CN117887643A - 一种抗过敏的益生菌剂及其应用 - Google Patents
一种抗过敏的益生菌剂及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种抗过敏的益生菌剂及其应用,所述抗过敏的益生菌剂中的菌株包括动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis BLa36菌株和干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89菌株。两种菌株存在潜在的相互作用,能够相互配合,在抗过敏的功效上协同增效,因此,该益生菌剂为抗过敏反应或防治过敏性疾病提供了新的策略。由于动物双歧杆菌乳亚种和干酪乳杆菌均为益生菌,因此其在用于制备相关功效产品时,安全性高,且不易产生抗性。
Description
技术领域
本发明属于益生菌技术领域,涉及一种抗过敏的益生菌剂及其应用。
背景技术
过敏性疾病,包括哮喘、过敏性鼻炎、食物过敏和特应性皮炎等,这些疾病的发生与多种因素有关,包括遗传、环境污染、生活方式以及微生物组失衡等。
肠道微生物组的失衡被认为是过敏性疾病发展的关键因素之一。肠道是人体最大的免疫器官,肠道微生物通过影响肠道屏障功能、调节宿主免疫反应等机制,与宿主的健康状态密切相关。益生菌,作为肠道微生物组的重要组成部分,能够维持肠道微生物平衡,增强肠道屏障功能,调节免疫系统,从而对过敏性疾病产生预防和治疗作用。
尽管益生菌在过敏性疾病治疗中的潜力已被广泛认识,但目前市场上的益生菌产品在抗过敏方面的效果仍存在局限性。这主要是因为不同益生菌株对过敏性疾病的影响存在差异,且部分益生菌的抗过敏机制尚不明确,导致其在临床应用中的效果不一。因此,开发一种具有明确抗过敏机制、高效安全的益生菌剂,对于提高过敏性疾病的治疗效果、改善患者生活质量具有重要意义。
该益生菌剂应具备以下特点:能够有效调节免疫系统,减少IgE介导的免疫反应;增强肠道屏障功能,减少过敏原的透过;以及调节肠道微生物组,恢复微生物平衡。此外,该益生菌剂的开发还需考虑到安全性、稳定性以及适宜的给药方式,以满足临床应用的需求。综上所述,开发一种新型抗过敏益生菌剂,不仅能够为过敏性疾病的治疗提供新的策略,还有助于深化我们对肠道微生物与过敏性疾病关系的理解。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种抗过敏的益生菌剂及其应用,具体提供一种抗过敏的益生菌剂及其在制备预防、缓解或治疗过敏反应的产品中的应用。
为达到此发明目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供一种抗过敏的益生菌剂,所述抗过敏的益生菌剂中的菌株包括保藏编号为CGMCC No.24029的动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa36菌株和保藏编号为CGMCC No.15409的干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89菌株。
本发明开发了一种全新的益生菌复配方式,将动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa36菌株和干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89菌株进行复配,发现两者存在潜在的相互作用,能够相互配合,在抗过敏的功效上协同增效,具体表现在:(1)显著降低过敏性疾病模型中的特异性免疫球蛋白E(IgE)水平;特异性IgE是过敏反应的关键介质,其水平的降低直接反映了过敏反应的减轻;(2)能够有效减少由肥大细胞释放的组胺量,从而缓解过敏症状;(3)通过调节辅助型T细胞1(Th1)/辅助型T细胞2(Th2)平衡,降低过敏性疾病中Th2细胞产生的细胞因子(如IL-4、IL-10)的浓度,同时促进Th1细胞产生的细胞因子(如IFN-γ)的表达,这种调节有助于减轻Th2细胞介导的过敏反应;(4)调节脾脏中T细胞的过敏相关基因表达,包括降低促过敏基因的表达和增强抗过敏基因的表达。
在使用菌量一致的情况下,与单一的BLa36菌株或单一的LC89菌株相比,两种菌的复配在上述功效的发挥显著提高。因此,该益生菌剂为抗过敏反应或防治过敏性疾病提供了新的策略。由于动物双歧杆菌乳亚种和干酪乳杆菌均为益生菌,因此其在用于制备相关功效产品时,安全性高,且不易产生抗性。
优选地,所述动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactisBLa36菌株与干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89菌株的活菌数之比为1:10-10:1。
基于BLa36菌株与LC89菌株的潜在相互作用关系,本发明还发现当两种菌株以上述特定的活菌数配比进行复合时,其在降低特异性免疫球蛋白E(IgE)水平、减少组胺量、调节辅助型T细胞1/辅助型T细胞2平衡、调节脾脏中T细胞的过敏相关基因表达的功效上更加显著。
优选地,在所述益生菌剂中,活菌总数不低于1×109 CFU/mL或1×109 CFU/g,例如1×109 CFU/mL(CFU/g)、5×109 CFU/mL(CFU/g)、1×1010 CFU/mL(CFU/g)、5×1010 CFU/mL(CFU/g)、1×1011 CFU/mL(CFU/g)、1×1012 CFU/mL(CFU/g)、1×1013 CFU/mL(CFU/g)等;该数值范围内的其他具体点值均可选择,在此便不再一一赘述。
优选地,所述益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。
本发明所涉及的益生菌剂的剂型不受限制,包括最常用的冻干粉剂,或进一步制得的胶囊剂、片剂或颗粒剂。其中冻干粉剂示例性地可以采用如下方法制得:
将BLa36菌株与LC89菌株分别接种于培养基中进行培养,得到培养液;培养液离心,得到菌体;菌体用冻干保护剂重悬,得到重悬液;重悬液冻干,即得,然后按比例将二者复配。
或者,将BLa36菌株与LC89菌株分别接种于培养基中进行培养,得到培养液;培养液离心,得到菌体;将两种菌体按照比例混合后用冻干保护剂重悬,得到重悬液;重悬液冻干,即得。
优选地,所述益生菌剂还包括冻干保护剂和/或辅助添加剂。
优选地,所述冻干保护剂包括脱脂乳、明胶、糊精、阿拉伯胶、右旋糖酐、藻胶钠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇或木糖醇中的任意一种或至少两种的组合。
优选地,所述辅助添加剂包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉、螺旋藻、节旋藻、云芝多糖、水苏糖、聚葡萄糖、α-乳淸蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
第二方面,本发明提供根据第一方面所述的抗过敏的益生菌剂在制备预防、缓解或治疗过敏反应或过敏性疾病的产品中的应用。
优选地,所述过敏性疾病包括哮喘、过敏性鼻炎、食物过敏、花粉过敏或特应性皮炎。
优选地,所述产品中还包括辅料。
优选地,所述辅料包括赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、包衣材料、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。
相对于现有技术,本发明具有以下有益效果:
本发明开发了一种全新的益生菌复配方式,将动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa36菌株和干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89菌株进行复配,发现两者存在潜在的相互作用,能够相互配合,在抗过敏的功效上协同增效,在使用菌量一致的情况下,与单一的BLa36菌株或单一的LC89菌株相比,两种菌的复配在上述功效的发挥显著提高。因此,该益生菌剂为抗过敏反应或防治过敏性疾病提供了新的策略。由于动物双歧杆菌乳亚种和干酪乳杆菌均为益生菌,因此其在用于制备相关功效产品时,安全性高,且不易产生抗性。
本发明所涉及的BLa36菌株的分类命名为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏时间为2021年12月02日,保藏编号为CGMCC No.24029,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明所涉及的LC89菌株的分类命名为干酪乳杆菌Lactobacillus casei,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏时间为2018年03月05日,保藏编号为CGMCC No.15409,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
图1是各组小鼠血清中免疫球蛋白E(IgE)水平的统计结果图;
图2是各组小鼠血清中免疫球蛋白G1(IgG1)水平的统计结果图;
图3是各组小鼠血清中免疫球蛋白G2a(IgG2a)水平的统计结果图;
图4是各组小鼠血清中组胺水平的统计结果图;
图5是各组小鼠血清中白介素-4(IL-4)水平的统计结果图;
图6是各组小鼠血清中白介素-10(IL-10)水平的统计结果图;
图7是各组小鼠血清中干扰素γ(IFN-γ)水平的统计结果图;
图8是各组小鼠脾脏白介素-4(IL-4)的基因表达量的统计结果图;
图9是各组小鼠脾脏GATA结合蛋白3(GATA-3)的基因表达量的统计结果图;
图10是各组小鼠脾脏T-bet转录因子的基因表达量的统计结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例中涉及的培养基配方如下:
MRS培养基:蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温801mL/L、半胱氨酸盐酸盐0.5g/L。
下述实施例所涉及的BLa36菌株的分类命名为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis,保藏编号为CGMCC No.24029。
下述实施例所涉及的LC89菌株的分类命名为干酪乳杆菌Lactobacillus casei,保藏编号为CGMCC No.15409。
下述涉及的菌悬液制备方法:将所需菌株接种于液体培养基中,37℃下培养24h进行活化,连续活化2次,得到活化液;将活化液按5%(v/v)的接种量接种于液体培养基中,37℃下培养24 h,得到菌液;将菌液在4℃下5000rpm下离心10 min,过滤,得到菌体,使用PBS溶液重悬菌体,即得。
试验结果数据使用R语言的ggplot2进行统计分析,***代表p<0.001,**代表p<0.01,*代表p<0.05,NS.代表无显著差异。
实施例
本实施例探究益生菌剂对过敏小鼠的症状改善能力:
(1)试验动物:6周龄雌性Balb/c小鼠,这些小鼠在受控环境下饲养,室温维持在22±2℃,湿度为55%±5%,遵循12h光/暗循环。它们可以随意进食和饮水。所有涉及小鼠的实验程序均符合上海实验动物护理与动物实验中心规定的动物护理和使用伦理指南。将小鼠从普通饲料转换到纯化型生长繁殖饲料(AIN-93G),预喂养一周,以适应新的饲料。
(2)动物分组:按上述小鼠适应性喂养1周后,将56只小鼠随机分为7组(每组8只):对照组(CTL组)、模型组(MC组)、BLa36组(记为S1组)、LC89组(记为S2组)、市售动物双歧杆菌乳亚种菌株ATCC27536组(记为S3组)、复合菌组1(BLa36 + LC89组,活菌数比为1:1,记为S4组)、复合菌组2(ATCC27536 + LC89组,活菌数比为1:1,记为S5组)。
(3)动物建模及干预方法:通过OVA(卵清白蛋白,购于上海麦克林生化科技公司)介导的Balb/c小鼠过敏模型,探究益生菌对过敏的潜在缓解效果,各组小鼠饲喂情况如下:
致敏阶段(第2、3、4周):对照组每天在小鼠两只耳朵上分别涂抹20μL MC903(卡泊三醇,作为佐剂,购于上海麦克林生化科技公司)-乙醇溶液(0.1 mM);模型组及各益生菌干预组每天在小鼠两只耳朵上分别涂抹含100μg卵清白蛋白的20μL MC903-乙醇溶液。同时灌胃处理:对照组和模型组每天灌胃400μL PBS溶液;各益生菌干预组每天灌胃400μL含有1×109 CFU相应菌液的PBS溶液。
激发阶段(第5周):在第29天和第32天进行两次激发。其中,对照组灌胃400μL PBS溶液;模型组灌胃400μL含125 mg/mL卵清白蛋白的PBS溶液;各益生菌干预组灌胃400μL含卵清白蛋白(125 mg/mL)和相应益生菌(总菌量均为1×109)的PBS溶液。
(4)样本收集和分析程序:在第二次激发后2小时内,通过眼眶静脉取血法收集血样,然后37°C静置1小时,3000 rpm离心10分钟,收集上清液并在-80°C保存。第二天,采用摘眼球法取出所有血液,处死小鼠后,在无菌条件下解剖,收集脾脏组织样本,冷冻保存于-80°C。
(5)指标检测:
(5.1)小鼠血清中特异性免疫球蛋白E(IgE)、免疫球蛋白G2a(IgG2a)、免疫球蛋白G1(IgG1)的测定:采用酶联免疫吸附(ELISA)技术对小鼠血清中OVA特异性IgE、IgG2a、IgG1抗体含量进行检测。首先,通过在96孔板中包被OVA溶液并孵育过夜实现抗原固定。随后,通过洗涤、封闭非特异性结合位点、加入稀释的小鼠血清样品以及特异性二抗(HRP标记的羊抗鼠IgE、IgG2a、IgG1),并进行适当的孵育和洗涤,以允许特异性抗体与抗原及二抗结合。最后,通过TMB显色反应并加入终止液后,在450 nm波长下测定OD值,从而准确评估血清中特异性抗体的含量。
(5.2)小鼠血清中组胺及细胞因子的测定:采用专门的小鼠组胺及白细胞介素-4、白细胞介素-10和干扰素γ细胞因子试剂盒(武汉纯度生物技术有限公司),按照制造商的指导进行量化测定。在450 nm波长下测定各孔的OD值以评估血清中组胺和细胞因子的含量。
(5.3)小鼠脾脏过敏相关细胞因子基因表达量的测定:通过本领域常规的RT-qPCR技术测定小鼠脾脏组织中过敏相关细胞因子(白细胞介素-4、GATA结合蛋白3、T-bet转录因子)基因的表达量。首先,从-80°C冰箱取出冻存的组织样本,使用液氮研磨成细粉后,依据总RNA提取试剂盒说明书提取RNA并反转录合成cDNA。将合成的cDNA作为模板,配合qPCR酶和特定引物,通过RT-qPCR技术定量分析目标基因mRNA的表达量,使用GAPDH作为内参基因,并应用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。
(6)指标分析:
(6.1)小鼠血清中特异性免疫球蛋白E(IgE)、免疫球蛋白G2a(IgG2a)、免疫球蛋白G1(IgG1)的测定结果:
如图1、图2、图3所示,与对照组相比,经卵清白蛋白刺激的MC组小鼠血清中免疫球蛋白IgE、IgG1和IgG2a的水平显著升高,这表明卵清白蛋白成功诱发了小鼠体内的强烈免疫反应。益生菌处理能够显著降低由卵清白蛋白刺激引起的免疫球蛋白IgE和IgG1水平的上升,并显著增加免疫球蛋白IgG2a的产生。免疫球蛋白IgG1与IgG2a的比值是反映机体Th2与Th1平衡的一个指标,其中Th1型细胞因子可以抑制Th2细胞的分化和Th2型细胞因子的生成。益生菌干预降低了IgG1/IgG2a比值,这意味着益生菌有效缓解了小鼠体内的过敏反应,且BLa36和LC89两种菌株联合使用(S4组)的效果尤为显著。这些结果说明了本发明所涉及的益生菌剂在调节免疫反应和减轻过敏症状方面的潜在价值。
(6.2)小鼠血清中组胺及细胞因子的测定结果:
如图4、图5、图6、图7所示,与对照组相比,经卵清白蛋白刺激的MC组小鼠在血清中的组胺、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)和干扰素γ(IFN-γ)水平均出现了显著的上升,这一变化直观地反映了卵清白蛋白刺激引发的强烈免疫和过敏反应。特别地,组胺作为过敏反应的直接介质,其水平的显著增加标志着过敏反应的激活和进行。同时,白介素-4和白介素-10的增加指示了Th2型免疫反应的升高,这与过敏反应中常见的免疫路径一致。干扰素γ水平的上升则可能反映了机体试图调节免疫反应的自然机制。
益生菌干预后,尤其是BLa36和LC89联合组(S4组),小鼠血清中的组胺、白介素-4和干扰素γ水平出现了显著的下降,而干扰素γ水平则显著上升。这些变化具有重要的生物学意义,揭示了该益生菌剂在调节过敏反应中的作用机制。组胺水平的降低直接指向了过敏症状的缓解,而白介素-4和白介素-10水平的下降则表明益生菌能够有效抑制Th2型免疫反应,减少与过敏反应密切相关的细胞因子的产生。更为关键的是,干扰素γ水平的显著上升表明益生菌促进了Th1型免疫反应,这不仅有助于平衡Th1/Th2的免疫响应,还能通过增强细胞免疫功能来抑制过敏反应。
综上,本发明所涉及的益生菌剂能够降低过敏介质组胺和Th2型细胞因子(如白介素-4和白介素-10)的水平,同时促进Th1型细胞因子干扰素γ的产生,展现了其在抗过敏反应中的双重调节作用。这些结果不仅具体展示了该益生菌剂对过敏反应的调节机制,也为该益生菌剂在过敏性疾病预防和治疗中的应用提供了有力的科学依据。
(6.3)小鼠脾脏过敏相关细胞因子基因表达量的测定结果:
如图8、图9、图10所示,与对照组相比,经卵清白蛋白刺激的MC组小鼠在脾脏中Th2型细胞因子GATA结合蛋白3(GATA-3)和白介素-4(IL-4)的基因表达量观察到了显著的上升,这一发现明确指出卵清白蛋白刺激不仅诱发了小鼠体内的Th2型炎症反应,而且还强化了与过敏反应紧密相关的Th2型免疫路径。此外,T-bet转录因子作为Th1型免疫反应的关键转录因子,其基因表达量的显著上升表明卵清白蛋白同时激活了小鼠体内的Th1免疫反应,这可能是机体自然调节免疫平衡的一种机制。
益生菌干预后,尤其是BLa36和LC89联合组(S4组),观察到这些细胞因子基因的表达量均显著下降。这一结果揭示了益生菌在调节免疫反应,特别是在抑制过敏反应中的重要作用。益生菌通过降低Th2型细胞因子GATA结合蛋白3和白细胞介素-4的基因表达,直接抑制了Th2型炎症反应的发展,这对于过敏反应的缓解至关重要。同时,益生菌对转录因子T-bet转录因子基因表达量的影响可能有助于重新平衡Th1/Th2的免疫响应,从而在更广泛的层面上调节免疫系统,减轻过敏症状。这些具体的分子层面的变化强有力地证明了本发明所涉及的益生菌剂通过调节关键的免疫调节因子的表达,有效抑制了由卵清白蛋白刺激引起的过敏性炎症反应。该益生菌剂的这种抗过敏作用不仅涉及到抑制Th2型免疫反应的关键因子,也可能涉及到促进Th1型免疫反应的平衡,从而为益生菌在过敏性疾病治疗和预防中的应用提供了有力的科学依据。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的技术方案,但本发明并不局限于上述实施例,即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于上述实施方式中的具体细节,在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.一种抗过敏的益生菌剂,其特征在于,所述抗过敏的益生菌剂中的菌株包括保藏编号为CGMCC No.24029的动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactisBLa36菌株和保藏编号为CGMCC No.15409的干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89菌株。
2.根据权利要求1所述的抗过敏的益生菌剂,其特征在于,所述动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa36菌株与干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89菌株的活菌数之比为1:10-10:1。
3.根据权利要求1所述的抗过敏的益生菌剂,其特征在于,在所述益生菌剂中,活菌总数不低于1×109 CFU/mL或1×109 CFU/g。
4.根据权利要求1所述的抗过敏的益生菌剂,其特征在于,所述益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。
5.根据权利要求1所述的抗过敏的益生菌剂,其特征在于,所述益生菌剂还包括冻干保护剂和/或辅助添加剂。
6.根据权利要求5所述的抗过敏的益生菌剂,其特征在于,所述冻干保护剂包括脱脂乳、明胶、糊精、阿拉伯胶、右旋糖酐、藻胶钠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇或木糖醇中的任意一种或至少两种的组合。
7.根据权利要求5所述的抗过敏的益生菌剂,其特征在于,所述辅助添加剂包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉、螺旋藻、节旋藻、云芝多糖、水苏糖、聚葡萄糖、α-乳淸蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的抗过敏的益生菌剂在制备预防、缓解或治疗过敏反应的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述产品中还包括辅料。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述辅料包括赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、包衣材料、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。
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