CN117904008A - 一种预防和缓解抑郁的戊糖片球菌jypr-9187及其菌剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种预防和缓解抑郁的戊糖片球菌JYPR‑9187及其菌剂和应用，戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）JYPR‑9187于2023年7月24日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27994，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。戊糖片球菌JYPR‑9187可以有效预防慢性不可预测的温和刺激导致的小鼠抑郁症，改善抑郁小鼠体重降低倾向，有助于降低抑郁小鼠海马组织内的神经炎症和血清中促炎细胞因子的含量。因此，戊糖片球菌JYPR‑9187在制备预防和/或治疗抑郁症的产品方面具有良好的开发前景。

Description

一种预防和缓解抑郁的戊糖片球菌JYPR-9187及其菌剂和 应用

技术领域

本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种预防和缓解抑郁的戊糖片球菌JYPR-9187及其菌剂和应用。

背景技术

抑郁症（depression）是抑郁障碍的一种典型情况，主要表现为情绪低落，兴趣减低，悲观，思维迟缓，缺乏主动性，自责自罪，饮食、睡眠差，担心自己患有各种疾病，感到全身多处不适，严重者可出现自杀念头和行为，是精神科自杀率最高的疾病。抑郁症的病因及发病机制尚不清楚，可能涉及生理、心理与社会等诸多因素。抑郁症发病率很高，据WHO（2012年）统计，全球约有3.5亿抑郁症患者，抑郁症目前已成为全球疾病中给人类造成严重负担的第二位重要疾病。

抑郁症治疗主要包括药物治疗、心理治疗和物理治疗。抗抑郁药是当前治疗抑郁障碍的主要方式，对抑郁心境及伴随的焦虑、紧张和躯体症状均有治疗效果，有效率可达60%~70%。目前三环类抗抑郁药物（Tricyclic Antidepressants，TCAs）是治疗抑郁的一线药，第二代非典型抗抑郁药为第二线药，其次可考虑单胺氧化酶抑制剂MAOIs。抗抑郁药物的副作用发生率高，一般疗程较短，导致药物治疗的复发率较高。而且，长期用药会对患者消化系统和神经系统造成损伤，部分抗抑郁药还可能导致大脑出现适应性改变，造成药物依赖。

研究发现，益生菌，特别是乳酸菌，除了具有调节肠道平衡、增强肠道免疫的功能，还能促进机体产生神经信号物质，调节内分泌细胞激素分泌，有助于维持人体神经系统的正常功能。但是目前对于抑郁症的有显著治疗效果的益生菌相关报道较少，相关产品仍待进一步开发。

发明内容

针对现有益生菌产品治疗抑郁症的效果不显著的技术问题，本发明提供一种预防和缓解抑郁的戊糖片球菌JYPR-9187及其菌剂和应用。

第一方面，本发明提供一种预防和缓解抑郁的戊糖片球菌JYPR-9187，戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）JYPR-9187于2023年7月24日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27994，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

第二方面，本发明提供一种戊糖片球菌JYPR-9187菌剂，包括上述戊糖片球菌JYPR-9187的菌体和低聚麦芽糖。

进一步的，戊糖片球菌JYPR-9187菌体数量为100~200亿/g。

进一步的，戊糖片球菌JYPR-9187菌剂的制备方法如下：

（1）将戊糖片球菌JYPR-9187在MRS平板培养基上进行活化，将活化后的戊糖片球菌JYPR-9187接种到MRS液体培养基中，培养获得菌液；

（2）将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于复原脱脂乳中，获得悬浊液；调整悬浊液的浓度，冷冻干燥，获得戊糖片球菌JYPR-9187菌粉；

（3）将上述戊糖片球菌JYPR-9187菌粉与低聚异麦芽糖复配，制得戊糖片球菌JYPR-9187菌剂。

进一步的，步骤（1）中，MRS液体培养基成分包括：蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、蒸馏水1000mL；MRS平板培养基通过向MRS液体培养基加入15g/L琼脂制得。

进一步的，步骤（1）中，戊糖片球菌JYPR-9187的接种量为1%。

进一步的，步骤（1）中，培养温度为37℃，培养时间为24h。

进一步的，步骤（2）中，调整悬浊液的浓度为1.0×10¹⁰~2.0×10¹⁰cfu/mL。

第三方面，本发明还提供一种上述戊糖片球菌JYPR-9187在制备预防和/或治疗抑郁症的产品方面的应用。

进一步的，制备预防和/或治疗抑郁症的产品为抑制海马组织神经炎症相关蛋白表达的产品。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的一种预防和缓解抑郁的戊糖片球菌JYPR-9187，根据实验结果显示，可以有效预防慢性不可预测的温和刺激导致的小鼠抑郁症，有效改善抑郁小鼠体重降低倾向，有助于减轻抑郁小鼠海马组织内的神经炎症，降低抑郁小鼠血清中促炎细胞因子的含量。因此，戊糖片球菌JYPR-9187在制备预防和/或治疗抑郁症的产品方面，具有良好的开发前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本申请实施例3中糖水偏好试验结果图。

图2是本申请实施例3中悬尾试验结果图。

图3是本申请实施例3中新奇抑制摄食试验结果图。

图中，NS表示数据间无显著差异，*表示数据间有显著差异（P＞0.05）。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1 菌种分离与鉴定

1、菌株筛选及纯化

（1）样品来源：2022年7月，于湖北省孝感市孝昌县小河镇小河中心小学菜地，取白菜花1g作为样品，备用。

（2）制备样品溶液：取10mL灭菌后的生理盐水（0.85%）至于无菌三角瓶中，然后将步骤（1）的样品加入其中，振荡。将上述溶液稀释制成不同浓度梯度的样品，分别为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，标号分别为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#，待用。

（3）制备MRS平板培养基；

将蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、琼脂15g和蒸馏水1000mL混合后，自然pH，搅拌菌液后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，将灭菌后的培养基倒入平皿中，放凉后待用；

（4）培养：取100μL步骤（2）的5#、6#、7#溶液，分别使用涂布器涂布在MRS平板培养基中，于37℃、厌氧条件下培养48h；

（5）按照以下菌落特征挑选菌落：

菌落直径1~2mm，菌落圆润，呈乳白色，边缘整齐。

（6）分离纯化

根据步骤（5）的菌落特征挑取5个单菌落，采用划线法接种至MRS平板培养基上，于37℃、厌氧条件下培养48h；然后挑取单菌落，置于甘油管中-70℃保藏。

2、鉴定

将分离纯化得到的单菌落（编号为：JYPR-9187）送去鉴定，鉴定单位：济南天一生物科技有限公司，鉴定过程中，使用的引物如下：

27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；

1492R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。

菌株JYPR-9187的基因序列如下：

TTAGACGGCTAGCTCCTAAAAGGTTACCCCACCGGCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAATGGTTTTAAGAGATTAGCTTAACCTCGCGGTCTCGCGACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACTAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTAGTAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAAGGGAACCTCTAATCTCTTAGACTGTCAGAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCTTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGATTACTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGTAATCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGCACTTCTTCGGTTGAGCCGAAGGCTTTCACATTAGACTTAAAAGACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAAATACCGTCACTGGGTAAACAGTTACTCTTACCCACGTTCTTCTTTAACAACAGAGCTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCACTGCCTTGGTGAGCCTTTACCTCACCAACTAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCAGAAGTGATAGCAGAGCCATCTTTCAAAAGAAAACCATGCGGTTTTCTCTGTTATACGGTATTAGCATCTGTTTCCAGGTGTTATCCCCTACTTCTGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTCACTTCGTGTTAAAATCTCAATCAGTACAAGTACGTCATAATCAATTAACGGAAGTTCGTTCGACTGCA。

根据鉴定结果显示，菌株JYPR-9187为戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus，将鉴定后的菌株JYPR-9187命名为戊糖片球菌JYPR-9187。将该菌株送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏信息如下；

分类命名：戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus，保藏日期：2023年7月24日，保藏编号：CGMCC No.27994，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。

实施例2 制备菌剂

（1）制备MRS液体培养基和MRS平板培养基：将蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g和蒸馏水1000mL混合后，自然pH，搅拌菌液后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，制得MRS液体培养基；MRS平板培养基通过向MRS液体培养基加入15g/L琼脂，倒入平皿中放凉制得。

（2）将戊糖片球菌JYPR-9187在MRS平板培养基上进行活化，将活化后的戊糖片球菌JYPR-9187按照1%的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃下培养24h获得菌液；

（3）将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于15%（w/w）复原脱脂乳中，获得悬浊液；调整悬浊液的浓度1.0×10¹⁰~2.0×10¹⁰cfu/mL，冷冻干燥，获得戊糖片球菌JYPR-9187菌粉；

（4）将上述戊糖片球菌JYPR-9187菌粉与低聚异麦芽糖（购自保龄宝生物股份有限公司）复配，制得戊糖片球菌JYPR-9187菌剂。

根据不同的剂量需求，通过调整戊糖片球菌JYPR-9187菌粉与低聚异麦芽糖的复配比例，可获得戊糖片球菌JYPR-9187含量分别为100亿/g、150亿/g、200亿/g的产品。

实施例3 JYPR-9187对小鼠抑郁的预防效果

1、建立抑郁小鼠模型

购买40只来自于杰克森实验室（JAX）的6~8周龄SPF级C57BL/6J健康雄鼠，进行为期一周的适应性喂养，饲养条件为：充足的食物和水源，温度25℃，12h明亮，12h黑暗。

试验小鼠在适应环境1周后，随机分为4组，每组10只，分别为模型组、JYPR-9187组、空白组、预防组。造模前，预防组小鼠灌胃6×10⁹cfu/mL的戊糖片球菌JYPR-9187菌液（用生理盐水溶解戊糖片球菌JYPR-9187菌粉制成），用量为每只小鼠500万cfu/天。空白组、JYPR-9187组和模型组小鼠灌胃相同体积的生理盐水，连续喂养14天。

14天后，将模型组、JYPR-9187组、预防组小鼠按每笼5只饲养，在21天的时间内按表1流程接受慢性、不可预知的温和刺激，模拟人类日常生活中接受的慢性低强度应激，使小鼠不能够预计刺激的出现，从而构建抑郁小鼠模型，模拟抑郁症患者的疾病状态。

表1 慢性应激刺激流程

上表中各刺激的具体试验步骤如下：

束缚2h：小鼠放于束缚罐中束缚2h；

冰水游泳：在强迫游泳桶中加入4℃冰水，每桶中1只小鼠，游泳5min；

孤独3h：所有小鼠每只单笼隔离，孤独3h；

气味2h：胡椒粉撒入鼠笼，气味刺激2h；

摇笼子10min：晃鼠笼10min（强度以小鼠不能站稳为准），方向不定；

电击：每只小鼠单独接受足底电击，电流强度2mA，电击4s，间隔10s，重复2次；

光照：持续电灯光照；

倾斜笼子：将鼠笼倾斜45°；

闪光：彩灯置于鼠笼上方，持续闪烁；

禁食：禁水禁食12h；

拥挤：将所有小鼠放入狭窄的桶中；

潮湿木屑：在鼠笼垫料上喷洒水，潮湿处理。

2、行为学评估

利用行为学变化来评估抑郁小鼠模型是否建模成功，评估试验包括糖水偏好试验、悬尾试验和新奇抑制摄食试验。

（1）糖水偏好试验

实验前准备：分别用50mL离心管分装1%的蔗糖溶液和纯水，将模型组、JYPR-9187组、预防组、空白组小鼠从普通笼子放入实验笼中，每只单独饲养。

适应阶段：在正式实验之前首先给予小鼠两个溶液，分别是1%（w/w）蔗糖溶液和纯水。适应阶段为72小时；为了防止小鼠习惯于侧面偏向，所以在此期间蔗糖和纯水的位置每12h更换一次；72h后剥夺小鼠水和粮6h。

正式实验：给予每笼小鼠1%蔗糖溶液和纯水，12h后测定每个水瓶液体消耗的总质量并计算出蔗糖偏好指数，计算公式如下：

所得实验数据均以“平均值±标准差”表示，使用统计软件（SPSS 26.0）对数据进行分析，多组间比较满足正态分布及方差齐性时，采用单因素方差法（One-way ANOVA）分析，P＜0.05认为结果具有统计学差异。

结果如图1所示，与空白组相比，模型组、JYPR-9187组蔗糖偏好指数显著降低（P＜0.05），说明抑郁小鼠造模成功，而预防组与空白组蔗糖偏好指数差异不显著，说明服用JYPR-9187对小鼠抑郁有一定的预防作用。

（2）悬尾试验

实验前准备：大小为55cm×60cm×11.5cm深开式箱体，将摄像机安装在露天聚氯乙烯（PVC）敞开式箱体上方的操作台上，通过USB将摄像机连接到计算机上。实验前用75%乙醇喷涂、纸巾擦拭箱体，确保箱体清洁无味道。测试前1小时，将模型组、JYPR-9187组、预防组、空白组小鼠放入测试室内进行适应。在每个隔间的底部放置一个吸水纸用来收集动物的粪便或尿液。

实验开始：将实验小鼠从饲养笼中轻轻取出，小鼠尾部2cm处用胶带固定，长约为7cm，为了防止小鼠爬尾，用长为1cm的吸管套住小鼠尾巴。将实验小鼠迅速放挂于实验箱底部大约距离20cm处，并立即离开；用摄像机拍摄，记录整个过程，记录小鼠6min的不动时间（不动时间的界定是小鼠前腿动但是后腿不参与的过程，开始时由于惯性所造成的移动也为不动时间）。实验结束后，把老鼠从箱子里拿出来，放回笼子里。在进行下一个实验动物之前，用75%乙醇和纸巾清洁整个盒子区域，尤其是小鼠粪便、尿。

结果如图2所示，与空白组相比，模型组、JYPR-9187组悬尾不动时间显著增加（P＜0.05），说明抑郁小鼠造模成功；预防组悬尾不动时间与空白组差异不显著，说明服用JYPR-9187对小鼠抑郁有一定的预防作用。

（3）新奇抑制摄食试验

实验前准备：使用大小为55cm×60cm×11.5cm顶部开放的白色不透明树脂测试箱，底部铺满约2cm厚的垫料，在中央摆放6粒饲料颗粒。

实验开始：将模型组、JYPR-9187组、预防组、空白组小鼠禁食24小时后，从同一个角落放入箱中并开始计时，以开始咀嚼食物为标准，记录所用时间，定义为摄食潜伏期。测试共计5分钟，5分钟内未进食小鼠摄食潜伏期记录为5分钟。

结果图3所示，与空白组相比，模型组、JYPR-9187组摄食潜伏期显著延长（P＜0.05），说明抑郁小鼠造模成功；预防组摄食潜伏期与空白组差异不显著，说明服用JYPR-9187对小鼠抑郁有一定的预防作用。

实施例4 JYPR-9187对抑郁小鼠的体重影响

按照实施例3，将造模成功的模型组小鼠、JYPR-9187组小鼠和空白组小鼠分别称取体重。JYPR-9187组小鼠灌胃6×10⁹cfu/mL的戊糖片球菌JYPR-9187菌液（用生理盐水溶解戊糖片球菌JYPR-9187菌粉制成，添加量为每只小鼠500万cfu/天），空白组和模型组小鼠灌胃相同量的生理盐水，连续喂养24天。期间，每6天称取一次每组小鼠体重，结果如表2所示。

表2 各组小鼠体重变化情况

注：*表示与空白组比较，P＜0.05；#表示与模型组比较，P＜0.05。

根据表2数据显示，第0天，与空白组相比，造模成功的模型组、JYPR-9187组小鼠体重显著减少（P＜0.05），模型组与JYPR-9187组小鼠体重差异不显著。JYPR-9187组小鼠随着灌胃益生菌的天数增加，体重也逐渐增加；模型组小鼠随着灌胃生理盐水天数增加，体重逐渐降低。从第6天开始，模型组与JYPR-9187组小鼠体重出现了显著差异（P＜0.05），JYPR-9187组小鼠体重与空白组差异不显著，说明JYPR-9187可以显著改善抑郁小鼠体重降低的症状，由此可以看出JYPR-9187对小鼠抑郁有一定的缓解效果。

实施例5 JYPR-9187对小鼠海马组织内NOD样受体蛋白3（NLRP3）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白水解酶-1（Caspase-1）、核转录因子NF-κBp65蛋白表达水平的影响

NLRP3炎症小体由ASC、Caspase-1和NLRP3组成。活化的NF-κB会上调NLRP3的mRNA转录水平，产生高水平的NLRP3结构蛋白。NLRP3结构蛋白的寡聚化作用使其与接头蛋白ASC的PYD相结合，然后ASC的CARD与pro-Caspase-1上的CARD结合，形成完整且有活性的NLRP3炎性小体，促使pro-Caspase-1自我裂解，产生活性的效应蛋白Caspase-1。

Caspase-1具有剪切GSDMD的功能，使GSDMD的N末端结构域释放。N-GSDMD通过与细胞膜上内页的磷脂酰丝氨酸和磷酸肌醇结合，在细胞膜上打孔，细胞内外失衡而破裂，引起细胞死亡，细胞内容物释放到细胞外，引起炎症反应。Caspase-1除了剪切GSDMD，还可以诱导IL-1β和IL-18从未成熟状态转化为活性状态，细胞死亡后IL-1β和IL-18会释放到细胞外从而诱发神经炎症。

1、各组小鼠海马组织内蛋白提取

（1）按照实施例4，连续喂养24天后，将称取体重后的小鼠禁食不禁水12h，以0.4%戊巴比妥按照1mL/g剂量腹腔注射麻醉小鼠后，将小鼠放置于冰盘上仰卧位，用透明医用胶带固定头部和四肢，进行眼球取血后处死。

（2）取小鼠海马组织：剪开小鼠头骨，暴露出头脑壳，用镊子撬开小鼠脑壳，在看到皮层后，轻轻拨开皮层直到发现在皮层下方月牙形的脑组织，取出脑组织，分离出海马，用刀片将左右海马分开。将海马放于冻存管中保存，暂时放入液氮罐中冷冻，待取材结束后转移至-80℃冰箱保存备用。

（3）裂解、匀浆：精确称取-80℃冻存的各组小鼠海马组织100mg，加入0.5ml的裂解液，使用电动匀浆器将组织粉碎匀浆。

（4）离心、变性：将样品匀浆离心10min（4℃，15000r/min）,取上清液加入EP管中，加入蛋白上样缓冲液，金属浴（100℃，10min）后冷却备用。

2、蛋白浓度测定

（1）配置工作液：按照标定浓度0.5mg/mL来处理标准品。

（2）设置浓度梯度：取8个无酶EP管，分别标记为A、B、C、D、E、F、G、H，抽取20μL浓度为0.5mg/mL的标准品，连续倍比稀释，分别得到浓度为0.50mg/mL、0.40mg/mL、0.30mg/mL、0.20mg/mL、0.15mg/mL、0.10mg/mL、0.05mg/mL、0.00mg/mL的标准品，加20μL到96孔板中。

（3）测定样品蛋白浓度：在酶标孔中加入20μL BCA工作液，封口膜覆盖酶标板（37℃，30min），酶标仪标定A562nm，计算蛋白浓度。

3、制胶、电泳、转模、抗体孵育

（1）准备：用蒸馏水清洗BIO-RAD玻璃板，安装于制胶支架上。

（2）配制10%分离胶：将30%制胶液（3.3mL）、1.5M Tris-HCI（2.5mL）、10% SDS（100μL）、10% PAGE凝胶固剂（100μL）、PAGE胶促凝剂（10μL）、ddH₂O（4.0mL）混匀，灌注于玻璃板中。

（3）配制5%浓缩胶：将30%制胶液（0.83mL）、1.0M Tris-HCI（0.625mL）、10% SDS（50μL）、10% PAGE凝胶固剂（75μL）、PAGE胶促凝剂（7.5μL）、ddH₂O（3.42mL）混匀，灌注于分离胶上，同时将10孔加样梳插入浓缩胶中，静置10min。

（4）移胶、加样：打开制胶支架，将玻璃板固定在电泳槽中，加入电泳缓冲液直至超过玻璃板上沿，垂直取出加样梳，先加入蛋白分子量标准品（Marker）3μL，依次将NLRP3、ASC、Caspase-1、NF-κBp65各3.5μL加入加样孔，最后再加入Marker 3μL标定蛋白位置。

（5）电泳：先设置80V恒压电泳，当条带移入浓缩胶后将电压修改为120V进行电泳，当目标蛋白与Marker分子量大致相当后停止电泳。

（6）转膜：用甲醛激活PVDF膜后，将双层海绵、滤纸、PVDF膜依次包夹于凝胶上，加入转模液进行电转，结合目标蛋白分子量分大小、Marker上印记裁剪PVDF膜。

（7）封闭、孵育抗体：将PVDF膜置于孵育盒，加入牛奶封闭液20ml，封闭2.5h,将封闭好的PVDF膜放入抗体孵育盒中，分别加入抗体GAPDH Anti-body（浓度1:2000）、NLRP3（浓度1:1000）、ASC（浓度1:1000）、Caspase-1（浓度1:1000）、NF-κBp65（浓度1:1000）各20mL，恒温水浴摇床上37℃孵育过夜。

（8）孵育二抗：将孵育过一抗的PVDF膜用TBST溶液洗涤4次（10min/次），放入孵育盒中，加入抗体HRP*Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（浓度1:10000）20mL，恒温摇床37℃孵育2h，用TBST溶液洗涤PVDF膜4次（10min/次）。

4、ECL法显色，分析结果

按照显影液使用说明，将配置好的显影液均匀滴落在PVDF膜上，使用Bio-RADQuantity one图像软件显影，以GAPDH为参考，用Image J软件比对灰度值，计算蛋白相对表达量，结果图表3所示。

所得实验数据均以“平均值±标准差”表示，使用统计软件（SPSS 26.0）对数据进行分析，多组间比较满足正态分布及方差齐性时，采用单因素方差法（One-way ANOVA）分析，P＜0.05认为结果具有统计学差异。

表3 各组小鼠海马组织内相关蛋白表达量

注：*表示与模型组比较，P＜0.05；#表示与空白组比较，P＜0.05。

根据表3数据显示，与空白组相比，模型组小鼠海马NLRP3、ASC、Caspase-1、NF-κBp65蛋白表达水平显著增加（P＜0.05）。JYPR-9187组小鼠与模型组相比，海马NLRP3、ASC、Caspase-1、NF-κBp65蛋白表达水平显著增加，与空白组无明显差异。由此可见，JYPR-9187抑制小鼠海马组织内神经炎症相关蛋白的表达，对小鼠抑郁有一定的缓解效果。

实施例6 JYPR-9187对抑郁小鼠血清中促炎细胞因子IL-1、IL-6、TNF-α浓度的影响

按照实施例5，将取得的小鼠眼球血液在室温条件下自然凝固30分钟，1000xg离心15分钟左右，收集血清上清，4℃保存待测。使用从上海科艾博生物科技有限公司购买的ELISA试剂盒，按照试剂盒说明书操作方法检测各组小鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α含量。

所得实验数据均以平均值±标准差表示，使用统计软件（SPSS 26.0）对数据进行分析，多组间比较满足正态分布及方差齐性时，采用单因素方差法（One-way ANOVA）分析，P＜0.05认为结果具有统计学差异。

表4 各组小鼠促炎细胞因子含量

注：*表示与模型组比较，P＜0.05；#表示，与空白组比较，P＜0.05。

根据表4数据显示，与空白组相比，模型组小鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α含量显著增加，说明抑郁小鼠体内炎症指标偏高（P＜0.05）。JYPR-9187组小鼠与模型组相比，血清中IL-1、IL-6、TNF-α含量显著减少（P＜0.05），与空白组小鼠无显著差异。由此说明JYPR-9187可以降低抑郁小鼠体内促炎细胞因子IL-1、IL-6、TNF-α的含量，JYPR-9187对小鼠抑郁有一定的缓解效果。

尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1. 一种预防和缓解抑郁的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）JYPR-9187，其特征在于，戊糖片球菌JYPR-9187于2023年7月24日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27994，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.一种戊糖片球菌JYPR-9187菌剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的戊糖片球菌JYPR-9187的菌体和低聚麦芽糖。

3.如权利要求2所述的一种戊糖片球菌JYPR-9187菌剂，其特征在于，戊糖片球菌JYPR-9187菌体数量为100~200亿/g。

4.如权利要求2所述的一种戊糖片球菌JYPR-9187菌剂，其特征在于，其制备方法如下：

（1）将戊糖片球菌JYPR-9187在MRS平板培养基上进行活化，将活化后的戊糖片球菌JYPR-9187接种到MRS液体培养基中，培养获得菌液；

（2）将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于复原脱脂乳中，获得悬浊液；调整悬浊液的浓度，冷冻干燥，获得戊糖片球菌JYPR-9187菌粉；

（3）将上述戊糖片球菌JYPR-9187菌粉与低聚异麦芽糖复配，制得戊糖片球菌JYPR-9187菌剂。

5. 如权利要求4所述的一种戊糖片球菌JYPR-9187菌剂，其特征在于，步骤（1）中，MRS液体培养基成分包括：蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温801mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、蒸馏水1000mL；MRS平板培养基通过向MRS液体培养基加入15g/L琼脂，倒入平皿中放凉制得。

6.如权利要求4所述的一种戊糖片球菌JYPR-9187菌剂，其特征在于，步骤（1）中，戊糖片球菌JYPR-9187的接种量为1%。

7.如权利要求4所述的一种戊糖片球菌JYPR-9187菌剂，其特征在于，步骤（1）中，培养温度为37℃，培养时间为24h。

8.如权利要求4所述的一种戊糖片球菌JYPR-9187菌剂，其特征在于，步骤（2）中，调整悬浊液的浓度为1.0×10¹⁰~2.0×10¹⁰cfu/mL。

9.一种如权利要求1所述的戊糖片球菌JYPR-9187在制备预防和/或治疗抑郁症的产品方面的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，制备预防和/或治疗抑郁症的产品为抑制海马组织神经炎症相关蛋白表达的产品。