CN117866096A - 抗cd5单域抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抗CD5单域抗体及其应用，本发明属于抗体技术领域。本发明提供的抗CD5单域抗体的重链互补决定区包括CDR1、CDR2和CDR3。本发明提供的抗CD5单域抗体能够特异性地与CD5结合，且能够识别CD5分子胞外区D3近膜结构域。本发明还提供了人源化抗CD5单域抗体，降低分子在体内的免疫原性，人源化CD5单域抗体能够特异性识别CD5分子，亲和力较高。为研发靶向CD5的药物提供了广阔的前景。

Description

抗CD5单域抗体及其应用

技术领域

本发明属于抗体技术领域，具体涉及抗CD5单域抗体及其应用。

背景技术

CD5是主要分布在T淋巴细胞及少量B淋巴细胞的大分子糖蛋白，不仅参与固有免疫反应，还调控T、B淋巴细胞介导的特异性免疫反应，并通过T淋巴细胞受体(TCR)和B淋巴细胞受体(BCR)信号通路影响T、B淋巴细胞的生物学特性及功能。CD5分子既可以协助T细胞调节自身免疫性疾病的多种免疫平衡，又可以在B细胞中产生自身抗体清除部分自身病理性抗原，参与多种自身免疫性疾病过程。

CD5是一种67kDa的I型跨膜糖蛋白，在结构上属于古老且高度保守的富含半胱氨酸的清道夫受体(scavenger receptor cysteine-rich，SRCR)超家族。SRCR超家族分子可介导同型或异型相互作用，介导致病原相关的分子模式识别。富含半胱氨酸的CD5主要由347个氨基酸残基组成的胞外区和93个氨基酸残基组成的胞内区共同组成^[1]。所述胞外区结构中包含3个SRCR结构域(D1、D2和D3)和1个疏水跨膜区，可作为调节T细胞增殖的受体，使CD5分子有望成为T细胞恶性肿瘤的一个理想靶点。其中D3为近膜结构域^[2]，在靶向不同抗原的CAR-T细胞研究中显示，结合抗原分子近膜表位可增强CAR-T细胞的免疫功能。

单域抗体(singledomain antibody，sdAb)是一种人工设计的抗体分子，是发现于羊驼、单峰驼等驼科以及鲨鱼、鳐鱼等软骨鱼中的一种天然缺失轻链的重链抗体。sdAb的分子量大小仅为普通抗体的1/10，是最小的完整抗原结合片段，所以sdAb又称为纳米抗体。sdAb重链可变区的长CDR3区可以形成一个稳定的凸起环结构，该结构中的稳定的二硫键可以穿透抗原的内部，与普通抗体与抗原形成的凹形拓扑结构相比，VHH抗体与抗原的亲和力较高。单域抗体的分子量小且CDR3较长，其特点使sdAb更加灵活并易于携带靶向药物进入传统抗体难以进入的结合部位发挥作用。单域抗体具有更好的溶解度，其亲水性高于传统抗体。由于其有更多的亲水性氨基酸，热稳定性更强同时在蛋白酶的作用下仍然保持生物活性。由于其结构，sdAb可用于显示传统免疫球蛋白的隐藏表位，使其在免疫研究、诊断检测、医学和生物成像以及治疗性抗体开发等领域取得了广泛的应用^[3]。

目前无针对CD5-D3靶点的上市药物，因此，亟需研发一种亲和力高、特异性靶向CD5分子且能够识别CD5分子胞外区D3近膜结构域治疗性单域抗体。

[1]贺欣,邢莉民,邵宗鸿.CD5及其在自身免疫性疾病中的作用研究进展[J].中国免疫学杂志,2020,36(14):1766-1770.

[2]Consuegra-Fernández M,Aranda F,I,et al.CD5 as a TargetforImmune-Based Therapies.Crit Rev Immunol[J].2015；35(2):85-115.

[3]Hamers-Casterman C,Atarhouch T,Muyldermans S,etal.Naturallyoccurring antibodies devoid of light chains[J].Nature.1993Jun 3；363(6428):446-448.

发明内容

针对上述不足，本发明提供了一种抗CD5单域抗体及其应用。本发明提供的抗CD5单域抗体能够特异性地与CD5结合，且能够识别CD5分子胞外区D3近膜结构域。本发明还提供了人源化抗CD5单域抗体，降低分子在体内的免疫原性。人源化CD5单域抗体能够特异性识别CD5分子，亲和力较高。为研发靶向CD5的药物提供了广阔的前景。

术语：

本发明中，术语“氨基酸”包含天然氨基酸、合成氨基酸、以及以类似于天然氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸在本文中可以由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名法委员会所推荐的单字母符号来提及。

本发明中，术语“核苷酸序列”是指DNA或RNA中碱基的排列顺序，即在DNA中为A、T、G、C的排列顺序，或者在mRNA中A、U、G、C的排列顺序，也包括rRNA、tRNA、mRNA中碱基的排列顺序。

本发明中，重链指抗体中2条较长、相对分子量较大的相同的重链(H链)；轻链指抗体中2条较短、相对分子量较小的相同的轻链(L链)。

本发明中，可变区指免疫球蛋白轻链和重链靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区。

本发明中，术语“互补决定区”或“CDR”通常是指在抗原结合片段可变区内的互补性决定区。在本发明中，所述重链可变区存在3个CDRs，所述CDRs对于每个可变区命名为HCDR1、HCDR2和HCDR3。

本发明中，术语“FR”通常是指抗体可变结构域的更高度保守的部分，其被称为框架区。

本发明中，术语“单域抗体”或“VHH”是指缺失抗体轻链而只有重链可变区的一类抗体。

本发明中，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”通常是指一组多肽，在最简单的实施方案中通常有两种，其当在免疫效应细胞中时，提供细胞对靶细胞(通常为癌细胞)的特异性，并产生细胞内信号。在一些实施方案中，CAR包含至少一个细胞外抗原结合结构域(如VHH、scFv或其部分)，跨膜结构域和胞质信号传导结构域(本文中也称为“胞内信号传导结构域”)，其包含衍生自如下所定义的刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号传导结构域。

本发明中，术语“人天然噬菌体展示抗体库筛选”，是以靶蛋白或过表达细胞株作为抗原，进行人天然噬菌体展示抗体库海选。根据海选结果，挑取足够数量单克隆进行初筛，挑取阳性克隆进行测序，并进行序列多样性分析，挑选出序列特异性的抗体克隆，之后进行抗体样品制备。本说明书中“人天然噬菌体展示抗体库”和“人天然库”可互换使用。

本发明中，术语“功能性变体”通常是指包括与其具有基本上相同的功能且与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

本发明中，术语“自然杀伤细胞”或“NK细胞”通常是指免疫系统的一种细胞毒性淋巴细胞。

本发明中，术语“表达”通常是指特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

本发明中，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及并入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。

术语“人源化”抗体是指抗体的恒定区部分(即CH和CL区)或抗体所有全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。人源化抗体包括嵌合抗体、改型抗体和全人源化抗体等几类。应该理解，本领域技术人员根据实际需要能够制备出本发明单域抗体的合适的人源化形式，这在本发明涵盖的范围之内。

本发明的技术方案包括：

一方面，本发明提供了一种抗CD5单域抗体，所述抗CD5单域抗体包括重链可变区，所述重链可变区包括互补决定区CDR1、CDR2和CDR3；

所述CDR1包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

所述CDR2包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

所述CDR3包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；

具体地，所述抗CD5单域抗体的氨基酸序列包括SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列。

另一方面，本发明提供了一种核苷酸，所述核苷酸编码上述抗CD5单域抗体。

具体地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；或与SEQ ID NO：5所示的序列至少80％同源性的核苷酸序列。

又一方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包含上述核苷酸。

具体地，所述表达载体为原核细胞表达载体或真核细胞表达载体。

优选地，所述表达载体为pComb3xss载体。

又一方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述表达载体。

具体地，所述宿主细胞为原核表达细胞或真核表达细胞。

优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。

又一方面，本发明提供了一种人源化抗CD5单域抗体，所述人源化抗CD5单域抗体通过对权利要求1-2任一项所述抗CD5单域抗体进行人源化而获得。

具体地，所述人源化抗CD5单域抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示；或与SEQID NO：6所示的序列至少80％同源性的氨基酸序列。

又一方面，本发明提供了一种编码人源化抗CD5单域抗体的核苷酸。

具体地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；或与SEQ ID NO：7所示的序列至少80％同源性的核苷酸序列。

又一方面，本发明提供了一种包含上述核苷酸序列的表达载体。

具体地，所述表达载体为原核细胞表达载体或真核细胞表达载体。

优选地，所述表达载体为IG17479-1 01H-PTT5-hFc载体。

又一方面，本发明提供了一种包含上述表达载体的宿主细胞。

具体地，所述宿主细胞为原核表达细胞或真核表达细胞。

优选地，所述宿主细胞为293TS细胞。

又一方面，本发明提供了上述抗CD5单域抗体在制备药物中的应用。

具体地，所述应用包括上述抗CD5单域抗体；核苷酸；表达载体和/或宿主细胞。

具体地，所述应用包括在制备对抗癌症或自身免疫疾病药物中的应用。

进一步具体地，所述癌症包括T细胞恶性肿瘤或B细胞恶性肿瘤。

优选地，所述T细胞恶性肿瘤包括急性淋巴细胞白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、成人T细胞白血病/淋巴瘤、T细胞前淋巴细胞白血病或外周T细胞淋巴瘤。

优选地，所述B细胞恶性肿瘤包括非霍奇金淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病。

进一步具体地，所述自身免疫疾病包括自类风湿性关节炎或移植物抗宿主病。

本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的抗CD5单域抗体能够特异性地与CD5结合，亲和力高。

(2)本发明提供的CD5的单域抗体能够识别CD5分子胞外区D3近膜结构域，可增强CAR-T细胞的免疫功能。

(3)本发明还提供的人源化抗CD5单域抗体，降低分子在体内的免疫原性。人源化CD5单域抗体能够特异性识别CD5分子，亲和力较高。

附图说明

图1为第一轮PCR单域抗体基因电泳图。

图2为第二轮PCR单域抗体基因电泳图。

图3为FACS检测CD5单域抗体与CD5阳性细胞Jurkat的结合反应。

图4为FACS检测12C单域抗体与CD5阳性细胞Jurkat、CD5阴性细胞Raji的结合反应。

图5为FACS检测12C单域抗体与293TS-CD5D3细胞的结合反应。

图6为12C单域抗体与CD5截短蛋白的结合与解离曲线及拟合图。

图7为12C单域抗体结合靶细胞的亲和力水平检测。

图8为FACS检测人源化12C-huVHH抗体与CD5阳性细胞Jurkat、CD5过表达细胞293T-CD5及CD5阴性细胞Raji的结合反应。

图9为人源化12C-huVHH抗体结合靶细胞的亲和力水平检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进行说明，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明，以使本发明技术方案更易于理解掌握。下属实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明均可从商业途径获得。

本发明中所用实验材料见表1：

表1实验材料

实施例1抗CD5抗原特异性抗体库的构建

1、CD5抗原免疫羊驼

羊驼的免疫和血清效价检测使用人CD5(Arg25-Pro372)-His。选择一只成年健康的羊驼，进行免疫，在颈背部皮下多点注射抗原，共免疫六次，跟踪观察注射部位包块吸收情况，以确认免疫正确。免疫间隔时间为两周，第5次免疫后，采血清，测定抗原免疫效价，当效价达到1万倍以上时(ELISA方法)，采全血100mL左右，分离淋巴细胞，80℃保存备用。

2、构建噬菌体抗体库并进行特异性抗原CD5单域抗体的筛选

(1)应用QIAGEN试剂盒参照说明书内容，提取裂解后淋巴细胞中的RNA，并进行RNA纯化；

(2)使用PrimeScript^TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit将RNA反转为cDNA，构建cDNA文库；

(3)采用巢式PCR方法克隆目的基因；

采用巢式PCR方法，分别用两套引物进行两轮PCR扩增抗体重链可变区(VHH)基因片段；

1)进行第一轮PCR扩增：

构建PCR引物：

表2第一轮PCR扩增下游引物

引物	序号	序列
			YT-1	SEQ ID NO：8	CGCCATCAAGGTACCAGTTGA
YT-2	SEQ ID NO：9	GGGGTACCTGTCATCCACGGACCAGCTGA
			YT-3	SEQ ID NO：10	TACTTCATTCGTTCCTGAGGAGACGGT
YT-4	SEQ ID NO：11	GGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG
			YT-5	SEQ ID NO：12	TGGTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGGTT

表3第一轮PCR扩增上游引物

表4第一轮PCR扩增引物组

引物组	F	R
			1#	YT1BN-BamHI、YT2BN-BamHI	YT-1、YT-2
2#	YT1BN-BamHI、YT2BN-BamHI	YT-3、YT-4
			3#	YT1BN-BamHI、YT2BN-BamHI	YT-5

表中，F和R为扩增引物，其中：F表示正向引物，R表示反向引物。

第一轮PCR扩增，可得到大于700bp的普通重链抗体基因片段，500bp-700bp之间的为缺失轻链的重链抗体基因片段，以及400bp-500bp的抗体重链可变区(VHH)目的基因片段。通过凝胶电泳分析，筛选出500bp-700bp的基因片段和400bp-500bp的基因片段进行回收。电泳结果如图1所示，1#组引物PCR产物显示出两条明亮的带，其中一条带大于700bp，代表普通抗体DNA，另一条带大小在500bp-700bp之间，代表重链抗体DNA。2#组和3#组引物PCR产物为重链抗体可变区片段(VHH)，大小在400bp-500bp之间。将500bp-700bp之间缺失轻链的重链抗体基因片段、400bp-500bp之间的抗体重链可变区(VHH)目的基因片段切胶回收。

2)进行第二轮扩增：

引物构建：

表5第二轮PCR扩增下游引物

引物	序号	序列
			YTV8-XhoI	SEQ ID NO：15	CCGCTCGAGTGAGGAGACGGTGACCTGG

表6第二轮PCR扩增上游引物

抗体重链可变区(VHH)目的基因扩增。以回收的完整重链抗体及其重链可变区的基因片段为模板，用抗体重链可变区(VHH)特异性引物经第二轮PCR扩增，得到抗体重链可变区(VHH)目的基因(400bp-500bp)。电泳结果如图2所示，可以看到一条亮带，抗体重链可变区(VHH)目的基因在400bp-500bp之间，也就是该亮带中混杂有多种400bp-500bp之间的抗体重链可变区(VHH)目的基因。第二轮PCR扩增，经凝胶电泳，可筛选出含抗体重链可变区(VHH)目的基因(即400bp-500bp之间的基因片段)。

(4)构建目的基因文库

将上述获得的抗体重链可变区(VHH)目的基因片段和噬菌体载体pComb3xss采用BamHI内切酶和XhoI内切酶双酶酶切，酶切完成后，经连接酶将抗体重链可变区(VHH)目的基因片段连接至pComb3xss载体，构建重组质粒。将构建好的重组质粒电转化至TG1感受态细胞中，以使抗体重链可变区(VHH)目的基因片段与pComb3xss载体能融合表达。通过梯度稀释铺板，计算库容的大小为1.58×10⁸。为检测文库的插入率，随机选取48个克隆做菌落PCR。结果显示插入率达到94％。

(5)扩大培养

将-80℃保存的含噬菌体细菌种子室温溶化，混匀取500μL加入至70mL2YT培养基中，加入辅助噬菌体M13KO7进行感染，过夜培养，离心，收集上清后加入20％PEG-2.5M NaCl混匀(噬菌体在上清中)，离心收集沉淀，加入PBS和甘油进行重悬，并保藏于80℃备用。

实施例2特异性噬菌体的筛选

由于经过巢式PCR扩增出来的重链抗体可变区(VHH)片段有多种，而这些片段中，并非所有这些基因片段都是AntiCD5目标片段，将这些片段重链抗体可变区(VHH)片段转入噬菌体后，需要对目标噬菌体进行纯化，所述纯化目标噬菌体的步骤为：

1、以包被液稀释CD5蛋白至100μg/mL，150μL/孔进行包被。室温静置2h后，4℃孵育过夜；

2、吸出包被液，加入封闭液300μL/孔，37℃孵育2h；

3、吸出封闭液，加入噬菌体抗体库(5×10¹¹-1×10¹²)，室温静置2h；

4、筛孔分别用PBST(含0.05％Tween20)、PBS各洗涤10次，每次2min，将没有结合的噬菌体洗掉；

5、加入TEA到筛孔中洗脱噬菌体，吹吸混悬均匀，室温静置10min；

6、再次吹吸混悬均匀后加入到预冷的1M TrisHCl中混匀，进行滴度的测定；

7、扩增并纯化扩增后的噬菌体。

上述步骤1-步骤7，重复4轮，并以步骤7制备得到的噬菌体作为下一轮步骤3中的加入微孔的噬菌体(前三轮为全长CD5蛋白(Arg25-Pro372)-His，第四轮为CD5截短蛋白(Ser276-Gln368)-Fc；第一筛选包被浓度为100μg/mL，第二轮筛选包被浓度为10μg/mL，第三轮筛选包被浓度为1μg/mL，第四轮筛选包被浓度为10μg/mL)，随着筛选轮数的增加，包被液浓度逐级递减，但是洗脱下来的噬菌体增加，也即得到高富集的CD5特异性噬菌体。

实施例3特异性阳性单克隆的筛选

1、对上述已经富集的CD5特异性噬菌体进行PCR扩增，获得的特异性CD5单域抗体基因(带有限制性内切酶BbsI和BamHI位点的PCR产物)；

所述PCR扩增所用引物如表7-表8所示：

表7PCR扩增下游引物

引物	序号	序列
			R	SEQ ID NO：19	gAAgATCTCCggATCCTgAggAgACggTgACCTgggT

表中，F和R为扩增引物，其中：F表示正向引物，R表示反向引物。

表8PCR扩增上游引物

2、用限制性内切酶BbsI和BamHI分别处理步骤1制备得到的PCR产物和pSJF2载体，经T4连接酶连接重组，而获得能在大肠杆菌中高效表达的质粒sdAb pSJF2；

3、从生长菌落的琼脂平板上随机挑取多个单菌落，然后接种在含有Amp的2YT液体培养基的96孔深孔培养板中；

4、培养4小时后，将单克隆一一对应接种在带编号的以小格分隔的含Amp的LB固体平板上；

5、向深孔培养板加入IPTG至终浓度0.5mM诱导；

6、培养过夜后，收获表达蛋白的菌上清液；

7、以CD5抗原进行ELISA测定，选出Anti CD5阳性克隆ELISA测定结果。

表9ELISA检测结果

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	4.039	3.870	3.787	3.788	4.002	3.685	3.479	3.697	0.070	3.740	3.734	3.245
B	4.000	3.714	4.024	3.801	3.843	3.897	3.894	4.246	3.760	3.847	3.913	3.940
													C	3.944	3.945	3.958	3.977	3.982	3.823	4.010	3.847	3.898	3.983	4.172	3.936
D	3.957	3.803	3.935	3.807	3.872	3.664	3.917	4.160	3.731	3.906	3.990	3.821
													E	3.863	3.934	3.890	3.774	3.980	3.158	3.797	3.663	3.839	3.857	4.039	3.478
F	3.936	3.979	3.960	3.916	3.749	3.955	3.699	3.803	3.828	3.912	3.696	3.805
													G	3.987	3.909	4.079	3.978	3.858	3.887	3.837	3.866	3.836	3.906	3.839	0.064
H	3.910	4.112	3.797	3.827	3.778	3.730	0.082	3.640	3.977	3.575	3.676	0.048

ELISA检测结果如表9所示：与96孔深孔板一致，第一列A-H为纵列编号、第一排1-12为横排编号，通过横纵编号为坐标对克隆进行编号和定位(A1-H12)，将深孔板内克隆与OD_450nm检测读数对应起来；每板接种94个克隆(留G12、H12不接种，作为阴性对照)，除9A和7H为阴性克隆外，其余均为阳性克隆。将阳性克隆进行测序，对测序结果进行分析，最终得到阳性候选抗体重链可变区(VHH)基因序列。

实施例4CD5单域抗体在宿主大肠杆菌中表达、纯化

得到上述阳性单克隆后，需要将其表达方可得到CD5单域抗体，后续主要是通过大肠杆菌表达，然后纯化，即可得到所需的CD5单域抗体。具体操作过程如下：

(1)根据ELISA阳性序列的多样性分析，将实施例3挑选得到的7个代表性阳性克隆菌液(1A，1F，2G，6C，8G，9H，12C)接种于4mL的含氨基苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜；

(2)转种1mL过夜培养物于100mL含氨基苄青霉素的LB培养液中，37℃，230rpm，摇床培养；培养至OD值达0.4-0.6；加入1.0mM IPTG，继续培养过夜，然后离心，收菌；高渗法裂解细菌，离心，收上清中可溶性单域抗体蛋白；

(4)经Ni+离子亲和层析获得纯度达95％以上的蛋白。

实施例5流式细胞实验检测CD5单域抗体与人CD5表达细胞的结合

为了评价CD5候选抗体在表达CD5分子的T系急性淋巴细胞白血病细胞系Jurkat细胞上的结合活性，采用FACS方法检测其与细胞上CD5蛋白的结合活性，结果如图3所示。

由图3可以看出，1A，1F，2G，6C，8G，9H克隆与阳性细胞Jurkat不结合或结合很弱；克隆编号为12C的单域抗体候选分子在表达CD5分子的T系急性淋巴细胞白血病细胞系Jurkat细胞上的结合活性最强。

实施例6流式细胞实验检测12C单域抗体的特异性

为了进一步分析初筛克隆12C单域抗体的特异性，确定最佳的候选克隆，采用FACS检测12C抗体与CD5阳性细胞Jurkat、CD5阴性细胞Raji的结合反应性。

结果如图4所示，12C单域抗体能够结合CD5阳性细胞Jurkat，且与CD5阴性细胞Raji不结合，说明12C单域抗体为特异性克隆。

实施例7 12C单域抗体识别CD5分子胞外区D3近膜结构域(CD5-D3)

CD5分子共有3个胞外结构域(D1、D2、D3)，其中D3为近膜结构域，氨基酸序列为Ser276-Gln368。通过基因合成，合成出人CD5截短蛋白(CD5-D3)基因序列，构建至载体，连接后导入大肠杆菌，挑取大肠杆菌单克隆后测序得到正确的质粒克隆，进行质粒抽提。通过转染试剂PEI瞬时转染处于对数生长期的293TS细胞。通过FACS检测12C单域抗体与293TS-CD5D3细胞的结合活性。结果如图5所示，12C单域抗体能够结合293TS-CD5D3细胞，表明12C单域抗体能够识别CD5分子胞外区D3近膜结构域。

实施例8蛋白水平亲和力测定实验

通过表面等离子共振技术(SPR)检测CD5-VHH与人CD5截短蛋白的结合亲和力。将人CD5截短蛋白偶联到CM5芯片上，用于捕获CD5-VHH抗体。以12C单域抗体作为流动相，进行亲和力检测，结果如图6所示。

图6为12C单域抗体与CD5截短蛋白的结合与解离曲线及拟合图，经计算分析得到12C单域抗体与抗原的亲和力数值。亲和力数据如表10所示。结果显示，12C单域抗体为高亲和力的抗人CD5抗体，亲和力KD值达到nm水平。

表10抗体SPR检测结果

抗体	受体	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
					12C	人CD5截短蛋白	3.10E+05	9.65E-04	3.12E-09

实施例9CD5单域抗体在真核细胞中的表达、纯化及细胞水平亲和力检测

1CD5单域抗体在真核细胞中的表达、纯化

将单域抗体12C-VHH序列插入到IG17479-1 01H-PTT5-hFc载体质粒中，通过293TS细胞表达系统表达。表达一周后收取上清经Protein A GE纯化后，使用Nanodrop检测定量分析，并进行SDS-PAGE分析。

2细胞水平亲和力检测

将12C-VHH抗体采用FACS稀释液梯度稀释，与Jurkat细胞共孵育，检测抗体为anti-human IgG Fc PE。通过拟合曲线计算抗体的EC₅₀，结果如图7所示。图7显示，12C单域抗体与Jurkat细胞表面CD5的结合EC₅₀值为10.53nM。

实施例10候选VHH序列

经过以上多个步骤的表征，获得了亲和力高、特异性好且识别CD5分子胞外区D3近膜结构域的单域抗体12C，所述12C单域抗体的氨基酸序列如SEQID NO：4所示；其互补决定区CDR1、CDR2、CDR3如表11所示；其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

表11VHH抗体CDR区信息

CDR区	序列编号	序列
			CDR1	SEQ ID NO：1	SYAMG
CDR2	SEQ ID NO：2	VGAIHKSGGDTYYADSVK
			CDR3	SEQ ID NO：3	CAAGDGTDTWDEYDY

实施例11抗体人源化改造

为了降低分子在体内的免疫原性，本发明对候选分子进行了人源化设计。得到了人源化的分子，人源化改造后的分子编号分别为12C-huVHH。所述12C-huVHH的氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示。进行在人源细胞表达的密码子优化后，核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

实施例12人源化CD5单域抗体在真核细胞中的表达、纯化

将人源化后的单域抗体12C-huVHH序列插入到IG17479-1 01H-PTT5-hFc载体质粒中，通过293TS细胞表达系统表达。表达一周后收取上清经Protein AGE纯化后，使用Nanodrop检测定量分析，并进行SDS-PAGE分析。

实施例13流式细胞实验检测人源化12C单域抗体的特异性

为了评估人源化对12C单域抗体特异性的影响，通过FACS对人源化改造后的衍生分子进行了检测。通过流式细胞实验(FACS)检测12C-huVHH与CD5阳性细胞Jurkat、CD5过表达细胞293T-CD5、CD5阴性细胞Raji的结合反应性，结果如图8所示。

结果显示，人源化12C单域抗体能够结合CD5阳性细胞Jurkat及293T-CD5，但与CD5阴性细胞Raji不结合。说明人源化12C能够特异性识别CD5分子。

实施例14人源化改造后的衍生分子细胞水平亲和力检测

为了评估人源化对抗体结合人CD5阳性Jurkat细胞结合的影响，采用FACS对人源化改造后的衍生分子进行了检测。用梯度稀释的抗体与CD5表达的Jurkat细胞共孵育，检测抗体为anti-human IgG Fc PE。通过拟合曲线计算抗体的EC₅₀。结果如图9所示，结果表明人源化后的得到的衍生分子12C-huVHH与Jurkat细胞表面CD5的结合亲和力分别为9.76nM。

综上所述，本发明技术方案通过结合基因工程的方法得到的特异性识别CD5分子胞外区D3近膜结构域的单域抗体，特异性好，且亲和力高。

对比例1与现有技术中抗CD5单域抗体进行对比

表12与现有技术中抗CD5单域抗体进行对比

注：表中NA代表未记载。

以上结果表明，本发明提供的抗CD5单域抗体能够特异性地与CD5结合，与Jurkat结合能力强，并且能够识别CD5分子胞外区D3近膜结构域。

上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围。应当指出的是，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附要求为准。

Claims (16)

1.一种抗CD5单域抗体，其特征在于，所述抗CD5单域抗体包括重链可变区，所述重链可变区包括互补决定区CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；所述CDR2包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；所述CDR3包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗CD5单域抗体，其特征在于，所述抗CD5单域抗体的氨基酸序列包括SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

3.一种核苷酸，其特征在于，所述核苷酸编码权利要求1-2中任一项所述的抗CD5单域抗体。

4.根据权利要求3所述的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求3-4任一项所述的核苷酸。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求5所述的表达载体。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为原核表达细胞或真核表达细胞。

8.一种人源化抗CD5单域抗体，其特征在于，所述人源化抗CD5单域抗体通过对权利要求1-2任一项所述的抗CD5单域抗体进行人源化而获得。

9.根据权利要求8所述的人源化抗CD5单域抗体，其特征在于，所述人源化抗CD5单域抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示。

10.一种编码人源化抗CD5单域抗体的核苷酸。

11.根据权利要求10所述的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的核苷酸序列为SEQ IDNO：7所示。

12.一种包含权利要求10-11任一项中所述核苷酸的表达载体。

13.一种包含权利要求12中所述表达载体的宿主细胞。

14.一种抗CD5单域抗体在制备药物中的应用。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述药物包括权利要求1-2任一项中所述抗CD5单域抗体，或权利要求3-4任一项中所述的核苷酸，或权利要求5中所述的表达载体，或权利要求6-7任一项中所述的宿主细胞，或权利要求8-9任一项中所述的人源化抗CD5单域抗体，权利要求10-11任一项中所述的核苷酸，或权利要求12中所述的表达载体，或权利要求13中所述的宿主细胞。

16.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述药物包括在治疗癌症或治疗自身免疫疾病的药物。