CN117904188A

CN117904188A - 一种用于植物瞬时表达的载体及其在老芒麦瞬时表达中的应用

Info

Publication number: CN117904188A
Application number: CN202410072415.3A
Authority: CN
Inventors: 窦全文; 郭佳磊; 王海庆; 刘博�; 杨莹; 沈文杰; 李晓慧; 陈洁
Original assignee: Northwest Institute of Plateau Biology of CAS
Current assignee: Northwest Institute of Plateau Biology of CAS
Priority date: 2024-01-18
Filing date: 2024-01-18
Publication date: 2024-04-19

Abstract

本发明属于植物转基因及组织培养技术领域，具体涉及一种用于植物瞬时表达的载体及其在老芒麦瞬时表达中的应用。本发明所述用于植物瞬时表达的载体中含有GRF4‑GIF1基因，此基因可以有效提高老芒麦瞬时表达时的效率。且本发明以幼胚或腋芽为外植体，取材简单易操作，整个瞬时表达过程更加高效，为老芒麦建立稳定的幼胚遗传转化体系以及老芒麦优异基因挖掘具有重要的应用价值，对于利用基因工程途径改良老芒麦品种具有重要意义。

Description

一种用于植物瞬时表达的载体及其在老芒麦瞬时表达中的应用

技术领域

本发明属于植物转基因及组织培养技术领域，具体涉及一种用于植物瞬时表达的载体及其在老芒麦瞬时表达中的应用。

背景技术

老芒麦(Elymussibiricus)又名垂穗大麦草、西伯利亚披碱草，是禾本科披碱草属多年生草本植物。老芒麦在我国的东北、华北、西北和青藏高原等地区广泛分布，是草甸草原和草甸群落中的优势种和建群种。因老芒麦分蘖力强，抗寒抗旱性好，并且产草量高，适口性好而被作为优良牧草广泛栽培。

野生老芒麦主要分布在寒冷、干旱和高海拔地区，表现出抗寒、抗旱、抗紫外线、耐盐等优良特性。目前老芒麦的研究多在生物学特性、生态分布、遗传多样性、品种选育、栽培与利用等方面，而老芒麦优异基因挖掘研究鲜有报道。开展老芒麦自然群体的适应性进化分析，解析其抗逆遗传基础，挖掘特色功能基因，对老芒麦及其近缘种的遗传改良都有重要意义。建立老芒麦遗传转化方法对于特色基因的挖掘具有至关重要的作用。然而，现有的老芒麦遗传转化方法多存在外植体取材困难且转化周期长的弊端，如中国专利CN116376971A中公开的一种根癌农杆菌介导的老芒麦遗传转化方法，因而，开发一种快速、高效的瞬时转化体系对于解析老芒麦优异基因资源具有重要应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于植物瞬时表达的载体及其在老芒麦瞬时表达中的应用，所述用于植物瞬时表达的载体含有GRF4-GIF1基因可以提高老芒麦瞬时表达的效率，且外植体为幼胚和腋芽，取材简单易操作，整个瞬时表达过程更加高效。

本发明提供了一种用于植物瞬时表达的载体，所述用于植物瞬时表达的载体包括初始质粒载体和GRF4-GIF1基因，所述GRF4-GIF1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述初始质粒载体包括pGGG Wheat GUS marker，所述pGGG Wheat GUSmarker的Addgene质粒编号为165418。

优选的，所述的用于植物瞬时表达的载体的制备方法，包括如下步骤：

以Nhe I快切酶对pGGG Wheat GUS marker进行酶切，得到线性化质粒载体；

以JD633质粒为模板进行PCR扩增，得到含有GRF4-GIF1基因的扩增产物；

将所述含有GRF4-GIF1基因的扩增产物通过infusion反应连接至所述线性化质粒载体上，得到所述用于植物瞬时表达的载体；

进行所述PCR扩增的引物的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示；所述JD633质粒的Addgene质粒编号为160393。

本发明还提供了上述技术方案所述用于植物瞬时表达的载体在老芒麦的瞬时表达中的应用；用于所述瞬时表达的外植体包括幼胚或腋芽。

优选的，进行所述老芒麦的瞬时表达时，外源基因连接至所述用于植物瞬时表达的载体上。

本发明还提供了一种老芒麦的瞬时表达方法，包括如下步骤：

将消毒后的幼胚与侵染液混合，在1000rpm条件下离心1min，将离心得到的幼胚在共培养基上进行第一暗培养，得到瞬时表达后的幼胚；

或，将消毒后的腋芽置于侵染液后，对含有腋芽的侵染液抽真空1h，期间每15min打破真空一次，得到抽真空后的腋芽；

将所述抽真空后的腋芽在共培养基上进行第二暗培养，得到瞬时表达后的腋芽；

所述共培养基以1/10比例的N6培养基盐和维生素为基础培养基，还包括10g/L的葡萄糖，0.5mg/L的二吗啉乙磺酸、100μM乙酰丁香酮和8g/L的琼脂，pH值为5.8；

所述侵染液包括基础侵染液和含有上述技术方案所述用于植物瞬时表达的载体的工程菌；

所述工程菌在所述侵染液中的OD600值为0.4～0.6；

所述基础侵染液以1/10比例的N6培养基盐和维生素为基础培养液，还包括10g/L的葡萄糖，0.5mg/L的二吗啉乙磺酸和100μM乙酰丁香酮，pH值为5.8。

优选的，所述工程菌的初始菌株为农杆菌。

优选的，所述第一暗培养的温度为21～23℃，时间为2～4天；所述第二暗培养的温度为21～23℃，时间为3～6天。

优选的，所述抽真空的压力为-0.04～-0.08MPa。

优选的，所述腋芽的培养方法包括：将含有初始腋芽的老芒麦茎秆在培养基上进行培养，使老芒麦茎秆上的腋芽与培养基接触，得到所述腋芽；

所述培养基以N6培养基为基础培养基，还包括1150mg/L的脯氨酸、300mg/L的酪蛋白、60g/L的蔗糖、0.25mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、0.1mg/L的6-苄氨基嘌呤、25mg/L的丁酰肼和4.5g/L的植物凝胶；

所述培养包括光培养和暗培养，其中光培养16h，暗培养8h为一个光周期；

所述光培养的温度为21～23℃，光照强度为1000～3000lux，暗培养的温度为21～23℃；

所述培养的时间为5～6周。

有益效果：

本发明提供了一种用于植物瞬时表达的载体，所述用于植物瞬时表达的载体包括初始质粒载体和GRF4-GIF1基因，所述GRF4-GIF1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述用于植物瞬时表达的载体中含有GRF4-GIF1基因，此基因可以有效提高老芒麦瞬时表达时的效率。

在此基础上，本发明还提供了所述用于植物瞬时表达的载体在老芒麦的瞬时表达中的应用；用于所述瞬时表达的外植体包括幼胚或腋芽。本发明以幼胚或腋芽为外植体，取材简单易操作，整个瞬时表达过程更加高效；且因为幼胚具有最高的组织培养再生能力，幼胚瞬时表达结合组织培养的方法下一步有望建立稳定的幼胚遗传转化体系；另外腋芽作为具有分化组织的外植体，下一步有望通过分生组织细胞分化成苗建立稳定的遗传转化体系，即先腋芽瞬时表达再利用腋芽组织培养方法从而获得转基因植株；为老芒麦建立稳定的幼胚遗传转化体系对老芒麦优异基因挖掘具有重要的应用价值，对于利用基因工程途径改良老芒麦品种具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明中插入GRF4-GIF1基因的pGGG Wheat GUS markerGRF4-GIF1载体T-DNA区的元件图谱；

图2为实施例1中GUS染色级数划分展示图；

图3为实施例1中幼胚转化效率的分子检测结果图；

图4为实施例3中腋芽转化效率的分子检测结果图；

图5为实施例3中腋芽转化及培养结果图，其中A为节处的腋芽，B为腋芽转化后GUS染色，C为培养1周的腋芽，D为培养2周的腋芽，E为培养5周的腋芽开始生根，F为腋芽发育成苗。

具体实施方式

本发明提供了一种用于植物瞬时表达的载体，所述用于植物瞬时表达的载体包括初始质粒载体和GRF4-GIF1基因，所述GRF4-GIF1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为5'-GTGCAGCGTGACCCGGTCGTGCCCCTCTCTA GAGATAATGAGCATTGCATGTCTAAGTTATAAAAAATTACCACATATTTTTTTTGTCACACTTGTTTGAAGTGCAGTTTATCTATCTTTATACATATATTTAAACTTTACTCTACGAATAATATAATCTATAGTACTACAATAATATCAGTGTTTTAGAGAATCATATAAATGAACAGTTAGACATGGTCTAAAGGACAATTGAGTATTTTGACAACAGGACTCTACAGTTTTATCTTTTTAGTGTGCATGTGTTCTCCTTTTTTTTTGCAAATAGCTTCACCTATATAATACTTCATCCATTTTATTAGTACATCCATTTAGGGTTTAGGGTTAATGGTTTTTATAGACTAATTTTTTTAGTACATCTATTTTATTCTATTTTAGCCTCTAAATTAAGAAAACTAAAACTCTATTTTAGTTTTTTTATTTAATAATTTAGATATAAAATAGAATAAAATAAAGTGACTAAAAATTAAACAAATACCCTTTAAGAAATTAAAAAAACTAAGGAAACATTTTTCTTGTTTCGAGTAGATAATGCCAGCCTGTTAAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACACCAACCAGCGAACCAGCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAAGCAGACGGCACGGCATCTCTGTCGCTGCCTCTGGACCCCTCTCGAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTTGCTCCGCTGTCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCGGAGCGGCAGACGTGAGCCGGCACGGCAGGCGGCCTCCTCCTCCTCTCACGGCACCGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCGCTTTCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGACACCCCCTCCACACCCTCTTTCCCCAACCTCGTGTTGTTCGGAGCGCACACACACACAACCAGATCTCCCCCAAATCCACCCGTCGGCACCTCCGCTTCAAGGTACGCCGCTCGTCCTCCCCCCCCCCCCCTCTCTACCTTCTCTAGATCGGCGTTCCGGTCCATGGTTAGGGCCCGGTAGTTCTACTTCTGTTCATGTTTGTGTTAGATCCGTGTTTGTGTTAGATCCGTGCTGCTAGCGTTCGTACACGGATGCGACCTGTACGTCAGACACGTTCTGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGGGGAATCCTGGGATGGCTCTAGCCGTTCCGCAGACGGGATCGATTTCATGATTTTTTTTGTTTCGTTGCATAGGGTTTGGTTTGCCCT

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在本发明中，所述初始质粒载体优选包括pGGG Wheat GUS marker，所述pGGGWheat GUS marker的Addgene质粒编号为165418。本发明所述用于植物瞬时表达的载体优选还包括玉米泛素启动子和Nos终止子，所述玉米泛素启动子、GRF4-GIF1编码区Nos终止子优选组成基因盒，所述基因盒优选插入所述pGGG Wheat GUS marker的Nhe I酶切位点处，插入GRF4-GIF1基因的pGGG Wheat GUS markerGRF4-GIF1载体T-DNA区的元件图谱如图1所示。

本发明所述用于植物瞬时表达的载体的制备方法，包括如下步骤：

本发明优选以Nhe I快切酶对pGGG Wheat GUS marker进行酶切，得到线性化质粒载体。本发明所述酶切的体系优选以10μL计，包括10×QuickCutbuffer1μL、质粒DNA 2μL、QuickCutNheⅠ1μL和无核酸酶水6μL；所述酶切的反反应条件优选为37℃反应1h。

本发明优选以JD633质粒为模板进行PCR扩增，得到含有GRF4-GIF1基因的扩增产物。本发明所述所述JD633质粒的Addgene质粒编号为160393。本发明进行所述PCR扩增的引物的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。本发明进行所述PCR扩增的体系优选以50μL计，包括10×PCR Buffer 5μL、2mM dNTPs 5μL、25mMMgSO₄3μL、10mM的上游引物1.5μL、10mM的下游引物1.5μL、模板DNA和1U/μL的KOD-Plus-Neo1μL和无核酸酶水1μL；所述PCR扩增的程序优选为94℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸30s，共35个循环。

得到所述含有GRF4-GIF1基因的扩增产物和线性化质粒载体后，本发明优选将所述含有GRF4-GIF1基因的扩增产物通过infusion反应连接至所述线性化质粒载体上，得到所述用于植物瞬时表达的载体。本发明所述infusion反应的体系优选为5μL计，包括5×In-Fusion HD Enzyme Premix 1μL、线性化质粒载体1μL，含有GRF4-GIF1基因的扩增产物1μL和无核酸酶水3μL；所述infusion反应的条件优选为50℃孵育15min。

本发明所述用于植物瞬时表达的载体中含有GRF4-GIF1基因，此基因可以有效提高老芒麦瞬时表达时的效率

基于上述优势，本发明还提供了上述技术方案所述用于植物瞬时表达的载体在老芒麦的瞬时表达中的应用；用于所述瞬时表达的外植体包括幼胚或腋芽。在本发明中，进行所述老芒麦的瞬时表达时，优选还包括外源基因，所述外源基因优选连接至所述用于植物瞬时表达的载体上。

具体的，本发明还提供了一种老芒麦的瞬时表达方法，包括如下步骤：

所述工程菌在所述侵染液中的OD600值为0.5；

本发明优选将所述用于植物瞬时表达的载体转化至农杆菌感受态中，得到含有GRF4-GIF1基因的工程菌。本发明所述农杆菌感受态优选包括AGL1(pSOUP)农杆菌感受态细胞。本发明对所述转化的步骤没有特殊限定，采用本领域中常规步骤即可。

得到所述含有GRF4-GIF1基因的工程菌后，本发明优选将所述含有GRF4-GIF1基因的工程菌接种至MG/L培养基中进行扩大培养，得到菌液。本发明所述MG/L培养基以水为溶剂，包括如下组分：胰蛋白胨5.0g/L、甘露醇5.0g/L、酵母提取物2.5g/L、谷氨酸1.0g/L、磷酸二氢钾250mg/L、氯化钠100mg/L、七水硫酸镁100mg/L和生物素母液(浓度0.1g/L)10μL；pH值优选为7.2。本发明所述扩大培养的温度优选为28℃，时间优选为18～20h。

得到所述菌液后，本发明优选将所述菌液进行离心，收集菌体。本发明所述离心的转速优选为5000rpm，时间优选为10min。

得到所述菌体后，本发明优选以基础侵染液重悬所述菌体，得到侵染液。本发明所述菌体在所述侵染液中的OD₆₀₀值优选为0.4～0.6，更优选为0.5。本发明所述基础侵染液以1/10比例的N6培养基盐和维生素为基础培养液，还包括10g/L的葡萄糖，0.5mg/L的二吗啉乙磺酸和100μM乙酰丁香酮，pH值优选为5.8。

得到所述侵染液后，本发明将消毒后的幼胚与侵染液混合，在1000rpm条件下离心1min，将离心得到的幼胚在共培养基上进行第一暗培养，得到瞬时表达后的幼胚。本发明所述幼胚优选为从乳熟期的老芒麦种子种剥离得到的幼胚；所述剥离的方法没有特殊限定，在保证为乳熟期种子幼胚的情况下常规剥离即可；所述剥离后的幼胚在进行瞬时转化前，优选保存于基础侵染液中。

本发明所述共培养基以1/10比例的N6培养基盐和维生素为基础培养基，还包括10g/L的葡萄糖，0.5mg/L的二吗啉乙磺酸、100μM乙酰丁香酮和8g/L的琼脂，pH值为5.8。本发明所述第一暗培养的温度优选为21～23℃，时间优选为2～4天，更优选为3天。

或者，在得到所述侵染液后，本发明将消毒后的腋芽置于侵染液后，对含有腋芽的侵染液抽真空1h，期间每15min打破真空一次，得到抽真空后的腋芽。本发明对所述消毒的方法没有特殊限定，采用本领域中常规限定方式即可。本发明所述抽真空的压力优选为-0.04～-0.08MPa，更优选为-0.07MPa。本发明每15min打破一次真空是为了便于侵染液浸入腋芽中。

本发明所述腋芽的培养方法优选包括：将含有腋芽的老芒麦茎秆在培养基上进行培养，使老芒麦茎秆上的腋芽与培养基接触，得到所述腋芽。

本发明所述含有腋芽的老芒麦茎秆优选选自于为未抽穗的老芒麦植株；进行所述培养前，本发明优选还包括对所述含有腋芽的老芒麦茎秆进行消毒，所述消毒的方式没有特殊限定，采用本领域中常规步骤即可。本发明所述培养基优选以N6培养基为基础培养基，还包括1150mg/L的脯氨酸、300mg/L的酪蛋白、60g/L的蔗糖、0.25mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、0.1mg/L的6-苄氨基嘌呤、25mg/L的丁酰肼和4.5g/L的植物凝胶。本发明所述培养优选包括光培养和暗培养，其中光培养16h，暗培养8h优选为一个光周期；所述光培养的温度优选为21～23℃，光照强度优选为1000～3000lux，更优选为2000lux，暗培养的温度优选为21～23℃；所述培养的时间优选为5～6周，更优选为6周。

得到所述抽真空后的腋芽后，将所述抽真空后的腋芽在共培养基上进行第二暗培养，得到瞬时表达后的腋芽。本发明所述第二暗培养的温度优选为21～23℃，时间优选为3～6天，更优选为5天。

得到所述瞬时表达的幼胚和瞬时表达的腋芽后，本发明优选还包括对所述瞬时表达的幼胚和瞬时表达的腋芽进行瞬时表达效率的鉴定；所述鉴定的方法优选包括GUS染色检测和/或分子检测；所述GUS染色检测优选包括将所述瞬时表达的幼胚或瞬时表达的腋芽浸没于GUS染色液中，在大气压为-0.04MPa条件下抽真空5min，后在37℃孵育24h，在体式镜下观察幼胚盾片部位或腋芽部位是否有蓝色斑点出现，并通过加权级数公式计算瞬时表达效率；所述加权级数公式优选为加权级数＝(a×0+b×1+c×2+d×3)/40，其中0、1、2和3分别表示GUS染色级数，染色面积为0的记为0，染色面积为1％～25％的记为1，染色面积为26％～50％记为2，染色面积为51％～100％的记为3；所述a、b、c和d分别表示染色级数为0、1、2和3的瞬时表达的幼胚或瞬时表达的腋芽数量。

本发明所述分子检测优选以所述瞬时表达的幼胚或瞬时表达的腋芽的DNA为模板，对潮霉素基因片段进行PCR扩增，观察扩增产物中是否有潮霉素基因片段，若存在所述潮霉素基因片段则表示瞬时表达成功，否则则不成功；所述潮霉素基因片段的长度优选为800bp。本发明用于所述PCR扩增的引物的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5所示。本发明对所述PCR扩增的体系和程序没有特殊限定，采用本领域中常规扩增体系和程序即可。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、转化载体的构建：

pGGG Wheat GUS marker是英国约翰·英纳斯中心作物转化和基因组编辑小组和Wendy Harwood教授赠予(Addgene质粒编号165418)，JD633是Jorge Dubcovsky教授赠予(Addgene质粒编号160393)。

使用Nhe I快切酶对pGGG Wheat GUS marker载体进行酶切(表1)，37℃反应1h。使用上游引物：5′-CCTCGAGTATGCTAGCTAATCCCCGATCTAG TAAC-3′(SEQ ID NO.2)和下游引物：5′-ACCTTGCGGAGCTAGTGCAGCGT GACCCGGTCGTG-3′(SEQ ID NO.3)以JD633为模板扩增了包括玉米泛素启动子、GRF4-GIF1编码区和Nos终止子的基因盒(表2)，反应程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸30s，共35个循环。通过infusion反应将基因盒连接到Nhe I酶切位点上(表3)，50℃孵育15mi n后转化大肠杆菌提取质粒。

表1质粒酶切体系

表2PCR反应体系

表3in-fusion反应体系

2、侵染液的制备

(1)将构建好的载体冻融法转化AGL1(pSOUP)农杆菌感受态细胞(农杆菌菌株购自唯地生物技术有限公司)，农杆菌在含有利福平20μg/mL和卡那抗生素50μg/mL的LB固体培养基上培养2天长出单克隆。

(2)挑取单菌落于含有利福平20μg/mL和卡那抗生素50μg/mL的LB液体培养基，28℃以200rpm的速度培养48h。

(3)此后向细菌培养物中加入同等体积无菌30％甘油水溶液(v/v)，并颠倒数次混合。每管分装800μL，并在室温下保持2h，期间每30min倒置混合一次。农杆菌储存在-80℃以备使用。

(4)取一管农杆菌加入到20mL不含任何抗生素的液体MG/L培养基中，28℃以200rpm的速度过夜培养(约18～20h)。

MG/L培养基成分：胰蛋白胨5.0g/L、甘露醇5.0g/L、酵母提取物2.5g/L、谷氨酸1.0g/L、磷酸二氢钾250mg/L、氯化钠100mg/L、七水硫酸镁100mg/L、和生物素母液(浓度0.1g/L)10μL。pH值调节到7.2。

(5)将菌液转移至50mL离心管，转速5000rpm离心10min收集细菌，收集后用40mL侵染液重悬沉淀，再离心一次收集细胞，最后以OD₆₀₀值为0.5的细胞密度重悬沉淀。

1000倍乙酰丁香酮母液(100mM)：将392.4mg乙酰丁香酮溶于10mL二甲基亚砜中，再用10mL蒸馏水稀释。使用0.22μm孔径的醋酸纤维素过滤器进行过滤除菌。

侵染液：1/10比例的N6培养基盐和维生素(1/10比例的N6培养基盐和维生素购买于酷来搏科技有限公司，货号为PM1311)、葡萄糖10g/L，二吗啉乙磺酸0.5mg/L，乙酰丁香酮100μM。调节pH为5.8。避光4℃保存。

(6)28℃下80rpm的转速摇4h活化农杆菌。

3、幼胚的瞬时表达

(1)幼胚的收集

实验材料在2023年7月初采自青海省西宁市西北高原生物研究所试验田，7月底至8月底采自青海省湟中县。实验材料在2023年8月采自青海省湟中县，取样的植株要没有疾病和害虫，轻轻压一下穗子观察种子比较饱满，检测种子发育时期为乳熟期，用尖嘴镊子刺破胚乳有白色水分流出。植株从茎秆基部剪下带回实验室。

(2)幼胚的保存：

从试验田采回的材料茎秆基部在水中浸泡并置于4℃冷柜黑暗保存。一组剪去茎秆保留穗子，用锡箔纸将穗子包好，再放在密封的自封袋中置于-5℃冷冻保存(保存方法参考中国专利CN103155913B)。保存12或24h之后用于下一步的转化。

(3)幼胚的转化：

从穗子剥离下幼嫩的种子，不需要去除种子的外稃内稃。先75％的酒精浸泡1min，再用无菌水冲洗3次。再用6％的次氯酸钠消毒浸泡5min，最后用无菌水冲洗6次。消毒结束后在体式镜下剥胚，左手持镊子撕去外稃。因为同一个穗子不同小花的幼胚发育阶段并不完全一致，需要再刺破胚乳看是否有白色水分流出，以确保发育时期是否为乳熟期，若幼胚过小或种子的胚乳中没有水分则舍弃。右手持镊子在幼胚的胚根胚芽处轻轻划一下，再在幼胚上部胚乳处轻轻挤压可挤出幼胚，用尖嘴镊子轻轻夹取幼胚到没有农杆菌的侵染液中。

幼胚剥完后，吸去侵染液，加入1mL活化好的侵染液。幼胚加入活化好的侵染液后分别以1000rpm，5000rpm和20000rpm的速度离心1min，一组设置不离心处理。然后立马将菌液倒在平板上，再用200μL枪将农杆菌吸干净，再用将幼胚放置于无菌滤纸上2min。然后将幼胚盾片朝上放在共培养基板子上。在21～23℃下黑暗培养2天或3天。共培养培养基选择铺一层滤纸和不铺滤纸。

共培养基：1/10比例的N6培养基盐和维生素、葡萄糖10g/L，二吗啉乙磺酸0.5mg/L，乙酰丁香酮100μM(在培养基不热时添加)和8g/L琼脂，调节pH值为5.8。

4、瞬时表达效率的鉴定

(1)GUS染色检测

GUS染色液购自北京索莱宝科学技术有限公司，将植物组织侵没在GUS染色液中，大气压为-0.04MPa抽真空5min，然后37℃孵育24h，在体式镜下观察幼胚盾片部位是否有蓝色斑点出现。

按照GUS染色效果对瞬时表达效率进行划分，可分为四个等级，如表4和图2所示，结果如表5所示。

表4GUS染色级数划分

表5幼胚GUS染色结果及加权分级结果

由表5可以得出：当发育时期为乳熟期、4℃保存24h、1000rpm离心1min、共培养培养基未铺滤纸、共培养三天时，基因瞬时表达的效率最高。总共40个幼胚中，11个没有GUS染色，18个染色面积达到1％～25％，6个染色面积达到26％～50％，5个染色面积达到51％～100％，加权级数＝(11×0+18×1+6×2+5×3)/40＝1.13，表达效率＝(18+6+5)/40，达到72.5％。

(2)分子检测

选择发育时期为乳熟期、4℃保存24h、1000rpm离心1min、共培养培养基未铺滤纸、共培养三天并处理提取材料RNA，使用PCR扩增潮霉素基因片段(上游引物：5′-TGTTTATCGGCACTTTGCATC-3′(SEQ ID NO.4)，下游引物：5′-AGCTGCATCATCGAAATTGCCGTC-3′(SEQ ID NO.5))，反应体系如表6所示，反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共40个循环。电泳检测PCR扩增结果，产物大小约为800bp。电泳结果显示10个样品中8个检测到潮霉素片段的表达，如图3所示，可见2、3、4、5、6、7、8、10泳道有目的条带。

表6分子检测PCR体系

实施例2

1、培养基的配置

腋芽培养基成分：N6培养基元素，脯氨酸1150mg/L、酪蛋白300mg/L、蔗糖60g/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.25mg/L、6-苄氨基嘌呤0.1mg/L、丁酰肼25mg/L和植物凝胶4.5g/L。按照上述比例配置培养基，并准备无菌水和灭菌的250mL量筒。

2、腋芽的培养

实验材料在2023年5月～9月采自青海省湟中县，取样的植株要没有疾病和害虫。选择未抽穗的植株，剪去叶片，用脱脂棉球蘸取75％酒精擦拭茎秆45s。将茎秆浸泡在含有6％次氯酸钠的250mL量筒中，浸泡5min，再用无菌水冲洗5次。剪去节上下部分，注意节的方向，腋芽在节上方，避免剪伤腋芽。再剥去节外面的表皮使腋芽暴露出来。将腋芽浅戳在培养基上，设定组织培养箱循环周期为：光照条件下，温度为21～23℃，光照培养时间为16h，光照强度为2000lux；黑暗条件下温度为21～23℃，黑暗培养的时间为8h。

培养一周后，可见腋芽的伸长，培养两周腋芽持续生长，培养5～6周可见根从腋芽基部发生，培养的41颗腋芽最后有27颗发育成苗，成苗率为65.9％。

实施例3

1、转化载体的构建

同实施例1。

2、侵染液的制备

同实施例1。

3、腋芽的瞬时表达

实验材料在2023年7月采自青海省湟中县，取样的植株要没有疾病和害虫。选择未抽穗的植株，剪去叶片，用脱脂棉球蘸取75％酒精擦拭茎秆45s。将茎秆浸泡在含有6％次氯酸钠的250mL量筒中，浸泡5min，再用无菌水冲洗5次。剪去节上下部分，注意节的方向，腋芽在节上方，避免剪伤腋芽。再剥去节外面的表皮使腋芽暴露出来。将腋芽置于活化好的侵染液中，抽真空1h，大气压为-0.07MPa，期间每隔15min打破真空使菌液渗透进入腋芽。然后将腋芽放置于无菌餐巾纸上2min吸干菌液，将腋芽浅戳在共培养板子上，21～23℃黑暗培养5天。

4、瞬时表达效率的鉴定

同实施例1。总共133个腋芽中，109个没有GUS染色，16个染色面积达到1％～25％，5个染色面积达到26％～50％，3个染色面积达到51％～100％(图5中B，加权级数＝(109×0+16×1+5×2+3×3)/40＝0.26，表达效率＝(16+5+3)/133，达到18％(表7)。分子检测10个腋芽中有两个有潮霉素基因的表达，如图4所示，2和10泳道有目的条带。

表7腋芽GUS染色结果及加权分级结果

对瞬时转化后的腋芽继续进行培养，观察其不同阶段的表型状态，如图5中C～F所示。可见，采用本实施例所述瞬时表达方法得到的瞬时表达后的腋芽能够生根且发育成苗。

尽管表7中以腋芽为外植体的表达效率并没有达到很高，但是禾本科牧草的农杆菌转化研究一直是本领域中公知的难题，而18％的表达效率可以充分说明本发明瞬时转化方法的可行性，同时腋芽取材的便利性也是本发明中的一个发明点。

由以上实施例可以得出：所述用于植物瞬时表达的载体含有GRF4-GIF1基因可以提高老芒麦瞬时表达的效率，且外植体为幼胚和腋芽，取材简单易操作，整个瞬时表达过程更加高效。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims

1.一种用于植物瞬时表达的载体，其特征在于，所述用于植物瞬时表达的载体包括初始质粒载体和GRF4-GIF1基因，所述GRF4-GIF1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的用于植物瞬时表达的载体，其特征在于，所述初始质粒载体包括pGGG Wheat GUS marker，所述pGGG Wheat GUS marker的Addgene质粒编号为165418。

3.根据权利要求2所述的用于植物瞬时表达的载体，其特征在于，所述植物瞬时表达的载体的制备方法包括如下步骤：

进行所述PCR扩增的引物的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；所述JD633质粒的Addgene质粒编号为160393。

4.权利要求1～3任一项所述用于植物瞬时表达的载体在老芒麦的瞬时表达中的应用；用于所述瞬时表达的外植体包括幼胚或腋芽。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，进行所述老芒麦的瞬时表达时，外源基因连接至所述用于植物瞬时表达的载体上。

6.一种老芒麦的瞬时表达方法，其特征在于，包括如下步骤：

所述侵染液包括基础侵染液和含有权利要求1～3任一项所述用于植物瞬时表达的载体的工程菌；

所述工程菌在所述侵染液中的OD₆₀₀值为0.4～0.6；

7.根据权利要求6所述的瞬时表达方法，其特征在于，所述工程菌的初始菌株为农杆菌。

8.根据权利要求6所述的瞬时表达方法，其特征在于，所述第一暗培养的温度为21～23℃，时间为2～4天；所述第二暗培养的温度为21～23℃，时间为3～6天。

9.根据权利要求6所述的瞬时表达方法，其特征在于，所述抽真空的压力为-0.04～-0.08MPa。

10.根据权利要求6所述的瞬时表达方法，其特征在于，所述腋芽的培养方法包括：将含有初始腋芽的老芒麦茎秆在培养基上进行培养，使老芒麦茎秆上的腋芽与培养基接触，得到所述腋芽；

所述培养的时间为5～6周。