CN117887755A - ZmGCH2蛋白及其编码基因在调控植物籽粒叶酸含量中的应用 - Google Patents
ZmGCH2蛋白及其编码基因在调控植物籽粒叶酸含量中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了ZmGCH2蛋白及其编码基因在调控植物籽粒叶酸含量中的应用。本发明首先通过对高、中和低叶酸含量的三个鲜食糯玉米自交系的转录组和蛋白组联合分析比较，鉴定并克隆得到1个与植物叶酸含量相关的ZmGCH2基因。进一步通过构建ZmGCH2突变体植株和过表达植株并测定籽粒中的叶酸含量，发现ZmGCH2过表达植株籽粒中5‑甲酰四氢叶酸和5‑甲基四氢叶酸含量分别是野生型的4.3倍和2.8倍；而ZmGCH2突变体植株籽粒中的叶酸含量略低于野生型，且未达到显著水平。以上结果说明ZmGCH2基因是与植物叶酸含量相关的基因，且可以通过过表达该基因提高植物籽粒的叶酸含量。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及ZmGCH2蛋白及其编码基因在调控植物籽粒叶酸含量中的应用。
背景技术
叶酸(folic acid，FA)是一类动植物生长发育必须的水溶性B族维生素，参与DNA甲基化、表观遗传等重要生命活动，它与人体健康、动物奶质和植物自身的品质、抗性等密切相关。叶酸在人体和动物中不能自主合成，人体生命活动所需的叶酸主要来自日常饮食，其中在小麦、水稻和玉米等主粮作物中的叶酸含量较低，一般为20～60ug/100g，世界卫生组织建议成人每日叶酸的摄入量为400ug，孕期妇女为600ug。所以，人们通过日常饮食摄入的叶酸含量难以达到建议摄入量，使得叶酸缺乏症成为了一个全球范围内的营养健康问题。如果能够对植物进行叶酸强化，获得高叶酸含量的作物，让人们从主粮作物中获得的叶酸量能满足生命活动需求，便可避免摄入过量人工合成FA带来的副作用。因此，主粮作物叶酸强化对解决叶酸缺乏症具有重要意义。
随着基因编辑等技术的快速发展，利用代谢工程策略来叠加叶酸基因被认为是作物叶酸强化的潜在选择。通过代谢工程进行叶酸强化的研究主要是针对叶酸合成通路上的关键酶基因等进行过表达，从而提高作物叶酸含量。因此，叶酸合成相关基因的克隆和功能解析是进行叶酸生物强化的基础。尽管前人在叶酸基因方面做了一些工作，但目前克隆的叶酸基因并不多，其基因功能验证和分子调控机制尚待进一步的研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何调控植物籽粒叶酸含量、培育高叶酸含量植物。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了与植物籽粒叶酸含量相关蛋白ZmGCH2的新用途。
本发明提供了ZmGCH2蛋白在如下1)-3)中的应用：
1)调控植物籽粒叶酸含量；
2)培育籽粒叶酸含量提高的转基因植物；
3)植物育种；
所述ZmGCH2蛋白为a1)或a2)或a3)或a4)：
a1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
a2)在序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物籽粒叶酸含量相关的蛋白质；
a4)与序列2所示的氨基酸序列具有90％同一性、来源于玉米且与植物籽粒叶酸含量相关的蛋白质。
其中，序列2由475个氨基酸残基组成。
上述a2)所述的蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述a3)所述的蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过9个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过8个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过7个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过6个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过4个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过3个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过2个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过1个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述a4)所述的蛋白质中，所述同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。所述同一性包括与本发明的序列2所示的氨基酸序列具有90％或更高，或91％或更高，或92％或更高，或93％或更高，或94％或更高，或95％或更高，或96％或更高，或97％或更高，或98％或更高，或99％或更高同源性的氨基酸序列。
上述a1)或a2)或a3)或a4)所述的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了与ZmGCH2蛋白相关的生物材料的新用途。
本发明提供了与ZmGCH2蛋白相关的生物材料在如下1)-3)中的应用：
1)调控植物籽粒叶酸含量；
2)培育籽粒叶酸含量提高的转基因植物；
3)植物育种；
所述生物材料为编码ZmGCH2蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物。
上述应用中，所述编码ZmGCH2蛋白的核酸分子为如下b1)或b2)或b3)所示的基因：
b1)序列1所示的DNA分子；
b2)序列3所示的DNA分子；
b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述ZmGCH2蛋白的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码上述ZmGCH2蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码上述ZmGCH2蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述ZmGCH2蛋白且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述应用中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达ZmGCH2蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动ZmGCH2转录的启动子，还可包括终止ZmGCH2转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。
所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述重组载体可为利用现有的植物表达载体构建的含有所述编码ZmGCH2蛋白的核酸分子或所述表达盒的载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建重组载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。所述重组微生物可为含有所述编码ZmGCH2蛋白的核酸分子或所述表达盒或所述重组载体的微生物。
上述应用中，所述叶酸可为5-甲酰四氢叶酸和/或5-甲基四氢叶酸。
上述应用中，所述调控植物籽粒叶酸含量可为提高植物籽粒叶酸含量，具体体现为：植物中ZmGCH2蛋白含量和/或活性越高，或ZmGCH2基因表达量越高，该植物籽粒中的叶酸含量越高。
上述应用中，所述植物育种的目的为培育高叶酸含量植物。
为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育籽粒叶酸含量提高的转基因植物的方法。
本发明提供的培育籽粒叶酸含量提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中ZmGCH2蛋白的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的籽粒叶酸含量高于所述受体植物。
上述方法中，所述叶酸可为5-甲酰四氢叶酸和/或5-甲基四氢叶酸。
上述方法中，所述提高受体植物中ZmGCH2蛋白的含量和/或活性的方法为在受体植物中过表达ZmGCH2蛋白。
进一步的，所述过表达的方法为将ZmGCH2蛋白的编码基因导入受体植物。
更进一步的，所述ZmGCH2蛋白的编码基因如序列表中序列1所示。
在本发明的一个具体实施例中，所述ZmGCH2蛋白的编码基因通过重组载体导入受体植物。所述重组载体为将序列1所示的ZmGCH2基因序列连入至载体pISCL4723中，且保持载体pISCL4723其它序列不变后得到的载体。
上述任一所述应用或方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述ZmGCH2基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
上述任一所述应用或方法中，所述植物可为c1)或c2)或c3)或c4)：
c1)双子叶植物或单子叶植物；
c2)禾本科植物；
c3)玉蜀黍属植物；
c4)玉米(如野生型玉米Kn5585)。
本发明首先通过对高、中和低叶酸含量的三个鲜食糯玉米自交系的转录组和蛋白组联合分析比较，鉴定并克隆得到1个与植物叶酸含量相关的ZmGCH2基因。进一步通过构建ZmGCH2突变体植株和过表达植株并测定籽粒中的叶酸含量，发现ZmGCH2过表达植株籽粒中5-甲酰四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸含量分别是野生型的4.3和2.8倍；而ZmGCH2突变体植株籽粒中的叶酸含量略低于野生型，且未达到显著水平。以上结果说明ZmGCH2基因是与植物籽粒叶酸含量相关的基因，且可以通过过表达该基因提高植物籽粒的叶酸含量。
附图说明
图1为ZmGCH2过表达植株和野生型植株干籽粒中的叶酸含量。
图2为ZmGCH2突变体植株和野生型植株干籽粒中的叶酸含量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的野生型玉米B73记载于文献“刘治先,赵宝和,韩静,刘朋.美国玉米自交系的种质基础分析[J].山东农业科学,2003(05):23-25.”中，公众可从北京市农林科学院玉米研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的pISCL4723载体记载于文献“Wang,D.,Zhong,Y.,Feng,B.,Qi,X.,Yan,T.,Liu,J.,Guo,S.,Wang,Y.,Liu,Z.,Cheng,D.,Zhang,Y.,Shi,Y.,Zhang,S.,Pan,R.,Liu,C.and Chen,S.(2023),The RUBY reporter enables efficient haploididentification in maize and tomato.Plant Biotechnol.J,21:1707-1715.https://doi.org/10.1111/pbi.14071”中，公众可从北京市农林科学院玉米研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的野生型玉米Kn5585是未米生物科技(江苏)有限公司的产品。
下述实施例中的PCR扩增Mix试剂为北京聚合美生物科技有限公司的产品。
实施例1、玉米ZmGCH2基因的克隆
一、转录组和蛋白组的联合分析
种植高、中和低叶酸含量的三个鲜食糯玉米自交系XT375、BN2和XT197，当自交系散粉时，严格自交，取适采期的新鲜籽粒进行取样，液氮速冻，之后-80摄氏度冰箱保存。每个样品三个生物学重复，共9个样品，将9个样品送迈维代谢生物技术公司分别提取RNA进行转录组测序、提取蛋白进行蛋白组测序。
通过对转录组和蛋白组数据的分析比较，在这三个材料中鉴定到34个与叶酸相关的差异表达基因和21个与叶酸相关的差异表达蛋白质，通过基因功能注释和生物信息学分析，对其中一个ZmGCH2基因进行了克隆。
二、ZmGCH2基因的克隆
1、根据玉米B73参考基因组中的ZmGCH2基因序列，利用Primer5软件设计特异性扩增该基因的引物对，引物序列如下：
KZ-6531F：5’-ataatagtcgccgcgggcag-3’；
KZ-6531R：5’-gaggcgatgagctacggaca-3’。
2、提取鲜籽粒中的总RNA，将RNA反转录为cDNA，然后以cDNA为模板采用步骤1中设计的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即ZmGCH2基因全长CDS区，并对其进行测序。
测序结果表明：ZmGCH2基因全长CDS区的核苷酸序列如序列1所示，其编码的ZmGCH2蛋白的氨基酸序列如序列2所示。
实施例2、玉米ZmGCH2基因过表达植株和突变植株的获得及其叶酸含量分析一、玉米ZmGCH2基因过表达植株和突变植株的获得
1、玉米ZmGCH2基因过表达植株的获得
将序列1所示的ZmGCH2基因序列连入至玉米过表达遗传转化载体pISCL4723中，构建得到ZmGCH2基因过表达载体，并将ZmGCH2基因过表达载体送至常州新米生物科技有限公司进行遗传转化(受体材料为野生型玉米Kn5585)，最终获得玉米ZmGCH2基因过表达的阳性转基因材料。
2、玉米ZmGCH2基因突变植株的获得
通过对野生型玉米B73进行EMS诱变，获得玉米ZmGCH2基因突变体材料。
通过对玉米ZmGCH2基因纯合突变体进行测序分析，发现与野生型玉米B73基因组DNA相比，玉米ZmGCH2基因纯合突变体的区别仅在于：在编码ZmGCH2蛋白的基因序列(序列1)中发生了碱基突变，该碱基突变为将序列1第678位的碱基G突变为碱基A，该突变导致ZmGCH2蛋白翻译提前终止。
二、玉米ZmGCH2基因过表达植株和突变植株的叶酸含量分析
供试材料：玉米ZmGCH2基因过表达材料(简称过表达)、玉米ZmGCH2基因突变材料(简称突变体)和野生型玉米B73、Kn5585(简称野生型)。其中，野生型玉米B73为突变体的对照，野生型玉米Kn5585为过表达的对照，每种材料选取5-10个植株。
采用高效液相色谱-质谱法(LC-MS)测定供试材料干籽粒中的叶酸(5-甲酰四氢叶酸F-thf和5-甲基四氢叶酸M-thf)含量。
ZmGCH2过表达植株和野生型植株干籽粒中的叶酸含量测定结果如图1所示，结果显示：野生型玉米干籽粒中的F-thf和M-thf叶酸含量分别为62.36ug/100mg和36.19ug/100mg，而ZmGCH2过表达植株干籽粒中的F-thf和M-thf叶酸含量分别为270.18ug/100mg和100.79ug/100mg，显著高于野生型玉米B73，是野生型的4.3和2.8倍。说明在玉米中过表达ZmGCH2基因可以提高籽粒叶酸含量。
ZmGCH2突变体植株和野生型植株干籽粒中的叶酸含量测定结果如图2所示，结果显示：野生型玉米干籽粒中的F-thf和M-thf叶酸含量分别为38.56ug/100mg和82.05ug/100mg，而ZmGCH2突变体植株干籽粒中的F-thf和M-thf叶酸含量分别为35.27ug/100mg和75.29ug/100mg，略低于野生型玉米B73，但并没达到显著水平。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.ZmGCH2蛋白在如下1)-3)中的应用：
1)调控植物籽粒叶酸含量；
2)培育籽粒叶酸含量提高的转基因植物；
3)植物育种；
所述ZmGCH2蛋白为a1)或a2)或a3)或a4)：
a1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
a2)在序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物籽粒叶酸含量相关的蛋白质；
a4)与序列2所示的氨基酸序列具有90％同一性、来源于玉米且与植物籽粒叶酸含量相关的蛋白质。
2.与ZmGCH2蛋白相关的生物材料在如下1)-3)中的应用：
1)调控植物籽粒叶酸含量；
2)培育籽粒叶酸含量提高的转基因植物；
3)植物育种；
所述生物材料为编码ZmGCH2蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述编码ZmGCH2蛋白的核酸分子为如下b1)或b2)或b3)所示的基因：
b1)序列1所示的DNA分子；
b2)序列3所示的DNA分子；
b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述的ZmGCH2蛋白的DNA分子。
4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：所述叶酸为5-甲酰四氢叶酸和/或5-甲基四氢叶酸。
5.一种培育籽粒叶酸含量提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：提高受体植物中ZmGCH2蛋白的含量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物的籽粒叶酸含量高于所述受体植物；
所述ZmGCH2蛋白为a1)或a2)或a3)或a4)：
a1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
a2)在序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物籽粒叶酸含量相关的蛋白质；
a4)与序列2所示的氨基酸序列具有90％同一性、来源于玉米且与植物籽粒叶酸含量相关的蛋白质。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述叶酸为5-甲酰四氢叶酸和/或5-甲基四氢叶酸。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述提高受体植物中ZmGCH2蛋白的含量和/或活性的方法为在受体植物中过表达ZmGCH2蛋白。
8.根据权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于：所述过表达的方法为将ZmGCH2蛋白的编码基因导入受体植物中。
9.根据权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于：所述ZmGCH2蛋白的编码基因序列如序列表中序列1所示。
10.根据权利要求1-4任一所述的应用或权利要求5-9任一所述的方法，其特征在于：所述植物为c1)或c2)或c3)或c4)：
c1)双子叶植物或单子叶植物；
c2)禾本科植物；
c3)玉蜀黍属植物；
c4)玉米。
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