CN117866857A - 一种缓解肠道炎症的富硒棒状乳杆菌h8及其制备方法与应用 - Google Patents
一种缓解肠道炎症的富硒棒状乳杆菌h8及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物新应用技术领域，具体为一种缓解肠道炎症的富硒棒状乳杆菌H8及其制备方法与应用。该菌株名称为棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）ES23，保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.27653。该菌株具有良好的纳米硒转化能力及有机硒的富集能力，其富硒发酵物具备抗氧化能力，并对肠道炎症具有良好的防治效果，能够提高机体免疫力。
Description
技术领域
本发明属于微生物新应用技术领域，具体为一种缓解肠道炎症的富硒棒状乳杆菌H8及其制备方法与应用。
背景技术
肠炎是临床上常见疾病，近年来其发病率在世界各地都有增加。发病症状因较为复杂性，呈现轻重不一的情况，轻者会腹胀腹痛、恶心呕吐，营养物质吸收受影响，重者会出现菌群紊乱、肠坏死、结肠癌等并发症。目前，发病人群分布于各个年龄段，这可能与环境、饮食、自身免疫等情况有关。引起小肠肠炎疾病的致病菌主要以志贺氏菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等菌株为主，致病菌在肠道内会黏附到肠黏膜表面，干扰肠道菌群。因此，感染致病菌引起小肠肠炎的患者的肠道菌群多样性会发生改变，肠道菌群中具有抗炎能力的细菌丰度减少，而具有促炎能力的细菌丰度可能会增加。
目前，对于肠炎的治疗，多数方式以抗生素为主。抗生素类药物可以控制炎症，主要是通过影响致病菌的结构和功能，抑制致病菌的代谢过程，进而显著地抑制细菌生长或直接杀死细菌。然而，使用抗生素来治疗或预防由致病菌引起的肠炎颇具争议。长期或大量使用抗生素不仅会增加携带者的耐药性，还会导致抗生素的作用减弱并在体内累积，导致胃肠道菌群失调，引发多种疾病。因此，寻找天然、安全、有效的功能性成分来替代抗生素是防治致病菌感染、保护肠道健康的重要方向。
硒被证明是免疫系统的有效保护剂。硒是人类和动物健康所需要的基本微量元素，主要以硒蛋白的形式积极参与到动物生理学过程中，通过提高含硒酶活性增强机体抗氧化能力。大量研究表明，日粮补充硒可以显著增加动物淋巴细胞的转化率、增加细胞因子分泌，特别是IL-2，促进T细胞增殖、分化为抗原特异性T细胞，从而增强细胞免疫功能。研究发现淋巴细胞SelW表达降低时，IL-1R、 IL-6、IL-12、TNF-a等细胞因子的表达显著升高，而IL-2、 IL-4、 IL-10、 INF-γ的表达显著降低，表明SelW可通过影响上述细胞因子的表达调节免疫机能。而体外研究也证实，培养的脾脏淋巴细胞中SelW对炎症基因iNOS、COX2、NF-κB和PTGE、凋亡相关基因BCL-2、BAK-1、Caspase-3、BAX和P53的表达具有调控作用，说明SelW可通过调节NF-κB通路及凋亡相关通路来发挥其对免疫机能的调节作用。膳食补充一定剂量的硒能显著增强淋巴细胞对植物血凝素的应答能力以及NK细胞活力，改善细胞免疫机能。因此膳食补硒可能是控制小肠肠炎的一个关键因素。
无机硒（如亚硒酸钠）虽然硒含量高，但其本身毒性较高，无法准确掌握适当使用剂量还可导致硒的吸收转化率降低，甚至危害动物体正常生长发育。大量的研究表明，纳米硒和有机硒与无机硒相比，其毒性较低，生物活性较高，可以迅速被吸收和利用，成为近年来研究者所关注的焦点。在现有的有机硒转化方法中，生物富集法因其高稳定性、低毒、更强的生物活性环保的优点而受到广泛的关注。富硒益生菌在提高免疫力和消除炎症反应方面作用效果显著优于其他益生菌。富硒益生菌能够促进动物体的生长性能和免疫功能，并有利于肠道微生物的平衡，具有显著的经济效益和开发前景。因此，亟待发现一种具有良好纳米硒转化能力及有机硒的富集能力的富硒益生菌。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的为从富硒土壤中分离出硒耐受能力较强的益生菌，通过耐硒与富硒评价筛选得到具有良好抗氧化功能的益生菌，并对其小肠炎症治疗效果进行挖掘。以求为富硒益生菌工业化生产提供了参考指标，也为富硒益生菌在肠炎防治领域的推广应用提供理论依据和数据支持。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
第一方面，本发明提供一种缓解肠道炎症的富硒棒状乳杆菌，属于棒状乳杆菌，名称为棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）ES23（即富硒棒状乳杆菌H8），分类命名为棒状乳杆菌Lactobacillus coryniformis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期2023年6月16日，保藏编号为CGMCC NO.27653。
进一步地，所述棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）的生物学特征为：
（1）革兰氏阳性菌，呈现两端圆、短而直的杆状形态。
（2）16S rDNA基因测序：对棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）ES23的16SrDNA基因序列进行PCR扩增、测序以及BLAST比对，结果显示，棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）ES23的16S rDNA基因序列与棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）的相似度较高，具有高度一致性。
（3）对于亚硒酸钠有耐受性，且能够将无机硒转化为纳米硒。
第二方面，本发明提供了采用第一方面所述的缓解肠道炎症的富硒菌株制备的菌剂或发酵物。
第三方面，本发明提供了一种组合物，包括第一方面所述的缓解肠道炎症的富硒菌株，或第二方面所述的菌剂或发酵物。
第四方面，本发明提供了第一方面所述的缓解肠道炎症的富硒菌株，或第二方面所述的菌剂或发酵物，或第三方面所述的组合物的应用，所述应用为以下的一种或多种：
（1）在制备纳米硒中的应用；
（2）在制备抗氧化产品中的应用；
（3）在制备防治炎症的产品中的应用；
（4）在制备提高免疫力的产品中的应用。
进一步地，所述炎症为肠道炎症。
更进一步地，所述肠道炎症为小肠肠炎或结肠炎症。
进一步地，所述产品为食品、保健品、药品或饲料。
本发明与现有技术相比，具有如下的优势：
1.本发明的富硒棒状乳杆菌H8（即棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）ES23）具有良好的纳米硒转化能力及有机硒的富集能力，是一种新型的棒状乳杆菌益生菌株。
2.本发明的富硒棒状乳杆菌H8能够在0.5-8.0mM/L亚硒酸钠存在的条件下实现生物纳米硒的转化，且转化率较高，最高可达58%。
3.本发明的富硒棒状乳杆菌H8具有卓越的抗氧化能力，并对肠道炎症显示了良好的治疗效果，这对于开发高效的肠炎治疗药物具有重要的实际意义。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为棒状乳杆菌的鉴定。其中，图1A为革兰氏染色图；图1B为系统发育树。
图2为具有潜在富硒能力的棒状乳杆菌的筛选。其中，图2A为添加不同浓度的亚硒酸钠培养后菌液的颜色变化情况；图2B为添加不同浓度的亚硒酸钠培养后纳米硒的产量情况。
图3为棒状乳杆菌H8生长曲线。
图4为棒状乳杆菌H8所产生物纳米硒的理化性质情况。其中，图4A为纳米硒颗粒透射电镜图，比例尺为500nm；图4B为傅里叶红外交换光谱分析；图4C为水合粒径情况；D为Zeta电位情况。
图5为棒状乳杆菌H8对LPS刺激的雏鸡生长性能和器官指数的影响情况。其中，图5A为雏鸡体重变化趋势；图5B为雏鸡体重增加量；图5C为雏鸡器官指数。
图6为棒状乳杆菌 H8 对 LPS 刺激的雏鸡血清生化指标的影响情况。其中，图6A为雏鸡血清生化指标；图6B为雏鸡血清氧化指标；图6C为雏鸡血清硒含量。
图7为结肠HE染色图，比例尺为500μm。
图中以不同字母标注表明组间具有显著性差异（p < 0.05）。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面结合附图通过实施例来对本发明进行详细说明，但并不是对本发明的限制，仅作为示例说明。
本发明涉及的培养基配方包括：
MRS液体培养基配方为（1L）：K2HPO4·3H2O 2g，无水乙酸钠5g，酵母浸粉5g，硫酸镁0.5g，牛肉膏10g，柠檬酸铵2g，胰蛋白胨10g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，葡萄糖20g，一水合硫酸盐0.25g，吐温80 1mL，调节pH至6.5，厌氧管分装，121℃灭菌15min。
MRS固体培养基配方为（1L）：K2HPO4·3H2O 2g，无水乙酸钠5g，酵母浸粉5g，硫酸镁0.5g，牛肉膏10g，柠檬酸铵2g，胰蛋白胨10g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，葡萄糖20g，一水合硫酸盐0.25g，吐温80 1mL，调节pH至6.5，厌氧管分装，121℃灭菌15min。
实施例1 富硒棒状乳杆菌的分离、筛选及鉴定
富硒乳杆菌的分离、筛选包括以下步骤：
（1）样品的采集与处理
采集五份来自湖北恩施地区的富硒土壤样本于无菌采样袋中，四度暂存，取样后及时分离。将称好的1g富硒土壤与9mL的生理盐水充分混匀，此溶液作为稀释10-1的悬浮液，吸取1mL悬浮液于另一支9mL生理盐水中，制成10-2的悬浮液，以此操作为标准制备梯度稀释液，稀释至10-7。
（2）棒状乳杆菌的纯化与鉴定
形态学鉴定：将上述合适梯度的稀释液，以1mL的体积涂布于MRS固体培养基，37℃厌氧培养48h，可根据菌落的活力适当延长培养时间。培养结束后，选取不同生长位置、菌落大小、菌落形态的10个单菌落进行革兰氏染色并在显微镜下观察。根据革兰氏染色的显微镜结果（图1A），初步判断10个单菌落均为革兰氏阳性菌，呈现两端圆、短而直的杆状，将菌落编号。
分子生物学鉴定：将10株疑似菌落提取基因组DNA，16S扩增后的产物约为1500bp，进行16s rDNA序列测序分析。将PCR产物测序结果（如SEQ ID NO：3- SEQ ID NO：6所示）与NCBI上GenBank数据库中已知序列进行同源性比较，确认10株菌分属4个亚种，均为棒状乳杆菌，将其分别编号为L1、L2、L3和L4，最后构建4株棒状乳杆菌的系统发育树分析其亲缘关系（图1B）。
16s rDNA扩增引物序列：上游引物：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG（SEQ ID NO：1）；下游引物：TACGGCTACCTTGTTACGACTT（SEQ ID NO：2）。
4个菌落基因组DNA的PCR产物测序结果如下：
L1 16S rDNA:（SEQ ID NO：3）
GGAAAGGGGGGCCTAATACATGCAGTCGAACGCACTGACGTCGACCGAAGCTGCTTGCAGTGGACGTTGATTGACGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACCATTCAGACCACATGGTCTGAATGTAAAAGACGGCCTTTGGCTGTCACTTTTGGACGGACCCGCGGCGTATTAGTTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGACAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTAGGATCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAACAGGGACTAGAGTAACTGTTAGTCCTTTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGAAGAAGTGCATTAGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACTGTAGAGATACAGCTTTCCCTTCGG
L2 16S rDNA：（SEQ ID NO：4）
CAGGGGGGGGCGTGCTATACATGCAAGTCGAACGCACTGACGTCGACCGAAGCTGCTTGCAGTGGACGTTGATTGACGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACCATTCAGACCACATGGTCTGAATGTAAAAGACGGCCTTTGGCTGTCACTTTTGGACGGACCCGCGGCGTATTAGTTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGACAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTAGGATCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAACAGGGACTAGAGTAACTGTTAGTCCTTTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGAAGAAGTGCATTAGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACTGTAGAGATACAGCTTTCCCTTC
L3 16S rDNA:（SEQ ID NO：5）
GGGAACGGGGCGGCGTGCTATACATGCAGTCGAACGCACTGACGTCGACCGAAGCTGCTTGCAGTGGACGTTGATTGACGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACCATTCAGACCACATGGTCTGAATGTAAAAGACGGCCTTTGGCTGTCACTTTTGGACGGACCCGCGGCGTATTAGTTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGACAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTAGGATCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAACAGGGACTAGAGTAACTGTTAGTCCTTTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGAAGAAGTGCATTAGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACTGTAGAGATACAGCTTTCCCT
L4 16S rDNA: （SEQ ID NO：6）
GCCCGTGGCGGGCGTGCTAATACATGCAAGTCGAACGCACTGACGTCGACCGAAGCTGCTTGCAGTGGACGTTGATTGACGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACCATTCAGACCACATGGTCTGAATGTAAAAGACGGCCTTTGGCTGTCACTTTTGGACGGACCCGCGGCGTATTAGTTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGACAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTAGGATCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAACAGGGACTAGAGTAACTGTTAGTCCTTTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGAAGAAGTGCATTAGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACTGTAGAGATACAGCTTTCCC
实施例2 缓解肠道炎症的富硒棒状乳杆菌的耐受性评价
棒状乳杆菌的硒耐受性评价，所述的方法包括：
（1）棒状乳杆菌的亚硒酸钠耐受性评价。
将棒状乳杆菌液体活化至二代，以2%的接种量接种于含有不同浓度亚硒酸钠的厌氧管（0-400 μg/mL），37℃培养24h。随后，观察厌氧管中培养基颜色变化，并梯度稀释进行活菌计数。
（2）棒状乳杆菌富硒后的纳米硒产量与转化率。
制备系列浓度梯度含亚硒酸钠的液体培养基，浓度分别为：0mM/L、0.5mM/L、1mM/L、2mM/L、5mM/L、10mM/L；将L1、L2、L3、L10接种于含不同浓度亚硒酸钠的液体筛选培养基。期间根据不同时间点，分别取发酵液，观察并记录发酵液颜色，发酵结束后，将发酵液离心，取菌体沉淀，洗涤后烘干，称重，直至重量基本不变（即为菌体的生物量）。根据国标方法，测定菌体内硒含量。
如图2A所示，将筛选得到的4株棒状乳杆菌分别置于添加了0mM/L、0.5mM/L、1mM/L、2mM/L、5mM/L、10mM/L的亚硒酸钠的MRS培养基中培养24h，4 株菌株都能在含亚硒酸钠的液体筛选培养基中正常生长，随发酵时间的延长，培养基变浑浊，颜色变红提示菌株在生长的同时不断转化亚硒酸钠:随着培养基中硒含量的增加，L4菌株发酵后培养基红色较浅，提示菌株转化亚硒酸钠能力弱于其他菌株。在0mM/L时，培养后4株菌液颜色无明显变化，菌株增殖发酵后均呈现橙黄色。在0.5-10mM/L时，4株菌开始还原亚硒酸钠形成纳米硒颗粒，菌液逐渐趋于红色。
其次，如图2B所示，进一步测定了4株棒状乳杆菌在0-10mM/L亚硒酸钠浓度条件下还原形成纳米硒的产量。其中，4株菌在0mM/L条件下均无法还原形成纳米硒；L1在0.5-5mM/L条件下还原形成纳米硒的产量逐渐升高，在5-10mM/L条件下达到平台期，纳米硒产量无显著性变化；L2和L3在0.5-5mM/L条件下还原形成纳米硒的产量逐渐升高，在5mM/L条件下纳米硒产量最高，在10mM/L条件下纳米硒产量显著下降；L4在0.5-5mM/L条件下纳米硒产量缓慢增加，纳米硒的产量较低，在10mM/L条件下纳米硒产量达到最高；菌体硒含量结果表明L2富硒量最高，富硒能力最强；因此根据发酵液颜色变红的速度、菌体富硒量等确定L2为优势富硒菌株，将其命名为富硒棒状乳杆菌H8。综上，初步筛选得到了富硒能力较强的棒状乳杆菌H8。
为了进一步明确棒状乳杆菌H8形成纳米硒的最佳转化条件，对富硒棒状乳杆菌H8进行针对性研究，测定其生长曲线如图3所示。
再次制备系列浓度梯度含亚硒酸钠的液体培养基，浓度分别为：0mM/L、0.5mM/L、1mM/L、2mM/L、3mM/L、4mM/L、5mM/L、6mM/L、7mM/L、8mM/L；将富硒棒状乳杆菌H8接种于含不同浓度亚硒酸钠的液体筛选培养基。期间根据不同时间点，分别取发酵液，观察并记录发酵液颜色。发酵结束后，根据国标法测定菌液残存活菌数和菌体硒含量，并计算得到富硒棒状乳杆菌H8在不同硒浓度下的有机硒转化率，结果如表 1所示。
表1 富硒棒状乳杆菌H8富硒量和残存活菌数
实施例3富硒棒状乳杆菌H8所产生物纳米硒的鉴定
鉴定方法包括如下方面：
（1）富硒棒状乳杆菌H8所产生物纳米硒的分离；
步骤（1）的操作为：将培养好的二代棒状进行富硒培养24h（亚硒酸钠添加量：0.5mM/L）后通过0.45μm滤膜除去菌体，6500 rpm离心10min，无菌PBS洗涤3次后重悬于PBS并调整浓度。
（2）生物纳米硒的形态、粒径与zeta电位；
步骤（2）的操作包括滴加5μL纯化的生物纳米硒于200目碳支持铜网上，在空气中干燥2 h后，用透射电子显微镜（TEM）测量样品的表观形貌，加速电压为15 KV。其次，用马尔文激光粒度仪在25 ℃测定生物纳米硒溶液的水合粒径和zeta电位，每个样品测量3次，每次测量扫描10次。
（3）生物纳米硒的官能团分析。
步骤（3）的操作包括将生物纳米硒与KBr研磨并混合（比例约1：50）后压片，在红外灯下烘烤几分钟，进样采集KBr背景；波数范围：800-4000 cm-1，分辨率：4 cm-1，扫描次数：32。
如图4A所示，对富硒棒状乳杆菌H8所产生物纳米硒进行理化性质分析，透射电镜结果显示富硒棒状乳杆菌H8所产生物纳米硒粒径大小均一、分散度良好，呈现规则球形纳米硒颗粒，粒径大小约为200nm。
对该生物纳米硒进行傅里叶变换红外光谱（FITR）测试并分析其官能团的结构，如图4B所示，红外光谱在3431cm-1处有一个吸收峰，对应于O-H的伸缩振动吸收峰，在1633cm-1和1410cm-1处的吸收峰可能与C=O和COO-的拉伸振动有关，1074cm-1处的吸收峰可能为葡萄糖基残基的伸缩振动吸收峰。
如图4C-4D，动态光散射结果进一步证实了富硒棒状乳杆菌H8所产生物纳米硒粒径大小均一，水合粒径大小为219.1nm；分散度良好，PDI值约为0.03；表面zeta电位约为-34.3mV，可能由于菌体分泌的特异性蛋白包裹与纳米颗粒表面所致。根据这些特征吸收峰推测富硒棒状乳杆菌H8可能分泌了糖类化合物，伴随着亚硒酸钠的还原过程，富硒棒状乳杆菌H8合成的糖类物质将转化后的硒包裹成球状分泌至菌体表面或胞外。
实施例4 富硒棒状乳杆菌H8对LPS（脂多糖，Lipopolysaccharides）刺激的雏鸡生长性能和器官指数的影响
1. 实验动物：动物实验获得中国农业大学实验动物福利与动物实验伦理审查委员会批准后，采购216只1日龄的白羽雏鸡（中国农业大学小牧场），实验参照《饲料原料和饲料添加剂畜禽靶动物有效性评价试验指南》开展。在实验条件下，严格按照《现代肉鸡生产手册》饲养，饮食中不含任何抗生素。试验期17天，分为预防期(1日龄-14日龄)、LPS应激期(15日龄-17日龄)2个阶段。试验期间所有鸡只自由采食和饮水，饲养环境温度、湿度和光照控制符合白羽雏鸡生长阶段对环境的需求。其中模型组的雏鸡腹腔注射LPS(0.5mg/kgBW)溶液200ul持续三天，正常试验组的雏鸡依次腹腔注射等量的生理盐水。各益生菌实验组活菌数保持相等，灌胃剂量为200ul。于14日龄时，每个重复随机选取1只共6只雏鸡进行称重、采血、屠宰、剖腹取样。
2. 动物分组：随机选取216只健康状况良好、体重相近和未经免疫的1日龄白羽雏鸡，随机分为7个处理组(每组6个重复，每个重复5只鸡)，预防期14天，LPS应激3天，分组情况如下：
（1）空白组（Control）：预防期灌胃生理盐水；2周（14天）后腹腔注射与实验组相同体积 (200ul) 的生理盐水，同时灌胃生理盐水。
（2）模型组（LPS组）：预防期灌胃生理盐水；2周后腹腔注射LPS(0.5mg/kgBW，3days)，同时灌胃生理盐水。
（3）乳杆菌组（H8组）：预防期灌胃乳杆菌H8菌悬液；2周后腹腔注射LPS(0.5mg/kgBW，3days)，同时灌胃乳杆菌菌悬液。
乳杆菌H8菌悬液的制备方法为：将乳杆菌H8种子液，用生理盐水稀释至OD600等于1，将稀释后的种子液以 1%接种量加入MRS液体培养基，在温度37℃、转速250rpm的条件下连续培养24h（24h后，残存活菌数为1.10E+09cfu/mL）。取培养后的菌液于离心机中，12000rpm离心15分钟，收集菌体沉淀，用生理盐水溶解并稀释到需要的活菌数（活菌数与H8-SeNPs组稀释后的活菌数相同），制得乳杆菌H8菌悬液。
（4）富硒乳杆菌组（H8-SeNPs组）：预防期灌胃乳杆菌H8富硒发酵物；2周后腹腔注射LPS(0.5mg/kgBW，3days)，同时灌胃富硒乳杆菌H8富硒发酵物。
乳杆菌H8富硒发酵物的制备方法为：将乳杆菌H8种子液，用生理盐水稀释至OD600等于1，将稀释后的种子液以 1%接种量加入MRS液体培养基，并加入亚硒酸钠溶液至终浓度为0.5Mmol/L，置于恒温摇床，在温度37℃，转速250rpm的条件下连续培养24h（24h后，菌体硒含量为22.8 mg/Kg，残存活菌数为 3.00E+08 cfu/mL）。取培养后的菌液于离心机中，12000rpm离心15分钟，收集沉淀，根据0.4ug/gBW 硒添加量用生理盐水溶解并稀释到需要的硒浓度，此时乳杆菌H8活菌数随硒浓度稀释相同倍数。
（5）Na2SeO3-乳杆菌组（H8- Na2SeO3组）：预防期灌胃Na2SeO3-乳杆菌混合液；2周后腹腔注射LPS(0.5mg/kgBW，3 days)，同时灌胃Na2SeO3-乳杆菌混合液。
Na2SeO3-乳杆菌混合液的制备方法为：将乳杆菌H8种子液，用生理盐水稀释至OD600等于1，将稀释后的种子液以 1%接种量加入MRS液体培养基，在温度37℃，转速250rpm的条件下连续培养24h（24h后，残存活菌数为1.10E+09cfu/mL）。取培养后的菌液于离心机中，12000rpm离心15分钟，收集菌体沉淀，用Na2SeO3溶液溶解（Na2SeO3浓度与H8-SeNPs组稀释后硒浓度相同），并稀释到需要的活菌数（活菌数与H8-SeNPs组稀释后的活菌数相同）。
（6）Na2SeO3组：预防期灌胃Na2SeO3溶液；2周后腹腔注射LPS(0.5mg/kgBW，3days)，同时灌胃Na2SeO3溶液。
（7）药物组（ENR组）：预防期灌胃恩诺沙星(5mg/ml，现用现配)；2周后腹腔注射LPS(0.5mg/kgBW，3 days)，同时灌胃恩诺沙星(5mg/ml，现用现配)。
富硒乳杆菌组、Na2SeO3-乳杆菌组和Na2SeO3组灌胃液中硒浓度一致，每日灌胃的硒量一致，每日灌胃的硒量均为0.4ug/gBW。乳杆菌组、富硒乳杆菌组和Na2SeO3-乳杆菌组每日灌胃的乳杆菌H8的活菌数保持一致。
在每日灌胃硒量（0.4ug/gBW）一致的前提下，乳杆菌组、富硒乳杆菌组和Na2SeO3-乳杆菌组每日灌胃的活菌数是变化的，但始终保持三组每日灌胃的活菌数一致。由于体重持续增加，富硒乳杆菌组每日灌胃的硒量随之增加，每日灌胃的乳杆菌H8活菌数随着硒量增加一同增加（详见表2）。实验中保持乳杆菌组和Na2SeO3-乳杆菌组的活菌数随着富硒乳杆菌组的活菌数一同增加，与富硒乳杆菌组活菌数始终保持一致。
应激期结束后，空腹24h宰杀取样。
表2 灌胃液的硒含量和活菌数
3. 数据采集：
饲喂期间每日记录体重、采食量、最后一次处理后禁止饲喂12h，进行称重，心脏采血处死，取肝脏和脾脏进行称重，用于器官指数计算。
如图5A和图5B所示，富硒乳杆菌组（H8-SeNPs组）的末重高于其他组，显著高于LPS组和Control组，与Na2SeO3组和ENR组差异不显著。富硒乳杆菌组体重增加量高于其他各组，与Na2SeO3组和ENR组差异不显著，与其他各组差异显著。同时，LPS刺激显著降低了雏鸡的采食量。
由图5C可知，LPS刺激降低了雏鸡肝脏系数，显著降低了其脾脏系数；富硒乳杆菌组的肝脏系数和脾脏系数高于ENR组，差异不显著，同时，富硒乳杆菌组的肝脏系数和脾脏系数高于其他各组，差异显著。
实施例5 富硒乳杆菌H8对LPS刺激的雏鸡血清生化指标的影响
实验动物和动物分组与实施例4保持一致。
图6A显示，模型组LPS刺激升高了雏鸡血清ALT、AST水平、显著降低了其血清ALB水平，表明LPS刺激可能对雏鸡肝脏造成了一定程度的消极影响；富硒乳杆菌组血清ALT、AST水平低于其他处理组，富硒乳杆菌组血清ALB水平高于其他处理组，表明富硒乳杆菌H8对LPS刺激带来的消极影响有抑制作用。
由图6B可知，模型组LPS刺激显著降低了雏鸡血清SOD酶活力、GPX酶活力、显著升高了其血清MDA含量，表明LPS刺激可能导致了雏鸡氧化应激，破坏了雏鸡的抗氧化防御系统。实验结果显示，富硒乳杆菌H8对LPS诱导产生的氧化应激有一定的保护作用：与对照组和其他各处理组相比，富硒乳杆菌组血清SOD酶活力、GPX酶活力显著增强，同时血清MDA含量显著下降，表明富硒后的棒状乳杆菌H8增强了其抗氧化功能，这种有益效果可能来源于富硒后产生的生物纳米硒以及胞内抗氧化酶水平的增加。
图6C表明，灌胃富硒乳杆菌H8（H8-SeNPs组）能够显著提高肠炎雏鸡血清硒含量，且显著高于Na2SeO3组和H8-Na2SeO3组，这提示着富硒乳杆菌H8转化产生的生物纳米硒相较于无机硒可能在雏鸡肠道的消化吸收率更高。
实施例6 富硒乳杆菌H8对LPS刺激的雏鸡血清生化的影响
实验动物和动物分组与实施例4保持一致。
雏鸡结肠组织处理：解剖后立即取出结肠组织，用 PBS 缓冲溶液漂洗并用滤纸吸干，置于4%多聚甲醛中固定。将置于4%多聚甲醛中的结肠组织经过修块、水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色、透明、封固等步骤，制成常规HE染色的组织切片，厚约4μm。光镜观察并显微照相，用于观察组织学变化。
对7 组结肠组织样本染色后，各组结肠组织样本变化各不相同(如图7 所示)。LPS组的观察结果表现为绒毛稀疏有断裂，结肠黏膜层溃疡、坏死、脱落，黏膜下层结构疏松；H8组和H8-Na2SeO3组部分结肠黏膜层溃疡，Na2SeO3组观察结果表现为仅有少量的肠道黏膜层结构疏松，病理损伤介于 LPS 组与H8-SeNPs 组之间，炎症损伤程度轻于H8组和H8-Na2SeO3组；Control组、H8-SeNPs组及ENR药物组三组结肠组织结构完整，轮廓清晰，细胞排列整齐，肠道内膜、外壁均显示正常的生理形态。可见，H8-SeNPs组及ENR药物组病理组织学结果同Control组相似，可显著降低上述病症，呈现正向治疗效果；以上试验结果证实了富硒乳杆菌H8（H8-SeNPs组）可以缓解 LPS 诱导的结肠炎症损伤。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种缓解肠道炎症的富硒菌株，其特征在于，所述菌株属于棒状乳杆菌，名称为棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）ES23，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2023年6月16日，保藏编号为CGMCC NO.27653。
2.根据权利要求1所述的缓解肠道炎症的富硒菌株，其特征在于，所述菌株为革兰氏阳性菌，呈两端圆、短而直的杆状形态。
3.根据权利要求1所述的缓解肠道炎症的富硒菌株，其特征在于，所述菌株对于亚硒酸钠有耐受性，且能够将无机硒转化为纳米硒。
4.根据权利要求1所述的缓解肠道炎症的富硒菌株，其特征在于，所述菌株的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO:4所示。
5.采用权利要求1所述的缓解肠道炎症的富硒菌株制备的富硒菌剂或富硒发酵物。
6.一种组合物，包括权利要求1所述的缓解肠道炎症的富硒菌株，或权利要求5所述的菌剂或发酵物。
7.如权利要求1所述的缓解肠道炎症的富硒菌株，或权利要求5所述的菌剂或发酵物，或权利要求6所述的组合物的应用，其特征在于，所述应用为以下的一种或多种：
（1）在制备纳米硒中的应用；
（2）在制备抗氧化的富硒产品中的应用；
（3）在制备防治炎症的富硒产品中的应用；
（4）在制备提高免疫力的富硒产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述炎症为肠道炎症。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肠道炎症为小肠肠炎或结肠炎症。
10.根据如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述产品为食品、保健品、药品或饲料。
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