CN117903257A - 用于胰岛素抗性的改良的肽药物 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及用于胰岛素抗性的改良的肽药物。本文描述经共价修饰的肽和/或蛋白质的合成方法和治疗用途。经共价修饰的肽和/或蛋白质使得基于肽和蛋白质的疗法具有改良的医药特性。

Description

用于胰岛素抗性的改良的肽药物
本申请本申请是申请日为2013年11月20日、申请号为201380069707.1、发明名称为“用于胰岛素抗性的改良的肽药物”的发明专利申请的分案申请。
交叉引用
本申请主张2012年11月20日申请的美国临时专利申请第61/728,649号的权益，所述申请以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本申请一般涉及用于胰岛素抗性的改良的肽药物。
背景技术
糖尿病的发病率提高是达到流行病比例的世界健康危机，其为患者发病和死亡的主要贡献者并且是严重的经济负担。肥胖是2型糖尿病的重要风险因素，并且约90％患有2型糖尿病的患者超重或肥胖。肥胖是全世界快速增加的问题，并且当前美国超过65％的成人超重(赫德利,A.A.等人，(2004)美国医学会杂志291：2847-2850(Hedley,A.A.,etal.(2004)JAMA 291:2847-2850))。需要开发用于肥胖和糖尿病的安全并有效的药物疗法。
发明内容
本文描述用于治疗或预防与胰岛素抗性有关的病症的组合物和方法，所述病症包括(并且不限于)肥胖、X综合症、代谢综合症、胰岛素抗性、2型糖尿病、高血压、心肌保护、动脉粥样硬化、心肌梗塞、β细胞保护等等。在一些实施例中，所述方法包括用肽和/或蛋白质预防性和/或治疗性治疗。天然肽和/或蛋白质以及肽和/或蛋白质药物通常在其在医学中的用途方面具有若干局限性(内斯特,J.J.,Jr.(2007)，综合药物化学II，2：573-601(Nestor,J.J.,Jr.(2007)Comprehensive Medicinal Chemistry II 2:573-601))-如短作用持续时间、不良生物可用性以及缺乏受体亚型选择性。此外，肽和/或蛋白质在配制物中不稳定，通常会进行凝集。
本文描述某些经共价修饰的肽和/或蛋白质(例如，GLP-1、升糖素、相关类似物等等)，在投与所述经修饰的肽和/或蛋白质后可获得较长的作用持续时间和/或改良的生物可用性。此类经共价修饰的肽和/或蛋白质适用于预防和/或治疗与以下疾病有关的病状：肥胖、代谢综合症、胰岛素抗性、2型糖尿病、高血压、动脉粥样硬化等等。
在一些实施例中，本文所述的经共价修饰的肽和/或蛋白质连接到糖苷表面活性剂。一方面，经共价修饰的肽和/或蛋白质连接到糖苷表面活性剂,其中肽和/或蛋白质连接到表面活性剂中的糖苷，随后糖苷连接到疏水基团。在一些实施例中，本文还经由并入表面活性剂提供用于合成经修饰的肽和/或蛋白质(例如经修饰的GLP-1、升糖素、胃泌酸调节素，升糖素、胃泌酸调节素或GLP-1的类似物，其它肠促胰岛素等等)的试剂和中间物。
在一些实施例中，本文提供如下肽产物，其包含共价连接到肽的表面活性剂X，所述肽包含连接氨基酸U和至少一种其它氨基酸：
其中表面活性剂X为式I的基团：
其中：
R1a在每次出现时独立地为一键、H、保护基、经取代或未经取代的C1-C30烷基、糖、经取代或未经取代的烷氧基芳基或经取代或未经取代的芳烷基；
R1b、R1c和R1d在每次出现时各自独立地为一键、H、保护基、经取代或未经取代的C1-C30烷基、经取代或未经取代的烷氧基芳基或经取代或未经取代的芳烷基；
W1在每次出现时独立地为-CH2-、-CH2-O-、-(C＝O)、-(C＝O)-O-、-(C＝O)-NH-、-(C＝S)-、-(C＝S)-NH-或-CH2-S-；
W2为-O-、-CH2-或-S-；
R2在每次出现时独立地为一键、H、经取代或未经取代的C1-C30烷基、经取代或未经取代的烷氧基芳基或经取代或未经取代的芳烷基、-NH2、-SH、C2-C4烯烃、C2-C4炔烃、-NH(C＝O)-CH2-Br、-(CH2)m-顺丁烯二酰亚胺或-N3；
n为1、2或3；并且
m为1-10的整数；
所述肽选自式II：
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-aa16-aa17-aa18-aa19-aa20-aa21-aa22-aa23-aa24-aa25-aa26-aa27-aa28-aa29-aa30-aa31-aa32-aa33-aa34-aa35-aa36-aa37-Z 式II(SEQ.ID.NO.1)
其中：
Z为OH、N-R4-His或-NH-R3、
其中
R3为H、C1-C12经取代或未经取代的烷基或小于10Da的PEG链；并且
R4为C2-C10酰基，例如Ac或Bz；
aa1为His、N-R4-His、pGlu-His或N-R3-His；
aa2为Ser、D-Ser、Ala、Gly、Pro、MePro、Aib、Ac4c或Ac5c；
aa3为Gln或Cit；
aa4为Gly或D-Ala；
aa5为Thr或Ser；
aa6为Phe、Trp、2FPhe、MePhe、2FMePhe或Nal2；
aa7为Thr或Ser；
aa8为Ser或Asp；
aa9为Asp或Glu；
aa10为Tyr、Leu、Met、Nal2、Bip、Bip2EtMeO或U；
aa11为不存在或Ser、Asn、Bip或U；
aa12为不存在或Lys、Glu、Ser、Arg或U；
aa13为不存在或Tyr、Gln、Cit或U；
aa14为不存在或Leu、Met、Nle或U；
aa15为不存在或Asp、Glu或U；
aa16为不存在或Ser、Gly、Glu、Ala、Aib、Ac5c、Lys、Arg或U；
aa17为不存在或Arg、hArg、Gln、Glu、Cit、Aib、Ac4c、Ac5c、Lys或U；
aa18为不存在或Arg、hArg、Ala、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa19为不存在或Ala、Val、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa20为不存在或Gln、Lys、Arg、Cit、Glu、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa21为不存在或Asp、Glu、Leu、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa22为不存在或Phe、Trp、Nal2、Aib、Ac4c、Ac5c或U
aa23为不存在或Val、Ile、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa24为不存在或Gln、Ala、Glu、Cit或U；
aa25为不存在或Trp、Nal2或U；
aa26为不存在或Leu或U；
aa27为不存在或Met、Val、Leu、Nle、Lys或U；
aa28为不存在或Asn、Lys、Gln、Cit或U；
aa29为不存在或Thr、Gly、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa30为不存在或Lys、Aib、Ac4c、Ac5c、Arg或U；
aa31为不存在或Arg、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa32为不存在或Asn、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa33为不存在或Arg、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa34为不存在或Asn、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa35为不存在或Asn、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa36为不存在或Ile、Aib、Ac4c、Ac5C或U；
aa36为不存在或Ala、Aib、Ac4c、Ac5C或U；
aa37为不存在或U；
U为天然或非天然氨基酸，其包含用于共价连接到表面活性剂X的官能团；
其中aa1-aa37中的任何两者任选地经由其侧链环化以形成内酰胺键联；并且
其限制条件为aa10-aa37中的一者或至少一者为共价连接到X的连接氨基酸U。
在一些实施例中，n为1。在一些实施例中，n为2，并且第一糖苷经由第一糖苷的W2与第二糖苷的OR1b、OR1c或OR1d中的任一者之间的键连接到第二糖苷。在一些实施例中，n为3，并且第一糖苷经由第一糖苷的W2与第二糖苷的OR1b、OR1c或OR1d中的任一者之间的键连接到第二糖苷，并且第二糖苷经由第二糖苷的W2与第三糖苷的OR1b、OR1c或OR1d中的任一者之间的键连接到第三糖苷。
在一个实施例中，式I-A化合物为以下化合物，其中X具有以下结构：
其中：
R1a为H、保护基、糖、经取代或未经取代的C1-C30烷基或含甾核部分；
R1b、R1c和R1d在每次出现时各自独立地为H、保护基或经取代或未经取代的C1-C30烷基；
W1在每次出现时独立地为-CH2-、-CH2-O-、-(C＝O)、-(C＝O)-O-、-(C＝O)-NH-、-(C＝S)-、-(C＝S)-NH-或-CH2-S-；
W2为-O-、-S-；
R2为一键、C2-C4烯烃、C2-C4炔烃或-(CH2)m-顺丁烯二酰亚胺；并且
m为1-10。
在另一个实施例中，式I-A化合物为以下化合物，其中X具有以下结构：
因此，在上述实施例中，R2为一键。
举例来说，在上述X的结构的示例性实施例中，W1为-C(＝O)NH-，R2为W1与肽内氨基酸残基U之间的键(例如肽中所存在的赖氨酸残基的侧链中的氨基)。
在另一个实施例中，式I-A化合物为以下化合物，其中X具有以下结构：
举例来说，在上述X的结构的示例性实施例中，W1为-CH2-并且R2为X上烷基-连接的顺丁烯二酰亚胺官能团，并且R2连接到肽内氨基酸残基U的适合部分(例如肽的半胱氨酸残基中的硫醇基与X上的顺丁烯二酰亚胺形成硫醚)。
在又另一个实施例中，式I-A化合物为以下化合物，其中X具有以下结构：
其中：
R1a为H、保护基、糖、经取代或未经取代的C1-C30烷基或含甾核部分；
R1b、R1c和R1d在每次出现时各自独立地为H、保护基或经取代或未经取代的C1-C30烷基；
W1为-(C＝O)-NH-；
W2为-O-；
R2为一键。
在另一个实施例中，式I-A化合物为以下化合物，其中X具有以下结构：
其中：
R1a为经取代或未经取代的C1-C30烷基；
R1b、R1c和R1d为H；
W1为-(C＝O)-NH-；
W2为-O-；并且
R2为一键。
在上文和本文所述的一些实施例中，R1a为经取代或未经取代的C1-C30烷基。
在上文和本文所述的一些实施例中，R1a为经取代或未经取代的C6-C20烷基。
在上文和本文所述的一些实施例中，R1a为糖。在一些实施例中，糖为半乳糖。在某些实施例中，糖为α连接的半乳糖。在其它实施例中，糖为α连接的半乳吡喃糖、β连接的半乳吡喃糖、α连接的半乳呋喃糖或β连接的半乳呋喃糖。
本文还涵盖替代实施例，其中式I-A中的X具有以下结构：
举例来说，在上述X的结构的示例性实施例中，W1为-S-，R2为C1-C30烷基，W2为S，R1a为W2与肽内氨基酸残基U的适合部分之间的键(例如肽的半胱氨酸残基中的硫醇基与X形成硫醚)。
在上述X的结构的另一个示例性实施例中，W1为-O-，R2为C1-C30烷基，W2为O，R1a为W2与肽内氨基酸残基U的适合部分之间的键(例如肽的丝氨酸或苏氨酸残基中的羟基与X形成醚)。
在一些实施例中，U用于共价连接到X，并且为二元天然或非天然氨基酸、包含硫醇的天然或非天然氨基酸、包含-N3基团的非天然氨基酸、包含乙炔系基团的非天然氨基酸或包含-NH-C(＝O)-CH2-Br或-(CH2)m-顺丁烯二酰亚胺的非天然氨基酸，其中m为1-10。
在肽产物的一些实施例中，表面活性剂为1-烷基糖苷类表面活性剂。在肽产物的一些实施例中，表面活性剂经由酰胺键连接到肽。
在肽产物的一些实施例中，表面活性剂X包含1-二十烷基β-D-葡糖醛酸、1-十八烷基β-D-葡糖醛酸、1-十六烷基β-D-葡糖醛酸、1-十四烷基β-D-葡糖醛酸、1-十二烷基βD-葡糖醛酸、1-癸基β-D-葡糖醛酸、1-辛基β-D-葡糖醛酸、1-二十烷基β-D-二葡糖醛酸、1-十八烷基β-D-二葡糖醛酸、1-十六烷基β-D-二葡糖醛酸、1-十四烷基β-D-二葡糖醛酸、1-十二烷基β-D-二葡糖醛酸、1-癸基β-D-二葡糖醛酸、1-辛基β-D-二葡糖醛酸或经官能化的1-二十烷基β-D-葡萄糖、1-十八烷基β-D-葡萄糖、1-十六烷基β-D-葡萄糖、1-十四烷基β-D-葡萄糖、1-十二烷基β-D-葡萄糖、1-癸基β-D-葡萄糖、1-辛基β-D-葡萄糖、1-二十烷基β-D-麦芽糖苷、1-十八烷基β-D-麦芽糖苷、1-十六烷基β-D-麦芽糖苷、1-十四烷基β-D-麦芽糖苷、1-十二烷基β-D-麦芽糖苷、1-癸基β-D-麦芽糖苷、1-辛基β-D-麦芽糖苷、1-二十烷基β-D-蜜二糖苷、1-十八烷基β-D-蜜二糖苷、1-十六烷基β-D-蜜二糖苷、1-十四烷基β-D-蜜二糖苷、1-十二烷基β-D-蜜二糖苷、1-癸基β-D-蜜二糖苷、1-辛基β-D-蜜二糖苷等等以及相应的6'或6',6-羧酸，并且所述肽产物通过在上述基团与肽上的基团(例如上述基团中的-COOH基团与肽的氨基)之间形成键联制备。在一些实施例中，表面活性剂X为1-十四烷基β-D-麦芽糖苷、1-十二烷基β-D-麦芽糖苷、1-癸基β-D-麦芽糖苷、1-辛基β-D-麦芽糖苷、1-二十烷基β-D-蜜二糖苷、1-十八烷基β-D-蜜二糖苷、1-十六烷基β-D-蜜二糖苷、1-十四烷基β-D-蜜二糖苷、1-十二烷基β-D-蜜二糖苷、1-癸基β-D-蜜二糖苷或1-辛基β-D-蜜二糖苷以及相应的6'或6',6-羧酸。在一些实施例中，表面活性剂X为1-十四烷基β-D-麦芽糖苷、1-二十烷基β-D-蜜二糖苷、1-十八烷基β-D-蜜二糖苷、1-十六烷基β-D-蜜二糖苷、1-十四烷基β-D-蜜二糖苷、1-十二烷基β-D-蜜二糖苷、1-癸基β-D-蜜二糖苷或1-辛基β-D-蜜二糖苷。
在肽产物的一些实施例中，U为肽的末端氨基酸。在肽产物的一些实施例中，U为肽的非末端氨基酸。在肽产物的一些实施例中，U为天然D-或L-氨基酸。在肽产物的一些实施例中，U为非天然氨基酸。在肽产物的一些实施例中，U选自Lys、Cys、Orn或包含用于共价连接到表面活性剂X的官能团的非天然氨基酸。
在肽产物的一些实施例中，用于将肽共价连接到表面活性剂X的官能团为-NH2、-SH、-OH、-N3、卤乙酰基、-(CH2)m-顺丁烯二酰亚胺(其中m为1-10)或乙炔系基团。
在一些实施例中，两个不同氨基酸残基的侧链官能团连接形成环内酰胺。此键联在如此连接的两个残基上用星号表示。举例来说，在一些实施例中，Lys*侧链与Glu*的侧链形成环内酰胺。在一些实施例中，此类内酰胺结构逆转并且从Glu*和Lys*形成。在一些情况下，已知此类内酰胺键联稳定肽中的α螺旋结构(康登,S.M.等人，(2002)，生物有机化学与医药化学，10：731-736(Condon,S.M.,et al.(2002)Bioorg Med Chem 10:731-736)；穆拉盖,E.N.等人，(2008)，生物有机化学与医药化学，16：10106-12(Murage,E.N.,et al(2008)Bioorg Med Chem 16:10106-12)；穆拉盖,E.N.等人，(2010)，药物化学杂志，53:6412-20(Murage,E.N.,et al.(2010)J Med Chem 53:6412-20))。在一些实施例中，半胱氨酸残基可以经由二硫键形成连接以实现构象限制的类似形式并且辅助螺旋结构形成(李,Y.等人，(2011)，肽，32：1400-1407(Li,Y.,et al.(2011)Peptides 32:1400-1407))。在一些实施例中，两个不同氨基酸残基的侧链官能团连接形成杂环，其经由侧链叠氮基与炔烃官能团之间的“点击反应”产生以获得构象限制的类似形式和稳定的螺旋构象(勒·谢瓦利埃·伊莎A.等人，(2009)，肽科学杂志，15：451-4(Le Chevalier Isaad A.,et al.(2009)J PeptideSci 15:451-4))。在一些实施例中，两个不同氨基酸残基的侧链官能团连接以经由使用烯烃复分解反应形成C-C双键，并且可以进一步通过还原成C-C单键而修饰(威尔丁,G.L.和海林斯基,G.J.(2011)，酶学方法，503:3-33(Verdine,G.L.and Hilinski,G.J.(2011)MethEnzymol 503:3-33))。
在一些实施例中，包含共价连接的烷基糖苷的肽产物为经共价修饰的升糖素或其类似物。在一些此类实施例中，肽产物含有共价连接的1-O-烷基β-D-葡糖醛酸，并且所述肽为升糖素的类似物。
在一些实施例中，包含共价连接的烷基糖苷的肽产物为经共价修饰的GLP-1或其类似物。在一些此类实施例中，肽产物含有共价连接的1-O-烷基β-D-葡糖醛酸，并且所述肽为GLP-1的类似物。
在一些实施例中，式I-A的肽产物具有式III-A的结构
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-aa16-aa17-aa18-aa19-aa20-aa21-aa22-aa23-aa24-aa25-aa26-aa27-aa28-aa29-Z式III-A(SEQ.ID.NO.2)
其中：
Z为OH或-NH-R3、其中R3为H或C1-C12经取代或未经取代的烷基或小于10Da的PEG链；
aa1为His、N-Ac-His、pGlu-His或N-R3-His；
aa2为Ser、Ala、Gly、MePro、Aib、Ac4c或Ac5c；
aa3为Gln或Cit；
aa4为Gly或D-Ala；
aa5为Thr或Ser；
aa6为Phe、Trp、2FPhe、MePhe、2FMePhe或Nal2；
aa7为Thr或Ser；
aa8为Ser或Asp；
aa9为Asp或Glu；
aa10为Tyr、Leu、Met、Nal2、Bip、Bip2EtMeO或U(X)；
aa11为不存在或Ser、Asn、Bip或U(X)；
aa12为不存在或Lys、Glu、Ser、Arg或U(X)；
aa13为不存在或Tyr、Gln、Cit或U(X)；
aa14为不存在或Leu、Met、Nle或U(X)；
aa15为不存在或Asp、Glu或U(X)；
aa16为不存在或Ser、Gly、Glu、Ala、Aib、Ac5c、Lys、Arg或U(X)；
aa17为不存在或Arg、hArg、Gln、Glu、Lys、Cit、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa18为不存在或Arg、hArg、Ala、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa19为不存在或Ala、Val、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa20为不存在或Gln、Lys、Arg、Cit、Glu、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa21为不存在或Asp、Glu、Leu、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa22为不存在或Phe、Trp、Nal2、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa23为不存在或Val、Ile、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa24为不存在或Gln、Ala、Glu、Cit或U(X)；
aa25为不存在或Trp、Nal2或U(X)；
aa26为不存在或Leu或U(X)；
aa27为不存在或Met、Val、Leu、Nle、Lys或U(X)；
aa28为不存在或Asn、Lys、Gln或U(X)；
aa29为不存在或Thr、Gly、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
其中aa1-aa29中的任何两者任选地经由其侧链环化以形成内酰胺键联；并且
其限制条件为aa10、aa11、aa12、aa16、aa17、aa18、aa19、aa20、aa21、aa22、aa23、aa24、aa25、aa26、aa27、aa28或aa29中的一者或至少一者为共价连接到X的天然或非天然氨基酸U。
在一些实施例中，式I-A的肽产物具有式III-B的结构：
His1-aa2-aa3-Gly4-Thr5-aa6-Thr7-Ser8-Asp9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-aa16-aa17-aa18-aa19-aa20-aa21-aa22-aa23-aa24-aa25-aa26-aa27-aa28-aa29-aa30-Z式III-B(SEQ.ID.NO.3)
其中：
Z为OH或-NH-R3、
其中R3为H、经取代或未经取代的C1-C12烷基或小于10Da的PEG链；
aa2为Gly、MePro或Aib；
aa3为Gln或Cit；
aa6为Phe、2FPhe、MePhe、2FMePhe或Nal2；
aa10为Tyr、Nal2、Bip、Bip2EtMeO或U(X)；
aa11为不存在或Ser、Asn、Bip或U(X)；
aa12为不存在或Lys、Glu、Ser或U(X)；
aa13为不存在或Tyr、Gln、Cit或U(X)；
aa14为不存在或Leu、Nle或U(X)；
aa15为不存在或Asp、Glu或U(X)；
aa16为不存在或Ser、Gly、Glu、Ala、Aib、Lys、Arg或U(X)；
aa17为不存在或Arg、hArg、Gln、Glu、Lys、Cit、Aib或U(X)；
aa18为不存在或Arg、hArg、Ala、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa19为不存在或Ala、Aib或U(X)；
aa20为不存在或Gln、Lys、Arg、Cit、Glu、Aib或U(X)；
aa21为不存在或Asp、Glu、Leu、Aib或U(X)；
aa22为不存在或Phe或U(X)
aa23为不存在或Val、Ile、Aib或U(X)；
aa24为不存在或Ala、Gln或U(X)；
aa25为不存在或Trp或U(X)；
aa26为不存在或Leu或U(X)；
aa27为不存在或Met、Val、Leu、Nle、Lys或U(X)；
aa28为不存在或Asn、Gln、Cit或U(X)；
aa29为不存在或Thr、Aib或U(X)；
aa30为不存在或Arg或U(X)；
其中aa1-aa23中的任何两者任选地经由其侧链环化以形成内酰胺键联；并且
其限制条件为aa10、aa11、aa12、aa16、aa17、aa18、aa19、aa20、aa21、aa22、aa23、aa24或aa28中的一者或至少一者为共价连接到X的天然或非天然氨基酸U。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，U为本文所述的任何连接氨基酸。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，aa12为赖氨酸。在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，aa14为亮氨酸。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，aa18为连接到X的赖氨酸残基。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，aa17为高精氨酸(hArg)残基。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，aa17为甘氨酸残基。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，aa2为Aib或Ac4c残基。在一些实施例中，aa2为Aib残基。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽包含一或多个Aib残基。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽在C端包含一或多个Aib残基。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-aa2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-aa16-aa17-Ala18-Ala19-aa20-Glu21-Phe22-aa23-aa24-Trp25-Leu26-aa27-aa28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.774)，其中
aa2为Gly或Aib；
aa16为Glu、Ser、Ala、Lys或Aib；
aa17为Gln、Lys或U(X)；
aa20为Lys、Glu或Arg；
aa23为Ile或Val；
aa24为Ala或U(X)；
aa27为Met、Val或Leu；
aa28为Asn、Gln或U(X)。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-aa2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-aa16-aa17-Ala18-Ala19-Lys20-Glu21-Phe22-Ile23-Ala24-Trp25-Leu26-Leu27-Asn28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.775)，其中
aa2为Gly或Aib；
aa16为Glu、Ala、Aib；
aa17为Lys或U(X)；
aa27为Leu或Val。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-aa2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-aa16-aa17-Arg18-Ala19-aa20-Asp21-Phe22-aa23-aa24-Trp25-Leu26-aa27-aa28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.776)，其中
aa2为Gly或Aib；
aa16为Glu、Ser、Ala或Aib；
aa17为Arg、hArg或Gln、
aa20为Lys或U(X)；
aa23为Ile或Val；
aa24为Gln、Ala或U(X)；
aa27为Leu或Val；并且
aa28为Asn、Gln或U(X)。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-aa2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-aa16-aa17-Arg18-Ala19-aa20-Asp21-Phe22-aa23-aa24-Trp25-Leu26-aa27-aa28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.777)，其中
aa2为Gly或Aib；
aa16为Glu、Ser、Ala、Aib；
aa17为Arg、hArg或Gln、
aa20为Lys或U(X)；
aa23为Ile或Val；
aa24为Gln、Ala或U(X)；
aa27为Leu或Val；
aa28为Asn、Gln或U(X)。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-aa2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-aa16-aa17 Ala18-Ala19-aa20-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ω-X)24-Trp25-Leu26-aa27-aa28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.778)，其中
aa2为Aib或Gly；
aa16和aa20各自个别地为Lys或Glu，并且经由其侧链环化以形成内酰胺键联；
aa17为Arg、hArg或Gln；
aa27为Met、Val、Leu或Nle；
aa28为Asn或Gln；并且
烷基为C8-C20线性烷基链。
在一些实施例中，Lys(N-ω-X)24为Lys(N-ω-1'-烷基β-D-葡糖醛酸基)。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-aa2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-aa16-aa17 Ala18-Ala19-Lys20-Glu21-Phe22-Ile23-Ala24-Trp25-Leu26-Leu27-Asn28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.779)，其中
aa2为Aib或Gly；
aa16为Glu、Ala或Aib；
aa17为Lys或Lys(N-ω-X)；
并且烷基为C8-C20线性烷基链。
在一些实施例中，aa17为Lys(N-ω-1'-烷基β-D-葡糖醛酸基)。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-aa2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-aa16-aa17-Arg18-Ala19-aa20-Asp21-Phe22-aa23-aa24-Trp25-Leu26-aa27-aa28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.780)，其中
aa2为Gly或Aib；
aa16为Glu、Ala、Aib；
aa17为Arg、hArg；
aa20为Lys或Lys(N-ω-X)；
aa23为Ile或Val；
aa24为Gln或Ala；
aa27为Leu或Val；
aa28为Asn或Gln；
并且烷基为C8-C20线性烷基链。
在一些实施例中，aa20为Lys(N-ω-1'-烷基β-D-葡糖醛酸基)。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-aa2-Gln3-Gly4-Thr5-aa6-Thr7-Ser8-Asp9-aa10-aa11-Z；(SEQ.ID.NO.781)，其中
aa2为Gly、Aib或MePro；
aa6为Phe、2FPhe、MePhe或2FMePhe；
aa10为Tyr、Nal2、Bip、Bip2Et或Bip2EtMeO；
aa11为Lys或Lys(N-ω-X)；
并且烷基为C8-C20线性烷基链。
在一些实施例中，aa11为Lys(N-ω-1'-烷基β-D-葡糖醛酸基)。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-aa2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Glu16-U(X)17-Ala18-Ala19-Lys20-Glu21-Phe22-Ile23-Ala24-Trp25-Leu26-Leu27-aa28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.795)
其中
aa2为Gly或Aib；
aa28为Asn或Gln。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-aa16-Gln17 Ala18-Ala19-aa20-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ω-X)24-Trp25-Leu26-Leu27-aa28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.796)
其中
aa16和aa20各自个别地为Lys或Glu，并且经由其侧链环化以形成内酰胺键联；
并且aa28为Asn或Gln；
X包含葡糖醛酸基类部分，其从1-烷基β-D-葡糖苷、1-烷基β-D-麦芽糖苷、1-烷基β-D-蜜二糖苷或相应α糖苷等等制备，并且其中烷基为C8-C20线性烷基链。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Glu*16-Gln17 Ala18-Ala19-Lys*20-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ω-X)24-Trp25-Leu26-Leu27-Gln28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.797)
其中
aa16和aa20经由其侧链环化以形成内酰胺键联；
并且X包含葡糖醛酸基类部分，其从1-烷基β-D-葡糖苷、1-烷基β-D-麦芽糖苷、1-烷基β-D-蜜二糖苷或相应α糖苷等等制备，并且其中烷基为C8-C20线性烷基链。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Glu*16-Gln17 Ala18-Ala19-Lys*20-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ω(1-十二烷基β-D-葡糖醛酸基))24-Trp25-Leu26-Leu27-Gln28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.601)
其中
Glu*16和Lys*20经由其侧链环化以形成内酰胺键联。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Glu*16-Gln17 Ala18-Ala19-Lys*20-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ω(1-十四烷基β-D-葡糖醛酸基))24-Trp25-Leu26-Leu27-Gln28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.602)
其中
Glu*16和Lys*20经由其侧链环化以形成内酰胺键联。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Glu*16-Gln17 Ala18-Ala19-Lys*20-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ω(1-十六烷基β-D-葡糖醛酸基))24-Trp25-Leu26-Leu27-Gln28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.603)
其中
Glu*16和Lys*20经由其侧链环化以形成内酰胺键联。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Glu*16-Gln17 Ala18-Ala19-Lys*20-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ω(1-十八烷基β-D-葡糖醛酸基))24-Trp25-Leu26-Leu27-Gln28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.604)
其中
Glu*16和Lys*20经由其侧链环化以形成内酰胺键联。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，aa16和aa20经环化以形成内酰胺键联。
在一些实施例中，对于式I-A、III-A或III-B的任何化合物，X包含十二烷基、十四烷基、十六烷基或十八烷基烷基链。
在一些实施例中，肽产物为与GLP1R和/或GLCR结合的生物活性肽产物。
在一个特定实施例中，上文及本文中所述的式I-A、III-A或III-B的肽产物具有以下结构：
其中R1a为如图1的表1中所述的C1-C20烷基链，R'为如图1的表1、图2的表2和图3的表3中所述的肽，式I-A的W2为-O-，并且式I-A的W1为-(C＝O)NH-并为连接到肽R'的酰胺键联的一部分。在一些此类实施例中，R1a为C6-C20烷基链。在一些此类实施例中，R1a为C8-C20烷基链。在一些此类实施例中，R1a为C12-C20烷基链。在一些此类实施例中，R1a为C12-C16烷基链。
在上述实施例中，使用氨基酸和/或肽R'的氨基部分(例如氨基酸残基(如肽R'内的赖氨酸或赖氨酸残基)的氨基)与具有以下结构的化合物形成共价键联：
其中R1a为上文和图1的表1、图2的表2和图3的表3中所述的C1-C20烷基链。
在此类情形下，用于与上述化合物A形成共价键联的具有氨基部分的氨基酸残基(例如肽R'内的赖氨酸)为连接到具有式A的结构的表面活性剂X的连接氨基酸U。因此，作为一个实例，图1的表1、图2的表2或图3的表3的Lys(C12)具有以下结构：
本文提供的实施例的范畴内还涵盖式I-A的肽产物，其经由在任一或两个羧酸官能团处结合而衍生自基于麦芽糖醛酸的表面活性剂。因此，作为一个实例，图1的表1、图2的表2或图3的表3中的肽包含键结到基于麦芽糖醛酸的表面活性剂X并且具有以下结构的赖氨酸连接氨基酸：
应了解，在一个实施例中，式I-A化合物通过以下步骤来制备：将赖氨酸连接到基团X，接着将其它氨基酸残基和/或肽连接到赖氨酸-X化合物以获得式I-A化合物。应了解，本文所述的其它天然或非天然氨基酸也适用于连接到表面活性剂X并且适用于连接其它氨基酸/肽而获得式I-A化合物。应了解，在另一个实施例中，式I-A化合物通过以下步骤制备：将全长或部分长度肽连接到基团X，接着任选地连接其它氨基酸残基和/或肽，获得式I-A化合物。
在一个特定实施例中，本文提供一种化合物，其选自图1的表1、图2的表2或图3的表3的化合物。
本文还提供医药组合物，其包含治疗有效量的上述肽产物或其可接受的盐以及至少一种医药学上可接受的载剂或赋形剂。
在医药组合物的一些实施例中，载剂为基于水的载剂。在医药组合物的一些实施例中，载剂为不基于水的载剂。在医药组合物的一些实施例中，不基于水的载剂为氢氟烷烃样溶剂，其可以包含亚微米无水α-乳糖或其它赋形剂。
本文提供的实施例的范畴内涵盖使包含具有亲核性基团的连接氨基酸U的氨基酸和/或肽与具有离去基或可以经活化而含有离去基的官能团(例如羧酸)或任何其它反应基团的基团X反应，从而使氨基酸和/或肽能够经由连接氨基酸U共价键联到表面活性剂X而提供式I-A的肽产物。
本文提供的实施例的范畴内还涵盖使包含具有离去基或可以经活化而含有离去基的官能团(例如羧酸)或任何其它反应基团的连接氨基酸U的氨基酸和/或肽与包含亲核性基团的基团X反应，从而使氨基酸和/或肽能够经由连接氨基酸U共价键联到表面活性剂X而提供式I-A的肽产物。
应了解，在一个实施例中，式I-A化合物通过以下步骤制备：使连接氨基酸U与X反应，接着向U添加其它残基以获得式I-A的肽产物。应了解，在一个替代实施例中，式I-A化合物通过以下步骤制备：使包含连接氨基酸U的适合肽与X反应，接着向U添加其它残基以获得式I-A的肽产物。
本文进一步提供合成上述肽产物的方法，其包含如下工序步骤：
(a)使肽与中间物(即，式IV化合物)偶合：
其中：
R1a在每次出现时独立地为一键、H、糖、离去基、保护基、天然或非天然氨基酸、经取代或未经取代的C1-C30烷基、经取代或未经取代的烷氧基芳基或经取代或未经取代的芳烷基；
R1b、R1c和R1d在每次出现时各自独立地为一键、H、离去基、保护基、经可逆保护的天然或非天然氨基酸、经取代或未经取代的C1-C30烷基、经取代或未经取代的烷氧基芳基或经取代或未经取代的芳烷基；
W1为-CH2-、-CH2-O-、-(C＝O)、-(C＝O)-O-、-(C＝O)-NH-、-(C＝S)-、-(C＝S)-NH-或-CH2-S-；
W2为-O-、-CH2-或-S-；
R2在每次出现时独立地为一键、H、离去基、保护基、经可逆保护的天然或非天然氨基酸、经取代或未经取代的C1-C30烷基、经取代或未经取代的烷氧基芳基或经取代或未经取代的芳烷基、-NH2、-SH、C2-C4烯烃、C2-C4炔烃、-NH(C＝O)-CH2-Br、-(CH2)m-顺丁烯二酰亚胺或-N3；
n为1、2或3；
m为1-10的整数；
以及
(b)任选地去除步骤(a)的经偶合的肽的保护基。
在所述方法的一些实施例中，各天然或非天然氨基酸在每次出现时独立地为经可逆保护的连接氨基酸。在所述方法的一些实施例中，各天然或非天然氨基酸在每次出现时独立地为经可逆保护的赖氨酸或游离赖氨酸。
在所述方法的一些实施例中，肽为上述式II的肽。
在所述方法的一些实施例中，
n为1；
W1为-(C＝O)-；
R1a为经取代或未经取代的C1-C30烷基、经取代或未经取代的1-烷氧基芳基或经取代或未经取代的1-芳烷基，
R2为经可逆保护的D-或L-构型的赖氨酸。
在所述方法的一些实施例中，
n为1；
W1为-(C＝O)-；
R1a为经取代或未经取代的C8-C30烷基、经取代或未经取代的1-烷氧基芳基或经取代或未经取代的1-芳烷基,
R2为经可逆保护的D-或L-构型的赖氨酸。
在所述方法的一些实施例中，R1a为辛基、癸基、十二烷基、十四烷基或十六烷基。
在上文和本文所述的一些实施例中，R1a为糖。在一些实施例中，糖为半乳糖。在某些实施例中，糖为α连接的半乳糖。在其它实施例中，糖为α连接的半乳吡喃糖、β连接的半乳吡喃糖、α连接的半乳呋喃糖或β连接的半乳呋喃糖。
在所述方法的一些实施例中，
n为1；
W1为-(C＝O)-NH-或-(C＝O)-O-；
R2为经取代或未经取代的C1-C30烷基疏水基团、经取代或未经取代的1-烷氧基芳基或经取代或未经取代的1-芳烷基，
R1a为经可逆保护的D-或L-构型的丝氨酸或苏氨酸。
在所述方法的一些实施例中，R2为辛基、癸基、十二烷基、十四烷基或十六烷基。
在所述方法的一些实施例中，
n为1；
m为1-6；
W1为-CH2-；
R1a为经取代或未经取代的C1-C30烷基疏水基团、经取代或未经取代的1-烷氧基芳基或经取代或未经取代的1-芳烷基，
R2为-N3、NH2、-C2-炔烃、-(CH2)m-顺丁烯二酰亚胺、NH-(C＝O)-CH2-Br或NH-(C＝O)-CH2-I。
在式IV的一些实施例中，
n为1；
W1为-(C＝O)-O-；
R2为H，
R1a为经取代或未经取代的C1-C30烷基疏水基团。
在所述方法的一些实施例中，W1为-(CH2)O。在所述方法的一些实施例中，n为1。在所述方法的一些实施例中，n为2，并且第一糖苷经由第一糖苷的W2与第二糖苷的OR1b、OR1c或OR1d中的任一者之间的键连接到第二糖苷。
在所述方法的一些实施例中，n为3，并且第一糖苷经由第一糖苷的W2与第二糖苷的OR1b、OR1c或OR1d中的任一者之间的键连接到第二糖苷，并且第二糖苷经由第二糖苷的W2与第三糖苷的OR1b、OR1c或OR1d中的任一者之间的键连接到第三糖苷。
在所述方法的一些实施例中，式IV化合物为经可逆保护的D-或L-构型的N-ε-(1'-烷基葡糖醛酸基)-赖氨酸，其中R1a为经取代或未经取代的C1-C20烷基链、经取代或未经取代的1-烷氧基芳基或经取代或未经取代的1-芳烷基。
在所述方法的一些实施例中，式IV化合物为经可逆保护的D-或L-构型的N-ε-(1'-十二烷基β-D-葡糖醛酸基)-赖氨酸。
在所述方法的一些实施例中，去除保护基包含使用弱酸和或弱碱处理。在所述方法的一些实施例中，去除保护基包含使用强酸。
在一些实施例中，方法进一步包含如下步骤：色谱、通过反相高效液相色谱法将中间物去盐或对中间物进行离子交换色谱。
一种医药组合物，其包含治疗有效量的上文和本文中所述的肽产物或其可接受的盐和至少一种医药学上可接受的载剂或赋形剂。
本文提供一种治疗与胰岛素抗性有关的病状的方法，其包含投与有需要的个体本文所述的任何肽产物或化合物。
本文提供治疗如下疾病的方法：糖尿病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性神经病、糖尿病性肾病、创伤愈合、胰岛素抗性、高血糖、高胰岛素血症、代谢综合症、糖尿病并发症、游离脂肪酸或甘油的血液含量提高、高脂质血症、肥胖、高三酸甘油酯血症、动脉粥样硬化、急性心血管综合症、梗塞、局部缺血性再灌注或高血压，其包含投与有需要的个体治疗有效量的上文和本文所述的肽产物。
本文提供降低重量增加或诱导重量减轻的方法，其包含投与有需要的个体治疗有效量的上文和本文所述的肽产物。
本文提供治疗哺乳动物病状的方法，所述病状的特征为肥胖相关的胰岛素抗性或代谢综合症，所述方法包含投与有需要的个体诱导重量减轻或胰岛素敏感量的上文和本文所述的肽产物。
在一些实施例中，待治疗的病状为代谢综合症(综合症X)。在一些实施例中，待治疗的病状为糖尿病。在一些实施例中，待治疗的病状为高脂质血症。在一些实施例中，待治疗的病状为高血压。在一些实施例中，待治疗的病状为血管疾病，包括动脉粥样硬化，或特征为C反应蛋白增多的全身性发炎。
在所述方法的一些实施例中，投与的肽产物的有效量为约0.1微克/千克/天到约100.0微克/千克/天，或0.01微克/千克/天到约1毫克/千克/天或0.1微克/千克/天到约50毫克/千克/天。在一些实施例中，不经肠投与肽产物。在一些实施例中，皮下投与肽产物。在一些实施例中，投与肽产物的方法为经鼻吹入。
然而，应了解，对于需要治疗的任何特定个体，特定剂量和给药频率可以变化并且取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性、所述化合物的代谢稳定性和作用持续时间、年龄、体重、一般健康状况、性别、膳食、投药模式和时间、排泄速率、药物组合、特定病状的严重性以及宿主经历的疗法。
本文提供治疗代谢综合症或其组分疾病的方法，其包含投与有需要的个体治疗有效量的上述肽产物。在一些实施例中，代谢综合症病状发展为糖尿病。
本文还提供经共价修饰的GLCR和/或GLP1R结合肽或其类似物，其包含如本文所述的亲水基团；和共价连接到亲水基团的疏水基团。在特定实施例中，经共价修饰的肽和/或蛋白质产物包含为糖的亲水基团和为C1-C20烷基链或芳烷基链疏水基团。
在一个实施例中，提供一种通过共价键联到表面活性剂来化学修饰分子以提高或维持组合物或分子的生物作用(例如受体结合或酶活性)的方法。在一些实施例中，所述分子为肽。方法另外可以包括另一修饰，其包含将组合物中的分子共价连接到聚合物(如聚乙二醇)。
在另一个实施例中，提供一种降低或去除肽和/或蛋白质药物的免疫原性的方法，其通过将肽链共价连接到至少一个烷基糖苷来进行，其中烷基具有1到30个碳原子。
还提供一种治疗与胰岛素抗性有关的病状的方法，所述病状包括(并且不限于)肥胖、代谢综合症、2型糖尿病、高血压、动脉粥样硬化等等，所述方法包含投与包含共价连接到至少一个烷基糖苷的肽的药物组合物并向脊椎动物传递，其中烷基具有1到30个碳原子、1到20个碳或另外在6到16个碳原子或6到18个碳范围内，并且其中烷基糖苷与肽的共价键联提高了药物的稳定性、生物可用性和/或作用持续时间。
本文进一步提供本文所述的肽产物(例如式I-A、式III-A或式III-B的肽产物)用于制造供治疗上文和本文所述的任何病状的药物的用途。
附图说明
图1：图1的表1描绘通过本文所述的方法制备的化合物。本说明书提供SEQ.ID.No.1-3和SEQ.ID.No.774-783和785-797的序列。另外，图1的表1提供化合物EU-A300到EU-A425的SEQ.ID编号，其分别具有如图1的表1中所示的SEQ.ID.NO.4-129。图1的表1中的化合物和图1的表1中所示的其相应SEQ.ID.NO特此并入到所申请的说明书中。
图2：图2的表2描绘通过本文所述的方法制备的化合物。本说明书提供SEQ.ID.No.1-3和SEQ.ID.No.774-797。另外，图2的表2提供化合物EU-A426到EU-599的SEQ.ID编号，其分别具有如图2的表2中所示的SEQ.ID.NO.130-317。图2的表2中的化合物和图2的表2中所示的其相应SEQ.ID.NO特此并入到所申请的说明书中。
图3：图3的表3描绘通过本文所述的方法制备的化合物。本说明书提供SEQ.ID.No.1-3和SEQ.ID.No.774-797。另外，图3的表3提供化合物EU-A700到EU-A1174的SEQ.ID编号，其分别具有如图3的表3中所示的SEQ.ID.NO.318-773；798-806。图3的表3中的化合物和图3的表3中所示的其相应SEQ.ID.NO特此并入到所申请的说明书中。
图4：图4说明GLP-1受体的胞外域的结合位点的X射线晶体结构(朗格,S.等人，(2008)，生物化学杂志，283：11340-7(Runge,S.,et al.(2008)J Biol Chem 283:11340-7))，并且说明受体和配体肠促胰岛素类似物-4的关键疏水性结合成分(Val19*、Phe22*、Trp25*、Leu26*)，所述成分为模拟的，并且在本发明的肽上经表面活性剂的疏水性1'-烷基部分置换。在此情形下，星号意指残基处于配体中。
图5：图5说明在时间t＝0、7小时皮下投与所列量的本发明测试化合物(EU-A993和EU-A1023)后db/db小鼠中的活体内血糖反应。
图6：图6说明一些本发明化合物的详细结构和其经由Lys残基的ε氨基官能团(在此情形下在24位)与根据本发明的一种方法修饰的单糖和二糖表面活性剂的实例的键联的实例。
图7：图7说明EU-A992的结构，EU-A992为本发明的结构类型的一个实例。
具体实施方式
本文描述具有改良的医药特性的某些经共价修饰的肽和/或蛋白质。本文还提供使用经共价修饰的肽和/或蛋白质治疗与肥胖和代谢综合症相关的病症的方法。
在一些实施例中，经修饰的肽和/或蛋白质包含共价连接到亲水基团-“头部”(例如多元醇(例如糖))的肽和/或蛋白质；所述亲水基团共价连接到疏水基团-“尾部”，从而产生表面活性剂。在一些实施例中，使用疏水性连接的糖苷表面活性剂(例如烷基糖苷)部分共价修饰肽或蛋白质(例如升糖素或GLP-1相关的肽等等)因多个机制延长肽和/或蛋白质的作用持续时间，所述机制包括在身体的投药位点形成药物储槽和与疏水性载剂蛋白的结合。在一些实施例中，在肽和/或蛋白质结构中并入位阻可以阻止蛋白酶接近肽和/或蛋白质产物，从而防止蛋白分解。在一些实施例中，如本文所述的肽和/或蛋白质的表面活性剂修饰(例如与烷基糖苷类表面活性剂的共价连接)使跨越粘膜障壁的转运增加。因此，本文所述的肽和/或蛋白质的修饰提供如下所要益处，其包括(并且不限于)防止蛋白分解和减缓从投药位点的移动，从而得到延长的药物动力学行为(例如循环t1/2延长)和改良的经粘膜生物可用性。
在一些实施例中，通过截短序列、引入限制位点和/或并入位阻以有益方式改良经改良的肽和/或蛋白质与其受体的相互作用。本文描述新的烷基糖苷试剂，其使得可在经修饰的肽和/或蛋白质中并入刚性与位阻。在一些实施例中，位阻赋予本文所述的经修饰的肽和/或蛋白质受体选择性。在一些实施例中，位阻可防止蛋白分解。
蛋白质和肽经历可能影响效能和安全性的多种物理和化学变化。尤其凝集，其包括二聚、三聚和形成更高级凝集物(如淀粉样蛋白)。凝集是存在于多个对基于肽和/或蛋白质的疗法的潜在有害影响下的关键问题，所述有害影响包括丧失功效，改变药物动力学，降低稳定性或缩短产物存放期，以及诱发不当免疫原性。自缔合肽的生物可用性和药物动力学可能受凝集物尺寸和在皮下位点破坏非共价分子间相互作用的简易性影响(马基,S.K.等人，(2008)，公共科学图书馆生物学，6:e17(Maji,S.K.,et al.(2008)PLoS Biol 6:e17))。在一些情况下，肽可能在皮下储槽中凝集，其以30天或30天以上的t1/2解离。此类减缓溶解可以引起如下有利作用，如从单次皮下注射传递一个月产生如此低的血液浓度以使得肽在活体内呈现出无活性。因此，在一些情况下，疏水性凝集消除了肽的生物可用性和有效性(克劳德菲特,D.K.等人，(1998)，药物研究，15：254-262(Clodfelter,D.K.,et al.(1998)Pharm Res 15:254-262))。本文所述的经修饰的肽产物连接到表面活性剂并且任选地经设计以使得可视需要干扰凝集或增强凝集。
通常共价连接到蛋白质的天然存在的寡糖不具有表面活性剂特征。在一些实施例中，本文所述的肽和/或蛋白质产物具有共价连接的糖和另一疏水基团，从而赋予经修饰的肽表面活性剂特征而使得可调节经表面活性剂修饰的肽的生物可用性、免疫原性和/或药物动力学行为。
经寡糖修饰的蛋白质和肽在例如(延森,K.J.和布莱西科,J.(2005)，生物聚合物，80：747-761(Jensen,K.J.and Brask,J.(2005)Biopolymers 80:747-761))中描述，其经由使用酶学(吉森,H.J.等人，(1996)，化学评论，96：443-474(Gijsen,H.J.,et al.(1996)Chem Rev96:443-474)；西尔斯,P.和王,C.H.(1998)，细胞分子生命科学，54：223-252(Sears,P.and Wong,C.H.(1998)Cell Mol Life Sci 54:223-252)；郭,Z.和邵,N.(2005)，医学研究评论，25：655-678(Guo,Z.and Shao,N.(2005)Med Res Rev 25:655-678))或化学方法(厄基,L.等人，(1992)，生物化学与生物物理学研究通讯，184：1125-1132(Urge,L.,etal.(1992)Biochem Biophys Res Commun 184:1125-1132)；塞尔瓦多,L.A.等人，(1995)，四面体，51：5643-5656(Salvador,L.A.,et al.(1995)Tetrahedron 51:5643-5656)；吉伯格,J.等人，(1997)，酶学方法，289：221-245(Kihlberg,J.,et al.(1997)Methods Enzymol289:221-245)；格雷格狄斯,G.等人，(2000)，细胞分子生命科学，57：1964-1969(Gregoriadis,G.,et al.(2000)Cell Mol Life Sci 57:1964-1969)；查克拉波提,T.K.等人，(2005)，糖结合杂志，22：83-93(Chakraborty,T.K.,et al.(2005)Glycoconj J 22:83-93)；刘,M.等人，(2005)，碳水化合物研究，340：2111-2122(Liu,M.,et al.(2005)Carbohydr Res 340:2111-2122)；佩恩,R.J.等人，(2007)，美国化学会志，129：13527-13536(Payne,R.J.,et al.(2007)J Am Chem Soc 129:13527-13536)；佩德森,S.L.等人，(2010)，化学生物化学，11：366-374(Pedersen,S.L.,et al.(2010)Chembiochem 11:366-374))并入糖或寡糖结构获得。肽以及蛋白质通过糖基化修饰(费莉娜,F.等人，(2003)，有机和生物分子化学，1：3059-3063(Filira,F.,et al.(2003)Org Biomol Chem 1:3059-3063)；内格里,L.等人，(1999)，药物化学杂志，42:400-404(Negri,L.,et al.(1999)J MedChem 42:400-404)；内格里,L.等人，(1998)，英国药理学杂志，124：1516-1522(Negri,L.,et al.(1998)Br J Pharmacol 124:1516-1522)；罗奇,R.等人，(1987)，国际肽和蛋白质研究杂志，29：250-261(Rocchi,R.,et al.(1987)Int J Pept Protein Res 29:250-261)；费莉娜,F.等人，(1990)，国际生物大分子杂志，12：41-49(Filira,F.,et al.(1990)Int JBiol Macromol 12:41-49)；戈博,M.等人，(1992)，国际肽和蛋白质研究杂志，40:54-61(Gobbo,M.,et al.(1992)Int J Pept Protein Res 40:54-61)；厄基,L.等人，(1992)，生物化学与生物物理学研究通讯，184：1125-1132(Urge,L.,et al.(1992)Biochem BiophysRes Commun 184:1125-1132)；第杰利-费拉德,F.等人，(1993)，四面体通讯，34：2457-2460(Djedaini-Pilard,F.,et al.(1993)Tetrahedron Lett 34:2457-2460)；卓利拉,B.等人，(1997)，生物有机化学与医药化学通讯，7：2247-2250(Drouillat,B.,et al.(1997)BioorgMed Chem Lett 7:2247-2250)；罗霍夫,E.,等人，(2000)，应用化学国际英文版，39：2761-2764(Lohof,E.,et al.(2000)Angew Chem Int Ed Engl 39:2761-2764)；格鲁纳,S.A.等人，(2001)，有机化学通讯，3：3723-3725(Gruner,S.A.,et al.(2001)Org Lett 3:3723-3725)；彼因,C.等人，(2001)，生物化学与生物物理学学报，1541：150-160(Pean,C.,et al.(2001)Biochim Biophys Acta 1541:150-160)；费莉娜,F.等人，(2003)，有机和生物分子化学，1：3059-3063(Filira,F.,et al.(2003)Org Biomol Chem 1:3059-3063)；古腾堡,G.M.等人，(2004)，有机化学杂志，69：7851-7859(Grotenbreg,G.M.,et al.(2004)J OrgChem 69:7851-7859)；比昂迪,L.等人，(2007)，肽科学杂志，13：179-189(Biondi,L.,etal.(2007)J Pept Sci 13:179-189)；科达,Y.等人，(2008)，生物有机化学与医药化学，16：6286-6296(Koda,Y.,et al.(2008)Bioorg Med Chem 16:6286-6296)；山本,T.等人，(2009)，药物化学杂志，52：5164-5175(Yamamoto,T.,et al.(2009)J Med Chem 52:5164-5175))。
然而，上述尝试未描述连接到肽连接的寡糖的其它疏水基团。因此，本文提供并入连接到糖和/或寡糖的疏水基团的经修饰的肽和/或蛋白质，所述糖和/或寡糖共价连接到肽和/或蛋白质并且使得可调节生物可用性、免疫原性和药物动力学行为。因此，本文还提供包含寡糖和疏水基团的表面活性剂，其使得可共价修饰肽和/或蛋白质，如升糖素和/或GLP-1和/或其类似物。
本文提供基于糖的表面活性剂的用途，其用于共价键联到肽以改良肽和/或蛋白质特性。在一些实施例中，如本文所述的肽和/或蛋白质的表面活性剂修饰(例如与烷基糖苷类表面活性剂的共价连接)使跨越粘膜障壁的转运增加。在一些实施例中，表面活性剂与肽和/或蛋白质产物的共价连接降低或阻止了肽和/或蛋白质的凝集。在一些实施例中，经共价修饰的肽和/或蛋白质为经共价修饰的升糖素或GLP-1肽或其类似物，其通过用烷基糖苷表面活性剂部分共价修饰来修饰以改良其医药和医学特性。这些经表面活性剂修饰的类似物具有增加的位阻，其阻止蛋白分解，减缓吸收并减缓从身体清除。
在某些情况下，表面活性剂对医药配制物的物理特性或性能的作用是有益的，但对皮肤和/或其它组织刺激，并且尤其对粘膜刺激，如鼻、口、眼、阴道、直肠、颊或舌下区域中存在的粘膜。另外，在一些情况下，表面活性剂使蛋白质变性，从而破坏其生物功能。因为表面活性剂在高于临界微胞浓度(CMC)下发挥其作用，所以需要具有低CMC的表面活性剂以使得其可以以低浓度或少量有效地用于医药配制物中。因此，在一些实施例中，在纯水或水溶液中，适用于本文所述的肽修饰的表面活性剂(例如烷基糖苷)的CMC小于约1mM。仅作为实例，烷基糖苷在水中的某些CMC值为：辛基麦芽糖苷19.5mM；癸基麦芽糖苷1.8mM；十二烷基-β-D-麦芽糖苷0.17mM；十三烷基麦芽糖苷0.03mM；十四烷基麦芽糖苷0.01mM；蔗糖十二烷酸酯0.3mM。应了解，适合表面活性剂可以视经修饰的肽和/或蛋白质而定具有较高或较低CMC。如本文所使用，“临界微胞浓度”或“CMC”为溶液中两性组分(烷基糖苷)的如下浓度，在所述浓度下溶液中开始形成微胞(球形微胞、圆棒、层状结构等)。在某些实施例中，烷基糖苷-十二烷基、十三烷基和十四烷基麦芽糖苷或葡糖苷以及蔗糖十二烷酸酯、十三烷酸酯和十四烷酸酯具有较低CMC并且适用于本文所述的肽和/或蛋白质修饰。
胰岛素抗性
与长期高血糖有关的风险包括微血管并发症、感觉神经病、心肌梗塞、中风、大血管死亡和所有原因的死亡的风险增加。2型糖尿病还与肥胖有因果关系，肥胖为另一个全球性流行病。2007年，全世界至少$2320亿花费在治疗和预防糖尿病上，其中所述量的四分之三花费在工业化国家中用于治疗长期并发症和一般护理，如致力于预防微血管和大血管并发症。在2007年，美国经济的糖尿病估计间接成本(由于糖尿病所致的残疾、生产力丧失和过早死亡)为$580亿。
肥胖引起胰岛素抗性，其为体内细胞由于胰岛素受体数量减少并且这些受体与关键胞内信号传导系统的偶合减少而对胰岛素刺激的反应能力降低。肥胖病态进一步引起“代谢综合症”，其为具有极大医疗后果的疾病的群集(胰岛素抗性、高血压、动脉粥样硬化等)。如果胰岛素抗性诊断得足够早，那么可以预防或延迟显性2型糖尿病，其中生活方式干预针对降低卡路里(calorie)摄入和身体肥胖并且经由药物治疗来标准化葡萄糖控制。即使治疗准则推荐早期主动干预，但很多患者不能达到葡萄糖控制的目标。多种因素造成未能成功地控制2型糖尿病，包括社会心理和经济影响以及可用抗糖尿病药物的功效、便利性和耐受性特征方面的缺点。本文所述的肽和/或蛋白质产物经设计以克服这些缺点。
肠促胰岛素作用
“肠促胰岛素作用”用于描述如下现象，其中经口传递的葡萄糖负载相较于静脉内投与的相同葡萄糖负载产生大得多的胰岛素分泌。此作用由至少两种由肠L-细胞分泌的肠促胰岛素激素介导。葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)和升糖素样肽1(GLP-1)鉴别为肠促胰岛素，并且认为健康个体可以由肠促胰岛素作用产生其膳食胰岛素分泌反应的高达70％。
通常，肠促胰岛素肽视需要响应于摄取的营养物分泌，并且因为由二肽基肽酶IV(DPP-4)酶降解而具有短血浆半衰期。在患有2型糖尿病的人中，对GLP-1的胰腺反应削弱，但胰岛素分泌反应可以用药理学剂量的人类GLP-1恢复(基弗,T.J.等人，(1995)，内分泌学，136：3585-3596(Kieffer,T.J.,et al.(1995)Endocrinology 136:3585-3596))。此外，GLP-1促进β-细胞新生和保持(艾伯,K.等人，(2008)，糖尿病、肥胖和代谢，10：994-1003(Aaboe,K.,et al.(2008)Diabetes Obes Metab 10:994-1003))。GLP-1如对心肌功能具有其它有益作用(特雷曼,M.等人，(2010)，心血管药物趋势，20：8-12(Treiman,M.,et al.(2010)Trends Cardiovasc Med 20:8-12))：例如其改良人类个体的左心室功能(索克斯,G.G.等人，(2006)，心脏衰竭杂志，12：694-699(Sokos,G.G.,et al.(2006)J Card Fail12:694-699))。GLP-1还减缓人类的胃排空并降低食欲(托夫特-尼耳森,M.B.等人，(1999)，糖尿病护理，22：1137-1143(Toft-Nielsen,M.B.等人，(1999)Diabetes Care 22:1137-1143))。
用代谢稳定并且长效的GLP-1类似物治疗糖尿病患者在例如(德拉布,S.R.(2010)，药物疗法，30：609-624(Drab,S.R.(2010)Pharmacotherapy 30:609-624))中描述，遭遇与使用便利性和副作用(如恶心、胰脏炎和甲状腺癌的风险)相关的问题。GLP-1类似物提供胰岛素分泌的葡萄糖依赖性刺激并且使低血糖的风险降低。此外，尽管多种当前糖尿病疗法引起重量增加，但如下文所描述，GLP-1类似物诱导饱腹感和温和重量减轻。因此，在一些实施例中，本文提供如下GLP-1类似物，其为长效的并且以低剂量投与从而降低与当前疗法有关的副作用。
已知多种肽肠激素调节食欲(桑格,G.J.和李,K.(2008)，自然评论药物发现，7：241-254(Sanger,G.J.and Lee,K.(2008)Nat Rev Drug Discov 7:241-254))。若干肽来源于如下前原升糖素基因产物的组织特异性酶学加工(前激素转化酶；PC)：例如升糖素、GLP-1、升糖素样肽-2(GLP-2)、肠高血糖素以及胃泌酸调节素(OXM)(杜拉克,D.J.(2005)，自然临床实践内分泌学与代谢，1：22-31(Drucker,D.J.(2005)Nat Clin Pract EndocrinolMetab1:22-31)；辛克莱,E.M.和杜拉克,D.J.(2005)，生理学(贝塞斯达)，20：357-365(Sinclair,E.M.and Drucker,D.J.(2005)Physiology(Bethesda)20:357-365))。GLP-1、GLP-2、肠高血糖素和OXM由肠中的L-细胞响应于摄食而共分泌。或者前原升糖素经加工(PC2)以在胰腺的胰岛中的α细胞中产生升糖素。OXM的结构基本上为C端延长8个残基的升糖素。
除刺激胰岛素生物合成和葡萄糖依赖性胰岛素分泌以外，GLP-1和其稳定模拟物(例如肠促胰岛素类似物-4，利拉鲁肽(liraglutide))还引起动物模型(马克,C.M.等人，(2006)，国际肥胖杂志(伦敦)，30：1332-1340(Mack,C.M.,et al.(2006)Int J Obes(Lond)30:1332-1340)；克努森,L.B.(2010)，国际临床实践杂志，64(增刊167):4-11(Knudsen,L.B.(2010)Int J Clin Pract 64(Suppl.167):4-11))和2型糖尿病患者(德弗罗佐,R.A.等人，(2005)，糖尿病护理，28:1092-1100(DeFronzo,R.A.,et al.(2005)Diabetes Care28:1092-1100)；布斯,J.B.等人，(2010)，糖尿病护理，33:1255-1261(Buse,J.B.,et al.(2010)Diabetes Care33:1255-1261))的适度重量减轻。升糖素输注减少人的食品摄入(吉尔里,N.等人,(1992)，美国生理学杂志，262：R975-980(Geary,N.,et al.(1992)Am JPhysiol 262:R975-980))，而连续升糖素治疗脂肪组织还促进脂肪分解(海克米亚,C.M.等人，(1983)，内分泌学，113：270-276(Heckemeyer,C.M.,et al.(1983)Endocrinology 113:270-276))和重量减轻(萨尔特,J.M.等人，(1960)，代谢，9：753-768(Salter,J.M.,et al.(1960)Metabolism 9:753-768)；陈,E.K.等人，(1984)，实验和分子病理学，40：320-327(Chan,E.K.,et al.(1984)Exp Mol Pathol 40:320-327))。升糖素对能量代谢具有多种影响(埃普内,K.M.等人，(2010)，生理与行为，(Heppner,K.M.,et al.(2010)PhysiolBehav))。升糖素或类似物可以诊断模式用于暂时麻痹肠道。因此，至少两种来自前原升糖素蛋白的PC加工的产物与饱腹感和代谢作用有关。
在啮齿动物中，重复地腹膜内投与OXM(前原升糖素的第三产物)与相较于对照白色脂肪组织减少和重量减轻有关(戴金,C.L.等人，(2004)，内分泌学，145：2687-2695(Dakin,C.L.,et al.(2004)Endocrinology 145:2687-2695))。在静脉内输注投与正常重量人类期间，Oxm使食品摄入减少19.3％，并且此作用在输注后继续超过12小时(柯亨,M.A.等人，(2003)，临床内分泌学与代谢杂志，88：4696-4701(Cohen,M.A.,et al.(2003)J ClinEndocrinol Metab 88:4696-4701))。志愿者经4周治疗引起持续的饱腹感作用和重量减轻，从而反映出身体脂肪减少(韦恩,K.等人，(2005)，糖尿病，54:2390-2395(Wynne,K.,etal.(2005)Diabetes 54:2390-2395))。
OXM与GLP-1和升糖素在结构上同源，并且活化升糖素受体(GCGR)与GLP-1受体(GLP1R)，但与齐名配体相比效能低10到100倍。此外，OXM与GLP1R的相互作用的研究表明，与GLP-1比较，其可能对β-抑制蛋白具有不同作用(乔根森,R.等人，(2007)，药理学与实验治疗学杂志，322：148-154(Jorgensen,R.,et al.(2007)J Pharmacol Exp Ther322:148-154))，因此充当“偏置”配体。OXM的独特受体已寻求多年，但尚未阐明，并且假定其经由GLP1R和GCGR路径起作用。因此，本文提供对肠肽进行表面活性剂修饰的方法，所述肠肽可诱导饱腹感、重量减轻、缓解胰岛素抗性和/或延迟前期糖尿病向糖尿病的进展。
GLP-1
鉴于前原升糖素蛋白的产物对上述饱腹感和代谢的复杂和相互作用行为，来自多个组的研究人员关于GLP-1和升糖素结构研究了结构活性关系。整个序列中的残基展示为接受置换。举例来说，GLP-1的N端区域，尤其在2、3、5、8、11和12处完全接受经Ala置换(艾德豪斯,K.等人，(1994)，生物化学杂志，269：6275-6278(Adelhorst,K.,et al.(1994)J BiolChem 269:6275-6278))。
已展示具有结合到GLP1R和GLCR的能力的嵌合类似物可以通过将来自GLP-1的C端残基接枝到升糖素的N端上获得(约尔特,S.A.等人，(1994)，生物化学杂志，269：30121-30124(Hjorth,S.A.,et al.(1994)J Biol Chem 269:30121-30124))。3位的残基(GLP1中的酸性Glu或升糖素或OXM中的中性Gln)降低了升糖素(朗格,S.等人，(2003)，生物化学杂志，278：28005-28010(Runge,S.,et al.(2003)J Biol Chem 278:28005-28010))或OXM(博开,A.等人(2009)，糖尿病，58：2258-2266(Pocai,A.,et al.(2009)Diabetes 58:2258-2266))对GlP1R的亲和力。研究了对用3位具有Gln的GLP-1或升糖素或OXM的稳定类似物处理的动物的代谢特征的影响(戴,J.W.等人，(2009)，自然化学生物学，5：749-757(Day,J.W.,et al.(2009)Nat Chem Biol 5:749-757)；德鲁斯,M.R.等人，(2009)，内分泌学，150：1712-1722(Druce,M.R.,et al.(2009)Endocrinology 150:1712-1722)；博开,A.等人，(2009)，糖尿病，58：2258-2266(Pocai,A.,et al.(2009)Diabetes 58:2258-2266))。这些类似物经设计以对GLP1R与GCGR具有促效作用(戴,J.W.等人，US 2010/0190701 A1(Day,J.W.,et al.US 2010/0190701 A1)；帕特森,J.T.等人，(2011)，肽科学杂志，17：659-666(Patterson,J.T.,et al.(2011)J Pept Sci 17:659-666)；瑞贝尔,D.，美国专利申请2012/0178670(Ribier,D.,US Patent Application 2012/0178670))。
嵌合类似物应具有母激素作用于其受体的所要作用，因此类似于明显作用于GLP-1R与GLCR的OXM的作用：葡萄糖依赖性胰岛素分泌和饱腹感，其与由于升糖素而产生的脂肪分解和脂肪燃烧增加偶合。类似物展示为引起降低重量和增加脂肪燃烧的所要作用。此类特征在治疗肥胖中具有有吸引力，但肥胖治疗中的主要挑战是顺应性。尽管当前已知的对GLP-1R与GLCR具有亲和力的升糖素和OXM的全长类似物可以相应地引起重量减轻，但这些类似物未针对高生物可用性、医药特性和传递到患者的便利性进行优化，所述特性对于理想药物治疗方案为必需的。因此，本文提供肠肽的类似物(例如GLP、OXM、升糖素等等)，其允许高生物可用性和/或长效作用而在治疗病状(如肥胖和/或糖尿病和/或代谢综合症)中获得改良的治疗结果。
用OXM样分子进行的代谢综合症和糖尿病的经优化的治疗的其它因素是指治疗持续时间和升糖素作用量。举例来说，用活化GLP-1和升糖素受体(OXM药理学特征)的类似物连续治疗可以引起脂肪质量的极大和快速损失(戴,J.W.等人，(2009)，自然化学生物学，5：749-757(Day,J.W.,et al.(2009)Nat Chem Biol 5:749-757))，但是其还可以引起瘦肌肉质量的损失(科金斯基,J.R.等人，(2012)，肥胖(银泉)：doi：10.1038/oby.2012.67(Kosinski,J.R.,et al.(2012)Obesity(Silver Spring):doi:10.1038/oby.2012.67))，其对于此类别中的药物是不利的。举例来说，在科金斯基,J.R.等人的研究论文中，连续从艾扎特微泵(Alzet minipump)投与天然激素Oxm 14天并使脂肪质量降低30％，但也使瘦质量(肌肉)降低7％。
已知升糖素作用为刺激肝糖分解、脂肪分解和增加脂肪燃烧，但是其还可以对肌肉具有分解作用。使用组合GLP-1与升糖素作用(OXM特征)的药剂成功治疗需要最优地引起饱腹感和GLP-1类似物的增强的葡萄糖依赖性胰岛素分泌以及适量升糖素作用(脂肪燃烧)。此外，间歇性使用此类药剂将经由损失脂肪质量并使瘦质量损失达最小来提供适度、连续重量减轻的所要临床特征。本文提供如下分子，其具有GLP-1与OXM作用的所要组合以及可调节的药物动力学/药效特征以使得可最优地用于疗法(例如代谢综合症、糖尿病、肥胖等等)中。
在一个实施例中，式I-A、III-A和III-B的化合物经设计以提供升糖素样活性或GLP-1样活性。在另一个实施例中，式I-A、III-A和III-B的化合物提供可调节的活性。举例来说，在一个实例中，本文所述的肽产物(图1的表1中、图2的表2中和图3的表3中的化合物)对升糖素与GLP-1的受体的EC50小于约500nM，优选小于约50nM，更优选小于约20nM。在另一情况下，本文所述的肽产物(例如图1的表1中、图2的表2中和图3的表3中的化合物)对GLP-1受体较有效(例如EC50小于10nM，优选小于5nM，更优选为约1nM)，并且对升糖素受体不太有效(例如EC50小于50nM，优选小于约20nM，更优选为约5nM)。生物活性的这种可调节性使得在某种程度上保持适量升糖素作用，从而使得可发生脂肪燃烧，同时还保持增强的葡萄糖依赖性胰岛素分泌的有益作用。OXM与GLP-1和升糖素在结构上同源，并活化升糖素受体(GCGR)与GLP-1受体(GLP1R)。因此，在一些实施例中，式I-A、III-A和III-B的化合物提供可调节的OXM样生物活性。在一些特定实施例中，本文所述的肽产物包含如下肽，其具有GLP-1和/或其类似物的氨基酸残基1-17(例如包含如本文所述的经修饰的非天然氨基酸置换、如本文所述的环内酰胺键联、如本文所述的表面活性剂修饰或其组合的类似物)。在一些其它实施例中，本文所述的肽产物包含如下肽，其具有GLP-1和/或其类似物的氨基酸残基1-16(例如包含如本文所述的经修饰的非天然氨基酸置换、如本文所述的环内酰胺键联、如本文所述的表面活性剂修饰或其组合的类似物)。在其它实施例中，本文所述的肽产物包含如下肽，其具有GLP-1和/或其类似物的氨基酸残基1-18(例如包含如本文所述的经修饰的非天然氨基酸置换、如本文所述的环内酰胺键联、如本文所述的表面活性剂修饰或其组合的类似物)。另外，本文所述的肽产物包含一或多个残基(例如Aib、Ac4c)，其使式I-A、III-A和III-B的设计化合物和图1的表1中、图2的表2中和图3的表3中的化合物的螺旋稳定。
相信配体的升糖素亚家族以两个域的模式结合到其受体，所述两个域的模式与多种B类受体(肠泌素类、G蛋白偶合受体(GPCR))共用。对于GLP-1，认为存在残基1到约残基16的N端区域，其结合到跨膜螺旋的顶部(近膜区)，和17到31的螺旋C端区域，其结合到受体的大量胞外N端延长部分(ECD)。这些配体的结合集中在如下事实：这些肽配体的N端截短类似物仍可以基本上保留仅对受体的经分离的ECD区域的结合亲和力和选择性。因此，已表明N端区域负责受体活化，而C端区域负责结合。最近已展示GLP-1的短N端类似物可以为有效结合物以及受体活化剂(玛普丽,C.(Mapelli,C.)等人，(2009)，药物化学杂志(J Med Chem)，52：7788-7799；哈克,T.S.(Haque,T.S.)等人，(2010)，肽(Peptides)，31：950-955；哈克,T.S.等人(2010)，肽，31：1353-1360)。
此外，对GLP1R以及GLP-1模拟物肠促胰岛素类似物-4(百泌达(Byetta))的截短拮抗剂类似物的N端区域的x射线晶体结构(朗格,S.等人，(2008)，生物化学杂志，283:11340-7(Runge,S.,et al.(2008)J Biol Chem 283:11340-7))的研究展示ECD中的关键配体结合区具有高疏水性(图3)。肠促胰岛素类似物-4超出Glu15的序列与此极具疏水性的区域(Val19*、Phe22*、Trp25*、Leu26*)以两性螺旋形式相互作用，其中在此情形下星号表示其为配体中的残基。在一个实施例中，GLP-1或升糖素的截短N端片段经修饰以结合到GLCR并共价连接到表面活性剂。表面活性剂的疏水性1'-烷基部分模拟并置换天然激素配体的C端区域，并且提高了肽效能、功效和作用持续时间。此外，此类类似物由于其较小的尺寸而具有很大优点，较小的尺寸降低其复杂性、合成成本和对蛋白分解的易感性。另外，较小的肽更容易经由鼻粘膜或肠上皮细胞障壁吸收。
低血糖是一种血糖低的病状，其可能危及生命，并且越来越被视为通过较多患者中使用的集中胰岛素治疗造成的高血糖的较具侵袭性的治疗。低血糖在血糖含量降到过低而不能向脑和肌肉提供足够能量来进行身体活动时见到。升糖素可以用来治疗此病状，并通过刺激肝脏分解糖原而产生葡萄糖并使血糖含量朝向正常值上升来完成。保留活化GLCR的能力的升糖素的类似物可以用来实现对血糖含量的这种所要作用。
活化GLP1R的GLP-1的类似物刺激从胰腺产生胰岛素，并且，在高血糖含量存在下从胰腺释放胰岛素。此作用使得可有效控制并标准化血糖含量，如用当前产品(如艾塞那肽(exenatide))可以见到。此外，此类产品似乎产生降低的食欲并减缓食品从胃移动。因此，其经由多种机制治疗糖尿病。组合升糖素与GLP-1的作用并活化GLCR与GLP1R的类似物可以在治疗糖尿病中经由协调的作用提供益处而抑制食欲，以葡萄糖依赖性方式释放胰岛素，辅助避免低血糖并促进脂肪燃烧。/>
此类治疗高血糖(包括糖尿病、I型糖尿病、II型糖尿病或妊娠期糖尿病，其为胰岛素依赖型或非胰岛素依赖型)的方法预期适用于降低糖尿病的并发症，包括肾病、视网膜病和血管疾病。心血管疾病中的应用涵盖微血管以及大血管疾病(戴维森,M.H.(2011)，美国心脏病杂志，108[增刊]：33B-41B(Davidson,M.H.,(2011)Am J Cardiol108[suppl]:33B-41B)；格杰,M.等人，(2012)，临床内分泌学与代谢杂志，97：doi：10.1210/jc.2011-3456(Gejl,M.,et al.(2012)J Clin Endocrinol Metab 97:doi:10.1210/jc.2011-3456))并包括治疗心肌梗塞。此类降低食欲或促进体重损失的方法预期适用于降低体重，阻止重量增加或治疗各种原因的肥胖，包括药物诱发性肥胖，以及减少与肥胖有关的并发症，包括血管疾病(冠状动脉疾病、中风、周边血管疾病、局部缺血再灌注等)、高血压、II型糖尿病发作、高脂质血症和肌肉骨胳疾病。
如本文所使用，术语升糖素或GLP-1类似物包括其所有医药学上可接受的盐或酯。
肽和其类似物
一方面，经共价修饰并适用于本文所述的方法的肽为升糖素和/或相关激素GLP-1的截短类似物，其包括(并且不限于)：
升糖素：
His1-Ser2-Gln3-Gly4-Thr5 Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Ser16-Arg17-Arg18-Ala19-Gln20-Asp21-Phe22-Val23-Gln24-Trp25-Leu26-Met27-Asn28-Thr29(SEQ.ID.NO.782)
胃泌酸调节素：
His1-Ser2-Gln3-Gly4-Thr5 Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Ser16-Arg17-Arg18-Ala19-Gln20-Asp21-Phe22-Val23-Gln24-Trp25-Leu26-Met27-Asn28-Thr29-Lys30-Arg31-Asn32-Arg33-Asn34-Asn35-Ile36-Ala37(SEQ.ID.NO.783)
GLP-1(使用升糖素编号)：
His1-Ala2-Glu3-Gly4-Thr5 Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Val10-Ser11-Ser12-Tyr13-Leu14-Glu15-Gly16-Gln17-Ala18-Ala19-Lys20-Glu21-Phe22-Ile23-Ala24-Trp25-Leu26-Val27-Lys28-Gly29-Arg30(SEQ.ID.NO.1)
在一些实施例中，本文所述的肽产物具有如下结构：
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-aa16-aa17-aa18-aa19-aa20-aa21-aa22-aa23-aa24-aa25-aa26-aa27-aa28-aa29-aa30-aa31-aa32-aa33-aa34-aa35-aa36-aa37-Z式II
(SEQ.ID.NO.1)
其中：
Z为OH、N-R4-His或-NH-R3、其中R3为H、C1-C12经取代或未经取代的烷基或小于10Da的PEG链；并且R4为C2-C10酰基，例如Ac或Bz；
aa1为His、N-R4-His、pGlu-His或N-R3-His；
aa2为Ser、D-Ser、Ala、Gly、Pro、MePro、Aib、Ac4c或Ac5c；
aa3为Gln或Cit；
aa4为Gly或D-Ala；
aa5为Thr或Ser；
aa6为Phe、Trp、2FPhe、MePhe、2FMePhe或Nal2；
aa7为Thr或Ser；
aa8为Ser或Asp；
aa9为Asp或Glu；
aa10为Tyr、Leu、Met、Nal2、Bip、Bip2EtMeO或U；
aa11为不存在或Ser、Asn、Bip或U；
aa12为不存在或Lys、Glu、Ser、Arg或U；
aa13为不存在或Tyr、Gln、Cit或U；
aa14为不存在或Leu、Met、Nle或U；
aa15为不存在或Asp、Glu或U；
aa16为不存在或Ser、Gly、Glu、Ala、Aib、Ac5c、Lys、Arg或U；
aa17为不存在或Arg、hArg、Gln、Glu、Cit、Aib、Ac4c、Ac5c、Lys或U；
aa18为不存在或Arg、hArg、Ala、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa19为不存在或Ala、Val、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa20为不存在或Gln、Lys、Arg、Cit、Glu、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa21为不存在或Asp、Glu、Leu、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa22为不存在或Phe、Trp、Nal2、Aib、Ac4c、Ac5c或U
aa23为不存在或Val、Ile、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa24为不存在或Gln、Ala、Glu、Cit或U；
aa25为不存在或Trp、Nal2或U；
aa26为不存在或Leu或U；
aa27为不存在或Met、Val、Leu、Nle、Lys或U；
aa28为不存在或Asn、Lys、Gln、Cit或U；
aa29为不存在或Thr、Gly、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa30为不存在或Lys、Aib、Ac4c、Ac5c、Arg或U；
aa31为不存在或Arg、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa32为不存在或Asn、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa33为不存在或Arg、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa34为不存在或Asn、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa35为不存在或Asn、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa36为不存在或Ile、Aib、Ac4c、Ac5C或U；
aa36为不存在或Ala、Aib、Ac4c、Ac5C或U；
aa37为不存在或U；
U为天然或非天然氨基酸，其包含用于共价连接到表面活性剂X的官能团；
其中aa1-aa37中的任何两者任选地经由其侧链环化以形成内酰胺键联；并且
其限制条件为aa10-aa37中的一者或至少一者为共价连接到X的连接氨基酸U。
在特定实施例中，连接氨基酸U为二氨基酸样Lys或Orn，X为来自1-烷基糖苷类的经修饰的表面活性剂，其连接到U，并且Z为OH或-NH-R2，其中R3为H或C1-C12；或小于10Da的PEG链。
在一些实施例中，式I-A的肽产物具有式III-A的结构：
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-aa16-aa17-aa18-aa19-aa20-aa21-aa22-aa23-aa24-aa25-aa26-aa27-aa28-aa29-Z式III-A(SEQ.ID.NO.2)
其中：
Z为OH或-NH-R3、其中R3为H或C1-C12经取代或未经取代的烷基或小于10Da的PEG链；
aa1为His、N-Ac-His、pGlu-His或N-R3-His；
aa2为Ser、Ala、Gly、MePro、Aib、Ac4c或Ac5c；
aa3为Gln或Cit；
aa4为Gly或D-Ala；
aa5为Thr或Ser；
aa6为Phe、Trp、2FPhe、MePhe、2FMePhe或Nal2；
aa7为Thr或Ser；
aa8为Ser或Asp；
aa9为Asp或Glu；
aa10为Tyr、Leu、Met、Nal2、Bip、Bip2EtMeO或U(X)；
aa11为不存在或Ser、Asn、Bip或U(X)；
aa12为不存在或Lys、Glu、Ser、Arg或U(X)；
aa13为不存在或Tyr、Gln、Cit或U(X)；
aa14为不存在或Leu、Met、Nle或U(X)；
aa15为不存在或Asp、Glu或U(X)；
aa16为不存在或Ser、Gly、Glu、Ala、Aib、Ac5c、Lys、Arg或U(X)；
aa17为不存在或Arg、hArg、Gln、Glu、Lys、Cit、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa18为不存在或Arg、hArg、Ala、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa19为不存在或Ala、Val、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa20为不存在或Gln、Lys、Arg、Cit、Glu、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa21为不存在或Asp、Glu、Leu、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa22为不存在或Phe、Trp、Nal2、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa23为不存在或Val、Ile、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa24为不存在或Gln、Ala、Glu、Cit或U(X)；
aa25为不存在或Trp、Nal2或U(X)；
aa26为不存在或Leu或U(X)；
aa27为不存在或Met、Val、Leu、Nle、Lys或U(X)；
aa28为不存在或Asn、Lys、Gln或U(X)；
aa29为不存在或Thr、Gly、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
其中aa1-aa29中的任何两者任选地经由其侧链环化以形成内酰胺键联；并且
其限制条件为aa10、aa11、aa12、aa16、aa17、aa18、aa19、aa20、aa21、aa22、aa23、aa24、aa25、aa26、aa27、aa28或aa29中的一者或至少一者为共价连接到X的天然或非天然氨基酸U。
在一些实施例中，本文所述的肽产物具有式III-B的结构：
His1-aa2-aa3-Gly4-Thr5-aa6-Thr7-Ser8-Asp9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-aa16-aa17-aa18-aa19-aa20-aa21-aa22-aa23-aa24-aa25-aa26-aa27-aa28-aa29-aa30-Z式III-B(SEQ.ID.NO.3)
其中：
Z为OH或-NH-R3、其中R3为H或经取代或未经取代的C1-C12烷基；或小于10Da的PEG链；
aa2为Gly、MePro或Aib；
aa3为Gln或Cit；
aa6为Phe、2FPhe、MePhe、2FMePhe或Nal2；
aa10为Tyr、Nal2、Bip、Bip2EtMeO或U(X)；
aa11为不存在或Ser、Asn、Bip或U(X)；
aa12为不存在或Lys、Glu、Ser或U(X)；
aa13为不存在或Tyr、Gln、Cit或U(X)；
aa14为不存在或Leu、Nle或U(X)；
aa15为不存在或Asp、Glu或U(X)；
aa16为不存在或Ser、Gly、Glu、Ala、Aib、Lys、Arg或U(X)；
aa17为不存在或Arg、hArg、Gln、Glu、Lys、Cit、Aib或U(X)；
aa18为不存在或Arg、hArg、Ala、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa19为不存在或Ala、Aib或U(X)；
aa20为不存在或Gln、Lys、Arg、Cit、Glu、Aib或U(X)；
aa21为不存在或Asp、Glu、Leu、Aib或U(X)；
aa22为不存在或Phe或U(X)
aa23为不存在或Val、Ile、Aib或U(X)；
aa24为不存在或Ala、Gln或U(X)；
aa25为不存在或Trp或U(X)；
aa26为不存在或Leu或U(X)；
aa27为不存在或Met、Val、Leu、Nle、Lys或U(X)；
aa28为不存在或Asn、Gln、Cit或U(X)；
aa29为不存在或Thr、Aib或U(X)；
aa30为不存在或Arg或U(X)；
其中aa1-aa23中的任何两者任选地经由其侧链环化以形成内酰胺键联；并且
其限制条件为aa10、aa11、aa12、aa16、aa17、aa18、aa19、aa20、aa21、aa22、aa23、aa24或aa28中的一者或至少一者为共价连接到X的天然或非天然氨基酸U。
在式III-A和式III-B的一些特定实施例中，X具有以下结构：
其中：
R1a为经取代或未经取代的C1-C30烷基；
R1b、R1c和R1d为H；
W1为-(C＝O)-NH-；
W2为-O-；并且
R2为一键。
在一些上述实施例中，R1a为C1-C20烷基、C8-C20烷基、C12-18烷基或C14-C18烷基。
在式III-B的一些实施例中，U为本文所述的任何连接氨基酸。图1的表1、图2的表2和图3的表3说明与如本文所述的表面活性剂共价连接的肽的某些实例。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-aa2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Glu16-U(X)17-Ala18-Ala19-Lys20-Glu21-Phe22-Ile23-Ala24-Trp25-Leu26-Leu27-aa28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.795)
其中
aa2为Gly或Aib；
aa28为Asn或Gln。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-aa16-Gln17 Ala18-Ala19-aa20-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ω-X)24-Trp25-Leu26-Leu27-aa28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.796)
其中
aa16和aa20各自独立地为Lys或Glu，轻轻经由其侧链环化以形成内酰胺键联；
并且aa28为Asn或Gln；
X包含葡糖醛酸基类部分，其从1-烷基β-D-葡糖苷、1-烷基β-D-麦芽糖苷、1-烷基β-D-蜜二糖苷或相应α糖苷等等制备，并且其中烷基为C8-C20线性烷基链。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Glu*16-Gln17 Ala18-Ala19-Lys*20-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ω-X)24-Trp25-Leu26-Leu27-Gln28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.797)
其中
aa16和aa20经由其侧链环化以形成内酰胺键联；
并且X包含葡糖醛酸基类部分，其从1-烷基β-D-葡糖苷、1-烷基β-D-麦芽糖苷、1-烷基β-D-蜜二糖苷或相应α糖苷等等制备，并且其中烷基为C8-C20线性烷基链。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Glu*16-Gln17 Ala18-Ala19-Lys*20-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ω(1-辛基β-D-葡糖醛酸基))24-Trp25-Leu26-Leu27-Gln28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.600)
其中
Glu*16和Lys*20经由其侧链环化以形成内酰胺键联。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Glu*16-Gln17 Ala18-Ala19-Lys*20-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ω(1-十二烷基β-D-葡糖醛酸基))24-Trp25-Leu26-Leu27-Gln28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.601)
其中
Glu*16和Lys*20经由其侧链环化以形成内酰胺键联。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Glu*16-Gln17 Ala18-Ala19-Lys*20-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ω(1-十四烷基β-D-葡糖醛酸基))24-Trp25-Leu26-Leu27-Gln28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.602)
其中
Glu*16和Lys*20经由其侧链环化以形成内酰胺键联。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Glu*16-Gln17 Ala18-Ala19-Lys*20-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ω(1-十六烷基β-D-葡糖醛酸基))24-Trp25-Leu26-Leu27-Gln28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.603)
其中
Glu*16和Lys*20经由其侧链环化以形成内酰胺键联。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Glu*16-Gln17 Ala18-Ala19-Lys*20-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ω(1-十八烷基β-D-葡糖醛酸基))24-Trp25-Leu26-Leu27-Gln28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.604)。
其中
Glu*16和Lys*20经由其侧链环化以形成内酰胺键联。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Glu*16-Gln17 Ala18-Ala19-Lys*20-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ω(1-十二烷基β-D-蜜二糖醛基))24-Trp25-Leu26-Leu27-Gln28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.631)
其中
Glu*16和Lys*20经由其侧链环化以形成内酰胺键联。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Glu*16-Gln17 Ala18-Ala19-Lys*20-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ω(1-十四烷基β-D-蜜二糖醛基))24-Trp25-Leu26-Leu27-Gln28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.632)
其中
Glu*16和Lys*20经由其侧链环化以形成内酰胺键联。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Glu*16-Gln17 Ala18-Ala19-Lys*20-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ω(1-十六烷基β-D-蜜二糖醛基))24-Trp25-Leu26-Leu27-Gln28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.633)
其中
Glu*16和Lys*20经由其侧链环化以形成内酰胺键联。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Glu*16-Gln17 Ala18-Ala19-Lys*20-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ω(1-十八烷基β-D-蜜二糖醛基))24-Trp25-Leu26-Leu27-Gln28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.634)
其中
Glu*16和Lys*20经由其侧链环化以形成内酰胺键联。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-Gly2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Glu16-Gln17 Ala18-Ala19-Arg20-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ω(1-十二烷基β-D-蜜二糖醛基))24-Trp25-Leu26-Leu27-Gln28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.637)。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-Gly2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Glu16-Gln17 Ala18-Ala19-Arg20-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ω(1-十八烷基β-D-蜜二糖醛基))24-Trp25-Leu26-Leu27-Gln28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.640)。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Glu*16-Gln17 Ala18-Ala19-Lys*20-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ω(1-癸基β-D-葡糖醛酸基))24-Trp25-Leu26-Leu27-Gln28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.799)
其中
Glu*16和Lys*20经由其侧链环化以形成内酰胺键联。
在式I-A、III-A或III-B的一些实施例中，肽产物具有以下结构：
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Glu*16-Gln17 Ala18-Ala19-Lys*20-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ω(1-十一烷基β-D-葡糖醛酸基))24-Trp25-Leu26-Leu27-Gln28-Thr29-NH2；(SEQ.ID.NO.800)
其中
Glu*16和Lys*20经由其侧链环化以形成内酰胺键联。
本文所提供的实施例的范畴内涵盖式I-A、式III-A或式III-B的肽产物，其中所述肽产物包含一个或一个以上表面活性剂基团(例如，具有式I结构的基团X)。在一个实施例中，式I-A、式III-A或式III-B的肽产物包含一个表面活性剂基团。在另一个实施例中，式I-A、式III-A或式III-B的肽产物包含两个表面活性剂基团。在又另一个实施例中，式I-A、式III-A或式III-B的肽产物包含三个表面活性剂基团。
本文认识到SEQ.ID.NO.1的某些部分对治疗与胰岛素抗性有关的病状和/或心血管病状的重要性。因此，本文提供一种治疗有需要的个体的糖尿病的方法，其包含投与有需要的个体治疗有效量的升糖素类似物，所述升糖素类似物包含SEQ.ID.NO.1的氨基酸残基aa1-aa17。
在另一个实施例中，本文提供一种治疗有需要的个体的糖尿病的方法，其包含投与有需要的个体治疗有效量的升糖素类似物，所述升糖素类似物包含SEQ.ID.NO.1的氨基酸残基aa1-aa18。
在另一个实施例中，本文提供一种治疗有需要的个体的糖尿病的方法，其包含投与有需要的个体治疗有效量的升糖素类似物，所述升糖素类似物包含SEQ.ID.NO.1的氨基酸残基aa1-aa19。
在另一个实施例中，本文提供一种治疗有需要的个体的糖尿病的方法，其包含投与有需要的个体治疗有效量的升糖素类似物，所述升糖素类似物包含SEQ.ID.NO.1的氨基酸残基aa1-aa20。
在另一个实施例中，投与上述所述升糖素类似物引起重量减轻。
本文认识到SEQ.ID.NO.1的某些部分对治疗与胰岛素抗性有关的病状和/或心血管病状的重要性。因此，本文提供一种治疗有需要的个体的糖尿病的方法，其包含投与有需要的个体治疗有效量的升糖素类似物，所述升糖素类似物包含SEQ.ID.NO.1的氨基酸残基aa1-aa17。
在另一个实施例中，本文提供一种治疗有需要的个体的糖尿病的方法，其包含投与有需要的个体治疗有效量的升糖素类似物，所述升糖素类似物包含SEQ.ID.NO.1的氨基酸残基aa1-aa18。
在另一个实施例中，本文提供一种治疗有需要的个体的糖尿病的方法，其包含投与有需要的个体治疗有效量的升糖素类似物，所述升糖素类似物包含SEQ.ID.NO.1的氨基酸残基aa1-aa19。
在另一个实施例中，本文提供一种治疗有需要的个体的糖尿病的方法，其包含投与有需要的个体治疗有效量的升糖素类似物，所述升糖素类似物包含SEQ.ID.NO.1的氨基酸残基aa1-aa20。
在另一个实施例中，投与上述所述升糖素类似物引起重量减轻。
在任何上述实施例中，所述升糖素类似物经式I的表面活性剂X修饰：
其中：
R1a在每次出现时独立地为一键、H、糖、经取代或未经取代的C1-C30烷基、经取代或未经取代的烷氧基芳基、经取代或未经取代的芳烷基或含甾核部分；
R1b、R1c和R1d在每次出现时各自独立地为一键、H、经取代或未经取代的C1-C30烷基、经取代或未经取代的烷氧基芳基或经取代或未经取代的芳烷基；
W1在每次出现时独立地为-CH2-、-CH2-O-、-(C＝O)、-(C＝O)-O-、-(C＝O)-NH-、-(C＝S)-、-(C＝S)-NH-或-CH2-S-；
W2为-O-、-CH2-或-S-；
R2在每次出现时独立地为连接到U的键、H、经取代或未经取代的C1-C30烷基、经取代或未经取代的烷氧基芳基或经取代或未经取代的芳烷基、-NH2、-SH、C2-C4烯烃、C2-C4炔烃、-NH(C＝O)-CH2-Br、-(CH2)m-顺丁烯二酰亚胺或-N3；
n为1、2或3；并且
m为1-10的整数。
在一个特定实施例中，所述升糖素类似物经具有以下结构的表面活性剂X修饰：
其中：
R1a为经取代或未经取代的C1-C30烷基；
R1b、R1c和R1d为H；
W1为-(C＝O)-NH-；
W2为-O-；并且
R2为一键。
在一些上述实施例中，R1a为C1-C20烷基、C8-C20烷基、C12-C18烷基或C14-C18烷基。
在上文和本文所述的一些实施例中，R1a为糖。在一些实施例中，糖为半乳糖。在某些实施例中，糖为α连接的半乳糖。在其它实施例中，糖为α连接的半乳吡喃糖、β连接的半乳吡喃糖、α连接的半乳呋喃糖或β连接的半乳呋喃糖。
如本文所使用，术语糖尿病包括1型与2型糖尿病。因此，在一些实施例中，本文所述的方法包含投与患有1型糖尿病的个体任何本文所述化合物，其包括式II、III-A和/或III-B的化合物和/或图1的表1、图2的表2和图3的表3中所述的化合物。在一些其它实施例中，本文所述的方法包含投与患有2型糖尿病的个体任何本文所述化合物，其包括式II、III-A和/或III-B的化合物和/或图1的表1、图2的表2和图3的表3中所述的化合物。
本文还提供一种治疗有需要的个体的心血管疾病的方法，其包含投与有需要的个体治疗有效量的升糖素类似物，所述升糖素类似物包含SEQ.ID.NO.1的氨基酸残基aa1-aa17。
本文还提供一种治疗有需要的个体的心血管疾病的方法，其包含投与有需要的个体治疗有效量的升糖素类似物，所述升糖素类似物包含SEQ.ID.NO.1的氨基酸残基aa1-aa18。
本文还提供一种治疗有需要的个体的心血管疾病的方法，其包含投与有需要的个体治疗有效量的升糖素类似物，所述升糖素类似物包含SEQ.ID.NO.1的氨基酸残基aa1-aa19。
本文还提供一种治疗有需要的个体的心血管疾病的方法，其包含投与有需要的个体治疗有效量的升糖素类似物，所述升糖素类似物包含SEQ.ID.NO.1的氨基酸残基aa1-aa20。
在上述实施例的一些情形下，在心血管疾病与局部缺血性事件有关时投与所述升糖素类似物。
本文还提供一种治疗有需要的个体的心血管疾病的方法，其包含投与有需要的个体治疗有效量的升糖素类似物，所述升糖素类似物包含SEQ.ID.NO.1的氨基酸残基aa1-aa17。
本文还提供一种治疗有需要的个体的心血管疾病的方法，其包含投与有需要的个体治疗有效量的升糖素类似物，所述升糖素类似物包含SEQ.ID.NO.1的氨基酸残基aa1-aa18。
本文还提供一种治疗有需要的个体的心血管疾病的方法，其包含投与有需要的个体治疗有效量的升糖素类似物，所述升糖素类似物包含SEQ.ID.NO.1的氨基酸残基aa1-aa19。
本文还提供一种治疗有需要的个体的心血管疾病的方法，其包含投与有需要的个体治疗有效量的升糖素类似物，所述升糖素类似物包含SEQ.ID.NO.1的氨基酸残基aa1-aa20。
在上述实施例的一些情形下，在心血管疾病与局部缺血性事件有关时投与所述升糖素类似物。
在任何上述实施例中，所述升糖素类似物经式I的表面活性剂X修饰：
其中：
R1a在每次出现时独立地为一键、H、糖、经取代或未经取代的C1-C30烷基、经取代或未经取代的烷氧基芳基、经取代或未经取代的芳烷基或含甾核部分；
R1b、R1c和R1d在每次出现时各自独立地为一键、H、经取代或未经取代的C1-C30烷基、经取代或未经取代的烷氧基芳基或经取代或未经取代的芳烷基；
W1在每次出现时独立地为-CH2-、-CH2-O-、-(C＝O)、-(C＝O)-O-、-(C＝O)-NH-、-(C＝S)-、-(C＝S)-NH-或-CH2-S-；
W2为-O-、-CH2-或-S-；
R2在每次出现时独立地为连接到U的键、H、经取代或未经取代的C1-C30烷基、经取代或未经取代的烷氧基芳基或经取代或未经取代的芳烷基、-NH2、-SH、C2-C4烯烃、C2-C4炔烃、-NH(C＝O)-CH2-Br、-(CH2)m-顺丁烯二酰亚胺或-N3；
n为1、2或3；并且
m为1-10。
在一个特定实施例中，所述升糖素类似物经具有以下结构的表面活性剂X修饰：
其中：
R1a为经取代或未经取代的C1-C30烷基；
R1b、R1c和R1d为H；
W1为-(C＝O)-NH-；
W2为-O-；并且
R2为一键。
在一些上述实施例中，R1a为C1-C20烷基、C8-C20烷基、C12-C18烷基或C14-C18烷基。
在上文和本文所述的一些实施例中，R1a为糖。在一些实施例中，糖为半乳糖。在某些实施例中，糖为α连接的半乳糖。在其它实施例中，糖为α连接的半乳吡喃糖、β连接的半乳吡喃糖、α连接的半乳呋喃糖或β连接的半乳呋喃糖。
氨基或羧基端的修饰可以任选地引入肽(例如升糖素或GLP-1)中(内斯特,J.J.,Jr.(2009)，当今医药化学，16：4399-4418(Nestor,J.J.,Jr.(2009)Current MedicinalChemistry16:4399-4418))。举例来说，肽可以在N端进行截短或酰基化以产生如对于一些肽中已见到的展现低功效、部分促效剂和拮抗剂活性的肽类似物(高莱特,P.等人，(1998)，欧洲药理学杂志，354：105-111(Gourlet,P.,et al.(1998)Eur J Pharmacol 354:105-111)，高资,I.和弗曼,S.(2003)，当代药物设计，9：483-494(Gozes,I.and Furman,S.(2003)Curr Pharm Des 9:483-494)，其内容以引用的方式并入本文中)。举例来说，缺失bPTH的前6个残基产生拮抗类似物(马哈菲,J.E.等人，(1979)，生物化学杂志，254：6496-6498(Mahaffey,J.E.,et al.(1979)J Biol Chem 254:6496-6498)；戈德曼,M.E.等人，(1988)，内分泌学，123：2597-2599(Goldman,M.E.,et al.(1988)Endocrinology 123:2597-2599))，并且对本文所述的肽进行类似操作产生有效拮抗类似物。对肽N端到其它修饰(如缺失或并入D-氨基酸，如D-Phe)在经本文所述的修饰(如长链烷基糖苷)取代时也可以得到有效和长效促效剂或拮抗剂。此类促效剂和拮抗剂还具有商业效用并且属于本文所述的所涵盖实施例的范畴。
本文所述的实施例的范畴内还涵盖共价连接到肽类似物的表面活性剂，其中天然肽通过以下方式修饰：乙酰化、酰化、聚乙二醇化、ADP核糖基化、酰胺化、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸盐、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟基化和ADP核糖基化、硒化、硫酸化、转运RNA介导的向蛋白质添加氨基酸(如精氨酰化)以及泛素化。参见例如(内斯特,J.J.,Jr.(2007)，综合药物化学II，2：573-601(Nestor,J.J.,Jr.(2007)Comprehensive Medicinal Chemistry II 2:573-601)，内斯特,J.J.,Jr.(2009)，当前药物化学，16：4399-4418(Nestor,J.J.,Jr.(2009)CurrentMedicinal Chemistry 16:4399-4418)，克赖顿,T.E.(1993)(Creighton,T.E.(1993)),沃尔德,F.(1983)，蛋白质1-12的翻译后共价修饰(Wold,F.(1983)PosttranslationalCovalent Modification of Proteins 1-12)，塞夫特,S.和恩格拉德,S.(1990)，酶学方法，182：626-646(Seifter,S.and Englard,S.(1990)Methods Enzymol 182:626-646)，拉坦,S.I.等人，(1992)，纽约科学院年鉴，663：48-62(Rattan,S.I.,et al.(1992)Ann N YAcad Sci 663:48-62))。本文所述的实施例的范畴内还涵盖分支链肽或有或没有分支链的环状肽。环状、分支链和分支链环状肽由翻译后自然过程产生，并且还能通过适合的合成方法制备。在一些实施例中，本文所述的任何肽产物包含上述肽类似物，随后其共价连接到烷基-糖苷表面活性剂部分。
本文所提供的实施例的范畴内还涵盖肽链，其在适合位置通过如下方法取代：通过在连接氨基酸上在例如Lys的ε位用具有饱和或不饱和烷基链的脂肪酸(如辛酸、癸酸、十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸、十八烷酸、3-苯基丙酸等等)酰化来取代本文所主张的类似物(张,L.和布拉基,G.(2012)，当今医药化学，19:1602-1618(Zhang,L.and Bulaj,G.(2012)Curr Med Chem 19:1602-1618))。类似地，此类酰化可以连接到间隔基(如γ连接的谷氨酸)或进一步连接到“微型PEG”链(如9-氨基-4,7-二氧杂壬酸)的γ连接的谷氨酸上(德玛驰,R.D.和沃德,B.P(2012)，美国专利申请US2012/0238493(DiMarchi,R.D.and Ward,B.P(2012)US Patent Application US2012/0238493))。此类类似物的非限制性说明性实例为：
His1-Gly2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Glu16-Lys(N-ε-十二酰基)17-Ala18-Ala19-Lys20-Glu21-Phe22-Ile23-Ala24-Trp25-Leu26-Leu27-Asn28-Thr29-NH2，(SEQ.ID.NO.785)
His1-Gly2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Glu16-Lys(N-ε-十六酰基)17-Ala18-Ala19-Lys20-Glu21-Phe22-Ile23-Ala24-Trp25-Leu26-Leu27-Asn28-Thr29-NH2，(SEQ.ID.NO.786)
His1-Gly2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Glu16-Lys(N-ε-十八酰基)17-Ala18-Ala19-Lys20-Glu21-Phe22-Ile23-Ala24-Trp25-Leu26-Leu27-Asn28-Thr29-NH2，(SEQ.ID.NO.787)
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-环(Glu16-Gln17-Ala18-Ala19-Lys20)-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ε-十六酰基)24-Trp25-Leu26-Leu27-Asn28-Thr29-NH2，(SEQ.ID.NO.788)
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-环(Glu16-Gln17-Ala18-Ala19-Lys20)-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ε(N-α-十八酰基)-γ-谷酰基)24-Trp25-Leu26-Leu27-Asn28-Thr29-NH2，(SEQ.ID.NO.789)
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-环(Glu16-Gln17-Ala18-Ala19-Lys20)-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ε(N-α-十六酰基)-γ-谷酰基)24-Trp25-Leu26-Leu27-Asn28-Thr29-NH2，(SEQ.ID.NO.790)
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-环(Glu16-Gln17-Ala18-Ala19-Lys20)-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ε-(N-α-十八酰基(N9-γ-谷酰基(9-氨基-4,7-二氧杂壬酰基))))24-Trp25-Leu26-Leu27-Asn28-Thr29-NH2，(SEQ.ID.NO.791)
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-环(Glu16-Gln17-Ala18-Ala19-Lys20)-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ε(N-α-十六酰基(N9-γ谷酰基(9-氨基-4,7-二氧杂壬酰基))))24-Trp25-Leu26-Leu27-Asn28-Thr29-NH2，(SEQ.ID.NO.792)等等。
在其它实施例中，肽链视情况在适合位置通过在连接氨基酸上使例如Cys的硫氢基与间隔基和疏水部分(如甾核，例如胆固醇部分)反应来取代。在一些此类实施例中，经修饰的肽进一步包含一或多个PEG链。此类分子的非限制性实例为：
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-环(Glu16-Gln17-Ala18-Ala19-Lys20)-Glu21-Phe22-Ile23-Cys(S-(3-(PEG4-氨基乙基乙酰胺-胆固醇))24-Trp25-Leu26-Leu27-Asn28-Thr29-NH2，(SEQ.ID.NO.793)
His1-Gly2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-环(Glu16-Gln17-Ala18-Ala19-Lys20)-Glu21-Phe22-Ile23-Cys(S-(3-(PEG4-氨基乙基乙酰胺-胆固醇))24-Trp25-Leu26-Leu27-Asn28-Thr29-NH2，(SEQ.ID.NO.794)等等。
除20种标准氨基酸以外，存在大量“非标准氨基酸”或非天然氨基酸，其为所属领域已知并可以如上文所述并入本文所述的化合物中。其它非标准氨基酸经反应性侧链修饰以用于结合(高蒂尔,M.A.和克洛克,H.A.(2008)，化学通讯(剑桥)，2591-2611(Gauthier,M.A.and Klok,H.A.(2008)Chem Commun(Camb)2591-2611)；迪格勒夫,A.J.等人，(2009)，生物结合化学，20：1281-1295(de Graaf,A.J.,et al.(2009)Bioconjug Chem20:1281-1295))。在一种方法中，释放的tRNA/tRNA合成酶对在表达质粒中由琥珀抑制因子密码子编码(戴特斯,A等人，(2004)，生物有机化学与医药化学通讯，14,5743-5(Deiters,A,et al.(2004).Bio-org.Med.Chem.Lett.14,5743-5))。举例来说，将对叠氮基苯丙氨酸并入肽中，随后与经官能化的表面活性剂或具有乙炔部分的PEG聚合物在还原剂和铜离子存在下反应，以有利于称为“胡伊斯根[3+2]环加成(Huisgen[3+2]cycloaddition)”的有机反应。使用本文所述的含有经乙炔修饰的烷基糖苷或经PEG修饰的糖苷的试剂进行的类似反应工序将得到经聚乙二醇化或经烷基糖苷修饰的肽。对于少于约50个残基的肽，使用标准固相合成在链的理想位置并入所述反应性氨基酸残基。与仅通过PEG并入修饰的肽比较，此类经表面活性剂修饰的肽和/或蛋白质提供不同药理学和药物特性谱。
所属领域的技术人员应了解肽类似物的多种置换是可能的，并且其限制条件为氨基酸序列具有并入的表面活性剂部分，其将具有本文所述的经表面活性剂修饰的肽产物的所要特质。
特定定义
如在说明书中所使用，术语“一”意指一或多。如在权利要求中所使用，在结合词语“包含”使用时，词语“一”意指一或多。如本文所使用，「另一个」意指至少第二个或更多个。
如本文所使用，各种常见氨基酸的一个和三个字母缩写如(纯应用化学31，639-645(1972)(Pure Appl.Chem.31,639-645(1972)))中所建议并且符合37CFR§1.822(55FR18245，1990年5月1日)。除非另外表示为D-或DL，否则缩写表示L-氨基酸。天然与非天然的某些氨基酸为非手性的，例如甘氨酸、Cα-二乙基甘氨酸(Deg)、α-氨基-异丁酸(Aib)、1-氨基环丁烷-1-甲酸(Ac4c)、1-氨基环戊烷-1-甲酸(Ac5c)、1-氨基环己烷-1-甲酸(Ac6c)。谷氨酰胺的类似物包括瓜氨酸(Cit)。所有肽序列呈现为左侧是N端氨基酸，并且右侧是C端氨基酸。可以使用C-α-甲基脯氨酸限制肽键联(MePro)，C-α-甲基苯丙氨酸(MePhe)、2-氟苯丙氨酸(2FPhe)、C-α-甲基-2-氟苯丙氨酸(2FMePhe)和C-α-甲基赖氨酸(MeLys)也可以。其它非天然芳香族氨基酸可以经取代，如2-萘基丙氨酸(Nal2)、联苯丙氨酸(Bip)、2-乙基-4'-甲氧基联苯丙氨酸(Bip2EtMeO)，并且可以引起效能增加。
“烷基”指脂肪族烃基。提及烷基包括“饱和烷基”和/或“不饱和烷基”。不论饱和或不饱和与否，烷基包括分支链、直链或环状基团。“经取代的”烷基经一或多个其它基团取代。在某些实施例中，一或多个其它基团个别地并独立地选自酰胺、酯、烷基、环烷基、杂烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、羟基、烷氧基、芳氧基、烷基硫基、芳基硫基、烷基亚砜、芳基亚砜、酯、烷基砜、芳基砜、氰基、卤素、烷酰基、烷酰基、烷酰基氧代基、异氰酸酯基、硫氰酸酯基、异硫氰酸酯基、硝基、卤烷基、卤烷氧基、氟烷基、氨基、烷基-氨基、二烷基-氨基、酰胺基、氧代基、疏水性天然产物(如甾类)、芳烷基链(包括烷氧基芳基)、含有酰基部分的烷基链等等。在一些实施例中，烷基连接到肽中残基(例如Tyr或Dmt)的Nα位。此类别称为N-烷基，并包含C1-C10的直链或分支链烷基或经芳基取代的烷基，如苯甲基、苯基乙基等等。在一些实施例中，烷基部分为与糖部分糖苷键联(通常连接到例如葡萄糖的1位)的1-烷基。此类1-烷基为C1-C30烷基。
“芳基”指芳香族环，其中形成环的各原子为碳原子。本文所述的芳基环包括具有五、六、七、八、九个或大于九个碳原子的环。芳基任选地经选自以下基团的取代基取代：卤素、烷基、酰基、烷氧基、烷基硫基、磺酰基、二烷基-氨基、羧基酯、氰基等等。芳基的实例包括(但不限于)苯基和萘基。
术语“酰基”指C1-C20酰基链。此链可以包含线性脂肪族链、分支链脂肪族链、含有环状烷基部分的链、疏水性天然产物(如甾类)、芳烷基链或含有酰基部分的烷基链。
术语“甾核”指包含下示称为A、B、C和D的四个稠环的排列的类固醇核：
含甾核部分的实例包括(并且不限于)胆固醇等等。
如本文所使用，“治疗性组合物”可以包含与水性或有机载剂或赋形剂的混合物，并且可以例如与医药学上可接受的通常用于片剂、丸剂、胶囊、冻干物、栓剂、溶液、乳液、悬浮液或适合使用的其它形式的无毒载剂混配。除上文所揭示的载剂以外，载剂还可以包括海藻酸盐、胶原蛋白、葡萄糖、乳糖、甘露糖、阿拉伯胶、明胶、甘露醇、淀粉糊、三硅酸镁、滑石、玉米淀粉、角蛋白、胶态二氧化硅、马铃薯淀粉、尿素、中等链长甘油三酯、葡聚糖和其它适用于制造固体、半固体或液体形式制剂的载剂。此外，可以使用辅助性稳定剂、增稠剂或着色剂，例如稳定干燥剂，如二羟基丙酮。
如本文所使用，“医药学上可接受的载剂”或“治疗有效载剂”为水性或非水性(固体)的，例如醇性或油性的，或其混合物，并且可以含有表面活性剂、润肤剂、润滑剂、稳定剂、染料、香料、防腐剂、用于调节pH值的酸或碱、溶剂、乳化剂、胶凝剂、增湿剂、稳定剂、湿润剂、延时剂、保湿剂或通常包括在特定形式医药组合物中的其它组分。医药学上可接受的载剂在所属领域中是众所周知的，并且包括例如水溶液(如水或生理学缓冲生理食盐水)，或其它溶剂或媒剂，如二醇、甘油，以及油(如橄榄油)或可注射有机酯。医药学上可接受的载剂可以含有生理学上可接受的用于例如稳定或提高特定抑制剂(例如碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)的吸收的化合物；抗氧化剂，如抗坏血酸或谷胱甘肽；螯合剂，低分子量蛋白质；或其它稳定剂或赋形剂。
如本文所使用，肽产物的“胰岛素再敏化”量为如下量，其提高有需要的个体的身体对内源或外源投与的胰岛素的反应，通常同时降低体重，如通过例如口服葡萄糖挑战测试或正常血糖钳夹测试证明。
医药组合物还可以含有医药学上可接受的接近生理条件所需要的其它辅助物质，此类“物质”包括(但不限于)pH调节和缓冲剂、张力调节剂等等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。另外，肽或其变体的悬浮液可以包括脂质保护剂，其使脂质在储存时免于自由基和脂质过氧化损伤。亲脂性自由基淬灭剂(如α-生育酚)和水溶性铁特异性螯合剂(如铁草铵)为适合的。
如本文所使用，“表面活性剂”为改良水界面张力的表面活性剂。通常，表面活性剂在分子中具有一个亲脂基团或区域和一个亲水基团或区域。大体上，基团包括皂类、清洁剂、乳化剂、分散和湿润剂以及若干组防腐剂。更具体来说，表面活性剂包括硬脂酰基三乙醇胺、月桂基硫酸钠、牛磺胆酸钠、月桂基氨基丙酸、卵磷脂、苯扎氯铵、苄索氯铵和单硬脂酸甘油酯；以及亲水性聚合物，如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇(PEG)、羧基甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟基甲基纤维素、羟基乙基纤维素和羟基丙基纤维素或烷基糖苷。在一些实施例中，表面活性剂为非离子型表面活性剂(例如烷基糖苷表面活性剂)。在一些实施例中，表面活性剂为离子型表面活性剂。
如本文所使用，“烷基糖苷”指如所属领域中已知由键联连接到任何疏水性烷基的任何糖。疏水性烷基可以视糖部分的所要疏水性和亲水性选择而具有任何所要尺寸。一方面，烷基链的范围为1到30个碳原子；或6到16个碳原子。
如本文所使用，“糖”包括直链或环形式的单糖、寡糖或多糖。寡糖为具有两个或两个以上单糖残基的糖。适合以官能化形式使用的多种可能糖的一些实例包括葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、蔗糖、海藻糖等等。
如本文所使用，“蔗糖酯”为脂肪酸的蔗糖酯。蔗糖酯可以采取多种形式，因为蔗糖中的八个羟基可用于反应，并且多个脂肪酸基团(从乙酸酯到更大更巨型的脂肪)可以与蔗糖反应。此灵活性意指可以基于所用脂肪酸部分定制多种产物和功能。蔗糖酯具有食品和非食品用途，尤其作为表面活性剂和乳化剂，其中在药物、化妆品、清洁剂和食品添加剂中具有越来越多的应用。其可生物降解，无毒并且对皮肤温和。
如本文所使用，“适合”的烷基糖苷意指无毒并且为非离子的烷基糖苷。在一些情况下，适合的烷基糖苷在与化合物一起经由经眼、经鼻、经鼻泪骨、舌下、经颊、吸入途径或通过注射途径(如皮下、肌肉内或静脉内途径)投与时降低化合物的免疫原性或凝集并且提高其生物可用性。
“连接氨基酸”为任何天然或非天然氨基酸，其包含用于与经官能化的表面活性剂共价键联的反应性官能团(迪格勒夫,A.J.等人，(2009)，生物结合化学，20：1281-1295(deGraaf,A.J.,et al.(2009)Bioconjug Chem 20:1281-1295))。举例来说，在一些实施例中，连接氨基酸为具有反应性官能团-NH2的Lys或Orn；或具有反应性官能团-SH的Cys；或具有反应性官能团-C(＝O)-OH的Asp或Glu。举例来说，在一些其它实施例中，连接氨基酸为具有如-OH、-N3、卤乙酰基或乙炔系基团的反应性官能团的任何氨基酸，所述基团用于与经适当官能化的表面活性剂形成共价键联。
如本文所使用，“经官能化的表面活性剂”为包含适用于与连接氨基酸共价键联的反应性基团的表面活性剂。举例来说，在一些实施例中，经官能化的表面活性剂包含羧酸基(例如在单糖下6位)作为适用于与连接氨基酸共价键联的反应性基团。举例来说，在一些实施例中，经官能化的表面活性剂例如在单糖的6位包含-NH2基团、-N3基团、乙炔系基团、卤乙酰基、-O-NH2基团或-(CH2-)m-顺丁烯二酰亚胺基(如流程6中所示)，所述基团使得可与适合连接氨基酸共价键联。在一些实施例中，经官能化的表面活性剂为如本文所述的式II化合物。任选地，在一些特定实施例中，经官能化的表面活性剂包含共价连接的连接氨基酸；随后经表面活性剂修饰的肽通过向连接氨基酸依序添加一或多种氨基酸形成。
如本文所使用，术语“肽”为包含两个或两个以上氨基酸的任何肽。术语肽包括多肽、短肽(例如包含2-14个氨基酸的肽)、中等长度肽(15-50)或长链肽(例如蛋白质)。术语肽、多肽、中等长度肽和蛋白质在本文中可互换使用。如本文所使用，术语“肽”解释为意指由经由肽键连接的氨基酸残基、其天然存在的相关结构变体以及非天然存在的合成类似物构成的聚合物、其天然存在的相关结构变体和非天然存在的合成类似物。合成肽可以例如使用自动肽合成器合成。
肽可以含有除20种由基因编码的氨基酸以外的氨基酸。“肽”包括通过自然过程(如加工和其它翻译后修饰)修饰的肽，而且包括通过化学修饰技术修饰的肽。此类修饰充分描述在基本教科书中和更详细的专论中，并且对于所属领域的技术人员是众所周知的。应了解，在一些实施例中，相同类型的修饰以相同或不同程度存在于给定肽的若干位点中。此外，在一些实施例中，给定肽含有一种以上的修饰。修饰在肽的任何位置发生，包括肽主链、氨基酸侧链以及氨基或羧基端。
术语肽包括包含天然和非天然氨基酸或天然氨基酸的类似物的肽或蛋白质。如本文所使用，肽和/或蛋白质“类似物”包含基于天然氨基酸的非天然氨基酸，如酪氨酸类似物，其包括对位经取代的酪胺酸、邻位经取代的酪胺酸和间位经取代的酪胺酸，其中酪氨酸上的取代基包含乙酰基、苯甲酰基、氨基、肼、羟基胺、硫醇基、羧基、甲基、异丙基、C2-C20直链或分支链烃、饱和或不饱和烃、O-甲基、聚醚基、卤素、硝基等等。Tyr类似物的实例包括2,4-二甲基-酪氨酸(Dmt)、2,4-二乙基-酪氨酸、O-4-烯丙基-酪氨酸、4-丙基-酪氨酸、Cα-甲基-酪氨酸等等。赖氨酸类似物的实例包括鸟氨酸(Orn)、高赖氨酸、Cα-甲基-赖氨酸(CMeLys)等等。苯丙氨酸类似物的实例包括(但不限于)间位经取代的苯丙氨酸，其中取代基包含甲氧基、C1-C20烷基，例如甲基、烯丙基、乙酰基等等。特定实例包括(但不限于)2,4,6-三甲基-L-苯丙氨酸(Tmt)、O-甲基-酪氨酸、3-(2-萘基)丙氨酸(Nal(2))、3-(1-萘基)丙氨酸(Nal(1))、3-甲基-苯丙氨酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸(Tic)、经氟化的苯丙氨酸、异丙基-苯丙氨酸、对叠氮基-苯丙氨酸、对酰基-苯丙氨酸、对苯甲酰基-苯丙氨酸、对碘-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-苯丙氨酸和异丙基-苯丙氨酸等等。肽类似物设计中所用的或非天然氨基酸包括(并且不限于)C-α-二取代的氨基酸(如Aib)、Cα-二乙基甘氨酸(Deg)、氨基环戊烷-1-甲酸(Ac5c)等等。此类氨基酸经常得到受约束的结构，通常偏向α螺旋结构(考尔,R.和巴拉茹阿玛,P.(1999)，生物有机化学与医药化学，7：105-117(Kaul,R.andBalaram,P.(1999)Bioorg Med Chem 7:105-117))。适用于类似物设计的此类非天然氨基酸的其它实例为高精胺酸(Har)等等。在某些情况下，取代经还原的酰胺键可改良针对酶破坏的保护或改变受体结合。举例来说，并入残基之间具有经还原的酰胺键的Tic-Phe二肽单元(表示为Tic-ψ[CH2-NH]-ψ-Phe)降低了酶降解。因此，本文所述的实施例的范畴内还涵盖共价连接到包含经修饰的氨基酸的肽和/或上述肽类似物的表面活性剂。下文展示某些非天然氨基酸。
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如本文所使用，术语“变体”解释为意指不同于参照肽但保留必需特性的肽。肽的典型变体的氨基酸序列与另一个参照肽不同。一般来说，差异为有限的以使得参照肽与变体的序列在整体上密切类似并且在多个区域中相同。变体和参照肽的氨基酸序列可以因为一或多个任何组合形式的取代、加成、缺失而不同。经取代或插入的氨基酸残基可以为或可以不为由遗传密码编码的氨基酸残基。肽的非天然存在的变体可以通过诱变技术，通过直接合成和通过其它适合的重组方法制备。
方法
在一些实施例中，本文提供预防和/或治疗与胰岛素敏感性降低有关的病状的方法，其包含投与有需要的个体治疗有效量的本文所述的经表面活性剂修饰的肽和/或蛋白质产物(例如式I-A、III-A或III-B的肽产物)。在一些实施例中，特征为胰岛素敏感性降低的病状包括(并且不限于)代谢综合症、与肥胖相关的胰岛素抗性、高血压、与高C反应蛋白有关的全身性发炎、糖尿病等等。
本文还提供治疗胰岛素抗性的方法，其包含投与有需要的个体治疗有效量的本文所述的经表面活性剂修饰的肽和/或蛋白质产物(例如式I-A、III-A或III-B的肽产物)。在一些实施例中，胰岛素抗性与代谢综合症(综合症X)和/或糖尿病有关。
本文进一步提供刺激身体对胰岛素的再敏化的方法，其包含投与有需要的个体治疗有效量的本文所述的经表面活性剂修饰的肽和/或蛋白质产物(例如式I-A、III-A或III-B的肽产物)。
在又另一个实施例中，本文提供经由重量减轻提高胰岛素敏感性的方法，其包含投与有需要的个体治疗有效量的本文所述的经表面活性剂修饰的肽和/或蛋白质产物(例如式I-A、III-A或III-B以及图1的表1、图2的表2和图3的表3的肽产物)。
本文还提供治疗糖尿病或前驱糖尿病的方法，其包含投与有需要的个体治疗有效量的上文和本文以及图1的表1、图2的表2和图3的表3中所述的肽产物。
本文提供治疗选自以下疾病的病状或延迟其进展或发作的方法：糖尿病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性神经病、糖尿病性肾病、胰岛素抗性、高血糖、高胰岛素血症、代谢综合症、糖尿病并发症、游离脂肪酸或甘油的血液含量提高、高脂质血症、肥胖、高三酸甘油酯血症、动脉粥样硬化、急性心血管综合症、梗塞、局部缺血性再灌注或高血压，其包含投与有需要的个体治疗有效量的本文以及图1的表1、图2的表2和图3的表3中所述的肽产物。在另一个实施例中，本文提供治疗创伤愈合延迟的方法，其包含投与有需要的个体治疗有效量的本文以及图1的表1、图2的表2和图3的表3中所述的肽产物。
在一个实施例中。所述待治疗的病状为糖尿病。在一个实施例中，所述待治疗的病状为胰岛素抗性。在一个实施例中，所述待治疗的病状为代谢综合症。在一个实施例中，所述肽的所述有效量为约0.1微克/千克/天到约100.0微克/千克/天。
在一个实施例中，投药方法为不经肠。在一个实施例中，投药方法为经口。在一个实施例中，投药方法为皮下。在一个实施例中，投药方法为经鼻吹入。
本文进一步提供一种降低重量增加或诱导重量减轻的方法，其包含投与有需要的个体治疗有效量的本文以及图1的表1、图2的表2和图3的表3中所述的肽产物。在一些实施例中，重量增加与代谢综合症有关。
本文进一步提供一种治疗低血糖的方法，其包含投与有需要的个体治疗有效量的本文以及图1的表1、图2的表2和图3的表3中所述的肽产物。
本文还提供治疗糖尿病的方法，其包含投与有需要的个体治疗有效量的本文以及图1的表1、图2的表2和图3的表3中所述的肽产物以及至少一种其它治疗剂；其中所述治疗剂选自抗糖尿病剂、抗肥胖剂、饱腹感剂、消炎剂、抗高血压剂、抗动脉粥样硬化剂以及降脂剂。
在上述方法的一些实施例中，共价连接到表面活性剂的肽和/或蛋白质为升糖素或GLP-1肽或其类似物。在一些实施例中，预防性投与经表面活性剂修饰的肽和/或蛋白质(例如式I-A、III-A或III-B的肽产物)并且其延迟与胰岛素抗性有关的任何病状的发生，包括(并且不限于)代谢综合症、高血压、糖尿病、2型糖尿病、妊娠期糖尿病、高脂质血症、动脉粥样硬化、全身性发炎等等。在一些实施例中，治疗性投与经表面活性剂修饰的肽和/或蛋白质(例如式I-A、III-A或III-B的肽产物)并且其延迟与以下疾病有关的任何病状的进展：代谢综合症、高血压、糖尿病、2型糖尿病、妊娠期糖尿病、高脂质血症、动脉粥样硬化、全身性发炎等等。在一些实施例中，预防性和/或治疗性投与经表面活性剂修饰的肽和/或蛋白质(例如式I-A、III-A或III-B的肽产物)并且其延迟胰岛素抗性发展为糖尿病。在一些实施例中，预防性和/或治疗性投与经表面活性剂修饰的肽和/或蛋白质(例如式I-A、III-A或III-B的肽产物)并且其减少或中断胰岛素抗性的进一步丧失，从而稳定疾病。
在一些实施例中，不经肠投与经表面活性剂修饰的肽和/或蛋白质(例如式I-A、III-A或III-B的肽产物)。在一些实施例中，皮下投与经表面活性剂修饰的肽和/或蛋白质(例如式I-A、III-A或III-B的肽产物)。在一些实施例中，通过经鼻吹入投与经表面活性剂修饰的肽和/或蛋白质(例如式I-A、III-A或III-B的肽产物)。
在上述方法的一些实施例中，与包含当前已知疗法的药物(例如艾塞那肽、二甲双胍等等)比较，经表面活性剂修饰的肽和/或蛋白质(例如式I-A、III-A或III-B的肽产物)具有较长作用持续时间。
组合疗法
在上述方法的一些实施例中，将经表面活性剂修饰的肽和/或蛋白质(例如式I-A、III-A或III-B的肽产物)与治疗代谢综合症的其它方法组合投与，所述其它方法选自包含抗糖尿病剂、抗肥胖剂、抗高血压剂、抗动脉粥样硬化剂和降脂剂的群组。举例来说，适用于与本文所述的经表面活性剂修饰的肽和/或蛋白质产物组合投与的有效抗糖尿病剂包括双胍、磺酰脲、葡糖苷酶抑制剂、PPARγ促效剂、PPARα/γ双重促效剂、aP2抑制剂、DPP4抑制剂、胰岛素敏化剂、GLP-1类似物、胰岛素以及美格替耐(meglitinide)。其它实例包括二甲双胍、格列苯脲(glyburide)、格列美脲(glimepiride)、格列甲嗪(glipyride)、格列吡嗪(glipizide)、氯磺丙脲(chlorpropamide)、格列齐特(gliclazide)、阿卡波糖(acarbose)、米格列醇(miglitol)、吡格列酮(pioglitazone)、曲格列酮(troglitazone)、罗格列酮(rosiglitazone)、莫格他唑(muraglitazar)、胰岛素、Gl-262570、伊萨列酮(isaglitazone)、JTT-501、NN-2344、L895 645、YM-440、R-119702、A19677、瑞格列奈(repaglinide)、那格列奈(nateglinide)、KAD 1129、AR-HO 39242、GW-40I 5 44、KRP2 I7、AC2993、LY3 I 5902、NVP-DPP-728A以及沙格列汀(saxagliptin)。
在上述方法的一些实施例中，将经表面活性剂修饰的肽和/或蛋白质(例如式I-A、III-A或III-B的肽产物)与治疗代谢综合症的其它方法组合投与，所述其它方法选自有效抗肥胖剂的群组。举例来说，适用于与本文所述的肽产物一起投与的有效抗肥胖剂包括β3肾上腺素促效剂、脂肪酶抑制剂、血清素(和多巴胺)再吸收抑制剂、甲状腺受体β化合物、CB-l拮抗剂、NPY-Y2和NPY-Y4受体促效剂以及食欲抑制剂。这些类别的特定成员包含奥利司他(orlistat)、AfL-962、A1967l、L750355、CP331648、托吡酯(topiramate)、阿索开(axokine)、苯丁胺(phentermine)、苯基丙醇胺、利莫那班(rimonabant，SR1 4I7164)以及氯苯咪吲哚(mazindol)。
在上述方法的一些实施例中，将经表面活性剂修饰的肽和/或蛋白质(例如式I-A、III-A或III-B的肽产物)与治疗代谢综合症的其它方法组合投与，所述其它方法选自有效降脂剂的群组。举例来说，适用于与本文所述的肽产物一起投与的有效降脂剂包括选自由以下药剂组成的群组的药剂：MTP抑制剂、胆固醇酯转移蛋白、HMG CoA还原酶抑制剂、角鲨烯合成酶抑制剂、苯氧酸衍生物、LDL受体活性上调剂、脂肪加氧酶抑制剂以及ACAT抑制剂。来自这些类别的特定实例包含普伐他汀(pravastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、尼伐他汀(nisvastatin)、维沙他汀(visastatin)、非诺贝特(fenofibrate)、吉非罗齐(gemfibrozil)、氯贝丁酯(clofibrate)、阿伐麦布(avasimibe)、TS-962、MD-700、CP-52941 4以及LY295 427。
在上述方法的一些实施例中，将经表面活性剂修饰的肽和/或蛋白质(例如式I-A、III-A或III-B的肽产物)与肽激素和其类似物组合投与，已知所述肽激素和其类似物在动物模型和人中展现促饱腹作用。本文所提供的实施例的范畴内涵盖本文所述的肽产物与用于治疗肥胖的长效饱腹感剂的组合。此类肽饱腹感剂的实例包括GLP-1、胰腺多肽(PP)、胆囊收缩素(CCK)、肽YY(PYY)、淀粉素、降血钙素、OXM、神经肽Y(NPY)以及其类似物(布鲁姆,S.R.等人，(2008)，分子介入，8：82-98(Bloom,S.R.,et al.(2008)Mol Interv8:82-98)；菲尔德,B.C.等人，(2009)，英国临床药理学杂志，68：830-843(Field,B.C.,etal.(2009)Br JClin Pharmacol 68:830-843))。
本文所提供的实施例的范畴内还涵盖治疗肥胖的方法，其包含投与本文所述的肽产物与肽激素的组合，所述肽激素包括(并且不限于)瘦素、胃内激素以及CART(可卡因和安非他明调节的转录)类似物和拮抗剂。
身体中的其它肽产物与脂肪细胞或肥胖状态(脂肪因子)有关并且已知具有促炎性作用(冈萨雷斯-佩雷斯,A.和科莱恩,J.(2010)，科学世界杂志，10：832-856(Gonzalez-Periz,A.and Claria,J.(2010)ScientificWorldJournal 10:832-856))。此类药剂在与本文所述的肽产物组合使用时将具有其它有利的作用。在与本文所述的肽产物组合使用时提供有益作用的药剂的实例包括脂联素、趋化素、内脂素、新脂肪因子、网膜素、抵抗素、TNFα、IL-6和肥胖抑制素的类似物和拮抗剂。
中间物
在一个实施例中，本文提供以下中间物和/或试剂，其包含表面活性剂部分和能够与天然或非天然氨基酸上的反应性官能团形成一键的反应性官能团。这些中间物和/或试剂使得可改良用于人类和动物疾病的肽和/或蛋白质的生物可用性和医药、药物动力学和/或药效行为。将此类中间物和/或试剂经由官能团共价连接到氨基酸侧链上(例如Lys的ε-氨基官能团，Cys的硫氢基上或肽和/或蛋白质目标的氨基或羧基端上)使得可合成本文所述的肽产物。在特定实施例中，非离子型表面活性剂部分为具有O-烷基糖苷取代基的单糖或二糖，所述糖苷键联具有α或β构型。在特定实施例中，O-烷基链为C1-C20或C6-C16烷基链。
在另一个实施例中，本文提供以下中间物和/或试剂，其包含具有模拟O-烷基糖苷键联的某些烷基糖苷键联的非离子型表面活性剂部分和能够与天然或非天然氨基酸上的反应性官能团形成一键的反应性官能团。此类中间物和/或试剂含有S连接的烷基链或N连接的烷基链，并且与O连接的烷基糖苷所连接的产物比较，具有变化的化学和/或酶学稳定性。
在一些实施例中，本文提供的中间物和/或试剂为如下化合物，其中亲水基团为经修饰的葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、葡糖醛酸、二葡糖醛酸等等。在一些实施例中，亲水基团为葡萄糖、麦芽糖、葡糖醛酸或二葡糖醛酸，并且疏水基团为C1-C20烷基链或芳烷基链。在一些实施例中，与疏水基团的糖苷键联具有α构型，并且在一些情况下，在糖变旋异构中心的所述键联为β构型。
在一些实施例中，亲水基团为葡萄糖、麦芽糖、葡糖醛酸或二葡糖醛酸，并且疏水基团为C1-C20烷基或芳烷基链。
在一些实施例中，本文提供的中间物和/或试剂包含含有反应性官能团的表面活性剂，所述反应性官能团为羧酸基、氨基、叠氮基、醛、顺丁烯二酰亚胺、硫氢基、羟基氨基、炔烃等等。
在一些实施例中，中间物和/或试剂为O连接的烷基糖苷，其中一个羟基官能团修饰为羧酸或氨基官能团。在一些实施例中，试剂为α或β构型的1-O-烷基葡糖醛酸，并且烷基链长度为C1到C20。在一些此类实施例中，烷基长度为C6到C16。
在一些实施例中，试剂包含α或β构型的1-O-烷基二葡糖醛酸，并且烷基链长度为C1到C20。在一些此类实施例中，烷基长度为C6到C16。
在一些实施例中，试剂为α或β构型的S连接的烷基糖苷，其中一个羟基官能团修饰为羧酸或氨基官能团。
在一些实施例中，试剂为α或β构型的N连接的烷基糖苷，其中一个羟基官能团修饰为羧酸或氨基官能团。
在又另一个实施例中，本文提供含有共价连接的烷基糖苷的肽和/或蛋白质产物，其具有可接受用于人类和动物疾病的特性。流程1列出示例性非离子型表面活性剂，其可以经修饰以产生适用于合成本文所述的经表面活性剂修饰的肽产物的试剂和/或中间物。
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流程1.市售烷基糖苷类非离子型表面活性剂的实例
在一些实施例中，本文所述的经共价修饰的肽和/或蛋白质将表面活性剂部分并入肽结构中。在特定实施例中，本文所述的经共价修饰的肽和/或蛋白质并入烷基、烷氧基芳基或芳烷基糖苷类非离子型表面活性剂。烷基糖苷为重要商品，并且广泛用于食品、服务和清洁行业。因此其以商业上大规模制备已成为广泛研究的目标。酶学与化学方法均可用于其极低成本地制备(帕克,D.W.等人，(2000)，生物技术通讯，22：951-956(Park,D.W.,etal.(2000)Biotechnology Letters 22:951-956))。这些烷基糖苷可以进一步经修饰以产生用于合成本文所述的经共价修饰的肽和/或蛋白质的中间物。因此，已知优选在6位氧化1-十二烷基β-D-葡糖苷，在氧气存在下使用未保护的材料和铂黑催化剂时产生高产量的相应葡糖醛酸类似物(凡贝肯姆,H.(1990)，作为有机原材料的碳水化合物，289-310(vanBekkum,H.(1990)Carbohydrates as Organic Raw Materials 289-310))。可利用在烷基葡糖苷的6位氧化伯醇的其它化学选择方法。举例来说，使用催化量的2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基(TEMPO)以及化学计量量的有机氧化剂[双(乙酰氧基)碘]苯(BAIB)(德米克,A.等人，(1997)，有机化学杂志，1997：6974-6977(De Mico,A.,et al.(1997)J Org Chem1997:6974-6977))，通过氧化伯羟基得到突出产量的核苷-5'-甲酸(埃普,J.B.和韦德兰斯基,T.S.(1999)，有机化学杂志，64：293-295(Epp,J.B.and Widlanski,T.S.(1999)J Org Chem64:293-295))。此氧化对于伯羟基具有化学选择性，即使在其它第二羟基未经保护时(科迪,J.D.等人，(2005)，美国化学会志，127：3767-3773(Codee,J.D.,et al.(2005)JAm ChemSoc 127:3767-3773))。以类似的方式，通过在水中用TEMPO使用KBr和次氯酸钠作为化学计量氧化剂(米尔克赖特,G.等人，(2004)，脂质化学与物理学，127:47-63(Milkereit,G.,etal.(2004)Chem Phys Lipids 127:47-63))氧化，将1-十二烷基β-D-吡喃葡萄糖苷、1-十四烷基β-D-吡喃葡萄糖苷、1-十六基β-D-吡喃葡萄糖苷、1-十八烷基β-D-吡喃葡萄糖苷和1-二十烷基β-D-吡喃葡萄糖苷氧化为相应糖醛酸(1-十二烷基β-D-葡糖醛酸、1-十四烷基β-D-葡糖醛酸、1-十六烷基β-D-葡糖醛酸、1-十八烷基β-D-葡糖醛酸、1-二十烷基β-D-葡糖醛酸)。实例中提供使用(二乙酰氧基碘)苯(DAIB，也称为BAIB)进行的温和氧化程序。这些葡糖醛酸中间物中的某些可购得(例如辛基b-D-葡糖醛酸；卡波辛斯(Carbosynth)、MO07928)，并且，如所示，大量葡糖醛酸中间物可通过常规方法制备(沙哈曼,M.和谢费尔,H.J.(2003)，欧洲有机化学杂志，351-358(Schamann,M.and Schafer,H.J.(2003)Eur JOrg Chem 351-358)；范登博斯,L.J.等人，(2007)，欧洲有机化学杂志，3963-3976(Van denBos,L.J.,et al.(2007)Eur J Org Chem 3963-3976))，或在需要时购自商业来源。流程2说明例如某些经官能化的表面活性剂中间物，其包含-COOH基团作为用于制备本文所述的中间物和/或试剂的反应性官能团。
流程2.烷基二葡糖醛酸和葡糖醛酸类试剂的实例。
类似地，芳烷基糖苷(包括烷氧基芳基)可以形成密切相关的非离子型表面活性剂的基础。举例来说，4-烷氧基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷通过在三氟化硼醚化物存在下使4-烷氧基酚与五-O-乙酰基β-D-葡萄糖反应而容易地合成。随后，在甲醇/水中使用三甲胺去乙酰化并且如上文和实例中所述选择性氧化，产生适用于形成本文所述的试剂和肽的烷氧基芳基葡糖醛酸试剂(斯米茨,E.等人，(1996)英国化学会志，帕金汇刊I，2873-2877(Smits,E.,et al.(1996)J Chem Soc,Perkin Trans I 2873-2877)；斯米茨,E.等人，(1997)，液晶，23：481-488(Smits,E.,et al.(1997)Liquid Crystals 23:481-488))。
流程3.芳烷基或烷氧基芳基表面活性剂部分的说明性成员。
葡糖醛酸类中间物通过标准偶合剂容易地活化以键联到例如赖氨酸的氨基酸侧链。因此，如流程4中所示，可以在偶合剂存在下使Fmoc-Lys-O-TMS(三甲基硅烷基＝TMS)与辛基β-D-葡糖醛酸反应，随后O-TMS保护基可以在水性处理时水解，产生Fmoc-Lys(1-辛基β-D-葡糖醛酰胺)。在需要在分子的N端区域附近并入表面活性剂部分时，可以使用标准偶合方案将此试剂用于并入到肽的固相合成中。第二羟基可以保持不经保护，因为Lys氨基官能团具有高很多的反应性或其可以通过全乙酰化保护。如果使用经乙酰基保护的形式，那么可以通过用MeOH/NaOMe或MeOH/Et3N处理来以高产量移除乙酰基保护基团。流程4说明本文所述的试剂的制备。
流程4.制备试剂的实例。
在一些实施例中，用于制备本文所述的生物活性肽产物的试剂和/或中间物包含用于并入到合成的肽产物中的经表面活性剂修饰的连接氨基酸的家族。因此，在一个实施例中，本文所述的肽产物以线性方式合成，其中将经官能化的表面活性剂经由连接氨基酸侧链的官能团(例如赖氨酸残基的氨基)连接到经可逆保护的连接氨基酸，产生专有试剂(如流程4中所示)，其可以并入到增长的肽链中，随后剩余肽通过将其它氨基酸连接到半胱氨酸残基来合成。适用于合成本文所述的经修饰的肽和/或蛋白质的保护基在例如(T.W.格林、P.G.M.伍兹，有机合成中的保护基，威立-因特塞斯公司，纽约，1999，503-507，736-739(T.W.Green,P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,Wiley-Interscience,New York,1999,503-507,736-739))中描述，所述文献的揭示内容以引用的方式并入本文中。
在另一个实施例中，本文所述的肽产物通过经由肽链中的连接氨基酸上的适合官能团将经官能化的表面活性剂共价连接到全长肽来合成。
或者，可以在肽的固相合成过程期间将经官能化的表面活性剂添加到已去除保护基的连接氨基酸侧链。举例来说，可以在肽的固相合成期间将烷基葡糖醛酸基直接添加到连接氨基酸侧链(例如去除保护基的Lys侧链)。举例来说，使用Fmoc-Lys(Alloc)-OH作为亚单元提供正交保护，其可以被移除而肽仍在树脂上。因此，使用Pd/硫巴比妥、Pd/1,3-二甲基巴比妥酸(DMBA)或其它Alloc去保护配方去除Lys侧链的保护基使得氨基可暴露而与经酰基保护或未经酰基保护的1-辛基β-D-葡糖醛酸单元偶合或形成侧链内酰胺。最终，随后用低百分比CF3CO2H(TFA)裂解混合物去除保护基将提供所要产物。尽管糖苷键联对强酸不稳定，但此处和别处的经验为其对低百分比TFA裂解条件相对稳定。或者，可以使用糖OH官能团上的酰基保护(例如乙酰基，Ac；苯甲酰基，Bz)或三烷基硅烷基保护来对糖苷键联提供增加的保护。随后，通过碱(NH2NH2/MeOH；NH3/MeOH、NaOMe/MeOH)去除保护基，产生所要去除保护基的产物。流程4说明本文所述的试剂。流程5说明本文所述的肽中间物的非限制性实例。尽管本实例说明肽的N端具有表面活性剂键联的肽，但本文所述方法适用于合成肽的中间区域、C端区域或任何位置具有与表面活性剂的键联的肽中间物。
流程5.肽中间物的说明性实例。
如下文在流程6中所示，其它试剂通过修饰6位官能团产生，得到与氨基酸侧链官能团的不同方式的键联。因此，氨基取代基可用于键联到Asp或Glu侧链。叠氮基或炔烃取代基可用于键联到含有胡伊斯根3+2环加成的互补受体的非天然氨基酸(高蒂尔,M.A.和克洛克,H.A.(2008)，化学通讯(剑桥)，2591-2611(Gauthier,M.A.and Klok,H.A.(2008)ChemCommun(Camb)2591-2611))。可以相应地使用胺氧基或醛官能团键联到醛(即肟键联)或氨基官能团(即还原烷基化)。顺丁烯二酰亚胺或-NH-(C＝O)-CH2-Br官能团可以与Cys或其它SH官能团化学选择性键结。这些类型的键联策略在与本文所述的试剂结合使用时是有利的。有机合成中广泛实践官能团的相互转化，并且可以得到获得本文所列的各官能团修饰的多种途径的综合清单(拉罗克,R.C.(1999))，“综合有机转化”，VCH出版社，纽约(Larock,R.C.(1999))“Comprehensive Organic Transformations”,VCH Publishers,New York))。
因此，例如，通过活化和用叠氮基阴离子置换(反应如碳水化合物化学法中所用的反应)将辛基1-β-D-葡糖苷6位上的伯羟基转化为叠氮基(例如通过甲苯磺酰基化，接着添加NaN3)。通过在吡啶中用硫代乙酸还原(埃洛弗松,M.等人，(1997)，四面体，53：369-390(Elofsson,M.,et al.(1997)Tetrahedron 53:369-390))或通过产生氨基的类似方法(丹吉尔,P.等人，(1994)，液晶，17：589-595(Stangier,P.,et al.(1994)Liquid Crystals17:589-595))将相应的叠氮基还原为氨基官能团。乙炔、胺氧基和醛部分的途径最好以三乙酰氧基形式进行，所述形式可从市售葡糖苷通过用Ac2O处理，接着温和水解伯胺获得。此6-羟基形式可以选择性地氧化为醛，或活化为甲苯磺酸盐或三氟甲磺酸盐并且经NH2OH或乙炔化钠置换。如在所属领域中众所周知，顺丁烯二酰亚胺键联可以经由所示碳键联或优选地经由O或酰胺键联获得，其同样通过置换经活化的羟基或将葡糖醛酸衍生物偶合到氨基连接的顺丁烯二酰亚胺试剂进行。其它官能团相互转化是药物化学领域中的一般技术人员众所周知的并且属于本文所述的实施例的范畴。
本文所述的合成方法的范畴内还涵盖表面活性剂，其中糖和疏水链经由α糖苷键联共价连接。主要为α连接的糖苷的合成途径在所属领域中是众所周知的并且通常用全乙酰基糖产生并且使用酸性催化剂(例如SnCl4、BF3或HCl)实行α-糖基化(丘迪奇,M.和伯斯坦,G.D.(2008)，分子生物学方法，494：187-208(Cudic,M.and Burstein,G.D.(2008)Methods Mol Biol 494:187-208)；威尔,V.等人，(2000)，脂质化学与物理学，104：75-91(Vill,V.,et al.(2000)Chem Phys Lipids 104:75-91)，此类揭示内容以引用的方式并入本文中)。对于二糖糖苷存在类似的合成途径(冯明登,H.M.等人，(2000)，脂质化学与物理学，106：157-179(von Minden,H.M.,et al.(2000)Chem Phys Lipids 106:157-179)，此类揭示内容以引用的方式并入本文中)。随后如上进行官能团相互转化，得到6-羧酸等以用于产生相应α连接的试剂。
流程6列出适用于合成本文所述的经共价修饰的肽和/或蛋白质的某些化合物和试剂。使用对于氨基酸使用单个字母缩写的标准命名法。
流程6.其它试剂实例。
可以通过例如罗斯维尔,P.等人，(1980)，生物化学，19：4108-4115(Rosevear,P.,etal.(1980)Biochemistry 19:4108-4115)，李,Y.T.等人，(1991)，生物化学杂志，266：10723-10726(Li,Y.T.,et al.(1991)J Biol Chem 266:10723-10726)或寇左和厄菲，美国油脂化学家会志，61:1651-1655(1984)(Koeltzow and Urfer,J.Am.Oil Chem.Soc.,61:1651-1655(1984))、美国专利第3,219,656号和美国专利第3,839,318号中所述的已知程序或例如李,Y.T.等人，(1991)，生物化学杂志，266：10723-10726(Li,Y.T.,et al.(1991)JBiol Chem266:10723-10726)，格帕兰,V.等人，(1992)，生物化学杂志，267：9629-9638(Gopalan,V.,et al.(1992)J Biol Chem 267:9629-9638)中所述的酶学方法合成多种烷基糖苷。可以在Fmoc-Ser-OH上使用全乙酰基葡萄糖进行与天然氨基酸(如Ser)的O烷基键联，产生Nα-Fmoc-4-O-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)-L-丝氨酸。将此物质在伯碳原子(6位)处选择性地去除保护基并且如上文所述使用TEMPO/BAIB选择性地氧化，产生相应6-羧基官能团，其可以与亲脂性胺偶合而产生新类别的非离子型表面活性剂和试剂(流程7)。
流程7.非离子型表面活性剂的替代性实例。
疏水性烷基与亲水性糖之间的键联可以尤其包括糖苷、硫代糖苷、酰胺(作为有机原材料的碳水化合物，F.W.利兹坦赛尔编，VCH出版社，纽约，1991(Carbohydrates asOrganic Raw Materials,F.W.Lichtenthaler ed.,VCH Publishers,New York,1991))、脲基(奥地利专利386,414(1988)；化学文摘，110：137536p(1989)(Austrian Pat.386,414(1988)；Chem.Abstr.110:137536p(1989))；参见格鲁伯,H.和戈伯,G.，“反应性蔗糖衍生物”，作为有机原材料的碳水化合物中，第95-116页(Gruber,H.and Greber,G.,“ReactiveSucrose Derivatives”in Carbohydrates as Organic Raw Materials,pp.95-116))或酯键联(糖酯：制备和应用，J.C.科尔伯特编，(新泽西州诺伊斯数据公司)，(1974)(SugarEsters:Preparation and Application,J.C.Colbert ed.,(Noyes Data Corp.,NewJersey),(1974)))。
可以从中选择有用的烷基糖苷以用于对试剂修饰或用于配制本文所述的产物的实例包括：烷基糖苷，如辛基-、壬基-、癸基-、十一烷基-、十二烷基-、十三烷基-、十四烷基-、十五烷基-、十六烷基-、十七烷基-和十八烷基-D-麦芽糖苷、-蜜二糖苷、-葡糖苷或-蔗糖苷(即蔗糖酯)(根据寇左和厄菲(Koeltzow and Urfer)；俄亥俄州莫米市安娜塔斯公司(Anatrace Inc.,Maumee,Ohio)；加利福尼亚州圣地亚哥市卡尔生物化学公司(Calbiochem,San Diego,Calif.)；瑞士福鲁卡化学公司(Fluka Chemie,Switzerland)合成)；烷基硫代麦芽糖苷，如庚基、辛基、十二烷基-、十三烷基-和十四烷基-β-D-硫代麦芽糖苷(根据德菲叶,J.和佩德森,C.，“用于碳水化合物转化技术的氟化氢溶剂和试剂”，作为有机原材料的碳水化合物中，247-265(F.W.利兹坦赛尔编)VCH出版社，纽约(1991)(Defaye,J.and Pederson,C.,“Hydrogen Fluoride,Solvent and Reagent for CarbohydrateConversion Technology”in Carbohydrates as Organic Raw Materials,247-265(F.W.Lichtenthaler,ed.)VCH Publishers,New York(1991))；费仁斯,T.，细菌学杂志，144:7-11(1980)(Ferenci,T.,J.Bacteriol,144:7-11(1980))合成)；烷基硫代葡糖苷，如1-十二烷基-或1-辛基-硫基α或β-D-吡喃葡萄糖苷(俄亥俄州莫米市安娜塔斯公司(Anatrace,Inc.,Maumee,Ohio)；参见西户,S.和土屋,T.，化学快报33：503-508，(1985)(Saito,S.and Tsuchiya,T.Chem.Pharm.Bull.33:503-508(1985)))；烷基硫代蔗糖苷(根据例如拜德,T.P.和罗伯伊特,J.F.，碳水化合物研究，140：9-20(1985)(Binder,T.P.andRobyt,J.F.,Carbohydr.Res.140:9-20(1985))合成)；烷基麦芽三糖苷(根据寇左和厄菲(Koeltzow and Urfer)合成)；蔗糖氨基-烷基醚的长链脂肪族碳酸酰胺(根据奥地利专利382,381(1987)；化学文摘，108：114719(1988)(Austrian Patent 382,381(1987)；Chem.Abstr.,108:114719(1988))和格鲁伯和戈伯，第95-116页(Gruber and Greberpp.95-116)合成)；帕拉金糖和异麦芽糖胺通过酰胺键连接到烷基链的衍生物(根据库恩茨M，“作为合成表面活性剂和聚合物的中间物的基于蔗糖的亲水构建嵌段”，《作为有机原材料的碳水化合物》，127-153(Kunz,M.,“Sucrose-based Hydrophilic Building Blocks asIntermediates for the Synthesis of Surfactants and Polymers”in Carbohydratesas Organic Raw Materials,127-153)合成)；通过尿素连接到烷基链的异麦芽糖胺的衍生物(根据库恩茨合成)；蔗糖氨基-烷基醚的长链脂肪族碳酸酰脲(根据格鲁伯和戈伯，第95-116页(Gruber and Greber,pp.95-116)合成)；以及蔗糖氨基-烷基醚的长链脂肪族碳酸酰胺(根据奥地利专利382,381(1987)；化学文摘，108：114719(1988)(Austrian Patent 382,381(1987)；Chem.Abstr.,108:114719(1988))和格鲁伯和戈伯，第95-116页(Gruber andGreber,pp.95-116)合成)。
可以进一步经修饰以并入用于键联到肽的反应性官能团的一些优选糖苷包括由糖苷或酯键联连接到6、8、10、12、14或16个碳原子的烷基链的糖麦芽糖、蔗糖、葡萄糖和半乳糖，例如己基-、辛基-、癸基-、十二烷基-、十四烷基-和十六烷基-麦芽糖苷、-蜜二糖苷、-蔗糖苷、-葡糖苷以及-半乳糖苷。在身体中，这些糖苷降解为无毒醇或脂肪酸以及寡糖或糖。以上实例说明欲用于本文所主张的方法中的烷基糖苷的类型，然而，所述清单并不意欲是详尽的。
一般来说，这些表面活性剂(例如烷基糖苷)任选地经设计或选择以改良肽的生物特性，以便调节生物可用性、半衰期、受体选择性、毒性、生物分布、溶解性、稳定性(例如热、水解、氧化、对酶降解的抗性等等)、纯化和加工的便利性、结构特性、光谱学特性、化学和/或光化学特性、催化活性、氧化还原电位、与其它分子反应的能力(例如共价或非共价)等等。
表面活性剂
术语“表面活性剂(surfactant)”来自将短语“表面活性剂(surface activeagent)”缩短。在医药应用中，表面活性剂适用于液体医药配制物，在所述液体医药配制物中，其用于多种目的，充当乳化剂、增溶剂和湿润剂。乳化剂使亲脂性或部分亲脂性物质的水溶液稳定。增溶剂提高了医药组合物的组分的溶解性，从而提高可获得的浓度。湿润剂为一种化学添加剂，其降低流体的表面张力，从而诱导其容易地在涂覆其的表面上展开，因此使得甚至用所述流体“湿润”所述表面。湿润剂提供一种方式，其用于使液体配制物实现与粘膜或药物配制物接触的其它表面区域紧密接触。因此，表面活性剂可以为用于稳定本文所述的肽产物的配制物以及用于改良肽自身特性的有用添加剂。
在特定实施例中，可以合成方法获得的烷基糖苷(例如烷基糖苷十二烷基、十三烷基和十四烷基麦芽糖苷、-蜜二糖苷或-葡糖苷以及蔗糖十二烷酸酯、十三烷酸酯和十四烷酸酯)适用于共价连接到如本文所述的肽。类似地，相应的烷基硫代糖苷为可以合成方法获得的稳定表面活性剂，其可接受用于配制物开发。
可以通过适当修饰表面活性剂(例如烷基糖苷)的疏水性或亲水性区域来实现各种物理和表面活性剂特性。举例来说，比较十二烷基麦芽糖苷(DM)与十二烷基葡糖苷(DG)的双层活性的研究发现DM的双层活性比DG高超过三倍，即使疏水性尾部的长度相同(洛佩斯,O.等人，(2002)，胶体聚合物科学，280：352-357(Lopez,O.,et al.(2002)ColloidPolym Sci 280:352-357))。在此特定情况下，极性区域的一致性(二糖相对于单糖)影响表面活性剂行为。在连接到肽(例如本文所述的肽产物)的表面活性剂的情形下，肽区域还可以促进对整个分子的疏水性或亲水性特征。因此，对物理和表面活性剂特性的调节可以用来实现适用于个别肽目标的特定物理和医药特性。
PEG修饰
在一些实施例中，本文所述的经表面活性剂修饰的肽产物进一步经修饰以并入一或多个PEG部分(委罗内塞,F.M.和梅罗,A.(2008)，生物药物，22：315-329(Veronese,F.M.and Mero,A.(2008)BioDrugs 22:315-329))。在一些情况下，并入大PEG链阻止肾脏的肾小球中的肽过滤到此处形成的稀尿中(内斯特,J.J.,Jr.(2009)，当今医药化学，16：4399-4418(Nestor,J.J.,Jr.(2009)Current Medicinal Chemistry 16:4399-4418)，卡利切蒂,P.和委罗内塞,F.M.(2003)，先进药物输送评论，55：1261-1277(Caliceti,P.andVeronese,F.M.(2003)Adv Drug Deliv Rev 55:1261-1277))。在一些实施例中，任选的PEG亲水性链使得可以平衡肽或蛋白质的溶解性和物理特性，所述肽或蛋白质通过并入较长链烷基糖苷部分而被赋予疏水性。
蛋白质的聚乙二醇化也可能具有潜在地负面作用。因此，聚乙二醇化可以使一些蛋白质基本上丧失生物活性，并且这可能涉及特定类别受体的配体。在所述情况下，可逆聚乙二醇化可能是有益的(珀雷格-舒尔曼,T.等人，(2004)，药物化学杂志，47：4897-4904(Peleg-Shulman,T.,et al.(2004)J Med Chem 47:4897-4904)，格林沃尔德,R.B.等人，(2003)，先进药物输送评论，55：217-250(Greenwald,R.B.,et al.(2003)Adv Drug DelivRev 55:217-250)，罗伯茨,M.J.和哈里斯,J.M.(1998)，药学杂志，87：1440-1445(Roberts,M.J.and Harris,J.M.(1998)J Pharm Sci 87:1440-1445))。
此外，分子量增加可以阻止穿透除肾小球膜障壁以外的生理障壁。举例来说，已表明，聚乙二醇化的高分子量形式可以阻止穿透到一些组织，从而降低治疗效果。此外，高分子量可以阻止跨越粘膜障壁(经鼻、经颊、经阴道、经口、经直肠、经肺传递)吸收。然而，延迟吸收可以是高度有利的以投与肺稳定的分子，大大延长作用持续时间。本文所述的肽和/或蛋白质产物具有增加的经粘膜生物可用性，并且这将使得较长链PEG修饰可与表面活性剂修饰结合使用，从而在鼻内或其它经粘膜路径后获得商业上显著的生物可用性。
在一些实施例中，长链PEG聚合物和短链PEG聚合物适用于修饰本文所述的蛋白质和肽。通过吸入投与糖尿病疗法为一种用于药物传递的新方法，并且肺具有高度可穿透的障壁(例如伊旭布拉(Exubera))。对于此应用，延迟穿透肺障壁，优选聚乙二醇化形式，在C10到C400(约250到10,000Da)的较低分子量范围中。因此，通过PEG延长的主要路径为实现高于肾小球过滤截止值的“有效分子量”(大于68kDa)，而使用较短链可以为用于延长在肺中的滞留的路径以治疗肺病和其它呼吸道病状。因此，约500到3000Da的PEG链具有足以减缓进入外周循环但不足以使其具有极长循环时间的尺寸。在一些实施例中，施用聚乙二醇化以向肺组织提供增加的局部功效而使本文所述的经共价修饰的肽和/或蛋白质的全身性副作用的可能性降低。在一些此类实施例中，在约750到约1500Da范围内的PEG链统称为“PEG1K”。
此外，其它聚合物可以与本文所述的化合物结合使用以优化其物理特性。举例来说，聚(2-乙基2-恶唑啉)结合物具有可变的疏水性以及足以提高作用持续时间的尺寸(梅罗,A.等人，(2008)，控制释放杂志，125：87-95(Mero,A.,et al.(2008)J Control Release125:87-95))。此类聚合物与糖的键联产生一类适用于修饰本文所述的肽和/或蛋白质的表面活性剂。
聚乙二醇链经官能化以使得其可结合到肽和/或蛋白质链上的反应性基团。典型的官能团使得可经由聚乙二醇链上相应的羧基、氨基或顺丁烯二酰亚胺基(等等)与肽上的氨基、羧基或硫氢基反应。在一个实施例中，PEG包含C10-C3000链。在另一个实施例中，PEG的分子量高于40,000道尔顿。在又另一个实施例中，PEG的分子量低于10,000道尔顿。PEG作为蛋白质修饰在所属领域中众所周知，并且其用途在例如美国专利第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号；和第4,179,337号中描述。
非传统型PEG链经修饰而性质上为两性的。即，其具有亲水性PEG结构，但经修饰以含有疏水性区域，如脂肪酸酯和其它疏水性组分。参见例如(米勒,M.A.等人，(2006)，生物结合化学，17：267-274)(Miller,M.A.,et al.(2006)Bioconjug Chem 17:267-274))；伊奎瑞布等人，US 6,309,633(Ekwuribe,et al.US 6,309,633)；伊奎瑞布等人，US 6,815,530(Ekwuribe,et al.US 6,815,530)；伊奎瑞布等人，US 6,835,802(Ekwuribe,et al.US 6,835,802))。尽管蛋白质的这些两性PEG结合物原先经开发以提高经口生物可用性，但其在此作用方面相对低效。然而，使用此类具有两性肽的两性PEG结合物将在肺中产生显著延长的滞留而延长这些药物的有用生物活性。优选的PEG链在500到3000Da的分子量范围中。以上参考文献中提供合成这些结合物的方法的详细描述，所述参考文献的全部内容并入本文中。
PEG实体自身不具有连接到目标分子(如肽)的官能团。因此，为产生PEG连接，PEG实体必须首先经官能化，随后使用经官能化的连接将PEG实体连接到目标分子，如肽(格林沃尔德,R.B.等人，(2003)，先进药物输送评论，55：217-250(Greenwald,R.B.,et al.(2003)Adv Drug Deliv Rev 55:217-250)，委罗内塞,F.M.和帕苏婷,G.(2005)，今日药物发现，10：1451-1458(Veronese,F.M.and Pasut,G.(2005)Drug Discov Today 10:1451-1458)，罗伯茨,M.J.等人，(2002)，先进药物输送评论，54：459-476(Roberts,M.J.,et al.(2002)Adv Drug Deliv Rev 54:459-476))。在一个实施例中，位点特异性聚乙二醇化可以经由在肽分子上Cys取代实现。目标肽可以通过如本文所述的固相合成、重组方法或其它方法来合成。
因此，在一些实施例中，本文所述的肽产物包含经烷基糖苷修饰的Lys或其它反应性残基以及至少一个Cys残基、Lys残基或分子别处其它反应性氨基酸残基上的特异性聚乙二醇化。
在另一个实施例中，Lys或具有亲核性侧链的其它残基可以用于并入PEG残基。这可以经由使用与PEG-羧基或PEG-碳酸酯链的酰胺或氨基甲酸酯键联实现。参见例如以下文献中所述：委罗内塞,F.M.和帕苏婷,G.(2005)，今日药物发现，10:1451-1458(Veronese,F.M.and Pasut,G.(2005)Drug Discov Today 10:1451-1458)。替代性方法是经由连接含SH残基(如巯基乙酰基、巯基丙酰基(CO-CH2-CH2-CH2-SH)等等)修饰Lys侧链氨基官能团。或者，PEG链可以在合成过程期间以酰胺形式在C端并入。连接PEG链的其它方法利用与His和Trp的侧链的反应。修饰肽链以使得可连接PEG链的其它类似方法在所属领域中是已知的，并且以引用的方式并入本文中(罗伯茨,M.J.等人，(2002)，先进药物输送评论，54：459-476(Roberts,M.J.,et al.(2002)Adv Drug Deliv Rev 54:459-476))。
配制物
在一个实施例中，如本文中所揭示的经共价修饰的肽或蛋白质提供于配制物中，所述配制物在向个体投与时进一步降低、防止或减少组合物中的肽和/或蛋白质缔合或凝集，例如降低肽和/或蛋白质自缔合或自凝集，或降低与其它肽或蛋白质的缔合或凝集。
高蛋白质浓度下的自缔合在治疗配制物中为有问题的。举例来说，自缔合增加浓缩单克隆抗体在水溶液中的粘度。浓缩胰岛素制剂通过自凝集不活化。尤其在高蛋白质浓度下的这些自缔合蛋白质相互作用减少、调节或消除许多治疗剂的生物活性(克劳德菲特,D.K.等人，(1998)，药物研究，15：254-262(Clodfelter,D.K.,et al.(1998)Pharm Res15:254-262))。在高浓度下配制用以通过注射或其它方法传递的治疗蛋白质可能由于这些蛋白质相互作用而物理上不稳定或变得不可溶。
制备肽和蛋白质配制物中的重大挑战为开发可制造并且稳定的剂型。对于加工和处理至关重要的物理稳定特性通常不充分地表征并且难以预测。遇到多种物理不稳定性现象，如缔合、凝集、结晶和沉淀，如通过蛋白质相互作用和溶解度特性决定。这导致重大的制造、稳定性、分析和传递挑战。在许多临床情况下需要关于需要高剂量(级别为mg/kg)的肽和蛋白质药物开发配制物。举例来说，使用皮下途径，大致<1.5mL为可允许的投与体积。这可能需要>100mg/mL蛋白质浓度以实现充足剂量。类似考虑因素存在于关于单克隆抗体开发高浓度冻干配制物中。一般来说，较高蛋白质浓度准许使用较小注射体积，其对于患者舒适性、便利性和顺应性极重要。本文所述的经表面活性剂修饰的化合物经设计以使此类凝集事件最小化并且可以通过使用少量如本文所描述的表面活性剂进一步促进。
由于注射对于许多人来说是不适的投与模式，已寻求投与肽治疗剂的其它方法。某些肽和蛋白质治疗剂可以例如通过鼻内、颊内、经口、经阴道、吸入或其它经粘膜投与来投与。实例为那法瑞林(nafarelin)和降血钙素，其以商业经鼻喷雾配制物形式投与。本文所述的经共价修饰的肽和/或蛋白质经设计以促进此类经粘膜投与且此类配制物可以通过使用少量如本文所描述的表面活性剂进一步促进。
典型的配制参数包括选择最优溶液pH、缓冲液和稳定化赋形剂。另外，冻干饼状物复水对于冻干或粉末状配制物重要。另外并且显著的一个问题包含蛋白质配制物在自缔合时的粘度的变化。粘度的变化可能显著改变传递特性，例如在鼻内、经肺或口腔喷雾剂的喷雾(气溶胶)传递中。此外，增加的粘度可能使得通过注射器或静脉内管线的注射传递更困难或不可能。
已报导许多稳定和维持肽的完整性和生理活性的尝试。一些尝试已产生针对热变性和凝集的稳定化，尤其用于胰岛素泵送系统。描述聚合表面活性剂(瑟罗,H.和盖森,K.，(1984)，糖尿病学，27：212-218(Thurow,H.and Geisen,K.(1984)Diabetologia 27:212-218)；查瓦拉,A.S.等人，(1985)，糖尿病，34：420-424(Chawla,A.S.,et al.(1985)Diabetes34:420-424))。相信胰岛素通过这些化合物的稳定化是立体性质的。在使用的其它系统中包括糖(荒川,T.和季马舍夫,S.N.，(1982)，生物化学，21：6536-6544(Arakawa,T.and Timasheff,S.N.(1982)Biochemistry 21:6536-6544))、如氨基酸的渗透剂(荒川,T.和季马舍夫,S.N.，(1985)，生物物理杂志，47：411-414(Arakawa,T.and Timasheff,S.N.(1985)Biophys J 47:411-414))和如脲的水结构裂解剂(佐藤,S.等人，(1983)，药学杂志，72：228-232(Sato,S.,et al.(1983)J Pharm Sci 72:228-232))。这些化合物通过调节蛋白质或肽的分子内疏水性相互作用发挥其作用。
各种肽、肽或蛋白质描述于本文中且可以经本文所述的共价结合表面活性剂试剂中的任一者修饰。有利地，本文所述的肽修饰包含共价连接包含亲水性(例如糖)和疏水性(例如烷基链)基团二者的表面活性剂，进而允许肽在生理条件下的稳定化。在一些实施例中，包含亲水基团和疏水基团的部分(例如糖苷表面活性剂)与本文所述的肽和/或蛋白质的共价键联消除对于修饰肽和/或蛋白质的氨基酸序列以增强稳定性(例如减少凝集)的需要。
在一些实施例中，配制物包含至少一种包含经本文所述的表面活性剂衍生试剂修饰并且在配制中另外可能与表面活性剂相关的肽的药物，其中表面活性剂进一步由例如糖、烷基糖苷或其它赋形剂组成并且可以选自由以下组成的群组的形式投与：滴剂、喷雾、气溶胶、冻干物、喷雾干燥产物、可注射和持续释放形式。喷雾和气溶胶可以通过使用适当分配器获得并且可以通过鼻内、经颊、吸入或其它经粘膜途径投与。冻干物可能含有其它化合物，如甘露糖醇、糖、次微米级无水α-乳糖、明胶、生物相容性凝胶或聚合物。持续释放形式可以是眼插入物、易侵蚀微粒、可水解聚合物、膨胀粘膜粘附微粒、pH敏感微粒、纳米粒子/乳胶系统、离子交换树脂和其它聚合凝胶和植入物(毛果芸香碱药膜，加利福尼亚州阿尔扎公司(Ocusert,Alza Corp.,California)；乔希,A.、S.萍和K.J.希美尔斯坦，专利申请WO 91/19481(Joshi,A.,S.Ping and K.J.Himmelstein,Patent Application WO 91/19481))。也可实现显著口服生物可用性。
本文所述的肽和蛋白质修饰缓和并且在一些情况下可能消除对于有机溶剂的需要。海藻糖、乳糖和甘露糖醇以及其它糖已用于防止凝集。通过与海藻糖以300:1到500:1(赋形剂:蛋白质)范围内或其以上的摩尔比配制使抗-IgE人类化单克隆抗体的凝集最小化。但是，粉末为过度粘着的并且不适合于气溶胶投与或在储存期间展现不希望的蛋白质糖化(安迪亚,J.D.等人，(1999)，药物研究，16：350-358(Andya,J.D.,et al.(1999)PharmRes16:350-358))。发现添加剂中的每一者作为治疗剂的添加剂具有限制，包括异生物质代谢、刺激或毒性或高成本。与本文所述的经共价修饰的肽和/或蛋白质一起使用涵盖有效、非刺激性且无毒、不需要异生物质代谢的赋形剂，因为其由天然糖、脂肪酸或长链醇组成，且其也可以用于在水溶液中或在通过如血浆或唾液的水性体液的生理复水就地复水干燥肽和/或蛋白质配制物时使凝集最小化。
其它配制物组分可以尤其包括缓冲剂和生理盐、无毒蛋白酶抑制剂(如抑肽酶和大豆胰蛋白酶抑制剂)、α-1-抗胰蛋白酶和蛋白酶不活化单克隆抗体。缓冲剂可以包括有机物，如乙酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐、反丁烯二酸盐、苹果酸盐、聚赖氨酸、聚谷氨酸盐、壳聚糖、硫酸葡聚糖等，或无机物，如磷酸盐和硫酸盐。此类配制物可以另外含有较小浓度的抑菌剂，如苯甲醇等。
适合于鼻内投与的配制物也包含本文所述的经修饰的肽和/或蛋白质产物于可接受蒸发溶剂，如氢氟烷烃中的溶液或悬浮液。此类配制物适合于从定量雾化吸入器(MDI)投与且具有不从投与位点移动、低刺激性和不存在消毒需要的优势。此类配制物也可以含有可接受的赋形剂或膨胀剂，如次微米级无水α-乳糖。
在另一方面中，本文所述的经共价修饰的肽和/或蛋白质展现增加的存放期。如本文所用，短语“存放期”广泛地描述为产物在不变得不适合于使用或消费的情况下可以储存的时间长度。本文所述的组合物的“存放期”也可以表明对应于组合物的品质中的可容许损失的时间长度。如本文所用的组合物存放期与到期日期有区别；“存放期”涉及本文所述的组合物的品质，而“到期日期”更涉及组合物的制造和测试要求。举例来说，已经过其“到期日期”的组合物仍可能是安全和有效的，但制造商不再保证最佳品质。
给药
本文所述的经共价修饰的肽和/或蛋白质可以任何在多种疾病病况中赋予有益的治疗效果的量投与。在一些实施例中，本文所述的经共价修饰的肽和/或蛋白质适用于治疗炎症。在一个实施例中，本文中呈现的化合物在调节手术后或慢性疼痛中赋予有益的活性。在一个实施例中，肽以高于或低于调节疼痛的其它治疗形式的浓度向患者投与。在另一实施例中，肽与其它化合物一起投与以产生协同治疗作用。
代表性传递方案包括经口、经粘膜投与、非经肠(包括皮下、腹膜内、肌肉内和静脉内注射)、经直肠、颊内(包括舌下)、经皮、吸入、经眼和经粘膜(包括鼻内)投与模式。传递肽的有吸引力和广泛使用的方法需要皮下注射控制释放的可注射配制物。在一些实施例中，本文所述的经共价修饰的肽和/或蛋白质适用于皮下、鼻内和吸入投与。此外，取决于治疗的病状，这些治疗组合物全身性或局部地投与。配制和投与技术可以发现于最新版“雷明顿氏药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)”(宾夕法尼亚州伊斯顿市马克出版公司(Mack Publishing Co,Easton Pa))中。
精确剂量和组成以及最适当传递方案的选择将尤其受选定肽的药理学特性、治疗的病状的性质和严重程度以及接受者的身体状况和精神敏锐度影响。另外，投与途径将导致有差别的量的吸收材料。通过不同途径投与肽的生物可用性尤其可变，可见从小于1％到接近100％的量。通常，除静脉内、腹膜内或皮下注射以外的途径的生物可用性为50％或50％以下。
一般来说，本文所述的经共价修饰的肽和/或蛋白质或其盐通过皮下注射以每日每千克体重约0.1与1000μg之间，或每日每千克体重约0.1到约100μg之间的量投与。对于50kg人类女性受试者，活性成分的日剂量为通过皮下注射的约5到约5000μg，或约5到约5000μg。取决于投与途径、化合物效能、药物动力学概况和观测的可适用的生物可用性，将需要不同剂量。通过吸入，日剂量为1000到约20,000μg，每日两次。在如马、狗和牛的其它哺乳动物中，可能需要较高剂量。此剂量可以按达成最有效结果的需要通过单次投与、通过多次施用或经由控制释放以常规医药组合物传递。
可遵循任何合适的给药时程投与任何本文所述的经共价修饰的肽和/或蛋白质或其盐。在一些实施例中，每日、每周、每两周或每月投与所述剂量。在一些实施例中，每周一次或每周两次投与所述剂量。在其它实施例中，每周三次、每周四次、每周五次、每周六次或每周七次投与所述剂量。在一些实施例中，一天一次一天两次或每两天一次投与所述剂量。在一些实施例中，每三天一次、每四天一次、每五天一次或每六天一次投与所述组合物。在一些实施例中，每月投与所述剂量。
药学上可接受的盐保留亲本肽的所需生物活性而无毒性副作用。此类盐的实例为(a)与例如氢氯酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等的无机酸形成的酸加成盐；和与如乙酸、三氟乙酸、酒石酸、丁二酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、葡萄糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、丹宁酸、双羟萘酸、褐藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等的有机酸形成的盐；(b)与如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等多价金属阳离子；或与由N,N'-二苯甲基乙二胺或乙二胺形成的有机阳离子形成的碱加成盐或络合物；或(c)(a)和(b)的组合，例如丹宁酸锌盐等。
在一些实施例中，也涵盖包含本文所述的经共价修饰的肽和/或蛋白质或其药学上可接受的盐作为活性成分的医药组合物，其在与药学上可接受的无毒载剂的混杂物中。如上所述，此类组合物可以制备用于非经肠(皮下、肌肉内或静脉内)投与，尤其呈液体溶液或悬浮液形式；用于经口或颊内投与，尤其呈锭剂或胶囊形式；用于鼻内投与，尤其呈散剂、经鼻滴剂、蒸发溶液或气溶胶形式；用于吸入，尤其呈与广泛定义的赋形剂的液体溶液或干燥散剂形式；和用于经直肠或经皮投与。
所述组合物可以便利地以单位剂型投与并且可以通过医药技术中众所周知的的方法中的任一种制备，例如如雷明顿氏药物科学，第17版，宾夕法尼亚州伊斯顿市马克出版公司，(1985)中所述，所述文献以引用的方式并入本文中。用于肠胃外投与的配制物可以含有无菌水或生理盐水、如丙二醇的烷二醇、如聚乙二醇的聚亚烷基二醇、糖类、植物来源的油、氢化萘、血清白蛋白纳米粒子(如伊利诺伊州绍姆堡美国医药合伙人公司(AmericanPharmaceutical Partners,Inc.Schaumburg IL)的AbraxaneTM中所使用)等作为赋形剂。对于经口投与，配制物可以通过添加胆盐或酰肉碱强化。用于经鼻投与的配制物可以是如氢氟碳的蒸发溶剂中的固体或溶液，并且可以含有用于稳定化的赋形剂，例如糖类、表面活性剂、次微米级无水α-乳糖或聚葡萄糖，或可以是以经鼻滴剂或定量喷雾形式使用的水性或油性溶液。对于颊内投与，典型的赋形剂包括糖、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预胶凝化淀粉等。
当配制用于经鼻投与时，跨越鼻粘膜的吸收可以通过以在约0.1与15重量％之间、在约0.5与4重量％之间或约2重量％的范围内的量的表面活性剂，如甘氨胆酸、胆酸、牛磺胆酸、乙胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氢胆酸、甘氨脱氧胆酸、环糊精等进一步增强。据报导展现较大功效以及减少的刺激的另一类吸收增强剂为烷基麦芽糖苷种类，如十四烷基麦芽糖苷(阿诺德,J.J.等人，(2004)，药学杂志，93：2205-2213(Arnold,J.J.,et al.(2004)JPharm Sci 93:2205-2213)，阿赫桑,F.等人，(2001)，药物研究，18：1742-1746(Ahsan,F.,et al.(2001)Pharm Res 18:1742-1746))和其中的参考文献，其全部特此以引用的方式并入。
当配制用于通过吸入传递时，多种配制物提供优势。将活性肽吸收到易于分散的固体，如二酮哌嗪(例如Technosphere粒子；(普富茨纳,A.和福斯特,T.，(2005)，药物传递专家意见，2：1097-1106(Pfutzner,A.and Forst,T.(2005)Expert Opin Drug Deliv 2:1097-1106))或类似结构得到导致治疗剂的快速初始吸收的配制物。含有活性肽和赋形剂的冻干散剂，尤其是玻璃状粒子适用于以良好生物可用性传递到肺，例如参见(辉瑞(Pfizer)和安万特药物公司(Aventis Pharmaceuticals Inc.)的吸入胰岛素)。描述通过吸入传递肽的其它系统(曼达勒,T.K.，美国保健系统药物杂志，62：1359-64，(2005)(Mandal,T.K.,Am.J.Health Syst.Pharm.62:1359-64(2005)))。
经延长的时间段，例如一周到一年的时段向个体传递本文所述的经共价修饰的肽和/或蛋白质可以通过持续所需释放时段单次投与含有足够活性成分的控制释放系统实现。各种控制释放系统，如单片或储集器型微胶囊、储槽式植入物、聚合水凝胶、渗透泵、小泡、胶束、脂质体、经皮贴片、离子导入装置和替代性可注射剂型可以用于此目的。控制释放赋形剂也已经开发用于每周两次或每周投药，例如经保护接枝共聚物系统(卡斯蒂略,G.M.等人，(2012)，药物研究，29：306-18(Castillo,G.M.,et al.(2012)Pharm Res29:306-18))可用于疏水性或疏水改性肽，如本发明的那些肽。定位于传递活性成分所需的位点是一些控制释放装置的另一特征，其可能在治疗某些病症中证实为有益的。
一种形式的控制释放配制物含有分散或囊封于如共聚(乳酸/乙醇酸)的缓慢降解、无毒、非抗原聚合物中的肽或其盐，如以引用的方式并入本文中的肯特(Kent)、路易斯(Lewis)、桑德斯(Sanders)和泰斯(Tice)的创始工作美国专利第4,675,189号中所述。化合物或其盐也可以配制于胆固醇或其它脂质基质集结粒，或硅弹性体基质植入物中。其它缓慢释放、储槽式植入物或可注射配制物将为所属领域的技术人员显而易见。参见例如持续和控制释放药物传递系统，J.R.罗宾逊编，纽约马塞尔德克公司，1978(Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978)和R.W.贝克，生物活性剂的控制释放，纽约约翰·威利父子公司，1987(R.W.Baker,Controlled Release of Biologically Active Agents,John Wiley&Sons,New York,1987)。
另一种形式的控制释放配制物包含可生物降解聚合物，如共聚(乳酸/乙醇酸)或乳酸和PEG的嵌段共聚物于生物可接受的溶剂中的溶液，其经皮下或肌肉内注射以实现储槽式配制物。混合本文所述的肽与所述聚合配制物适合于实现作用配制物的极长持续时间。
如本文所用，出于本文的目的，“治疗有效量”与“有效量”可互换，并且通过此类考虑因素判定为所属领域中已知的。所述量必须对于在治疗罹患其疾病的个体中实现所需药物介导效应有效。治疗有效量也包括(但不限于)由所属领域的技术人员选择的适当量度，例如改善的生存率，更快速的恢复，或症状的改善、改良或消除，或其它可接受生物标记物或替代标记物。
然而，应了解，对于需要治疗的任何特定个体，特定剂量水平和给药频率可以变化并且取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性、所述化合物的代谢稳定性和作用持续时间、年龄、体重、一般健康状况、性别、膳食、投药模式和时间、排泄速率、药物组合、特定病状的严重性以及宿主经历的疗法。
给药方法包括本文所述的组合物的所有方面，包括(但不限于)减少或消除肽和/或蛋白质药物的免疫原性、为非刺激的、具有抗细菌或抗真菌活性、具有增加的药物稳定性或生物可用性、减少药物的生物可用性差异、避免肝第一通间隙(first pass liverclearance)和减少或消除任何副作用的组合物。如本文所用，术语“免疫原性”为特定物质或组合物或药剂刺激免疫反应的能力。通过所属领域中已知的方法确认本文所述的经共价修饰的肽和/或蛋白质的免疫原性。
本说明书中提及的所有公开案和专利申请都以引用的方式并入本文中，引用的程度为使每个单独公开案或专利申请都经特定且单独指示从而以引入的方式并入一般。
本文所述的经共价修饰的肽和/或蛋白质和用于其合成的试剂更具体地描述于下文实例中，所述实例仅预期为说明性的，因为其中的许多修改和变化将为所属领域的一般技术人员显而易见。
实例
实例1：试剂-N-α-Fmoc,N-ε-(1-辛基β-D-葡萄糖苷酸-6-基)-L-赖氨酸
在烘干的250mL锥形瓶中放置1-辛基β-D-葡萄糖醛酸(卡波辛斯有限公司(Carbosynth Ltd.)，3.06g，10mmol)、50mL无水DMF和无水1-羟基苯并三唑(1.62g，12mmol)。在搅拌的情况下添加N,N'-二环己基碳化二亚胺(2.48g，12mmol)于50mL DMF中的冷冻(4℃)溶液，且使反应进行5分钟。在烧结玻璃漏斗上过滤N,N'-二环己基脲的大量白色沉淀且将滤液添加到N-α-Fmoc-L-赖氨酸(3.68g，10mmol)于25ml无水DMF中的溶液中。使反应在升温至室温的情况下进行25分钟或直到茚三酮颜色极淡。过滤反应混合物，汽提到干燥且通过溶解于MeOH中而从MeOH/Et2O结晶并且用Et2O缓慢稀释到浊点，接着冷藏。可以通过使用EtOAc至EtOAc/EtOH/AcOH的溶剂梯度的硅胶色谱实现进一步纯化。
以类似方式，但取代N-α-Boc-L-赖氨酸获得N-α-Boc,N-ε-(1-辛基β-D-葡萄糖苷酸-6-基)-L-赖氨酸，其适合于N末端并入和裂解至自由N端。以类似方式，但取代N-α-Ac-L-赖氨酸获得N-α-Ac,N-ε-(1-辛基β-D-葡萄糖苷酸-6-基)-L-赖氨酸，其适合于在具有阻断N端的肽的N端处并入。以类似方式，但取代适当量的N-α-Fmoc-L-鸟氨酸获得N-α-Fmoc,N-δ-(1-辛基β-D-葡萄糖苷酸-6-基)-L-鸟氨酸。以类似方式，但取代其它N-单保护二氨基酸，我们获得对应试剂。或者，在偶合期间且在不预活化1-辛基β-D-葡萄糖醛酸的情况下使用瞬态Me3Si酯保护基提供形成试剂的便捷途径。通过Fmoc-Lys-OH与等摩尔量的N,O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺在二氯甲烷(CH2Cl2)中的反应产生瞬态Me3Si酯。有机层以易于与如上所述的1-烷基葡萄糖醛酸苷偶合的CH2Cl2中的溶液形式含有所需试剂。用水性NaHSO4洗涤经过滤反应混合物以水解Me3Si酯，经MgSO4干燥且去除溶剂。
类似地，但使用全乙酰基或全苯甲酰基1-辛基β-D-葡萄糖醛酸，我们获得试剂的Ac或Bz保护形式(例如2,3,4-三乙酰基1-辛基β-D-葡萄糖醛酸等，由用Ac2O处理形成)。此类试剂在自树脂的酸裂解期间具有增加的稳定性且在去保护期间检测到不稳定性时使用，参见(吉伯格,J.等人，(1997)，酶学方法，289：221-245(Kihlberg,J.,et al.(1997)Methods Enzymol 289:221-245))和其中的参考文献。通过使用如上文所述的MeOH/NH3、MeOH/NaOMe、MeOH/NH2NH2的裂解之后的碱催化的转酯化进行此类产物的最终去保护。
实例2：合成肽类似物
一般来说，肽合成方法涉及连续添加经保护氨基酸至生长肽链。通常，第一氨基酸的氨基或羧基和任何反应性侧链基团经保护。此经保护氨基酸随后附接到惰性固体载体，或用于溶液中，并且也适当经保护的序列中的下一氨基酸在能够形成酰胺键联的条件下添加。在所有所需氨基酸已经以恰当顺序连接之后，去除保护基和任何固体载体以获得粗肽。对肽脱盐且色谱地纯化。
制备具有少于约50个氨基酸的生理学活性截短肽的类似物的优选的方法涉及固相肽合成。在此方法中，α-氨基(Nα)官能团和任何反应性侧链经酸或碱敏感基团保护。保护基应对肽键联形成的条件稳定，同时在不影响现存肽链的情况下易于可去除。合适的α-氨基保护基包括(但不限于)叔丁氧基羰基(Boc)、苯甲氧羰基(Cbz)、邻氯苯甲氧羰基、联苯异丙氧羰基、叔戊氧羰基(Amoc)、异冰片氧羰基、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基苯甲氧羰基、邻硝基苯次磺酰基、2-氰基-叔丁氧羰基、9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)等，优选为Boc或更优选为Fmoc。合适的侧链保护基包括(但不限于)：乙酰基、苯甲基(Bzl)、苯甲氧基甲基(Bom)、Boc、叔丁基、邻溴苯甲氧羰基、叔丁基、叔丁基二甲基硅烷基、2-氯苯甲基(Cl-z)、2,6-二氯苯甲基、环己基、环戊基、异丙基、特戊酰基、四氢吡喃-2-基、甲苯磺酰基(Tos)、2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)、三甲基硅烷基和三苯甲基。就合成化合物来说优选的Nα保护基为Fmoc基团。优选的侧链保护基为就Glu、Tyr、Thr、Asp和Ser来说的O-叔丁基；就Lys和Trp侧链来说的Boc基团；就Arg来说的Pbf基团；就Asn、Gln和His来说的Trt基团。关于Lys残基的选择性修饰，通过不被裂解基于Fmoc或叔丁基的保护基的试剂去除的保护基的正交保护为优选的。Lys侧链的修饰的优选实例包括(但不限于)经肼去除但不经哌啶去除的那些；例如1-(4,4-二甲基-2,6-二氧环亚己-1-基)-3-甲基丁基(ivDde)或1-(4,4-二甲基-2,6-二氧环亚己-1-基)乙基(Dde)和烯丙氧羰基(Alloc)。
Fmoc-Lys(ivDde)或Fmoc-Lys(Dde)保护基流程在需要侧链内酰胺形成的情况下为优选的(小休斯顿,M.E.等人，(1995)，肽科学杂志，1：274-282(Houston,M.E.,Jr.,etal.(1995)J Pept Sci 1:274-282)；穆拉盖,E.N.等人，(2010)，药物化学杂志(Murage,E.N.,etal.(2010)J Med Chem))，因为在此状况下可以并入Fmoc-Glu(O-烯丙基)和Fmoc-Lys(Alloc)且用于提供瞬态保护，随后脱除保护基以用于内酰胺形成，同时保留Lys(Dde)保护基以随后去除和与官能化表面活性剂反应。在通过使用所属领域中众所周知的标准方案，用N,N'-二异丙基碳化二亚胺(DIC)/1-羟基苯并三唑(HOBt)或2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸铵(HBTU)/N,N-二异丙基乙基胺(DIEA)活化羧基侧链功能之后去除基于烯丙基的保护进行酸性与碱性残基(例如Glu与Lys)之间的侧链内酰胺。
在固相合成中，C端氨基酸首先附接到合适的树脂载体。合适的树脂载体为对于步进式缩合和去保护反应的试剂和反应条件惰性以及不溶于所用介质的那些材料。市售树脂的实例包括经反应性基团修饰的苯乙烯/二乙烯基苯树脂，例如氯甲基化共-聚-(苯乙烯-二乙烯基苯)、羟甲基化共-聚-(苯乙烯-二乙烯基苯)等。苯甲基化、羟甲基化苯基乙酰氨基甲基(PAM)树脂对于制备肽酸为优选的。当化合物的C端为酰胺时，优选的树脂为对甲基二苯甲基氨基-共-聚(苯乙烯-二乙烯基苯)树脂，基于2,4二甲氧基二苯甲基氨基的树脂(“Rink amide”)；4-羟基甲基苯氧基乙酰氨基甲基树脂(HMP Am)等。用于合成较大肽的尤其优选的载体为含有移植到其它聚合矩阵上的PEG序列的市售树脂，如Rink Amide-PEG和PAL-PEG-PS树脂(应用生物系统公司(Applied Biosystems))或设计用于使用Fmoc方案进行肽酰胺合成的类似树脂。因此在某些情况下，需要具有与PEG链的酰胺键联。在那些情况下，将N-Fmoc-氨基-PEG-羧酸连接到上文的酰胺形成树脂(例如Rink amide树脂等)为方便的。链的第一氨基酸可以N-Fmoc-氨基酸形式偶联到PEG链的氨基官能团。最终脱除保护基将产生所需肽-NH-PEG-共-NH2产物。
附接到PAM树脂可以通过Nα保护的氨基酸，例如Boc-氨基酸(呈其铵形式)、铯、三乙铵、1,5-二氮杂双环-[5.4.0]十一-5-烯、四甲基铵或类似盐于乙醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等中，优选地铯盐于DMF中的反应实现，其中树脂在例如约40℃与60℃之间，优选地约50℃的高温下，持续约12到72小时，优选地约48小时。这将在酸裂解后最终产生肽酸产物或在氨解后产生酰胺。
Nα-Boc-氨基酸可以借助于例如在约10℃与50℃之间，优选地25℃的温度下，在如CH2Cl2或DMF，优选地CH2Cl2的溶剂中持续约2到约24小时，优选地约2小时的(DIC)/HOBt介导的偶合附接到二苯甲胺树脂。
对于基于Boc的方案，经保护氨基酸的连续偶合可以通过所属领域中众所周知的方法，通常在自动化肽合成器中进行。在用三乙胺、DIEA、N-甲基吗啉(NMM)、三甲基吡啶或类似碱中和后，将每一经保护氨基酸以大致约1.5到2.5倍摩尔过量引入且在惰性、非水性、极性溶剂，如CH2Cl2、DMF、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N,N-二甲基乙酰胺(DMA)或其混合物中，优选地在二氯甲烷中在环境温度下进行偶合。对于基于Fmoc的方案，没有酸用于脱除保护基，但通常将碱，优选地DIEA或NMM并入偶合混合物中。偶合通常在DMF、NMP、DMA或混合溶剂，优选地DMF中进行。代表性偶合剂为N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳化二亚胺(DIC)或其它碳化二亚胺，单独或在存在HOBt、O-酰基脲、苯并三唑-1-基-氧基三(吡咯烷基)六氟磷酸鏻(PyBop)、N-羟基丁二酰亚胺、其它N-羟基酰亚胺或肟的情况下。或者，可使用经保护氨基酸活性酯(例如对硝基苯基、五氟苯基等)或对称酸酐。优选的偶合剂为铵/脲(供应商使用的替代命名法)类型的，如HBTU、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)、2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸铵(HCTU)等。
附接到Fmoc-PAL-PEG-PS树脂的优选的方法可以通过用DMF中的20％哌啶对树脂连接子脱除保护基，接着在微波辅助肽合成器中使用DMF中的HBTU:二异丙基乙基胺(DIEA)(1:2)，伴以5分钟、最大75°偶合循环进行N-α-Fmoc保护的氨基酸，约5倍摩尔过量的N-α-Fmoc-氨基酸的反应而实现。
关于微波辅助肽合成器中的此基于Fmoc的方案，通过含有0.1M 1-羟基苯并三唑(HOBt)的DMF中的20％哌啶在双重脱除保护基方案中持续30秒，随后在设定于75℃下的温度最大值的情况下持续3min去除N-α-Fmoc氨基酸保护基。将HOBt添加到脱除保护基溶液中以减少天冬酰亚胺形成。下一氨基酸的偶合随后采用5倍摩尔过量，使用HBTU:DIEA(1:2)，伴以5分钟、最大75°双偶合循环。
在固相合成结束时，自树脂去除完全经保护的肽。当与树脂载体的键联为苯甲酯类型时，裂解可以凭借用烷基胺或氟烷基胺对于具有烷基酰胺C端的肽的氨解，或通过用例如氨/甲醇或氨/乙醇对于具有未经取代酰胺C端的肽的氨解，在在约-10℃与50℃之间，优选地约25℃的温度下持续在约12与24小时之间，优选地约18小时实现。具有羟基C端的肽可以通过HF或其它强酸性脱除保护基方案或通过皂化裂解。或者，肽可以通过转酯化，例如用甲醇，接着氨解或皂化从树脂去除。经保护的肽可以通过硅胶或反相HPLC纯化。
可以通过用例如无水液态氟化氢在存在茴香醚或其它阳碳离子清除剂的情况下处理氨解产物、用氟化氢/吡啶复合物处理、用三(三氟乙酰基)硼和三氟乙酸处理、通过用氢和钯/碳或聚乙烯吡咯烷酮还原或通过用液态氨中的钠还原，优选地用液态氟化氢和茴香醚在约-10℃与+10℃之间，优选地约0℃的温度下，持续约15分钟与2小时之间，优选地约1.5小时从肽去除侧链保护基。
对于二苯甲胺类型树脂上的肽，树脂裂解和脱除保护基步骤可以组合于使用如上文所述的液态氟化氢和茴香醚的单一步骤中或优选地通过使用更温和的裂解混合液。举例来说，对于PAL-PEG-PS树脂，优选的方法为通过使用双重脱除保护基方案，其在微波辅助肽合成器中在38℃下使用所属领域中已知的温和裂解混合液中的一者，如TFA/水/三-异丙基硅烷/3,6-二氧杂-1,8-辛二硫醇(DODT)(92.5/2.5/2.5/2.5)，每次持续18分钟。裂解含有烷基糖苷的材料已显示使用TFA/水比率在9/1到19/1范围内的方案的烷基糖苷键联的残存。典型的混合液为94％ TFA；2％ EDT；2％ H2O；2％ TIS。通常，完全脱除保护基的产物经沉淀且用冷(-70℃到4℃)Et2O洗涤，溶解于去离子水中且冻干。
肽溶液可以通过采用以下类型中的任一者或全部的一系列色谱步骤脱盐(例如用BioRad阴离子交换树脂)并且肽通过所述步骤纯化：呈乙酸酯形式的弱碱性树脂上的离子交换；未衍生化共-聚(苯乙烯-二乙烯基苯)，例如/>XAD上的疏水性吸附色谱；硅胶吸附色谱；羧甲基纤维素上的离子交换色谱；分配色谱，例如在/>G-25上；逆流分配；超临界流体色谱；或HPLC，尤其为辛基-或十八烷基硅烷基硅(ODS)键合相柱填充物上的反相HPLC。
本文还提供制备本文所述的经共价修饰的肽和/或蛋白质和其药学上可接受的盐的方法，所述方法包含依序地在合适的树脂载体上缩合经保护氨基酸，去除保护基和树脂载体且纯化产物，获得生理学活性截短同源物的类似物和本文所述的经共价修饰的肽和/或蛋白质的类似物。在一些实施例中，本文所述的经共价修饰的肽和/或蛋白质并有如上文所定义的烷基糖苷修饰。
另一方面涉及制备本文所述的经共价修饰的肽和/或蛋白质和其医药学上可接受的盐的方法，所述方法包含使用基于微波辅助固相合成的方法或标准肽合成方案以依序地在合适的树脂载体上缩合经保护氨基酸、去除保护基和树脂载体且纯化产物，获得如上文所定义的生理学活性肽的类似物。
实例3.糖醛酸的一般氧化方法
向1-十二烷基β-D-吡喃葡萄糖苷(卡波辛斯)[2.0g，5.74mmol]于20mL乙腈和20mL去离子水中的溶液中添加(二(乙酰氧)碘基)苯(福鲁卡(Fluka))[4.4g，13.7mmol]和TEMPO(西格马阿尔德里奇(SigmaAldrich))[0.180g，1.15mmol]。在室温下搅拌所得混合物20h。反应后接着质谱(例如LCQ ESI)并且在完成后，用水稀释反应混合物且冻干到干燥，得到1.52g(粗产率73.1％)呈白色粉末状的粗产物1-十二烷基β-D-葡萄糖醛酸，其不经进一步纯化即直接用于固相合成。此产物通过如说明书中所述的使用NaOCl作为氧化剂的替代方法预先制备，并且也已经用于较长烷基。对于较长烷基，使用1,4-二恶烷代替乙腈且温度升高到高达30℃。以类似方式制备用于制造本文所述的产物和试剂的所需烷基糖类糖醛酸。
以类似方式，但使用例如对应1-辛基、1-癸基、1-十一烷基、1-十四烷基、1-十六烷基和1-十八烷基糖苷(购自俄亥俄州莫米市安娜塔斯(Anatrace,Maumee,OH))制备用于制造本文所述的产物和试剂的所需1-烷基糖类糖醛酸。以类似方式，但使用例如对应1-辛基、1-癸基、1-十一烷基、1-十四烷基、1-十六烷基和1-十八烷基β-D-蜜二糖苷或β-D-麦芽糖苷 (购自俄亥俄州莫米市安娜塔斯)制备用于制造本文所述的产物和试剂的所需1-烷基二糖糖醛酸。
实例4：制备类似物EU-A387.
如下制备Fmoc-His-Aib-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Bip-Ser-Lys-Tyr-Leu-Glu-Ser-Lys(Alloc)-Rink amide树脂样品：通过连续添加如实例1中所述的N-α-Fmoc保护的氨基酸并且通过与DMF/CH2Cl2(1:1)中的Pd(PPh3)4(0.5当量)和DMBA(20当量)一起在室温下在暗处培育过夜在Lys-N-ε位置脱除保护基。在通过DMF/CH2Cl2洗涤后，Lys侧链通过使用DIC/HOBt以DMF/CH2Cl2中的1'-十二烷基β-D-葡萄糖醛酸酰化。通过茚三酮检查偶合的完成且用CH2Cl2充分洗涤产物。
将产物树脂呈递到从树脂的最终脱除保护基和裂解，其通过用裂解混合液(94％TFA；2％ EDT；2％ H2O；2％ TIS)在室温下持续240分钟的时段的处理。用Et2O处理混合物以沉淀产物且用Et2O充分洗涤以在真空中的干燥之后产生粗标题肽产物。
通过反相(C18)hplc以两个批次进行纯化。将粗肽加载于15mL/min的流动速率下的4.1×25cm hplc柱(15％有机改性剂；乙酸缓冲液)上且在50℃下在60分钟内以15％-45％缓冲液B的梯度洗脱。冻干产物洗脱份以产生标题产物肽，其根据分析型hplc(18.6分钟；30％-60％ CH3CN，于0.1％ TFA中)/质谱(M+1峰值＝2382.14)具有98.03％纯度。以类似方式制备本发明的其它类似物，其表征说明于下文中。
以类似方式制备标题化合物的对应1-甲基和1-辛基类似物，但使用试剂1'-甲基β-D-葡萄糖醛酸和1'-辛基β-D-葡萄糖醛酸(卡波辛斯)。使用如上文所述制备的对应葡萄糖醛酸制备对应1-癸基、1-十二烷基、1-十四烷基、1-十六烷基、1-十八烷基和1-二十烷基类似物。或者，1-烷基葡糖醛酸基或其它糖醛酸酰化类似物可以通过初始纯化脱除保护基或部分脱除保护基的肽，接着通过所需糖醛酸试剂酰化来制备。
实例5：制备类似物EU-A1024.
Boc-His(Trt)-Aib-Gln(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Glu(O-Allyl)-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Alloc)-Glu(O-tBu)-Phe-Ile-Lys(Dde)-Trp(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-HMP酰胺树脂(以Fmoc-Thr(tBu)-HMP Am树脂为起始物，取代0.45mmol/g)样品通过连续添加如实例1中所述的N-α-Fmoc保护的氨基酸制备。Glu和Lys上的基于烯丙基的侧链通过与DMF/CH2Cl2(1:1)中的Pd(PPh3)4(0.5当量)和DMBA(20当量)一起在室温下在暗处培育过夜脱除保护基。用DMF中的0.5％ DIEA(两次)、DMF中的0.5％二乙基二硫代氨基甲酸钠(两次)和DMF/CH2Cl2洗涤树脂直到获得浅黄色树脂。侧链内酰胺键联由通过DMF中的DIC/HOBT(5当量)偶合Glu和Lys形成。用茚三酮检查反应的完成度且在必要时再偶合。在通过DMF/CH2Cl2洗涤后，Lys侧链通过与DMF(10当量)中的5％水合肼一起培育两次而脱除保护基，在各情况下持续15分钟。在通过DMF/CH2Cl2洗涤后，脱除保护基的Lys残基的侧链氨基与1'-十四烷基β-D-蜜二糖醛酸通过使用DIC/HOBt在DMF/CH2Cl2中反应。通过茚三酮检查偶合的完成且用CH2Cl2充分洗涤产物。再运行任何根据茚三酮未完成的偶合。一般来说，从2摩尔合成获得10-12g肽产物树脂。
将产物树脂呈递到从树脂的最终脱除保护基和裂解，其通过用裂解混合液(94％TFA；2％ EDT；2％ H2O；2％ TIS)在室温下持续240分钟的时段的处理。用Et2O处理混合物以沉淀产物且用Et2O充分洗涤以在真空中的干燥之后产生粗标题肽产物。一般来说，获得5到8g粗产物肽。
通过反相(C18)hplc以两个批次进行纯化。将粗肽(1-1.5g)加载于15mL/min的流动速率下的4.1×25cm hplc柱(15％有机改性剂；0.1％ TFA缓冲液)上且在室温下在70分钟内以35％-55％缓冲液B的梯度洗脱。对于纯度>70％的洗脱份进行较不纯洗脱份的再纯化。冻干产物洗脱份以产生标题产物肽，其根据分析型hplc(10.3分钟；45％-75％ CH3CN，于0.1％ TFA中)/质谱(1317.67，+3带电；1976.13，+2带电；分子量3950.44)具有98.7％纯度。以类似方式制备本发明的其它类似物，其表征说明于下文中。
以类似方式制备标题化合物的对应1-甲基和1-辛基类似物，但使用试剂1'-甲基β-D-葡萄糖醛酸和1'-辛基β-D-葡萄糖醛酸(卡波辛斯)。以类似方式，但使用对应1-辛基、1-癸基、1-十一烷基、1-十四烷基、1-十六烷基和1-十八烷基β-D-葡萄糖醛酸(如上文所述 制备)制备本发明的产物。以类似方式，但使用对应1-辛基、1-癸基、1-十一烷基、1-十四烷基、1-十六烷基和1-十八烷基β-D-蜜二糖醛酸或β-D-麦芽糖醛酸(如上文所述制备)制备本文所述的产物和试剂。或者，1-烷基葡糖醛酸基或其它糖醛酸酰化类似物可以通过初始纯化脱除保护基或部分脱除保护基的肽，接着通过所需糖醛酸试剂酰化来制备。
通过使用下表中给定的洗脱梯度的阳离子模式的HPLC/质谱进行分析和表征。
/>
0.1％TFA中的HPLC梯度
[a.]经30分钟的35％到65％CH3CN.
[b.]经20分钟的30％到60％CH3CN.
[c.]经20分钟的35％到65％CH3CN.
[d.]经20分钟的25％到55％ CH3CN.
[e.]经20分钟的40％到70％ CH3CN.
[f.]经20分钟的45％到75％ CH3CN.
菲罗门卢纳(Phenomenex Luna)C18 5微米250×4.6mm上的HPLC.如上文所述合成和分析的其它化合物为：
/>
0.1％TFA中的HPLC梯度
[a]经30分钟的35％到65％CH3CN.
[b]经20分钟的30％到60％CH3CN.
[c]经20分钟的35％到65％CH3CN.
[d]经20分钟的25％到55％CH3CN.
[e]经20分钟的40％到70％CH3CN.
[f]经20分钟的45％到75％CH3CN.
[g]经20分钟的50％到80％CH3CN.
[h]经20分钟的10％到40％CH3CN.
[i]经20分钟的30％到90％CH3CN.
在菲罗门卢纳C18 5微米250×4.6mm分析柱上进行HPLC。
实例6：化合物的细胞分析.
化合物以大致1mg的量精确称重并且在标准细胞分析(Cerep SA)中进行分析。读数为在以促效剂或拮抗剂模式的测试化合物处理的细胞中产生的cAMP的量使用的分析为刺激升糖素(人类，克隆到CHO细胞中)和GLP-1(鼠类细胞系)细胞分析中的cAMP含量。所述分析描述于基齐,G.G.等人，(1997)，生物化学杂志，272:7765-7769(Chicchi,G.G.,et al.(1997)J Biol Chem 272:7765-7769)和朗格,S.等人，(2003)，英国药理学杂志，138:787-794(Runge,S.,et al.(2003)Br J Pharmacol 138:787-794)中。
对于化合物EU-A391，GLCR细胞反应并不变化且GLP1R细胞反应在420nM的EC50的情况下急剧上升
n.c.意指EC50不可计算
§意指超促效剂
使用标准细胞分析(迪斯科韦尔克斯(DiscoveRx),LeadHunter分析)，使用cAMP刺激或抑制蛋白活化的读数进行另一系列的细胞分析。化合物以大致1mg的量精确称重并且运送到迪斯科韦尔克斯用于稀释和分析。使用的分析为关于细胞分析中的升糖素(人类，克隆到CHO细胞中)和GLP-1(人类，克隆到CHO细胞中)受体。
实例7：化合物的体内分析-db/db小鼠
用于此研究的60只雌性db/db B6BKS(D)Leprdb/J(品系000697)小鼠在到达时为大致8到9周龄(缅因州巴尔港杰克逊实验室(Jackson Laboratory,Bar Harbor,Maine))。小鼠根据体重随机分组且8只雌性小鼠的两个治疗组各自以100或300毫微摩尔/千克的剂量水平投与测试物品EU-A994、EU-A995或EU-A1026。一组的8只雌性小鼠充当媒剂对照且接受媒剂生理盐水中的0.2％ BSA，pH 7.4。另一组的8只雌性小鼠以50毫微摩尔/千克的剂量水平接受阳性对照物品利拉鲁肽(liraglutide)。在研究期间经由6mL/kg的剂量体积的皮下注射在第1天的大致0、7和24小时处投与测试物品、媒剂和阳性对照物品。
在接收时、在随机分组之前和第1天到第5天每天进行临床观测。在接收时、在随机分组之前和第1天到第5天每天测量和记录体重。第1天到第5天每天测量和记录摄食量。在预测试(第3天)和第1天的第一剂量之后的0、1、2、4、8、10、24、48、72和96小时处收集用于葡萄糖分析的血液样品。在研究终止时，对所有动物进行安乐死且在不进一步评估的情况下丢弃尸体。
关于利拉鲁肽和第2天和第3天的高剂量EU-A994和高剂量EU-A1026和第3天和第4天的低剂量EU-A1026注意到相对于媒剂的显著体重变化。在摄食量分析中，利拉鲁肽处理的动物显著不同于第1天和第2天的媒剂、第1天的高剂量EU-A994、第1天和第2天的低剂量EU-A995、第1天的高剂量EU-A994以及第2天的低和高剂量的EU-A1026，其显著不同于利拉鲁肽。关于10小时处的利拉鲁肽以及10和24小时处的高剂量EU-A994的葡萄糖含量显著不同于媒剂。10小时处的低剂量EU-A995和EU-A1026显著不同于利拉鲁肽(图5)。以类似方式，来自所述系列的其它类似物关于对血糖、体重和摄食量的影响进行测试。
实例8：化合物的体内分析-DIO小鼠
从JAX实验室接收14周龄的六十(60)只饮食诱导性肥胖C57BL/6J雄性小鼠。小鼠经耳部切迹以用于辨别且以每笼一只小鼠的密度圈养于通过HEPA过滤的空气单独且积极通风的聚碳酸酯笼子中。动物房间通过人工荧光照明完全照亮，具有控制的12h光/暗循环。动物房间中的正常温度和相对湿度范围分别为22±4℃和50％±15％。任意提供酸化到2.8到3.1的pH的过滤自来水和高脂肪饮食(60千卡％)。
在2周的驯化后，基于所需体重范围选择40只小鼠且将小鼠如下地随机分组(n＝10)。第1组.媒剂处理组；第2组.低剂量测试化合物；第3组.中剂量测试化合物；第4组.高剂量测试化合物。小鼠经由皮下每天给药，持续28天。每天记录体重和笼侧观测。每周记录食物和水摄取量。小鼠经历NMR测量以测定第1天(预剂量)和第26天的全身肥瘦组成。在第0天、第14天和第27天，小鼠禁食过夜以进行口服葡萄糖耐量测试。第二天，经由尾端切口收集第一血液样品(t＝0)。随后向小鼠投与1.0g/kg葡萄糖的药团。在葡萄糖之后的5、30、60和120分钟处经由尾端切口获得血液样品且紧接着将使用血糖仪测定血糖。
处死和组织收集：在第29天杀死小鼠。将末梢血加工为血清/血浆且将等分试样送至进行葡萄糖、胰岛素和脂质概况的分析。通过NMR测定身体组成。最佳化合物概况显示OGTT中减少的葡萄糖偏移、减少的基础胰岛素分泌，伴以增强的葡萄糖相关胰岛素分泌、减少的体重增加、减少的脂肪质量但对瘦肉质量的影响最小。
实例9：化合物的用途
本文所述的经共价修饰的肽和/或蛋白质适用于预防和治疗多种与肥胖、代谢综合症、心血管疾病和糖尿病相关的疾病。适当标记的表面活性剂修饰的肽可以诊断探针形式使用。
代表性传递方案包括经口、非经肠(包括皮下、肌肉内和静脉内注射)、经直肠、颊内(包括舌下)、经皮、吸入、经眼和鼻内。传递肽的有吸引力和广泛使用的方法需要皮下喷射控制释放的可注射配制物。用于施用本文所述的经共价修饰的肽和/或蛋白质是我其它投与途径为皮下、鼻内和吸入投与。
实例10.治疗胰岛素抗性的医药用途.
通过从用于所属领域的标准雾化器鼻内投与(200μL)含有0.5到10mg/mL药剂并且含有如苯甲醇的标准赋形剂的药剂于生理盐水中的溶液用EU-A596治疗具有胰岛素抗性或代谢综合症的迹象的人类患者。视需要重复所述治疗以缓解如肥胖、高血糖等的症状。以类似方式，通过定量雾化吸入器(MDI)按需要鼻内投与EU-A596和所选赋形剂于含有如氢氟烷烃的蒸发溶剂中的溶液以减少胰岛素抗性。使用包括测量血糖含量、HbA1c、身体质量指数和/或体重和/或测量腰臀比的标准测试测定治疗效果。
以类似方式，测试通过经颊、阴道内、吸入、皮下、静脉内、眼内或经口途径投与调节量以测定GLP1R和/或GLCR对身体中的细胞的刺激水准和测定治疗作用。
序列
本说明书提供SEQ.ID.No.1-3和SEQ.ID.No.774-783和785-797的序列。另外，图1的表1提供化合物EU-A300到EU-A425的SEQ.ID编号，其分别具有SEQ.ID.NO.4-129，如图1的表1中所示。图1的表1中的化合物和图1的表1中所示的其相应SEQ.ID.NO特此并入到所提交的说明书中。另外，图2的表2提供化合物EU-A426到EU-599的SEQ.ID编号，其分别具有SEQ.ID.NO.130-317，如图2的表2中所示。图2的表2中的化合物和图2的表2中所示的其相应SEQ.ID.NO特此并入到所提交的说明书中。另外，图3的表3提供化合物EU-A700到EU-A1174的SEQ.ID编号，其分别具有SEQ.ID.NO.318-773；798-806，如图3的表3中所示。图3的表3中的化合物和图3的表3中所示的其相应SEQ.ID.NO特此并入到所提交的说明书中。

Claims (10)

1.一种肽产物，其包含共价连接到肽的表面活性剂C，所述肽包含连接氨基酸U和至少一种其它氨基酸：
其中所述表面活性剂X为式I的基团：
其中：
R1a在每次出现时独立地为一键、H、保护基、糖、经取代或未经取代的C1-C30烷基、经取代或未经取代的烷氧基芳基、经取代或未经取代的芳烷基或含甾核部分；
R1b、R1c和R1d在每次出现时各自独立地为保护基、糖、一键、H、经取代或未经取代的C1-C30烷基、经取代或未经取代的烷氧基芳基或经取代或未经取代的芳烷基；
W1在每次出现时独立地为-CH2-、-CH2-O-、-(C＝O)、-(C＝O)-O-、-(C＝O)-NH-、-(C＝S)-、-(C＝S)-NH-或-CH2-S-；
W2为-O-、-CH2-或-S-；
R2在每次出现时独立地为连接到U的键、H、经取代或未经取代的C1-C30烷基、经取代或未经取代的烷氧基芳基或经取代或未经取代的芳烷基、-NH2、-SH、C2-C4烯烃、C2-C4炔烃、-NH(C＝O)-CH2-Br、-(CH2)m-顺丁烯二酰亚胺或-N3；
n为1、2或3；并且
m为1-10的整数；
所述肽选自式II：
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-aa16-aa17-aa18-aa19-aa20-aa21-aa22-aa23-aa24-aa25-aa26-aa27-aa28-aa29-aa30-aa31-aa32-aa33-aa34-aa35-aa36-aa37-Z 式II(SEQ.ID.NO.1)
其中：
Z为OH、N-R4-His或-NH-R3，
其中
R3为H、经取代或未经取代的C1-C12烷基或小于10Da的PEG链；
R4为C2-C10酰基，例如Ac或Bz；
aa1为His、N-R4-His、pGlu-His或N-R3-His；
aa2为Ser、D-Ser、Ala、Gly、Pro、MePro、Aib、Ac4c或Ac5c；
aa3为Gln或Cit；
aa4为Gly或D-Ala；
aa5为Thr或Ser；
aa6为Phe、Trp、2FPhe、MePhe、2FMePhe或Nal2；
aa7为Thr或Ser；
aa8为Ser或Asp；
aa9为Asp或Glu；
aa10为Tyr、Leu、Met、Nal2、Bip、Bip2EtMeO或U；
aa11为不存在或Ser、Asn、Bip或U；
aa12为不存在或Lys、Glu、Ser、Arg或U；
aa13为不存在或Tyr、Gln、Cit或U；
aa14为不存在或Leu、Met、Nle或U；
aa15为不存在或Asp、Glu或U；
aa16为不存在或Ser、Gly、Glu、Ala、Aib、Ac5c、Lys、Arg或U；
aa17为不存在或Arg、hArg、Gln、Glu、Cit、Aib、Ac4c、Ac5c、Lys或U；
aa18为不存在或Arg、hArg、Ala、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa19为不存在或Ala、Val、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa20为不存在或Gln、Lys、Arg、Cit、Glu、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa21为不存在或Asp、Glu、Leu、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa22为不存在或Phe、Trp、Nal2、Aib、Ac4c、Ac5c或U
aa23为不存在或Val、Ile、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa24为不存在或Gln、Ala、Glu、Cit或U；
aa25为不存在或Trp、Nal2或U；
aa26为不存在或Leu或U；
aa27为不存在或Met、Val、Leu、Nle、Lys或U；
aa28为不存在或Asn、Lys、Gln、Cit或U；
aa29为不存在或Thr、Gly、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa30为不存在或Lys、Aib、Ac4c、Ac5c、Arg或U；
aa31为不存在或Arg、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa32为不存在或Asn、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa33为不存在或Arg、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa34为不存在或Asn、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa35为不存在或Asn、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa36为不存在或Ile、Aib、Ac4c、Ac5C或U；
aa36为不存在或Ala、Aib、Ac4c、Ac5C或U；
aa37为不存在或U；
U为天然或非天然氨基酸，其包含用于共价连接到表面活性剂X的官能团；其中aa1-aa37中的任何两者任选地经由其侧链环化以形成内酰胺键联；并且其限制条件为aa10-aa37中的一者或至少一者为共价连接到X的连接氨基酸U。
2.根据权利要求1所述的肽产物，其中n为1或2。
3.根据权利要求1所述的肽产物，其中X具有如下结构：
其中：
R1a为H、保护基、糖、经取代或未经取代的C1-C30烷基或含甾核部分；
R1b、R1c和R1d在每次出现时各自独立地为H、保护基、糖或经取代或未经取代的C1-C30烷基；
W1在每次出现时独立地为-CH2-、-CH2-O-、-(C＝O)、-(C＝O)-O-、-(C＝O)-NH-、-(C＝S)-、-(C＝S)-NH-或-CH2-S-；
W2为-O-、-S-；
R2为一键、C2-C4烯烃、C2-C4炔烃或-(CH2)m-顺丁烯二酰亚胺；并且
m为1-10的整数。
4.根据权利要求3所述的肽产物，其中X具有如下结构：
5.根据权利要求3所述的肽产物，其中X具有如下结构：
6.根据权利要求3所述的肽产物，其中X具有如下结构：
其中：
R1a为H、保护基、糖、经取代或未经取代的C1-C30烷基或含甾核部分；
R1b、R1c和R1d在每次出现时各自独立地为H、保护基或经取代或未经取代的C1-C30烷基；
W1为-(C＝O)-NH-；
W2为-O-；并且
R2为一键。
7.根据权利要求3所述的肽产物，其中X具有如下结构：
其中：
R1a为经取代或未经取代的C1-C30烷基；
R1b、R1c和R1d为H；
W1为-(C＝O)-NH-；
W2为-O-；并且
R2为一键。
8.根据权利要求1或权利要求3所述的肽产物，其中R1a为经取代或未经取代的C1-C30烷基。
9.根据权利要求1或权利要求3所述的肽产物，其中R1a为经取代或未经取代的C6-C20烷基。
10.根据权利要求1或权利要求3所述的肽产物，其中R1a为经取代或未经取代的C12-C20烷基。
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