CN117867852A - 一种胶原纤维制备过程中的预处理方法及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医疗器械领域，公开了一种胶原纤维制备过程中的预处理方法及其制备方法，包括，将动物皮毛置于含50‑200mM的柠檬酸和0.05‑0.15mg/mL的胃蛋白酶的混合溶液中在温度为2‑6℃下浸泡，刮去杂质物，得到真皮组织。本发明方法通过特定含量的柠檬酸和胃蛋白酶发挥协同增效作用，极大程度的提高了脱毛脱脂的效果，同时实现了对动物源性潜在病毒的灭活，在本发明的预处理方法制备得到的真皮组织还可进一步用于制备胶原纤维。本发明的方法中简化了动物皮毛处理过程及后续胶原纤维制备过程中纯化工艺，纯度达到医用级别。
Description
技术领域
本发明涉及医疗器械领域，具体涉及一种胶原纤维制备过程中的预处理方法及其制备方法。
背景技术
胶原纤维是一种主要来源于动物(牛皮、猪皮)真皮层的生物材料，由于其具有独特的三股螺旋、链间氢键四分之一错列与准六角型排列的构型，形成了具有良好物理机械性能的胶原纤维三维编织结构，又因其具有良好的生物相容性和生物活性，所以胶原纤维被广泛应用于烧伤、组织修复、创面止血、眼角膜疾病、矫形等医学组织工程学领域。
目前，胶原纤维主要是以新鲜的动物皮毛为原料，现有胶原纤维原料预处理需经过反复盐渍—浸水—脱毛—脱脂—浸灰—脱灰—浸酸等一系列复杂工序才能得到真皮组织。生产工艺中的脱毛、脱脂、浸灰、脱灰过程中都需要用到有机溶剂，此种方法存在多项缺点，一是需要增加对残存有机溶剂的去除过程，来保证最终胶原纤维的生物安全性；二是脱毛脱脂不彻底，后续纯化难度增大，最终得到的胶原纤维很难达到医用级别要求。除此之外，由于预处理过程繁琐，产品收率低、能耗高、环境污染严重，导致胶原纤维难以大规模量产，限制了胶原纤维的广泛应用。
发明内容
本发明针对现有技术中使用有机溶剂对动物皮毛进行预处理造成脱毛脱脂不彻底、后续增加有机溶剂去除过程导致产品生产工艺繁琐，能耗高，环境污染严重，后续纯化难度大且难达到医用级别纯度要求的问题，提出一种胶原纤维制备过程中的预处理方法及其制备方法，利用本方法制备胶原纤维，在预处理步骤提高了脱毛脱脂效果，且在后续制备过程中不需要进行有机溶剂的去除，同时实现了对动物源性潜在病毒的灭活，极大简化了制备过程中的纯化工艺。
为实现上述技术目的，本发明提供了一种胶原纤维制备过程中的预处理方法，包括，将动物皮毛置于含50-200mM的柠檬酸和0.05-0.15mg/mL的胃蛋白酶的混合溶液中在温度为2-6℃下浸泡，刮去杂质物，得到真皮组织。
所述浸泡时间为5-10天；优选为7天。
所述浸泡温度为4℃；和/或，所述动物皮毛的质量与混合溶液的体积之比为8-10g:1L。
所述动物皮毛为哺乳动物皮毛；优选为牛皮、猪皮或羊皮。
所述将动物皮毛浸泡之前还包括将动物皮毛与皮下组织剥离，用蒸馏水清洗的步骤。
所述杂质物包括皮上毛、角质层和皮下附属物；和/或，所述刮去杂质物之前还需要用蒸馏水洗至溶液pH为6.5-7.5。
所述真皮组织需置于-70～-80℃的环境中储存。
本发明还提供一种胶原纤维的制备方法，包括胶原纤维制备过程中的预处理方法，还包括以下步骤：
S1、将真皮组织研磨，加入吸附剂，纯化后制得胶原蛋白溶液；
S2、将S1步骤制得的胶原蛋白溶液浓缩、分离，制得胶原纤维。
S1步骤中，所述研磨的转速为450-550rpm/min，时间为2.5-3.5min；和/或，所述吸附剂为硅藻土；和/或，所述真皮组织与吸附剂的质量之比为0.8-1:0.9-1.2；和/或，所述胶原组织加入吸附剂后需搅拌0.5-1h后静置1-3h，再过滤；和/或，所述纯化采用阳离子交换树脂，所述阳离子交换树脂为羧甲基纤维素阳离子交换树脂，所述阳离子交换树脂的洗脱剂为0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液，所述洗脱剂的pH为3.5-4.5。
S2步骤中，所述浓缩为超滤浓缩；和/或，所述分离为离心；和/或，所述离心转速为9000-11000rpm/min，时间为5-8min。
本发明还提供了一种胶原纤维。
本发明的技术方案具有以下有益效果：
(1)本发明提供的一种胶原纤维制备过程中的预处理方法，包括，将动物皮毛置于含50-200mM的柠檬酸和0.05-0.15mg/mL的胃蛋白酶的混合溶液中在温度为2-6℃下浸泡，刮去杂质物，得到真皮组织。本发明方法通过特定含量的柠檬酸和胃蛋白酶发挥协同增效作用，极大程度的提高了脱毛脱脂的效果，同时实现了对动物源性潜在病毒的灭活，在本发明的预处理方法制备得到的真皮组织还可进一步用于制备胶原纤维。本发明的方法中去掉了传统方法中因引入有机溶剂造成的后续处理的步骤，简化了动物皮毛处理过程及后续胶原纤维制备过程中纯化工艺，纯度达到医用级别。本发明的方法还缩短了生产周期、降低了能耗、减少了污染、提高了产品的安全性，为医用级胶原纤维的大规模生产提供了技术支撑。
(2)本发明提供的一种胶原纤维的制备方法，包括胶原纤维制备过程中的预处理方法，还包括S1、将真皮组织研磨，加入吸附剂，纯化后制得胶原蛋白溶液；S2、将S1步骤制得的胶原蛋白溶液超滤浓缩、离心，制得胶原纤维。在预处理的方法基础上，将真皮组织通过上述步骤制得胶原纤维，降低了胶原纤维制备过程中污染和有机溶剂残留，在保持胶原纤维空间大分子结构的同时降低了动物源性潜在病毒和免疫原性的风险。
(3)本发明提供的一种胶原纤维制备过程中的预处理方法，将动物皮毛置于含50-200mM的柠檬酸和0.05-0.15mg/mL的胃蛋白酶的混合溶液中在温度为2℃-6℃下浸泡5-10天，优选为将动物皮毛置于含100mM的柠檬酸和0.1mg/mL的胃蛋白酶的混合溶液中在4℃下浸泡7天，进一步提高了脱毛脱脂效果和对动物源性潜在病毒的灭活的效果。
(4)本发明提供的一种胶原纤维制备过程中的预处理方法，通过将动物皮毛制备成真皮组织，并将其储存在-70℃～-80℃的环境中，其真皮组织的物理和生物性质被很好的保留；通过本发明方法制备得到的胶原纤维，具有免疫原性低、纯度高、不溶于水和机械强度大等优点，可以方便、及时的应用到医疗器械领域。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实验例1中实施例1制备的真皮组织的效果图。
图2是本发明实验例1中对比例1制备的真皮组织的效果图。
图3是本发明实验例3中实施例1的胶原纤维的电镜图；参数为SEM、S-4800、10KV、标尺为0.5μm。
图4是本发明实验例3中实施例1的胶原纤维的电镜图；参数为TEM、HC-1、80KV、标尺为100μm。
图5为本发明实验例4中实施例1制得的胶原纤维复溶后的电泳图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
本实施例提供了一种胶原纤维制备过程中的预处理方法，具体方法为：选用可溯源性、健康的新鲜牛皮40g，平均分为4份，分别将新鲜牛皮与皮下组织剥离，用蒸馏水清洗后，在4℃条件下置于含100mM的柠檬酸和0.1mg/mL的胃蛋白酶的混合溶液1L中浸泡7天，用蒸馏水洗至pH为7.0，再用刀刮去皮上毛和角质层及皮下附属物，得到真皮组织，将其置于-80℃的环境中储存。
本实施例还提供了一种胶原纤维的制备方法，包括上述预处理方法还包括：将预处理得到的真皮组织经过以下步骤制得胶原纤维。
具体步骤如下：
S1、将10g真皮组织用胶体磨在500rpm/min条件下研磨3min，加入硅藻土10g，搅拌0.5小时后静置2小时，再用G3漏斗过滤，制备得到胶原蛋白粗提液；将胶原蛋白粗提液采用羧甲基纤维素阳离子树脂(WhatmanInc)和pH为4的0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液纯化，制得胶原蛋白溶液(纯度为98％)；
S2、将S1步骤制得的胶原蛋白溶液采用切向流浓缩，得到浓度为10mg/mL的胶原蛋白溶液，在10000rpm/min条件下离心5min，去掉上清，沉淀即为胶原纤维。
实施例2
本实施例提供了一种胶原纤维制备过程中的预处理方法及其制备方法，与实施例1的区别在于：将“含100mM的柠檬酸和0.1mg/mL的胃蛋白酶”更改为“含50mM的柠檬酸和0.05mg/mL的胃蛋白酶”，其余制备方法与实施例1一致。
实施例3
本实施例提供了一种胶原纤维制备过程中的预处理方法及其制备方法，与实施例1的区别在于：将“100mM的柠檬酸和0.1mg/mL的胃蛋白酶”更改为“含200mM的柠檬酸和0.15mg/mL的胃蛋白酶”；将“浸泡7天”更改为“浸泡10天”，其余制备方法与实施例1一致。
对比例1
本对比例提供了一种胶原纤维制备过程中的预处理方法及其制备方法，与实施例1的区别在于：预处理方法中，将“含100mM的柠檬酸和0.1mg/mL的胃蛋白酶”更改为“含0.1mg/mL的胃蛋白酶”，其余制备方法与实施例1一致。
对比例2
本对比例提供了一种胶原纤维制备过程中的预处理方法及其制备方法，与实施例1的区别在于：预处理方法中，将“含100mM的柠檬酸和0.1mg/mL的胃蛋白酶”更改为“含200mM的柠檬酸”，其余制备方法与实施例1一致。
对比例3
本对比例提供了一种胶原纤维制备过程中的预处理方法及其制备方法，与实施例1的区别在于：预处理方法中，将“含100mM的柠檬酸和0.1mg/mL的胃蛋白酶”更改为“水”，其余制备方法与实施例1一致。
对比例4
本对比例提供了一种胶原纤维制备过程中的预处理方法及其制备方法，与实施例1的区别在于：预处理方法中，浸泡温度由4℃调整为37℃，其余制备方法与实施例1一致。
实验例1
本实验例对实施例和对比例进行了脱毛情况观察和脱脂率测定，其中脱脂率按照《GB5009.6-2016食品安全国家标准食品中脂肪的测定》中索氏提取法进行测定。
实施例1和对比例1的脱毛情况分别见图1和图2。
实施例1-3和对比例1-3的脱脂率的测定结果见下表1。
表1脱脂率结果
与图2相比，图1的真皮组织脱毛干净，且对真皮组织无损伤，表明混合溶液中含100mM的柠檬酸和0.1mg/mL的胃蛋白酶能提高脱毛效果；由表1可知，与对比例1-3相比，实施例1-3的脱脂率为95.6-98.7％，其显著高于对比例1-3。综上所述，本发明提供的一种胶原纤维制备过程中的预处理方法可提高脱毛脱脂效果。
实验例2
本实验例对实施例1-3和对比例4的真皮组织进行了潜在病毒灭活检测，具体方法如下：
(1)选用可溯源性、健康的新鲜牛皮10g为原料，用蒸馏水清洗后，加入2mL无牛血清培养液，充分研磨，4000r/min离心取上清，除菌过滤，作为对照样品。
(2)分别取实施例1-3和对比例4制备好的真皮组织，用蒸馏水清洗后分别加入2mL无牛血清培养液，充分研磨，4000r/min离心取上清，用磷酸盐缓冲液调pH至中性，除菌过滤，作为处理后样品。
(3)按照《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》和《动物源性医疗器械产品注册申报资料撰写指导原则》，分别以水泡性口炎病毒(VSV)、猴空泡病毒40(SV40)、伪狂犬病毒(PRV)和呼肠孤病毒III型(Reo3)为指示病毒，通过96细胞病变法滴定病毒，测定TCID50,并计算对照样品和处理后样品检测值之差。
测试结果见下表2。
表2病毒灭活测试结果(LgTCID50/0.1mL)
由上表2可知，以对比例4为阳性对照实验组，对比例4的指示病毒降低系数≤1log，则认为对比例4对病毒几乎没有作用，降低量为0，实施例1-3的指示病毒降低系数均达到6logs以上，表明本发明提供的一种胶原纤维制备过程中的预处理方法是有效灭活病毒的方法。
实验例3
本实验例对实施例1所制备的胶原纤维在电镜下进行了观察，结果见图3-4。
由图3和图4可知，电镜下的胶原纤维呈明暗交替的周期性横纹，直径为0.5-10um，粗细不等，呈波浪形，且胶原纤维有分支，相互之间交织成网状。
实验例4
本实验例对实施例1制得的胶原纤维复溶后的胶原蛋白及Ⅰ型胶原标准品(国家食品药品检定研究院，货号380008-202001)进行定性检测，具体方法参见：GB/T38482-2021动物源性I型胶原蛋白成分测定聚丙烯酰胺凝胶电泳法。测定结果见图5。
由图5可知，实施例1制得的胶原纤维复溶后的电泳图谱与Ⅰ型胶原标准品一致，证明本发明预处理方法制备的真皮组织适合下一步胶原纤维的制备。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种胶原纤维制备过程中的预处理方法，其特征在于，包括，将动物皮毛置于含50-200mM的柠檬酸和0.05-0.15mg/mL的胃蛋白酶的混合溶液中在温度为2-6℃下浸泡，刮去杂质物，得到真皮组织。
2.根据权利要求1所述的胶原纤维制备过程中的预处理方法，其特征在于，所述浸泡时间为5-10天；优选为7天。
3.根据权利要求1所述的胶原纤维制备过程中的预处理方法，其特征在于，所述浸泡温度为4℃；和/或，所述动物皮毛的质量与混合溶液的体积之比为8-10g:1L。
4.根据权利要求1所述的胶原纤维制备过程中的预处理方法，其特征在于，所述动物皮毛为哺乳动物皮毛；优选为牛皮、猪皮或羊皮。
5.根据权利要求1-4中任一所述的胶原纤维制备过程中的预处理方法，其特征在于，所述将动物皮毛浸泡之前还包括将动物皮毛与皮下组织剥离，用蒸馏水清洗的步骤。
6.根据权利要求1所述的胶原纤维制备过程中的预处理方法，其特征在于，所述杂质物包括皮上毛、角质层和皮下附属物；和/或，所述刮去杂质物之前还需要用蒸馏水洗至溶液pH为6.5-7.5。
7.一种胶原纤维的制备方法，其特征在于，包括权利要求1-6中任一所述的胶原纤维制备过程中的预处理方法，还包括以下步骤：
S1、将真皮组织研磨，加入吸附剂，纯化后制得胶原蛋白溶液；
S2、将S1步骤制得的胶原蛋白溶液浓缩、分离，制得胶原纤维。
8.根据权利要求7所述的胶原纤维的制备方法，其特征在于，S1步骤中，所述研磨的转速为450-550rpm/min，时间为2.5-3.5min；和/或，所述吸附剂为硅藻土；和/或，所述真皮组织与吸附剂的质量之比为0.8-1:0.9-1.2；和/或，所述胶原组织加入吸附剂后需搅拌0.5-1h后静置1-3h，再过滤；和/或，所述纯化采用阳离子交换树脂，所述阳离子交换树脂为羧甲基纤维素阳离子交换树脂，所述阳离子交换树脂的洗脱剂为0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液，所述洗脱剂的pH为3.5-4.5。
9.根据权利要求7所述的胶原纤维的制备方法，其特征在于，S2步骤中，所述浓缩为超滤浓缩；和/或，所述分离为离心，离心转速为9000-11000rpm/min，时间为5-8min。
10.一种根据权利要求7-9中任一所述的胶原纤维的制备方法所制备得到胶原纤维。
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