CN117882658A - 一种种蛋开窗封窗方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种种蛋开窗封窗方法，所述方法包括：1)利用印章在种蛋蛋壳上标记出供切割线条；2)沿所述供切割线条切割蛋壳和内壳膜，取下切割得到的带有内壳膜的蛋壳切片，以对所述蛋壳进行开窗；以及3)用粘合剂涂抹所述蛋壳切片，然后将所述蛋壳切片盖回原处以进行封窗。本发明使用原蛋壳进行封窗，这样的操作不仅实现了原有蛋壳的回收利用，而且保留了蛋壳的完整性，实现了对胚胎伤害的最小化，提高了出壳率。此外，印章及开窗工具的使用可以使蛋壳开窗大小形状一致，这样便于高效、批量、快速操作，从而使得该方法的可操作性强，更标准化，且更适合自动化和批量生产。
Description
技术领域
本发明属于种蛋孵化领域，具体地，涉及一种种蛋开窗封窗的方法。
背景技术
鸡胚开窗、封窗技术指的是将发育到一定时期的种蛋蛋壳开孔，对鸡胚进行显微注射，然后再将蛋壳封口，继续孵化的技术。该技术目前主要应用于以下三个方面：1)制备转基因鸡；2)利用禽类原始生殖细胞保存禽类种质资源；3)以鸡胚作为胚胎发育的动物模型研究基因或药物功能。开窗方法、开窗工具、开窗位置及窗口大小、封窗材料等因素都会影响鸡胚发育及最终出壳率，具体如下：
1)开窗方法
开窗方法目前主要有代用蛋壳法和自身蛋壳法。关于代用蛋壳法，Ono[1]于1984年报道了将孵化2.5天的鹌鹑胚胎转移到鸡蛋壳内培养，有3％的鹌鹑孵出；Perry等[2]于1988年报道了建立禽类胚胎体外培养系统，将受体胚胎打开导入培养皿中，使胚盘暴露，注入供体胚胎细胞1-3μL，转入代用蛋壳进行孵化，72h之后再将胚胎蛋黄蛋清转入开口2cm双黄蛋的代用蛋壳，封口膜封口，最终出雏率为7％。关于自身蛋壳法，Kown[3]等于2004年报道了将新产蛋用70％酒精擦拭消毒，用一个精密的钻孔器在鸡蛋赤道面上开一个4.5×4.5mm2的窗口，用精致的镊子和外科手术刀去掉窗口内的小壳膜。用微注射针将5μL含有浓缩病毒颗粒的DMEM培养基注射进入了囊胚腔中央部分；微注射针由耐热玻璃管拉成，尖端内径为80μm；注射完后，窗口用薄膜封口，孵化率为8.3％。
2)开窗工具
开窗工具主要有钻孔器、手术刀片、自制开蛋工具、化学品腐蚀等。燕海峰等[4]用开蛋工具在鸡蛋赤道面部位开多边形或圆形切槽，通过窗口进行胚胎操作，将细胞液或其它物质注射入囊胚或发育一定时期的胚胎；剪一块比切块大的医用膜，以切块为中心直接贴上，稍用力抹平，再在医用胶带上涂上一层502胶水，转入孵化箱，最终孵化率高达50％以上。孙小美[3]等用浓盐酸腐蚀法对孵化三天的种蛋赤道面开窗，用蛋壳膜石蜡封口，第五天的鸡胚成活率为77％，但最终总出壳率该文献未提及。
3)开窗位置及窗口大小
开窗位置主要有尖端、赤道面、气室端。燕海峰等[4]于2008年报道，种蛋赤道面开窗最高孵化率可达65％，气室端开窗(针刺透内壳膜操作胚胎)方式，比赤道面开窗方式的孵化率明显提高，最高可达74％，但不适合需要精确操作的胚胎。Kamihira[6]等于2005年报道，在种蛋尖端水平切去一部分，直径为35mm。注射病毒液1.5-3.5μL至鸡胚血管。培养3天后再转移到代用蛋壳，添加稀蛋清和乳酸钙悬液，最终孵化率63％。李赞东等[7]于1994年报道，鸡胚体外培养时，打开后的蛋壳切口部位在翻蛋过程中极易与发育中的胎膜粘连，造成胎膜破裂、胚胎死亡。采用尖端开口后大头朝上胚胎在上方，不容易与蛋壳开口处粘连。郝志明等[8]于2005年报道，随着开孔直径的增加，鸡胚孵化率呈下降趋势，开孔直径为0.5、1.0和1.5cm时的孵化率分别为80.0％、30.0％和16.7％。
4)封窗材料
封窗材料主要为封口膜、胶水、石蜡、贴纸等。研究表明，窗口处气体和水分的挥发会影响鸡胚发育，有可能导致胚胎发育畸形或死亡。封窗材料不严密会造成漏气，增加污染风险。
在现有的开窗技术中，种蛋开窗工具没有标准化，多为手工操作，如用手术刀或剪刀等进行的手工切割；或采用化学方法，如用低浓度盐酸腐蚀蛋壳。手工操作进行开窗的缺点在于窗口的大小、规格、形状不一致。形成的窗口粗糙形成锯齿，工具尖锐，这些都容易对胚胎造成伤害乃至死亡。化学方法耗时长，化学试剂容易伤害胚胎。不同人员操作手法差异大，影响实验结果，产生的结果比较随机。
此外，现有的禽类胚胎蛋壳处理技术程序繁琐复杂，效率低，无法量产。如使用代用蛋壳，则操作复杂，增加污染几率，且成本高，不适合量产。
另外，现有技术一般采用封口膜、贴纸、胶水等材料进行封窗。在显微操作需要蛋壳开口较大的情况下，增加污染几率。另外，采用大面积异源材料对蛋壳进行封窗容易影响蛋壳透气率，进而影响胚胎发育。封窗不严则会导致漏液漏气，从而导致孵化率降低。
由于受多种因素影响及各因素之间的相互作用，开窗封窗后禽类胚胎存活率及出壳率的数据结果具有不稳定性和复杂性。此外，现有技术操作复杂，费时费力效率低，工具没有标准化，不适合自动化及批量生产。具体地，对禽类种蛋进行开窗的现有技术受技术要素、人员素质、试验条件局限，仅限于试验研究阶段，技术没有实现标准化，因此，无法大规模量产及推广，并且封窗材料不够稳定安全，操作不够简便易行，结果随机性强、不能重复。
因此，找出影响禽类胚胎存活率及出壳率的关键因素，提高孵化率，从而对现有技术进行改进仍是需要研究解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种新的种蛋开窗封窗方法，从而使得种蛋开窗封窗操作更加标准化，操作性更强，并且本发明提供的方法对禽类胚胎的伤害更小，出壳率更高。
具体地，根据本发明的第一方面，提供了一种种蛋开窗封窗方法，所述方法包括：1)利用印章在种蛋蛋壳上标记出供切割线条；2)沿所述供切割线条切割蛋壳和内壳膜，取下切割得到的带有内壳膜的蛋壳切片，以对所述蛋壳进行开窗；以及3)用粘合剂涂抹所述蛋壳切片，然后将所述蛋壳切片盖回原处以进行封窗。
本发明使用自身蛋壳和粘合剂进行封窗，这样的操作不仅实现了原有蛋壳的回收利用，而且保留了蛋壳的完整性，实现了对胚胎伤害的最小化，提高了出壳率。在本发明中，在没有引入外源物质的情况下，使用本发明提供的方法所实现的最大出壳率可达87.5％，平均出壳率可达70％以上。在对禽类胚胎进行外源物质注入时，使用本发明提供的方法所得到的禽类胚胎的出壳率也可达50％以上。此外，印章及开窗工具的使用可以使蛋壳开窗大小形状一致，这样便于高效、批量、快速操作，从而使得该方法的可操作性强，更标准化，且更适合自动化和批量生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的实施方案。
图1示出根据一些实施方案的印章设计图和印章加盖位置的示意图，其中，图1A为印章设计图案，也即由切割线条形成的直径为10mm的圆和一条与该圆的圆周垂直的长度为5mm的定位线条组成的图案，图1B为种蛋尖端开窗位置示意图(印章扣印位置即开窗位置)，图1C为种蛋赤道面开窗位置示意图(印章扣印位置即开窗位置)。
图2示出根据一些实施方案的鸡胚的全自身蛋壳培养的流程照片，其中，图2A-2F依次分别示出加盖印章(A)、台式电钻打孔(B)、开窗(C)、涂抹硅胶(D)、硅胶封口完成(E)、孵化出雏(F)。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施方案和附图，对本发明进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施方案仅仅是本发明的一部分实施方案，而不是全部的实施方案。基于本发明中的实施方案，本领域普通技术人员可以获得的所有其他实施方案，都属于本发明保护的范围。
在对本发明进行具体描述之前，需要特别指出，尽管在本文中采用步骤1)、步骤2)等方式来对本发明方法进行了描述，但是应该理解，该数字编号仅用于区分各步骤，而无意于以先后的顺序来对各步骤的顺序进行限定。这些步骤彼此之间可以按照数字编号顺序进行，可以按照数字编号顺序相反地进行，可以以任何其他顺序进行，或者可以同时进行，除非根据上下文可以明确判断需要以特定的顺序进行的除外。对于某个步骤中涉及的各操作，同样地，可以按照文字表述的顺序先后地进行，可以按照文字表述的顺序相反地进行，或者可以按照任何其他顺序进行，或者可以同时进行，除非根据上下文可以明确判断需要以特定的顺序进行的除外。
此外，除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解的相同的含义。
如上所述，种蛋开窗封窗技术是嵌合体生产、转基因鸡制备等的第一步，也是很关键的一步。然而，现有技术中针对种蛋开窗封窗操作非常复杂，费时费力且效率低，所使用的工具没有标准化，不适合自动化和批量生产。
因此，本发明提供了一种种蛋开窗封窗方法，所述方法包括：
1)利用印章在种蛋蛋壳上标记出供切割线条；
2)沿所述供切割线条切割蛋壳和内壳膜，取下切割得到的带有内壳膜的蛋壳切片，以对所述蛋壳进行开窗；以及
3)用粘合剂涂抹所述蛋壳切片，然后将所述蛋壳切片盖回原处以进行封窗。
在一些实施方案中，种蛋为来源于鸡、鸭、鹅、鹌鹑或鸽子的种蛋。当然，本发明提供的方法也适合于其他禽类种蛋的开窗封窗操作，本发明对此不作具体限定。
此外，可以理解的是，所述种蛋可以是完全没有经过孵化的种蛋，也可以是已经进行了短时的孵化或者说已经进行了初步的发育而处于所需发育阶段的种蛋。以鸡为例，所述种蛋或者说鸡胚已经发育到第13-18期(H&H期)，最优选发育到第15期；根据鸡的胚胎发育的各时期与时间的对应关系，本发明方法优选在鸡胚发育的第1、2、3或4天实施，最优选在鸡胚发育的第2-2.5天实施。同样地，对于其他的禽类，可以根据需要在所需的胚胎发育阶段来实施本发明方法。
在一些实施方案中，在上述步骤1)中，利用印章在种蛋蛋壳上所标记的供切割线条可以形成任何形状，例如多边形如三角形、四边形、五边形等等，圆形，或椭圆形。当然，供切割线条也可以形成不规则的形状或任何其他形状，本发明对此不作具体限定。然而，从方便切割方面考虑，优选地，所述供切割线条形成圆形或者椭圆形。
在一些实施方案中，在上述步骤1)中，印章还同时在种蛋蛋壳上标记出与所述供切割线条相交的至少一条定位线条。在本发明中，定位线条与供切割线条相交，这样在将蛋壳切片放回容纳胚胎的其余蛋壳部分时，通过将分别在蛋壳切片和其余蛋壳部分上保留的一部分定位线条对齐，可以将蛋壳切片和其余蛋壳部分按照两者切割前的相对位置进行放置和粘合。通过这种方式，蛋壳切片和其余蛋壳部分可以更为贴合，密封更有效，从而减少对胚胎的伤害，提高出壳率。
对定位线条与供切割线条相交的位置没有特别的限制，只要能够实现上述定位目的即可。例如，定位线条可以与供切割线条垂直或者以某个角度相交，定位线条与供切割线条的交点可以位于定位线条的中点处，也可以位于任何其他位置。
在一些实施方案中，在供切割线条形成多边形时，定位线条可以与多边形的某一条边或者某一个角相交。在一些实施方案中，在供切割线条形成圆形或椭圆形时，定位线条与供切割线条的圆周相交。在一些实施方案中，在供切割线条形成不规则的形状或任何其他形状时，定位线条与供切割线条形成的图形上的任一位置相交均可，前提是所述定位线条在该位置处可以实现定位的目的。
在本发明中，所述定位线条可以仅有一条，也可以有多条，例如2条、3条、4条，但是从实现定位目的和方便性考虑，优选仅有一条。
此外，可以理解，供切割线条所形成形状的尺寸不能过大，也不能过小，如果过大，则会造成胚胎的过度暴露，增加胚胎损伤的风险，如果过小，则不利于外源物质的注入操作。此外，由于不同禽类的种蛋具有不同的大小，因此具体选择尺寸时还要考虑该因素。对于定位线条的长短，也需要考虑上述因素来进行具体选择。
具体地，在供切割线条形成圆形时，其直径可以为约5mm-15mm，例如约5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm，优选10mm，定位线条的长度可以为约2.5-10mm，例如约2.5mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm，优选约5mm。可以理解，对于较大的种蛋例如鹅种蛋，可以使供切割线条形成直径较大例如约12mm的圆，并且可以采用较长例如约8mm的定位线条。对于较小的种蛋例如鹌鹑或鸽子种蛋，可以使供切割线条形成直径较小例如约6mm的圆，并且可以采用较短例如约2.5mm的定位线条。对于中等体积的种蛋例如鸡或鸭种蛋，可以使供切割线条形成为直径约5mm-15mm、优选约10mm的圆，并且可以采用长度为约2.5-10mm、优选约5mm的定位线条。
在一个具体的实施方案中，所述种蛋是来自于鸡或鸭的种蛋，供切割线条形成直径为约5-15mm的圆，优选10mm的圆。在一个具体的实施方案中，定位线条的长度可以为约2.5-10mm，优选5mm。在一个优选的实施方案中，所述定位线条在其中点处与该圆相交，例如以与圆周垂直的方式。
在标记后，沿着印章在种蛋蛋壳上标记出的供切割线切割蛋壳和内壳膜。可以使用本领域已知的任何切割工具进行切割。具体地，可以使用手电钻进行切割。在一个实施方案中，该手电钻具有直径为4mm的圆盘钻头。在一个具体的实施方案中，将手电钻固定在台式支架上，调整到适合高度；手持种蛋将供切割线条对准钻头，开始进行切割；沿供切割线条方向匀速转动种蛋，直至打孔完成；然后，将打孔位置向上，置于蛋盘中备用。通过使用手电钻加台钻支架，可以实现种蛋开窗的机械化和标准化。
在切割后，将种蛋转移至超净工作台内，用细胞镊取下切割得到的带有内壳膜的蛋壳切片，以对所述蛋壳进行开窗。
在一些实施方案中，在种蛋蛋壳尖端或蛋壳赤道面、优选蛋壳尖端处进行标记和开窗。在本发明中，无论是在种蛋蛋壳尖端还是蛋壳赤道面处进行标记和开窗，均能实现70％以上出壳率，在种蛋蛋壳尖端进行标记和开窗还可以实现最高达87.5％的出壳率。因此，本发明所提供的方法对尖端和赤道面进行标记和开窗均适合，并且对尖端标记和开窗更适合。此外，在实际实验中，对尖端进行标记和开窗更便于操作，因此，优选对尖端进行标记和开窗。
所述方法还包括在步骤2)和3)之间的步骤2’)：对种蛋内的胚胎进行操作以取出其中的一部分细胞或者组织和/或向种蛋内的胚胎内例如胚胎的血管内注入例如通过显微注射注入外源物质。例如，可以根据胚胎的发育时期和位置，将外源物质注入胚胎外周静脉血管、胚胎腹部主动脉或刚刚开始跳动的心脏，止于禽类上部的体液中或止于禽类本身内。
如上所述，在进行本发明方法之前，可以将种蛋孵化一段时间以使胚胎发育到所需阶段。一般而言，对于鸡胚而言，所述取出或者注入优选在胚胎发育到第13-18期(H&H期)时进行，最优选发育到第15期时进行。对鸡来说，根据其胚胎发育的各时期与时间的对应关系，所述取出或注入的时间优选在鸡胚发育的第1、2、3或4天进行，最优选在鸡胚发育的第2-2.5天进行。同样地，对于其他的禽类，可以根据需要在所需的胚胎发育阶段来实施本发明方法。
在注入的过程中，可以采用由耐热玻璃管拉制而成的微注射针。作为一个示例，可以采用由外径为1.0mm、内径为0.75mm且拉伸后针尖尖端直径为约50μm-80μm的微注射针。
在一些实施方案中，所述外源物质为其它禽类或同种的其它品种的干细胞、经基因编辑的细胞、基因或药物。向一种禽类胚胎内注入其它种的禽类的干细胞，或注入同种禽类的其它品种的干细胞，可以有效保存其它种的禽类或同种禽类的其它品种的种质资源，特别是濒临灭绝的或珍惜禽类的种质资源。向胚胎内注入经基因编辑的细胞，可以进行转基因处理，制备转基因禽类。向胚胎内注入基因或药物，可以通过随时观察胚胎发育情况来研究该基因或药物对胚胎发育的影响。
在上述取出或注入操作(如果有的话)后，用细胞镊夹起蛋壳切片，沿切片边缘涂抹一圈粘合剂，然后参照定位线条将蛋壳切片盖于容纳胚胎的其余蛋壳部分，以进行封窗。围绕切片边缘涂抹的粘合剂宽度可以为0.5-1.5mm，优选1mm。可以理解，粘合剂涂抹宽度以能够将蛋壳切片粘接回原处的最小宽度为宜，以尽可能地减少对胚胎的损伤。
在一些实施方案中，所述粘合剂为硅胶，优选地，所述硅胶为食品级硅胶。当然，能将蛋壳切片粘接回原蛋壳的且不影响胚胎发育的任何粘合剂均适用于本发明。但是，相对来说，硅胶由于其所具有的粘稠度、流动性和低毒性而更适合于本发明，并且使用硅胶可以获得更高的出壳率。在一些实施方案中，硅胶涂抹宽度为约0.5-1.5mm，优选1mm。
在一些实施方案中，所述方法还包括：将封窗后的种蛋进行孵化。在封窗后，将种蛋转移到孵化器中继续孵化，直至出雏。孵化种蛋可以采用本领域已知的常规条件和方法，只要能使种蛋最终孵化出幼雏即可，对其没有特别的限制。在一个具体的实施方案中，将封窗后的种蛋尖端朝上放入孵化器中干燥半小时，然后在合适的孵化条件下以尖端朝下的方式进行翻转孵化，直至出雏。孵化条件可以为温度38℃，相对湿度60％，自动翻蛋1小时每次，转蛋角±45°。
本发明使用自身蛋壳进行封窗，这样的操作不仅实现了自身蛋壳的回收利用，而且保留了蛋壳的完整性，实现了对胚胎伤害的最小化，提高了出壳率。在本发明中，在不进行外源物质注入的情况下，使用本发明提供的方法所实现的最大出壳率可达87.5％，平均出壳率可达70％以上。在对禽类胚胎进行外源物质注入时，使用本发明提供的方法所得到的禽类胚胎的出壳率可达50％以上。此外，印章及开窗工具的使用可以使蛋壳开窗大小形状一致，这样便于高效、批量、快速操作，从而使得该方法的可操作性强，更标准化，且更适合自动化和批量生产。
下面结合附图和实施例对本发明进行更为具体和详细的描述，实施例仅是本发明的优选实施方案，并不用于限制本发明。若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
实施例
实施例1：封窗方式对鸡胚出壳率的影响
为了研究封窗方式对鸡胚出壳率的影响，在鸡胚开窗后，分别使用原蛋壳和保鲜膜进行封窗，然后观察鸡胚出壳情况并计算鸡胚出壳率，具体如下：
将种蛋(种蛋品种为京粉8号)放入孵化器中进行孵化，其中孵化条件为：温度38℃，相对湿度60％，自动翻蛋1小时每次，转蛋角±45°。
在孵化第2.5天，取出种蛋，并在其蛋壳尖端盖上直径10mm印章以进行标记。印章图形由直径为10mm的圆和一条穿过圆圈且与圆周垂直的5mm线段组成，线段在圆圈内外均为2.5mm(见图1)。
然后，将手电钻固定在台式支架上，调整到适合高度。该手电钻具有直径为4mm的圆盘钻头。手持鸡蛋将盖章处圆圈对准钻头，开始进行切割。沿圆圈方向匀速转动鸡蛋，直至打孔完成。然后，将鸡胚打孔位置向上，置于蛋盘中备用。将种蛋转移至超净工作台内，用细胞镊取下圆形的蛋壳切片以开窗。
将经开窗的种蛋分为以下两个组，分别进行以下两种不同的封窗处理：
处理组1：用细胞镊夹起蛋壳切片，沿切片边缘涂抹一圈食品级硅胶(卡夫特(Kafuter)有机密封硅胶K-5600)，约1mm宽，参照标记将蛋壳切片盖回原蛋壳。
处理组2：在开孔周围用棉签蘸提前准备好的蛋清液涂抹蛋壳，然后用2×2cm的方形保鲜膜密封。
在进行上述两种封窗处理后，将封窗后的种蛋尖端朝上放入孵化器中干燥半小时，然后在上述孵化条件下以尖端朝下的方式进行翻转孵化，直至雏鸡出雏。
以上实验流程图示于图2中。
在本实施例中，为了确认是否存在影响出壳率的其他因素，例如孵化器是否正常工作，该批次种蛋的受精率是否合格，额外设置一个对照组，不对该对照组的种蛋进行打孔处理，而是正常进行孵化。
上述处理组1和2以及对照组的实验结果如下表1所示。
表1
| 处理组1(硅胶原蛋壳) | 样本数 | 出壳数 | 出壳率(％) |
| 试验1 | 48 | 42 | 87.5 |
| 试验2 | 28 | 22 | 78.6 |
| 试验3 | 30 | 23 | 76.7 |
| 试验4 | 25 | 18 | 72.0 |
| 试验5 | 28 | 20 | 71.4 |
| 处理组2(保鲜膜) | 样本数 | 出壳数 | 出壳率(％) |
| 试验1 | 30 | 16 | 53.3 |
| 试验2 | 27 | 13 | 48.1 |
| 试验3 | 26 | 15 | 57.7 |
| 试验4 | 22 | 12 | 54.5 |
| 试验5 | 20 | 12 | 60.0 |
| 对照组 | 样本数 | 出壳数 | 出壳率(％) |
| 试验1 | 30 | 27 | 90.0 |
| 试验2 | 30 | 28 | 93.3 |
| 试验3 | 30 | 28 | 90.0 |
| 试验4 | 29 | 27 | 93.1 |
| 试验5 | 28 | 26 | 92.3 |
由上表1可以看出，上述对照组的出壳率为91.74％，这表明在本次实验中，不存在影响出壳率的其他因素。
此外，通过t-检验对处理组1和2的数据进行分析，结果显示，用硅胶原蛋壳封窗的处理组1的鸡胚出壳率为77.24％±6.50％，显著高于保鲜膜封窗的处理组2的出壳率(54.72％±4.55％)，并且两者之间具有统计学差异(p<0.05)。这些数据表明，相对于采用蛋清和保鲜膜封窗，采用硅胶和蛋壳切片封窗对于鸡胚出壳率的影响显著更低。
实施例2：开窗位置对鸡胚出壳率的影响
为了研究开窗位置对鸡胚出壳率的影响，分别在鸡胚蛋壳的赤道面和尖端进行开窗，然后观察鸡胚出壳情况并计算鸡胚出壳率，具体如下：
将种蛋(种蛋品种为京粉8号)放入孵化器中进行孵化，其中孵化条件为：温度38℃，相对湿度60％，自动翻蛋1小时每次，转蛋角±45°。
在孵化第2.5天，取出种蛋，分为两组，分别在其蛋壳赤道面(处理组1)和蛋壳尖端(处理组2)盖上直径10mm印章以进行标记。印章图形由直径为10mm的圆和一条穿过圆圈且与圆周垂直的5mm线段组成，线段在圆圈内外均为2.5mm(见图1)。
然后，将手电钻固定在台式支架上，调整到适合高度。该手电钻具有直径为4mm的圆盘钻头。手持鸡蛋将盖章处圆圈对准钻头，开始进行切割。沿圆圈方向匀速转动鸡蛋，直至打孔完成，得到直径为10mm的窗口。接着，将种蛋转移至超净工作台内，用细胞镊取下圆形的蛋壳切片以开窗。
接着，用细胞镊夹起蛋壳切片，沿切片边缘涂抹一圈食品级硅胶(卡夫特(Kafuter)有机密封硅胶K-5600)，约1mm宽，参照标记将切片盖回原蛋壳。然后，对于赤道面开窗的种蛋，在封窗后将赤道面封窗处朝上放入孵化器中干燥半小时，对于尖端开窗的种蛋，在封窗后将尖端朝上放入孵化器中干燥半小时，然后在上述孵化条件下以尖端朝下的方式进行翻转孵化，直至雏鸡出雏。
在本实施例中，为了确认是否存在出壳率的其他因素，例如孵化箱是否正常工作，该批次种蛋的受精率是否合格，额外设置一个对照组，不对该对照组的种蛋进行打孔处理，而是正常进行孵化。
上述处理组1和2以及对照组的实验结果如下表2所示。
表2
| 处理组1(赤道面开口) | 样本数 | 出壳数 | 出壳率(％) |
| 试验1 | 34 | 28 | 82.35 |
| 试验2 | 18 | 13 | 72.2 |
| 试验3 | 33 | 22 | 66.7 |
| 试验4 | 35 | 25 | 71.4 |
| 试验5 | 24 | 16 | 66.7 |
| 处理组2(尖端开口) | 样本数 | 出壳数 | 出壳率(％) |
| 试验1 | 48 | 42 | 87.5 |
| 试验2 | 26 | 18 | 69.2 |
| 试验3 | 27 | 18 | 66.7 |
| 试验4 | 30 | 23 | 76.7 |
| 试验5 | 25 | 18 | 72.0 |
| 对照组 | 样本数 | 出壳数 | 出壳率(％) |
| 试验1 | 29 | 26 | 89.9 |
| 试验2 | 30 | 27 | 90.0 |
| 试验3 | 30 | 28 | 90.0 |
| 试验4 | 29 | 27 | 93.1 |
| 试验5 | 27 | 25 | 92.6 |
由上表1可以看出，上述对照组的出壳率为91.12％，这表明在本次实验中，不存在影响出壳率的其他因素。
此外，通过t-检验对处理组1和2的数据进行分析，结果显示，在赤道面开窗的处理组1的鸡胚出壳率为71.87％±6.63％，在尖端开窗的处理组2的出壳率为74.42％±8.20％。由上述数据还可以看出，处理组1和处理组2各自的出壳率均＞70％，因此尖端开窗和赤道面开窗均适合，并且尖端开窗更适合。此外，在实际实验中尖端开窗更便于操作，因此，优选尖端开窗，并且在后续实施例中采用尖端位置进行开窗封窗。
实施例3：不同开窗孔径对鸡胚出壳率的影响
为了研究不同开窗孔径对鸡胚出壳率的影响，分别在蛋壳尖端开不同直径的窗口，然后观察鸡胚出壳情况并计算鸡胚出壳率，具体如下：
将种蛋(种蛋品种为京粉8号)放入孵化器中进行孵化，其中孵化条件为：温度38℃，相对湿度60％，自动翻蛋1小时每次，转蛋角±45°。
在孵化第2.5天，取出种蛋，分为三组，分别在其蛋壳尖端盖上直径5mm(处理组1)、10mm(处理组2)、15mm(处理组3)的印章以进行标记。印章图形由直径分别为5mm、10mm、15mm的圆和一条穿过圆圈且与圆周垂直的5mm线段组成，线段在圆圈内外均为2.5mm(图1示出直径为10mm的情况)。
然后，将手电钻固定在台式支架上，调整到适合高度。该手电钻具有直径为4mm的圆盘钻头。手持鸡蛋将盖章处圆圈对准钻头，开始进行切割。沿圆圈方向匀速转动鸡蛋，直至打孔完成，得到直径分别为5mm、10mm、15mm的窗口。接着，将种蛋转移至超净工作台内，用细胞镊取出圆形的蛋壳切片以开窗。
接着，用细胞镊夹起蛋壳切片，沿切片边缘涂抹一圈食品级硅胶(卡夫特(Kafuter)有机密封硅胶K-5600)，约1mm宽，参照标记将切片盖回原蛋壳。然后，将封窗后的种蛋尖端朝上放入孵化器中干燥半小时，然后在上述孵化条件下以尖端朝下的方式进行翻转孵化，直至雏鸡出雏。
在本实施例中，为了确认是否存在影响出壳率的其他因素，例如孵化箱是否正常工作，该批次种蛋的受精率是否合格，额外设置一个对照组，不对该对照组的种蛋进行打孔处理，而是正常进行孵化。
上述处理组1、2和3以及对照组的实验结果如下表3所示。
表3
由上表1可以看出，对照组的出壳率为91.26％，这表明在本次实验中，不存在影响出壳率的其他因素。
此外，通过t-检验对处理组1、2和3的数据进行分析，结果显示，孔径5mm的处理组1的出壳率为74.46％±1.88％，其出壳率略高于孔径10mm的处理组2(出壳率为72.74％±4.44％)和孔径15mm的处理组3(出壳率为71.16％±5.28％)，并且孔径10mm的处理组2和15mm的处理组3之间差异不大，这表明开窗孔径对胚胎造成的影响比较稳定，5-15mm的孔径均可以获得比较高的出壳率。
对于需要进行显微注射的鸡胚，窗口太小，不利于进行显微注射，窗口太大，则会造成胚胎的过度暴露，增加胚胎损伤的风险。因此，10mm孔径的开口更适合。
实施例4：注射细胞的开窗封窗实验
将种蛋(种蛋品种为京粉8号)放入孵化器中进行孵化，其中孵化条件为：温度38℃，相对湿度60％，自动翻蛋1小时每次，转蛋角±45°。
在孵化第2.5天，取出种蛋，在其蛋壳尖端盖上直径10mm印章以进行标记。印章图形由直径为10mm的圆和一条穿过圆圈且与圆周垂直的5mm线段组成，线段在圆圈内外均为2.5mm(见图1)。
然后，将手电钻固定在台式支架上，调整到适合高度。该手电钻具有直径为4mm的圆盘钻头。手持鸡蛋将盖章处圆圈对准钻头，开始进行切割。沿圆圈方向匀速转动鸡蛋，直至打孔完成，得到直径为10mm的窗口。
接着，将种蛋转移至超净工作台内，用细胞镊取出圆形的蛋壳切片以开窗，使胚盘暴露于显微镜中。用口吸管自制显微操作针(玻璃管外径为1.0mm，内径为0.75mm，拉伸后针尖尖端直径约50μm)，将1-2μL(细胞浓度约为3000/μL)白羽肉鸡干细胞悬液注入鸡胚血管中。
然后，用细胞镊夹起蛋壳切片，沿切片边缘涂抹一圈食品级硅胶(卡夫特(Kafuter)有机密封硅胶K-5600)，约1mm宽，参照标记将切片盖回原蛋壳。然后，将封窗后的种蛋尖端朝上放入孵化器中干燥半小时，然后在上述孵化条件下以尖端朝下的方式进行翻转孵化，直至雏鸡出雏。
在本实施例中，在进行干细胞的注入实验的同时，也进行PBS注入的对照实验。通过PBS注入实验的结果，确认在本次实验中，不存在影响出壳率的其他因素。
本实施例的干细胞注入的实验结果如下表4所示。
表4
| 实验组 | 样本数 | 出壳数 | 出壳率(％) |
| 试验1 | 19 | 17 | 58.6 |
| 试验2 | 32 | 16 | 50.0 |
| 试验3 | 28 | 15 | 53.6 |
| 试验4 | 30 | 15 | 50.0 |
| 试验5 | 30 | 14 | 46.7 |
结果显示，采用本发明的全原蛋壳培养方法，在注射干细胞后，五个批次的鸡胚出壳率均值为51.78％，这表明本发明的鸡胚的全原蛋壳培养的方法可以实现鸡嵌合体的高效、稳定、批量化生产。
参考文献
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[8]郝志明等，鸡胚原壳体外培养研究。西北农林科技大学学报(自然科学版)第33卷第9期：35-38。
Claims (10)
1.一种种蛋开窗封窗方法，所述方法包括：
1)利用印章在种蛋蛋壳上标记出供切割线条；
2)沿所述供切割线条切割蛋壳和内壳膜，取下切割得到的带有内壳膜的蛋壳切片，以对所述蛋壳进行开窗；以及
3)用粘合剂涂抹所述蛋壳切片，然后将所述蛋壳切片盖回原处以进行封窗。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述种蛋为来源于鸡、鸭、鹅、鹌鹑或鸽子的种蛋。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中，所述供切割线条形成任何形状，例如多边形如三角形、四边形、五边形，圆形，或椭圆形。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述印章还同时在种蛋蛋壳上标记出与所述供切割线条相交的至少一条定位线条。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述供切割线条形成直径为5mm-15mm、优选10mm的圆形。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，在种蛋蛋壳尖端或蛋壳赤道面、优选蛋壳尖端处进行标记和开窗。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述粘合剂为硅胶，优选地，所述硅胶为食品级硅胶。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括在步骤2)和3)之间的步骤2’)：对种蛋内的胚胎进行操作以取出其中的一部分细胞或者组织和/或向种蛋内的胚胎注入例如通过显微注射注入外源物质。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述外源物质为其它禽类或同种的其它品种的干细胞、经基因编辑的细胞、基因或药物。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括步骤4)：将封窗后的种蛋进行孵化。
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|---|---|---|---|
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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