CN117904092A - 一种固定化厌氧氨氧化菌及其固定化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种固定化厌氧氨氧化菌及其固定化方法，包括（1）制备聚乙烯醇‑海藻酸钠‑气凝胶的混合液Ⅰ；（2）制备亚硝酸钠、氯化钙和聚乙烯亚胺的混合液Ⅱ；（3）将厌氧氨氧化菌与混合液Ⅰ混匀得到菌‑胶混合液，然后逐滴加入到等体积的混合液Ⅱ中，进行固定化交联，经清洗后得到固定化厌氧氨氧化菌小球。本发明提供的固定化方法能够获得包埋厌氧氨氧化菌的固定化小球，在好氧脱氮体系中能够维持厌氧氨氧化菌的高密度生长，保证底物的有效传质，实现污水的高效脱氮处理。
Description
技术领域
本发明属于水污染治理技术领域，具体涉及一种固定化厌氧氨氧化菌及其固定化方法。
背景技术
短程硝化厌氧氨氧化工艺因具有成本低等诸多优点而成为污水处理领域的研究热点。负责这两个过程的好氧氨氧化菌和厌氧氨氧化菌均是化能自养微生物，生长繁殖慢、细胞产量低。现有CANON、OLAND、DEMON、SNAP等都是以好氧氨氧化菌和厌氧氨氧化菌同时混合形成颗粒污泥来运行的短程硝化与厌氧氨氧化的一体式组合工艺。颗粒污泥内部包裹着厌氧氨氧化菌，外部为好氧氨氧化菌，由于颗粒污泥的直径和传质系数使内部厌氧氨氧化菌无法得到足够的基质，从而导致反应器效果不佳，而颗粒污泥的直径又难以控制。因此，如何使好氧氨氧化菌和厌氧氨氧化菌能够在同一环境下更好地协同去除废水中的总氮，对于废水生物脱氮处理来说将具有巨大的技术与工业应用价值。
自2002年在荷兰鹿特丹Dukhaven污水处理厂正式运行短程硝化-厌氧氨氧化工艺以来，工业应用中均存在亚硝酸盐积累率难以维持稳定、反应器中无法维持较高的Anammox细胞密度、好氧和厌氧协调能力差等问题而影响稳定运行。因此如何保持厌氧氨氧化菌在反应器中的高密度，防止其从反应器中流失并提高其抗性，成为短程硝化-厌氧氨氧化协调运行及推广需解决的重要问题之一。固定化技术可将筛选出的功能菌种加以固定，构成一种高效、快速、能连续处理的污水脱氮处理系统。
CN201610264152.1公开了一种共固定化厌氧氨氧化菌-短程硝化细菌的方法及其应用，包括如下步骤：(1)菌种的处理：取污泥浓度为8000ml/L厌氧氨氧化污泥用pH为7-7.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗3遍后备用，亚硝酸积累率＞90%的短程硝化污泥用去离子水清洗3遍后备用；(2)包埋剂的获取：选取木质粉状活性炭，先经冲洗去除杂质和粉尘，依次用质量百分比浓度为10%的盐酸、2%的氢氧化钠、生理盐水浸泡24小时；按照15g/L、2g/L、2g/L的浓度配制500ml聚乙烯醇-海藻酸钠-活性炭混合溶液①，在120℃中加热20min使其加速溶解；按照50g/L和2g/L的质量-体积百分浓度配制1000ml硝酸钠和氯化钙的混合固定液②。(3)厌氧氨氧化菌和短程硝化细菌的分层包埋固定：第一次包埋：将第(1)步的厌氧氨氧化菌和第(2)步的混合溶液①按照体积1:1比例均匀混合得到500ml菌-胶混合液，然后利用注射器将其逐滴加到500ml混合固定液②中，在室温下接触12h对其固定化交联，结束后用去除氧后的去离子水清洗厌氧氨氧化固定化小球3-5次；第二次包埋：将第(1)步的短程硝化污泥和第(2)步的混合溶液①按照体积1.5:1比例均匀混合得到300ml菌-胶混合液，再投入第一次包埋获得的厌氧氨氧化固定小球，混合后用直径0.4-0.6cm的玻璃吸管吸取混有菌液的固定化小球，滴入500ml混合固定液②中，在室温下接触12h对其固定化交联，结束后用去离子水清洗厌氧氨氧化菌-短程硝化细菌固定化凝胶小球3-5次；(4)包埋小球的活化：在30-35℃和pH＝7.5的条件下用配水活化培养6-8天，使固定化小球内部的微生物活性得到恢复，活化后可直接放入反应器直接使用。该专利以聚乙烯醇、海藻酸钠和活性炭作为包埋剂对厌氧氨氧化菌和短程硝化细菌进行分层包埋固定，先将等体积的厌氧氨氧化污泥和包埋剂均匀混合，固定后得到厌氧氨氧化凝胶小球，再将其投入短程硝化细菌和包埋剂的混合溶液中，固定后得到厌氧氨氧化菌-短程硝化细菌凝胶小球；经活化后直接投加到自养脱氮反应器中。虽然实现了两种菌的共固定化，使得两种菌的生物效能协调发挥，实现短程硝化反应和厌氧氨氧化反应的协调运行。但是，因为两种菌的生长周期不一样，因此共固定化在同一个范围内的生物会因为基质浓度的不同，生物量会存在差异，长期运行无法达到真正协同脱氮的效果。
CN201810107060.1公开了一种固定化好氧氨氧化菌和厌氧氨氧化菌的一体式自养脱氮反应器及其污水处理工艺，主要采用上流式反应器，利用海藻酸钠分层固定好氧氨氧化菌AOB和厌氧氨氧化菌的方法，能够在五天时间完成全程自养脱氮反应的启动，凝胶固定技术传质效果优于传统活性污泥。该技术虽然解决了两类菌群的协同脱氮问题，降低了成本，实现了快速启动。但对于污水处理来说，传质的性能决定处理效果，气液固三相的界面积决定传质效果，该专利将多层凝胶层固定在一起，与流动性的球形凝胶相比，气液固三相的相界面积明显降低，长期使用会因为传质空间不足，可能会影响长期运行效果。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种固定化厌氧氨氧化菌及其固定化方法。本发明提供的固定化方法能够获得包埋厌氧氨氧化菌的固定化小球，在好氧脱氮体系中能够维持厌氧氨氧化菌的高密度生长，保证底物的有效传质，实现污水的高效脱氮处理。
本发明提供的一种厌氧氧化菌的固定化方法，包括如下步骤：
（1）制备聚乙烯醇-海藻酸钠-气凝胶的混合液Ⅰ；
（2）制备亚硝酸钠、氯化钙和聚乙烯亚胺的混合液Ⅱ；
（3）将厌氧氨氧化菌与混合液Ⅰ混匀得到菌-胶混合液，然后逐滴加入到等体积的混合液Ⅱ中，进行固定化交联，经清洗后得到固定化厌氧氨氧化菌小球。
本发明步骤（1）中，聚乙烯醇、海藻酸钠、气凝胶按照混合液Ⅰ中质量体积浓度比为10:(1-6):(1-6)，优选10:(1-4):(1-4)混合，其中质量体积浓度以g/L计。混合后在100-150℃，优选100-120℃加热10-40min，优选20-30min制得混合液Ⅰ。
本发明步骤（1）中，所述气凝胶可以是二氧化硅气凝胶、碳气凝胶等中的至少一种，优选二氧化硅气凝胶。所述气凝胶的孔径为1-100nm，孔隙率为90%-99%，比表面积600-1000m2/g。
本发明步骤（2）中，首先按照质量体积浓度比为1:(5-20)，优选1:(5-15)配制亚硝酸钠、氯化钙混合液，其中质量体积浓度以g/L计；再加入聚乙烯亚胺，加入量为所配置混合液Ⅱ体积的1%-5%。其中聚乙烯亚胺为质量浓度20%-50%的水溶液，分子量一般在3000-4000。
本发明步骤（2）中，混合液Ⅱ中进一步还加入一定量的纳米氧化铜，加入量为5-10mg/L。纳米氧化铜的粒径为30-50nm。
本发明步骤（3）中，所述厌氧氨氧化菌的制备可以采用本领域公知的技术，如可以是将经过多级放大培养的厌氧氨氧化菌液，用pH为7.0-7.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗3-5次后经离心获得的厌氧氨氧化菌。多级放大培养中，使用的培养液中总氮浓度为100-1000mg/L，其中总氮为氨氮和亚硝氮之和，二者配比为1:1-1:1.5。或者直接取污水处理场的厌氧氨氧化菌颗粒污泥，搅拌使颗粒均匀破碎后用pH为7.0-7.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗后经离心获得的厌氧氨氧化菌。
本发明步骤（3）中，厌氧氨氧化菌与混合液Ⅰ的质量比1:1-1:3。
本发明步骤（3）中，固定化交联在室温进行，反应时间为10-15h。反应结束后，用去离子水清洗多次，优选3-5次。
本发明所述的固定化厌氧氨氧化菌是采用上述本发明方法制备的。所制备的固定化厌氧氨氧化菌小球中包埋有厌氧氨氧化菌，并含有聚乙烯亚胺，质量含量为1%-3%。进一步的，还可以包含纳米氧化铜，质量含量为0.5%-1.0%。
本发明还提供了上述固定化厌氧氨氧化菌的应用，用于短程硝化厌氧氨氧化工艺中，可以直接作为工艺启动的菌体。可以单独使用，也可以与好氧氨氧化菌配合使用。
本发明应用中，保藏的固定化厌氧氨氧化菌小球在使用前，首先在30-35℃和pH7.0-7.5的条件下活化培养6-8天。
本发明应用中，固定化厌氧氨氧化菌小球可以与好氧氨氧化菌按照质量比1:1-3:1装载到同一反应器内，总装载量占反应器体积的20%-40%。
本发明应用中，短程硝化厌氧氨氧化工艺的运行条件为：溶解氧浓度为0.1-1.0mg/L，温度为25-39℃，pH7-8.5。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）采用聚乙烯醇-海藻酸钠-气凝胶和亚硝酸钠-氯化钙-聚乙烯亚胺的组合包埋材料，可以为微生物提供无毒多孔的生存环境，有助于底物传质，在同一环境下与好氧氨氧化菌更好的协同去除废水中的总氮。
（2）在固定化过程中使用聚乙烯亚胺，一方面可以与其它固定化材料协同作用，增强固定化小球的稳定性；另一方面可以提高厌氧氨氧化菌被固定后的活性，并能够避免环境氧对菌体的影响，从而有利于厌氧氨氧化菌的繁殖生长，保持较高的细胞密度。
（3）在固定化过程中使用纳米氧化铜，与聚乙烯亚胺配合，能够避免包埋对菌体和外部环境传质的影响，保证传质效率。
（4）本发明提供的固定化方法能够获得包埋厌氧氨氧化菌的固定化小球，在好氧脱氮体系中能够维持厌氧氨氧化菌的高密度生长，保证底物的有效传质，并能够避免外部氧的不利影响，实现污水的高效脱氮处理。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方法和效果作进一步详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均可从生化试剂商店购买得到。
实施例1
（1）制备聚乙烯醇-海藻酸钠-气凝胶的混合液Ⅰ：分别称取10g聚乙烯醇、2g海藻酸钠和2g二氧化硅气凝胶（其中孔径为80-90nm，孔隙率为95%，比表面积800m2/g）置于水中并定量至1L，在110℃加热25min制得混合液Ⅰ。
（2）制备亚硝酸钠、氯化钙和聚乙烯亚胺的混合液Ⅱ：分别称取1g亚硝酸钠和10g氯化钙置于水中溶解并定量至1L，再按照所配置混合液Ⅱ体积的2%加入聚乙烯亚胺，聚乙烯亚胺为质量浓度为40%的水溶液，分子量在3300-3600。
（3）取污水处理场的厌氧氨氧化菌颗粒污泥，搅拌使颗粒均匀破碎后用pH为7-7.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗3次后离心获得的厌氧氨氧化菌。将离心后的厌氧氨氧化菌与混合液Ⅰ按质量比1:2混匀得到菌-胶混合液，然后逐滴加入到等体积的混合液Ⅱ中，室温下充分反应10h进行固定化交联，结束后用去离子水清洗3次，得到固定化厌氧氨氧化菌小球A，其中聚乙烯亚胺质量含量为2.1%。
实施例2
（1）制备聚乙烯醇-海藻酸钠-气凝胶的混合液Ⅰ：分别称取10g聚乙烯醇、4g海藻酸钠和1g二氧化硅气凝胶（其中孔径为90-100nm，孔隙率为97%，比表面积900m2/g）置于水中并定量至1L，在100℃加热30min制得混合液Ⅰ。
（2）制备亚硝酸钠、氯化钙和聚乙烯亚胺的混合液Ⅱ：分别称取1g亚硝酸钠和5g氯化钙置于水中溶解并定量至1L，再按照所配置混合液Ⅱ体积的5%加入聚乙烯亚胺，聚乙烯亚胺为质量浓度为40%的聚乙烯亚胺水溶液，分子量在3300-3600。
（3）取污水处理场的厌氧氨氧化菌颗粒污泥，搅拌使颗粒均匀破碎后用pH为7-7.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗3次后离心获得的厌氧氨氧化菌。将离心后的厌氧氨氧化菌与混合液Ⅰ按质量比1:1混匀得到菌-胶混合液，然后逐滴加入到等体积的混合液Ⅱ中，室温下充分反应15h进行固定化交联，结束后用去离子水清洗3次，得到固定化厌氧氨氧化菌小球B，其中聚乙烯亚胺质量含量为2.5%。
实施例3
（1）制备聚乙烯醇-海藻酸钠-气凝胶的混合液Ⅰ：分别称取10g聚乙烯醇、1g海藻酸钠和4g二氧化硅气凝胶（其中孔径为80-90nm，孔隙率为95%，比表面积1000m2/g）置于水中并定量至1L，在120℃加热20min制得混合液Ⅰ。
（2）制备亚硝酸钠、氯化钙和聚乙烯亚胺的混合液Ⅱ：分别称取1g亚硝酸钠和15g氯化钙置于水中溶解并定量至1L，再按照所配置混合液Ⅱ体积的1%加入聚乙烯亚胺，聚乙烯亚胺请为质量浓度为40%的聚乙烯亚胺水溶液，分子量在3300-3600。
（3）取污水处理场的厌氧氨氧化菌颗粒污泥，搅拌使颗粒均匀破碎后用pH为7-7.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗3次后离心获得的厌氧氨氧化菌。将离心后的厌氧氨氧化菌与混合液Ⅰ按质量比1:3混匀得到菌-胶混合液，然后逐滴加入到等体积的混合液Ⅱ中，室温下充分反应12h进行固定化交联，结束后用去离子水清洗3次，得到固定化厌氧氨氧化菌小球C，其中聚乙烯亚胺质量含量为1.5%。
实施例4
（1）制备聚乙烯醇-海藻酸钠-气凝胶的混合液Ⅰ：分别称取10g聚乙烯醇、2g海藻酸钠和2g二氧化硅气凝胶（其中孔径为80-90nm，孔隙率为95%，比表面积800m2/g）置于水中并定量至1L，在110℃加热25min制得混合液Ⅰ。
（2）制备亚硝酸钠、氯化钙和聚乙烯亚胺的混合液Ⅱ：分别称取1g亚硝酸钠和10g氯化钙置于水中溶解并定量至1L，再按照所配置混合液Ⅱ体积的2%加入聚乙烯亚胺，聚乙烯亚胺为质量浓度为20%的聚乙烯亚胺水溶液，分子量在3600-4000。
（3）取污水处理场的厌氧氨氧化菌颗粒污泥，搅拌使颗粒均匀破碎后用pH为7-7.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗3次后离心获得的厌氧氨氧化菌。将离心后的厌氧氨氧化菌与混合液Ⅰ按质量比1:2混匀得到菌-胶混合液，然后逐滴加入到等体积的混合液Ⅱ中，室温下充分反应10h进行固定化交联，结束后用去离子水清洗3次，得到固定化厌氧氨氧化菌小球D，其中聚乙烯亚胺质量含量为1.8%。
实施例5
（1）制备聚乙烯醇-海藻酸钠-气凝胶的混合液Ⅰ：分别称取10g聚乙烯醇、2g海藻酸钠和2g二氧化硅气凝胶（其中孔径为80-90nm，孔隙率为95%，比表面积800m2/g）置于水中并定量至1L，在110℃加热25min制得混合液Ⅰ。
（2）制备亚硝酸钠、氯化钙和聚乙烯亚胺的混合液Ⅱ：分别称取1g亚硝酸钠和10g氯化钙置于水中溶解并定量至1L，再按照所配置混合液Ⅱ体积的2%加入聚乙烯亚胺，聚乙烯亚胺为质量浓度50%的聚乙烯亚胺水溶液，分子量在3000-3300。
（3）取污水处理场的厌氧氨氧化菌颗粒污泥，搅拌使颗粒均匀破碎后用pH为7-7.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗3次后离心获得的厌氧氨氧化菌。将离心后的厌氧氨氧化菌与混合液Ⅰ按质量比1:2混匀得到菌-胶混合液，然后逐滴加入到等体积的混合液Ⅱ中，室温下充分反应10h进行固定化交联，结束后用去离子水清洗3次，得到固定化厌氧氨氧化菌小球E，其中聚乙烯亚胺质量含量为2.0%。
实施例6
所有的步骤和制备方法同实施例1，不同之处在于步骤（1）使用的是碳气凝胶。制备得到固定化厌氧氨氧化菌小球F，其中聚乙烯亚胺质量含量为1.9%。
实施例7
所有的步骤和制备方法同实施例1，不同之处在于步骤（2）的混合液Ⅱ中还加入粒径为30nm的纳米氧化铜，加入量为5mg/L。制备得到固定化厌氧氨氧化菌小球G，其中聚乙烯亚胺质量含量为2.1%，纳米氧化铜的质量含量为0.5%。
实施例8
所有的步骤和制备方法同实施例1，不同之处在于步骤（2）的混合液Ⅱ中还加入粒径为50nm的纳米氧化铜，加入量为10mg/L。制备得到固定化厌氧氨氧化菌小球H，其中聚乙烯亚胺质量含量为2.0%，纳米氧化铜的质量含量为1.0%。
对比例1
所有的步骤和制备方法同实施例1，不同之处在于步骤（2）中不加聚乙烯亚胺。制备得到固定化厌氧氨氧化菌小球M。
对比例2
所有的步骤和制备方法同实施例1，不同之处在于步骤（1）中二氧化硅气凝胶采用活性炭，制备得到固定化厌氧氨氧化菌小球N。
对比例3
所有的步骤和制备方法同实施例1，不同之处在于步骤（2）中不加亚硝酸钠，制备得到固定化厌氧氨氧化菌小球P。
对比例4
所有的步骤和制备方法同实施例7，不同之处在于步骤（2）中不加聚乙烯亚胺，制备得到固定化厌氧氨氧化菌小球Q。
测试例
分别取实施例1-8和对比例1-4制备的固定化厌氧氨氧化菌小球与好氧氨氧化菌按照总装载量占反应器体积的30%装载到有效容积为2L的有机玻璃反应器内，其中固定化小球与好氧氨氧化菌的质量比为1:1，处理废水中氨氮浓度为300mg/L左右。试验条件为pH7-8、溶解氧为0.1-1mg/L、温度为30-35℃。处理10天后，分析检测氨氮和总氮浓度，具体结果见表1。
表1 实施例和比较例的试验效果
从表1试验结果可以看出，固定化厌氧氨氧化菌小球与好氧氨氧化菌配合使用对氨氮和总氮的去除效果很好，可以在10天后达到稳定的处理效果，从连续5天出水氨氮浓度均小于8mg/L、总氮浓度小于30mg/L。
Claims (18)
1.一种固定化厌氧氨氧化菌的固定化方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）制备聚乙烯醇-海藻酸钠-气凝胶的混合液Ⅰ；
（2）制备亚硝酸钠、氯化钙和聚乙烯亚胺的混合液Ⅱ；
（3）将厌氧氨氧化菌与混合液Ⅰ混匀得到菌-胶混合液，然后逐滴加入到等体积的混合液Ⅱ中，进行固定化交联，经清洗后得到固定化厌氧氨氧化菌小球。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，聚乙烯醇、海藻酸钠、气凝胶按照混合液Ⅰ中质量体积浓度比为10:(1-6):(1-6)，优选10:(1-4):(1-4)混合，其中质量体积浓度以g/L计。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，混合后在100-150℃，优选100-120℃加热10-40min，优选20-30min制得混合液Ⅰ。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述气凝胶是二氧化硅气凝胶、碳气凝胶中的至少一种，优选二氧化硅气凝胶。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述气凝胶的孔径为1-100nm，孔隙率为90%-99%，比表面积600-1000m2/g。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，首先按照质量体积浓度比为1:(5-20)，优选1:(5-15)配制亚硝酸钠、氯化钙混合液，其中质量体积浓度以g/L计；再加入聚乙烯亚胺，加入量为所配置混合液Ⅱ体积的1%-5%。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，聚乙烯亚胺为质量浓度20%-50%的水溶液，分子量一般在3000-4000。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，混合液Ⅱ中还加入纳米氧化铜，加入量为5-10mg/L。
9.根据权利要求1或8所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，纳米氧化铜的粒径为30-50nm。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述厌氧氨氧化菌的制备是将经过多级放大培养的厌氧氨氧化菌液，用pH为7.0-7.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗3-5次后经离心获得的厌氧氨氧化菌；或者直接取污水处理场的厌氧氨氧化菌颗粒污泥，搅拌使颗粒均匀破碎后用pH为7.0-7.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗后经离心获得的厌氧氨氧化菌。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：多级放大培养中，使用的培养液中总氮浓度为100-1000mg/L，其中总氮为氨氮和亚硝氮之和，二者配比为1:1-1:1.5。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，厌氧氨氧化菌与混合液Ⅰ的质量比1:1-1:3。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，固定化交联在室温进行，反应时间为10-15h。
14.一种固定化厌氧氨氧化菌，其特征在于是采用权利要求1-13任意一项所述方法制备的。
15.权利要求14所述固定化厌氧氨氧化菌的应用，其特征在于：用于短程硝化厌氧氨氧化工艺中，直接作为工艺启动的菌体；单独使用，或者与好氧氨氧化菌配合使用。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于：固定化厌氧氨氧化菌使用前，首先在30-35℃和pH7.0-7.5条件下活化培养6-8天。
17.根据权利要求15所述的应用，其特征在于：固定化厌氧氨氧化菌小球与好氧氨氧化菌按照质量比1:1-3:1装载到同一反应器内，总装载量占反应器体积的20%-40%。
18.根据权利要求15所述的应用，其特征在于：短程硝化厌氧氨氧化工艺的运行条件为：溶解氧浓度为0.1-1.0mg/L，温度为25-39℃，pH7-8.5。
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