGATTATGCGGATCAAACC

Reverse TGCATTCACATTTGTTGTGCTGTAG

GAPDH Forward TTGAGGTCAATGAAGGGGTC

Reverse GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA

反应程序：

5.利用GAPDH对表达数据进行归一化处理。

结果如图3所示，图3中的A为 qRT-PCR分析IL-6基因表达。图3中的B为 TNF-α基因表达qRT- PCR分析。图3中的C为qRT-PCR分析VEGF mRNA表达。乳腺癌患者的IL-6 mRNA和TNF-αmRNA水平明显高于对照组(2.76±1.13 vs 1.02±0.19;P <0.001)，(2.45±0.84 vs1.04±0.29;P <0.001) 。此外，乳腺癌患者的VEGF mRNA水平显著高于对照组(2.65±0.99vs 1.04±0.28;P <0.001)。显著性以*定义，P＜0.05。采用Student t检验进行统计学分析(图3)。

实施例4 RT-PCR法及ELISA法检测乳腺癌患者和健康对照的CTRP6 mRNA和蛋白水平。

为了检测乳腺癌患者和正常健康志愿者的CTRP6水平，本发明采用RT-qPCR法检测mRNA表达，ELISA法检测蛋白质含量。

RT-qPCR法检测CTRP6 mRNA表达实验步骤：

2.去除基因组DNA反应体系配制及反应程序：

42℃ 2 min

4℃ ∞

3.反转录反应体系配制及反应程序：

37℃ 15 min

85℃ 5 sec

4℃ ∞

RT-qPCR反应体系及反应程序：

RT-qPCR扩增引物：

CTRP6 Forward CCTGCGTGGCATCTACTTCT

Reverse CTGCGCGTACAGGATGACAG

GAPDH Forward TTGAGGTCAATGAAGGGGTC

Reverse GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA

反应程序：

5.根据Ct值及内参基因GAPDH的参数分析CTRP6 mRNA的相对表达量。

CTRP6蛋白ELISA检测操作步骤:

1）.收集乳腺癌患者和正常健康对照的血液样本，1000g离心10分钟进行血清分离。

2）.开始实验之前，将所有试剂恢复至室温并充分混匀。

3）.根据待测样品及标准品的数量决定所需的ELISA板条数（含3个复孔），剩余板条用自封袋密封后放回4℃保存；

4）.分别将不同浓度梯度的标准品及待测样品50ul加至反应孔内，立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时；

5）.温育完成后弃掉孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干，重复此操作3-5次；

6）.每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟；

7）.重复步骤5，洗涤完成后每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃避免温育15分钟；

8）.取出酶标板，迅速加入50ul终止液，立即在450nm波长处测定各孔的OD值，并进行数据分析。

结果如图4所示，图4中的A为 qRT-PCR分析基因表达。利用GAPDH对表达数据进行归一化。图4中的B为ELISA法检测 CTRP6蛋白表达。乳腺癌患者的CTRP6 mRNA水平明显低于对照组(0.54±0.35 vs 1.04±0.29;P < 0.001)。乳腺癌患者的CTRP6蛋白水平也始终低于对照组(20.46±11.67 vs 34.43±15.07;P < 0.001)。结果以ng/ml表示。显著性以*定义，p＜0.05。采用Student t检验进行统计学分析。

实施例5 循环CTRP6与人体测量及生化指标的相关性分析。

本发明检测了乳腺癌患者循环CTRP6与年龄、BMI（身体质量指数）、IL-6、TNF-α、VEGF水平的相关性实验步骤如下：

1.对入组的乳腺癌患者的年龄进行统计；

2.BMI测定，清晨空腹状态下对患者进行身高（m）和体质量（kg）的测量，BMI计算公式为：BMI=体质量（kg）/身高²（m²）。

3.根据实施例3及实施例4测定的乳腺癌患者的循环CTRP6蛋白及mRNA水平以及IL-6、TNF-α、VEGF mRNA水平，通过SPSS统计学软件对上述数据进行Pearson相关系数分析。

结果如表1所示，CTRP6 mRNA与IL-6 mRNA水平(r= -0.321, P= 0.044)、TNF-αmRNA水平(r= -0.335, P= 0.034)、VEGF mRNA水平(r= -0.396, P= 0.011)呈显著负相关，其他相关性均无统计学意义(P >0.05)。

表1.循环CTRP6与人体测量及生化指标的相关性分析

注：以上为乳腺癌患者中的数据

实施例6 CTRP6 mRNA和蛋白均可作为乳腺癌的诊断性生物标志物。

ROC曲线分析结果如图5所示，CTRP6蛋白“ELISA法”(点)，CTRP6 mRNA相对表达“qRT-PCR法”(方)。CTRP6蛋白(ng/ml)曲线下面积= 0.766 (0.66-0.87)，P值＜0.001;CTRP6 mRNA曲线下面积= 0.862 (0.78-0.94)，P值＜0.001，显著性以p＜0.05定义。CTRP6蛋白或mRNA预测乳腺癌的最佳截断、敏感性和特异性(n=80)。截断值≤21.0 ng/ml时，CTRP6蛋白的ROC曲线下面积(AUC)为0.766 (95% CI: 0.663 -0.869)，敏感性为52.5%，特异性为80%，P值<0.001;截断值≤0.62时，CTRP6 mRNA的AUC为0.862 (95% CI: 0.780 -0.944)，敏感性为67.5%，特异性为92.5%，P值<0.001。CTRP6 mRNA和蛋白的ROC曲线具有良好的诊断价值，因此，CTRP6可以作为乳腺癌的良好无创伤诊断生物标志物。

虽然已经通过示例对本发明的一些特定实施例进行了详细说明，但是本领域的技术人员应该理解，以上示例仅是为了进行说明，而不是为了限制本发明的范围。本领域的技术人员还应理解，可以对实施例进行多种修改而不脱离本发明的范围和精神。本发明的范围由所附权利要求来限定。

Claims

1. 一种用于乳腺癌早期诊断的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为CTRP6mRNA或CTRP6蛋白质。

2.一种用于检测权利要求1中所述生物标志物的试剂，其特征在于，所述试剂包括CTRP6 mRNA的检测引物或抗CTRP6抗体。

3.如权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括PCR反应试剂或ELISA检测试剂。

4.一种用于乳腺癌早期诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2或3任一项所述的试剂。

5.权利要求2或3任一项所述的试剂在制备用于乳腺癌早期诊断的试剂盒中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂盒通过检测循环CTRP6的表达水平来实现对乳腺癌的早期诊断，包括从受试者血清样本中检测CTRP6 mRNA或蛋白的表达水平；通过比较受试者的CTRP6 mRNA或蛋白表达水平，确定是否存在乳腺癌的风险。

7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于，检测CTRP6 mRNA或蛋白的表达水平的方法包括PCR法或ELISA法。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述PCR为qRT-PCR。

9.使用如权利要求1所述的生物标志物进行乳腺癌早期诊断的方法，其特征在于，包括如下步骤：采集受试者血清样本，检测所述血清样本中的CTRP6 mRNA或蛋白的表达水平；通过比较受试者的CTRP6 mRNA或蛋白表达水平，确定受试者是否存在乳腺癌的风险。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，确定受试者是否存在乳腺癌的风险的标准：若循环CTRP6的表达水平低，则患乳腺癌的风险高，反之，则患乳腺癌的风险低。