CN117903980A - 一种海氏肠球菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海氏肠球菌及其应用，属于微生物技术领域，该海氏肠球菌是首次从中国林蛙肠道中分离筛选得到的海氏肠球菌，其具有较强耐酸能力，对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌和鼠伤寒沙门氏菌的生长具有较强的抑制作用，对人结肠癌细胞和宫颈癌细胞也具有较强的抑制作用，其发酵液抗氧化能力较强，对DSS诱导的小鼠结肠炎症状有显著的缓解作用。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种海氏肠球菌及其应用。
背景技术
中国林蛙(Rana chensinensis)俗称有哈士蟆、雪蛤等，是著名的药用蛙种，其雌体输卵管干制成的哈士蟆油是名贵中药材。我们研究发现，中国林蛙体表和肠道都含有丰富的微生物种类，包括大量乳酸菌。因此，我们在自然保护区高海拔、无人居、无污染的区域采集中国林蛙样品，从其肠道中分离筛选具有益生功能的益生菌，为益生菌的分离筛选提供新的动物资源。
海氏肠球菌(Enterococcus hirae)为革兰氏阳性菌，因能发酵葡萄糖产生乳酸而属于乳酸菌的一种。可以从发酵食品、奶酪和生牛奶中分离得到，很少分离出人源的海氏肠球菌。前人的多项研究结果均表明，海氏肠球菌具有多种动物益生功能，是一种潜在益生菌。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种海氏肠球菌及其应用，该海氏肠球菌是首次从中国林蛙肠道中分离筛选得到的海氏肠球菌，其具有较强耐酸能力，对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌和鼠伤寒沙门氏菌的生长具有较强的抑制作用，对人结肠癌细胞和宫颈癌细胞也具有较强的抑制作用，其发酵液抗氧化能力较强，对DSS诱导的小鼠结肠炎症状有显著的缓解作用。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种海氏肠球菌(Enterococcus hirae)TD1112，于2023年7月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.27807。
上述的海氏肠球菌(Enterococcus hirae)TD1112在非疾病治疗目的的抑制大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌和鼠伤寒沙门氏菌上的应用。
上述的海氏肠球菌(Enterococcus hirae)TD1112在制备治疗大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌和鼠伤寒沙门氏菌导致疾病的药品中的应用。
上述的海氏肠球菌(Enterococcus hirae)TD1112权利要求1所述的海氏肠球菌(Enterococcus hirae)TD1112在制备抗结肠癌和宫颈癌药物中的应用。
上述的海氏肠球菌(Enterococcus hirae)TD1112在制备结肠炎预防药物中的应用。
上述的的海氏肠球菌(Enterococcus hirae)TD1112在制备抗氧化功能药物中的应用。
一种抗结肠癌或宫颈癌药物，包括上述的海氏肠球菌TD1112。
一种结肠炎预防药物，包括上述的海氏肠球菌TD1112。
一种抗氧化功能药物，包括上述的海氏肠球菌TD1112。
本发明的海氏肠球菌TD1112是从四川自然保护区采集的野生中国林蛙消化道中分离筛选获得。海氏肠球菌TD1112在MRS琼脂培养基上生长良好，菌落为乳白色，表面光滑，边缘整齐，不透明，对菌体形态进行镜检，革兰氏染色呈紫色。通过采用细菌通用引物16SrRNA的27F/1492R对其基因组总DNA为模板进行PCR扩增，得到由1000个碱基对(bp)组成的目的基因序列，序列如SEQ ID No.1所示，SEQ ID No.1为：AGGGGGGTTGGGGGCGTGCTTAATACATGCAAGTCGAACGCTTCTTTTTCCACCGGAGCTTGCTCCACCGGAAAAAGAGGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAATCGAAACCGCATGGTTTCGATTTGAAAGGCGCTTTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACAAGGATGAGAGTAACTGTTCATCCCTTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAACTCATAGGAATTGGACGGGGGCCCCGCACAAGCGGTGGAGCATTGTGTTTTAATTCGAAGCAACGCGAGAAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTTG。
将测序得到的基因序列输入NCBI数据库进行比对，其与GenBank中的标准菌Enterococcus hirae 1-Z-12相似率达98.70％，可初步鉴定该菌株为海氏肠球菌(Enterococcus hirae)。这是首次从中国林蛙肠道中分离筛选得到一株海氏肠球菌(Enterococcus hirae)。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供的海氏肠球菌TD1112分离筛选自自然保护区的中国林蛙，耐酸、耐胆盐、人工胃液和人工肠液试验表明，其对人和动物的胃肠环境有较强的耐受能力。
2、本发明的海氏肠球菌TD1112对多种致病菌具有较强的抑制活性，可抑制大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌和鼠伤寒沙门氏菌生长。
3、本发明的海氏肠球菌TD1112对人结肠癌细胞粘附性能好，对人结肠癌细胞和宫颈癌细胞生长抑制能力强。
4、本发明的海氏肠球菌TD1112发酵液抗氧化能力较强，对DSS诱导的小鼠结肠炎症状有显著的缓解作用。
附图说明
图1为本发明海氏肠球菌TD1112菌株在MRS琼脂培养基上的菌落形态图(A)和革兰氏染色图(B)；
图2为本发明海氏肠球菌TD1112菌株与其它菌株的系统进化关系图；
图3为本发明海氏肠球菌TD1112菌株的溶血性实验结果图；
图4为本发明海氏肠球菌TD1112菌株1％发酵上清液对结肠癌细胞(A)和宫颈癌细胞(B)生长的影响统计结果图；图中A0、B0为空白对照，A1、B1为1％发酵上清液共培养72h。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
因此，以下对提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
下面结合实施例和附图对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
1.海氏肠球菌TD1112的分离、鉴定
1.1海氏肠球菌TD1112的分离、鉴定
1.1.1材料
中国林蛙样品采自四川九寨沟国家级自然保护区，尽快将活体带回实验室。
MRS肉汤培养基的配方(每升)：酪蛋白酶消化物10.0g，牛肉膏粉10.0g，酵母膏粉4.0g，柠檬酸三铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2.0g，葡萄糖20.0g，吐温-80，最终pH为5.7左右。使用时称取该品54.0g，加入蒸馏水或去离子水1L，分装于锥形瓶，于121℃高压条件灭菌15min。MRS琼脂培养基的配方(每升)：蛋白胨10.0g，牛肉膏粉5.0g，酵母膏粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，琼脂15.0g，最终pH为6.2左右。使用时称取该品64.3g，加入蒸馏水或去离子水1L，分装于锥形瓶，于121℃高压条件灭菌15min。
16s rRNA通用引物27F和1492R通用引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，序列如下：27F：5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3，1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3
1.1.2具体方式
活体林蛙表面清洗后麻醉，在无菌操作台剖腹取出肠道，挤出肠道内容物，接种于50mL MRS肉汤中，充分振荡混匀，置于37℃恒温摇床培养24h。吸取培养液1ml，采用10倍梯度稀释，取菌液各20μL，涂布接种于MRS琼脂培养基，37℃培养24h后挑取单菌落120个，并连续纯化分离3次。将纯化后的菌株接种于600μL MRS肉汤培养基中，37℃摇床培养18h，加入400μL浓度50％(V/V)的灭菌甘油，于-80℃超低温冰箱中冻存备用。
取出冻存菌株，经活化培养培养后，采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株DNA，16S rRNA扩增采用菌落PCR技术完成，PCR产物测序由生工生物工程(上海)有限公司完成，并进行分子生物学鉴定，共得到海氏肠球菌(Enterococcus hirae)10株，其中一株的16S rRNA序列如SEQ ID No.1所示；序列进行NCBI BLAST比对，与标准菌株Enterococcushirae 1-Z-12相似率达98.70％，其形态特征、菌落特征和革兰氏染色菌符合海氏肠球菌特征(图1)，因此命名为海氏肠球菌(Enterococcus hirae)TD1112。该菌株与GenBank其它几个菌株的系统发育关系如附图2。将该菌株2023年7月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.27807。
1.2海氏肠球菌TD1112的抗生素抗性和溶血性：
采用纸片琼脂扩散法测试该菌株对常见抗生素的敏感性。将海氏肠球菌TD1112菌株活化培养，菌液浓度调整至1×106CFU/mL，用无菌棉签将菌液均匀地涂抹于MRS培养基平板表面，室温10min后放入药敏纸片，37℃培养24h后，用游标卡尺测量各药敏纸片周围的抑菌圈直径，每种抗生素重复3次，试验结果参照美国临床实验室标准委员会(NCCLS)标准判断菌株的药物敏感性，分为敏感(S)、中介(I)和耐药(R)。溶血性实验在血平板上进行。
实验结果表明，所述海氏肠球菌TD1112对测试的四环素、氨苄西林、头孢曲松、克林霉素、克拉霉素和氯霉素6种常用抗生素均表现为敏感(S)，没有出现溶血现象(图3)，说明所述海氏肠球菌TD1112菌株对人畜的安全性(表1)。
表1海氏肠球菌TD1112菌株对6种抗生素的敏感性
| 编号 | 四环素 | 氨苄西林 | 头孢曲松 | 克林霉素 | 克拉霉素 | 氯霉素 |
| TD1112 | S | S | S | S | S | S |
2.海氏肠球菌TD1112对动物胃肠环境的适应性
2.1、耐酸性和耐胆盐性评估：将待测菌株海氏肠球菌TD1112在MRS琼脂平板上进行复苏并活化3代，并调节菌液初始浓度达到1×106CFU/mL。使用盐酸和猪胆盐分别配制酸度(pH＝3.0)及胆盐浓度(0.3％)的MRS肉汤培养基。将1mL待测菌株海氏肠球菌TD1112菌液接种于pH＝3.0的肉汤培养基中，37℃培养18h。培养完毕，取20μL菌液涂布于MRS琼脂平板培养基，设置3个重复，于37℃培养18h。观察培养后MRS平板表面是否有菌落生长。同样，将1mL待测菌株海氏肠球菌TD1112菌液接种于胆盐浓度为0.3％的MRS肉汤培养基，37℃培养18h后，涂平板，37℃培养24h，查看菌落生长情况。
耐酸性试验结果表明，海氏肠球菌TD1112在pH＝3.0的MRS肉汤培养基中处理18h后仍可在MRS琼脂平板上长出正常菌落；耐盐性试验结果表明，海氏肠球菌TD1112在胆盐浓度为0.3％ MRS肉汤培养基中耐受18h后仍可在MRS琼脂平板上长出正常菌落；说明海氏肠球菌TD1112具有较强的耐酸和耐盐特性。
2.2、模拟胃液、肠液耐受实验：模拟胃液和肠液购自上海源叶生物科技有限公司。人工胃液模拟液成分为稀盐酸、胃蛋白酶和氯化钠，最终pH 2.5；人工肠液模拟液成分为磷酸二氢钾和胰蛋白酶，最终pH 6.8。将海氏肠球菌TD1112菌株复苏并活化，将菌液浓度调整至1×108CFU/mL，取1mL菌液加人9mL模拟人工胃液液中，并进行10倍梯度稀释，吸取20μL涂平板计活菌数，作为耐受人工胃液的初始活菌值；接菌的模拟胃液于37℃培养3h后，再次涂平板计活菌数，作为耐受人工胃液的结束活菌值。同理，将1mL浓度为1×108CFU/mL所述海氏肠球菌TD1112发酵液加入9mL模拟肠液中，并进行活菌计数，37℃培养6h后再次计活菌数，计算存活率。存活率＝结束时活菌数/初始活菌数*100％。
结果表明，海氏肠球菌TD1112菌株对于人工模拟胃、肠液均有很好的耐受能力，人工胃液中3h后存活率为102.59％，人工肠液6h后存活率为105.25±2.29％。说明海氏肠球菌TD1112菌株在人和动物的胃肠中存活力高，有利于在消化道中定殖，发挥益生作用。
3.海氏肠球菌TD1112菌株的抑菌活性评估
将大肠埃希氏菌(Escherichia coli CMCCB 44102)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCCB 50094)、乙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella para-typhiB CMCCB 50094)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa CMCCB 10104)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium ATCC14028)分别接种于营养琼脂培养基，复苏并活化3次。吸取适量胰酪大豆胨液体培养基至离心管，将活化好的致病菌接种于肉汤培养基中，并调节菌液浓度达到1×108CFU/mL。吸取上述致病菌和肉汤的混合液1mL加至500mL灭菌后暂未凝固的营养琼脂培养基内(温度冷却至40℃左右)，充分混匀后按每皿20mL的量分装至培养皿中。待培养基冷却凝固后，使用直径6mm的打孔器在平板上打孔，制成致病菌琼脂板，每板对应一株菌，并设置三孔作为重复。将待测菌株进行复苏并活化，调节培养后的菌液浓度达到1×108CFU/mL。吸取50μL的待测菌菌液加至上述致病菌琼脂板孔内，于37℃培养24h。培养后，使用游标卡尺测量打孔点周围的抑菌圈直径大小并记录。将标准菌株LGG作为对照菌株，与待测菌株同时进行以上实验操作。
结果表明，海氏肠球菌TD1112菌株的发酵液对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌和鼠伤寒沙门氏菌的生长均有明显的抑制作用，特别是对乙型副伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌的生长抑制作用明显优于对照菌株LGG(表2)。
表2海氏肠球菌TD1112菌株的抑菌活性评估(直径：mm)
4.海氏肠球菌TD1112抗氧化试验
抗氧化剂就是任何以低浓度存在就能有效抑制自由基的氧化反应的物质，以抵消自由基对人体细胞的氧化攻击。其作用机理可以是直接作用在自由基，或是间接消耗掉容易生成自由基的物质，防止发生进一步反应，机体抗氧化的能力越强，就越健康，生命也越长。越来越多的研究显示抗氧化是预防衰老的重要步骤，因为自由基或氧化剂会将细胞和组织分解，影响代谢功能，并会引起不同的健康问题。如果能够消除过多的氧化自由基，对于许多自由基引起的及老化相关疾病都能够预防。例如常见的癌症、动脉硬化、糖尿病、白内障、心血管病、老年痴呆、关节炎等，这些疾病都被认为与自由基相关。
发酵液的制备：将海氏肠球菌TD1112冻存菌种复苏培养24h后，按2％接种量接种于MRS液体培养基中，在37℃条件下培养24h，菌液在4℃、4000r/min条件下离心15min，上清液经0.22μm滤膜过滤得到发酵上清液(CFS)冻存备用。
试剂与仪器：羟自由基测定试剂盒(A018-1-1)、DPPH自由基清除能力试剂盒(A153-1-1)和抑制与产生超氧阴离子自由基测定试剂盒(比色法A052-1-1)均由南京建成生物工程研究所生产。紫外可见分光光度计(UV752N型)，上海佑科仪器仪表有限公司生产；发酵液抗氧化能力测定由成都里来生物科技有限公司完成。
总抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)是指各种抗氧化物质构成的总抗氧化水平。研究抗氧化可以有效克服其所带来的危害，所以抗氧化被保健品、化妆品企业列为主要的研发方向之一，也是市场最重要的功能性诉求之一。许多抗氧化物质能使Fe3+还原成Fe2+，后者可与菲啉类物质形成稳固的络合物，通过比色可测出其抗氧化能力的高低。使用波长520nm，1cm光径，双蒸水调零，测定吸光度值。具体步骤按照总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒说明书进行。海氏肠球菌TD1112菌株发酵液的总抗氧化能力测定结果见表3，可知，海氏肠球菌TD1112发酵液的总抗氧化能力为16.40±0.54U/mL，说明其发酵液具有抗氧化能力。
抑制羟自由基能力：羟自由基系活性氧的一种，具有极强的得电子能力，也就是氧化能力很强。羟自由基能杀死红细胞，降解DNA、细胞膜和多糖化合物。芬顿(Fenton)反应是最常见的产生羟自由基的化学反应，H2O2的量和Fenton反应产生的羟自由基量成正比，当给予电子受体后，用Griess试剂显色，形成红色物质，其呈色与羟自由基的多少成正比关系。严格按照说明书操作，在550nm处测吸光值。计算公式如下：
抑制羟自由基能力(U/mL)＝(A对照-A测定)/(A标准-A空白)×C标准×(1/V样)×N
公式中，C标准:标准品浓度，8.824mmol/L；V样：取样量，0.2mL；N：样本测试前稀释倍数。
测定结果如表3，所述海氏肠球菌TD1112发酵液具有较强的抑制羟自由基能力，为3296.22±63.37U/mL。
DPPH自由基清除能力：DPPH又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种很稳定的氮中心的自由基。由于DPPH自由基有单电子，在517nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色，当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，呈现的颜色越浅，因此，可以对样本中DPPH清除能力进行定量分析。按照试剂盒说明书将标准品粉剂一支加无水甲醇2mL溶解，即为0.5mg/mL(Trolox)标准应用液，再用无水甲醇分别稀释成5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL，使用波长517nm，1cm光径，无水乙醇调零，测定各管吸光度，制作标准曲线。
DPPH自由基清除率(％)＝(1-(A测定－A对照)÷A空白)×100％
用从标准曲线算得的相当于抗氧化剂Trolox的量来表示样本的DPPH自由基清除能力。发酵液样品DPPH自由基清除能力(μg Trolox/mL)＝代入标准曲线得相当于Trolox的浓度×稀释倍数。海氏肠球菌TD1112发酵液的DPPH自由基清除能力测定结果见表3，可知，海氏肠球菌TD1112发酵液的DPPH自由基清除能力203.48±2.21μg Trolox/mL，DPPH自由基清除率53.66±0.57％，表明海氏肠球菌TD1112发酵液对DPPH自由基有较强的清除能力。
抗超氧阴离子能力：超氧阴离子自由基作为生物体代谢过程中产生的一种自由基，可攻击生物大分子，如脂质、蛋白质、核酸和聚不饱和脂肪酸等，使其交链或者断裂，引起细胞结构和功能的破坏，与机体衰老和病变有很密切的关系。本实验模拟机体中黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应系统，产生超氧阴离子自由基，加入电子传递物质及Gress氏显色剂，使反应体系呈现紫红色，用分光光度计测其吸光度，当被测样本中含有超氧阴离子自由基抑制剂时，则比色时测定管的吸光度低于对照管的吸光度，通过以维生素C做标准，可计算出被检物品对超氧阴离子自由基的抑制能力。测定时用1cm光径比色杯，双蒸水调零，波长550nm处比色。
抗超氧阴离子能力(U/L)＝(A对照-A测定)/(A对照-A标准)×C标准×1000×N
在反应系统中，每升发酵液在37℃反应40分钟所抑制的超氧阴离子自由基相当于1mg的维生素C所抑制的超氧阴离子自由基的变化值为一个活力单位。海氏肠球菌TD1112菌株发酵液的抗超氧阴离子能力测定结果见下表3，可知，海氏肠球菌TD1112发酵液对超氧阴离子自由基的抑制能力为292.99±1.40(U/L)，表明海氏肠球菌TD1112发酵液对超氧阴离子自由基的抑制能力较强。
表3海氏肠球菌TD1112菌株的抗氧化能力
5.海氏肠球菌TD1112发酵上清液对癌细胞的生长抑制作用
5.1、对癌细胞的粘附性：将海氏肠球菌TD1112复苏后接种于MRS肉汤培养基中，37℃恒温培养24h。培养完毕后置于-4℃、5000r/min条件下离心10min，并用无菌PBS缓冲液多次洗涤。调整菌悬液浓度至1×106CFU/mL后备用。复苏人结肠癌细胞HT-29，将其接种至六孔细胞培养皿，添加DMEM完全培养基并置于37℃、5％ CO2中培养，两天更换一次培养液。当细胞贴壁状态达80％时，使用0.25％胰酶-EDTA进行消化，并传代培养。培养完毕后用细胞血球计数板对其进行计数，并将细胞浓度调整至5×106个/mL。将1mL细胞悬浮液加至六孔细胞培养皿的其中一培养孔中，置于培养箱中培养。待培养板中的细胞长至单层，弃掉DMEM培养液，用无菌PBS将每孔冲洗3次。将1mL已制备好的菌悬液加入细胞孔，轻微晃动细胞培养板，吸取孔中少量菌液用于平板计数，其结果作为菌悬液中的初始活菌数。将细胞板置于37℃孵育2h，弃去培养基并用无菌PBS缓冲液洗涤3次。使用0.7mL 0.25％胰蛋白酶-EDTA消化细胞10min，待细胞完全脱落后加入0.3mL DMEM培养液终止消化，收集黏附实验结束后的培养液进行平板计数，其结果作为黏附活菌数。并用标准菌株LGG作为对照。
粘附率(％)＝结束期乳酸菌数目/初始乳酸菌接种数目×100％
结果见表4。所述海氏肠球菌TD1112对人结肠癌细胞HT-29的粘附率为16.37％±2.16％。
表4海氏肠球菌TD1112对人结肠癌细胞HT-29的粘附率(％)
| 菌株 | 重复1 | 重复2 | 重复3 | 均值(％) |
| TD1112 | 15.56 | 18.82 | 14.73 | 16.37±2.16 |
| 标准菌株LGG | 15.13 | 16.42 | 15.14 | 15.56±0.61 |
5.2、对癌细胞的生长抑制作用：
发酵上清液制备：将海氏肠球菌TD1112复苏后接种于MRS肉汤培养基中，37℃恒温培养24h，使菌悬液浓度至1×109CFU/mL。培养完毕后置于-4℃、5000r/min条件下离心10min，收集发酵上清液，用细菌滤膜过滤后备用。
癌细胞复苏：在15mL离心管中准备好预热的含有10％FBS和1％双抗的DMEM培养基，置于无菌操作台上，从-80℃冰箱或液氮中拿出冻存的人结肠癌细胞(HCT116)和人宫颈癌细胞(Hela细胞)，37℃水浴锅中快速解冻。待细胞解冻后，将其于无菌操作台上转移到准备好的含有培养基的15mL离心管中，1000r/min离心3min重悬细胞，吸到6cm的细胞培养皿中，在5％ CO2培养箱中37℃培养24h后，更换新鲜的培养基。
细胞传代：提前将PBS，RPMI培养基和胰蛋白酶放入37℃水浴锅中预热，将CO2培养箱中培养的癌细胞培养皿取出，在超净工作台进行后续操作。首先将培养皿中的培养基吸走，往培养皿中加入1ml PBS洗一次，吸走后加入1ml胰酶，轻轻混匀，将培养皿放入培养箱中消化2min，直至在光学显微镜下观察细胞变圆。消化完成后，将胰酶吸走。再加入1ml培养基，用移液枪吹打使细胞悬浮，并转移至1.5mL EP管，1200rpm/min离心3min，吸走上清液，往细胞沉淀中加入300μl培养基，吹打混匀，吸取150μL到装有4mL培养基的培养皿中，轻轻混匀，放入CO2培养箱中继续培养，48h后进行细胞生长抑制实验。
癌细胞生长抑制实验：按照上述细胞传代的方法一直操作到离心，吸走上清液，用1mL PRMI培养基混匀细胞，制成癌细胞悬浮液(细胞密度约为3×104/mL)。往96孔板的每个孔中加入100μL细胞悬浮液，培养24小时待细胞贴壁稳定后，洗掉培养基后加入含1％(V/V)发酵上清液的无血清培养基100μL继续培养72h，按照CCK-8试剂盒说明书操作检测细胞密度(见图4)，检测前在细胞培养箱内继续孵育1.5h小时，用酶标仪450nm测定吸光度。
测定结果如表5所示。1％海氏肠球菌TD1112菌株发酵上清液与癌细胞共培养72小时后，对人结肠癌细胞的生长抑制率为18.23％，而对宫颈癌细胞生长抑制率为29.84％，对两种癌细胞的生长均表现出明显的抑制作用。
表5海氏肠球菌TD1112发酵上清液对人结肠癌细胞和宫颈癌细胞的生长抑制作用
| 培养时间 | 重复1 | 重复2 | 重复3 | 均值(％) |
| HCT116-72h | 22.18 | 11.29 | 21.23 | 18.23±7.72 |
| Hela细胞-72h | 32.96 | 31.14 | 25.43 | 29.84±3.93 |
6.海氏肠球菌TD1112菌株对小鼠结肠炎的预防作用
6.1实验方法
DSS水溶液：用葡聚糖硫酸钠盐(DSS)配制浓度为4％(w/v)的水溶液。
菌悬液的制备：将海氏肠球菌TD1112在MRS肉汤培养基培养24h后，在-4℃、6000r/min条件下离心5min，弃上清液。使用无菌PBS缓冲液重悬菌体，调节菌液浓度为5×109CFU/mL，冰箱保存备用。
实验动物：由成都达硕实验动物有限公司提供4周龄SPF级雄性昆明小鼠27只，随机分成9笼，每笼3只，适应性饲养后，随机分为3组，每组3笼，包括空白对照组(CK)、DSS模型组、益生菌(海氏肠球菌TD1112)处理组，实验处理如表8所示。
表7DSS诱导小鼠结肠炎实验
血清炎症因子检测：在实验结束时，每组分别随机处死3只小鼠，进行眼眶取血，血液经离心机3000r/min离心15min，获得血清，使用ELISA试剂盒测定血清的炎症因子(IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α)，步骤按照试剂盒说明书进行。
6.2结果分析
DSS小鼠结肠炎模型实验结果表明，在DSS的作用下，模型组的五个炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10)指标都比对照组显著提高(p<0.01)，而益生菌TD1112处理组五个炎症因子指标都显著低于DSS模型组(p<0.01)，说明所述TD1112菌株对DSS诱导的小鼠结肠炎有明显的缓解作用(表8)。细胞因子是一类具有生物活性的小分子蛋白或多肽的总称，又分为促炎细胞因子和抗炎细胞因子。活化的炎性细胞在产生促炎细胞因子的同时产生抗炎细胞因子，而促炎与抗炎细胞因子相互作用形成复杂的网络，其动态平衡决定了炎症的发展与结局。
表8各组小鼠血清中各炎症因子浓度变化(x±SD)(单位：pg/mL)
与CK组比较，*p<0.05，**p<0.01；与DSS组比较，#p<0.05，##p<0.01
综上所述，本发明所述海氏肠球菌TD1112菌株是从自然保护区野生中国林蛙肠道中分离得到，安全性好，对人和动物肠道环境适应能力强，对多种常见肠道致病菌抑制作用明显，其发酵液抗氧化能力强，对人结肠癌细胞和宫颈癌细胞生长抑制作用较强，对DSS有道德小鼠结肠炎症状有明显的缓解作用，在益生菌领域具有潜在开发应用价值。
Claims (9)
1.一种海氏肠球菌(Enterococcus hirae)TD1112，于2023年7月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.27807。
2.权利要求1所述的海氏肠球菌(Enterococcus hirae)TD1112在非疾病治疗目的的抑制大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌和鼠伤寒沙门氏菌上的应用。
3.权利要求1所述的海氏肠球菌(Enterococcus hirae)TD1112在制备治疗大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌和鼠伤寒沙门氏菌导致疾病的药品中的应用。
4.权利要求1所述的海氏肠球菌(Enterococcus hirae)TD1112在制备抗结肠癌和宫颈癌药物中的应用。
5.权利要求1所述的海氏肠球菌(Enterococcus hirae)TD1112在制备结肠炎预防药物中的应用。
6.权利要求1所述的海氏肠球菌(Enterococcus hirae)TD1112在制备抗氧化功能药物中的应用。
7.一种抗结肠癌或宫颈癌药物，其特征在于，包括权利要求1中所述的海氏肠球菌TD1112。
8.一种结肠炎预防药物，其特征在于，包括权利要求1中所述的海氏肠球菌TD1112。
9.一种抗氧化功能药物，其特征在于，包括权利要求1中所述的海氏肠球菌TD1112。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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