CN117865808A - 一种新抗菌化合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新抗菌化合物及其制备方法与应用，所述新抗菌化合物由病原菌尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）胁迫内生真菌（Epicoccum latusicollum）发酵，过滤，弃去菌丝体，发酵液经大孔吸附树脂富集，采用高效液相制备分离获得，新化合物化学名为(6E,8E)‑13‑acetoxy‑3‑hydroxy‑8,10,12,14‑tetramethylhexadeca‑6,8‑dienoic acid。本发明通过病原菌胁迫内生菌发酵获得的新化合物具有显著的抗菌活性，为基于胁迫效应挖掘内生真菌抗菌天然化合物提供了科学依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物的应用，特别涉及一种采用病原菌胁迫内生菌分离新抗菌化合物的方法和应用。
背景技术
植物内生真菌(Endophytic fungi)是指生活在植物体内细胞中或在其生活史的某一段时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害的一类真菌。植物内生真菌长期与宿主共生，产生一系列次级代谢产物，以保护宿主免受多种胁迫。逆境可能诱导内生真菌产生特殊的次级代谢产物。自然界中，真菌常受到多种胁迫因素的挑战，作为一种生理反应，可能会为了逆境生存而激活适应性代谢重编程。因此，胁迫可能激活植物内生真菌的某些沉默基因，诱导独特的生物代谢途径，从而产生特殊的次级代谢产物。通过病原真菌胁迫内生真菌以寻找具有潜在抗菌活性的天然产物，为发现新型抗菌化合物提供了新方法。
发明内容
本发明目的是提供一种新抗菌化合物及其制备方法与应用。
新抗菌化合物，该化合物命名为(6E,8E)-13-acetoxy-3-hydroxy-8,10,12,14-tetramethylhexadeca-6,8-dienoic acid，具体结构式如下化合物(1)
前述的新抗菌化合物或其药用盐在制备抗菌药物中的应用和药学上可接受的载体。
所述的新抗菌化合物或其药用盐作为葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、辣椒刺盘孢(Colletotrichum capsici)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、香蕉炭疽盘长孢菌(Gloeosporium musarum)、可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)、稻黑孢霉(Nigrospora oryzae)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)和核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)病原真菌的抗真菌药物；所述的新抗菌化合物或其药用盐作为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)病原细菌的抗细菌药物。
新抗菌化合物的制备方法，将病原菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)胁迫内生真菌Epicoccum latusicollum同时接种于培养基发酵培养获得培养液，通过抽滤或高速离心将培养液分离成发酵液和菌丝体；弃去菌丝体，发酵液经大孔吸附树脂富集，采用高效液相制备分离，获得新抗菌化合物。
前述的新抗菌化合物的制备方法是，所述培养基为马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB)，其培养培养参数为18～28℃，160～220r/min培养5～30d，高速离心的转速为10,000～12,000r/min。
前述的新抗菌化合物的制备方法是，所述病原菌尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和内生真菌(Epicoccum latusicollum)发酵前先活化培养，然后4℃低温保存5～30d或直接接种于发酵培养基。
前述的新抗菌化合物的制备方法是，所述尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和内生真菌(Epicoccum latusicollum)的接种量为1:1～1:5；所述活化培养为：将尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和内生真菌(Epicoccum latusicollum)接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)中，28±1℃，培养3～7d。
前述的新抗菌化合物的制备方法是，所述大孔吸附树脂富集中采用大孔吸附树脂装填50×500mm的层析柱，用无水乙醇洗涤树脂，然后纯水洗脱平衡；将收集的上清液上样，随后用纯水洗涤至流出液近无色；再用80％甲醇/水(v/v)洗脱至流出液近无色，收集该部分洗脱液，50℃下用旋转蒸发仪减压浓缩至恒重，得到粗品。
前述的新抗菌化合物的制备方法是，所述高效液相制备分离采用10～50mL含50％乙腈/0.1％乙酸的水溶液溶解粗品，0.45μm滤膜过滤，经高效液相制备分离；所述高效液相制备分离中的流动相为乙腈-0.1％乙酸水溶液，梯度洗脱50～90min，流速50～100mL/min，检测波长为210nm和254nm，高效液相色谱法(HPLC)检测并收集分离液，依次合并目标物，旋转蒸发浓缩至小体积，反复纯化，获得化合物纯品
与现有技术比较，本发明从病原菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)胁迫内生真菌(Epicoccum latusicollum)发酵产物中制备分离得到化合物(1)，该化合物(1)具有显著的广谱抗菌活性，可以用于制备抗菌药物，为研究与开发新的抗菌药物提供了候选化合物，为开发利用植物内生真菌的天然活性物质提供了科学依据和新的思路。
附图说明
图1为化合物(1)的结构式；
图2为化合物(1)的1H-NMR谱；
图3为化合物(1)的13C-NMR谱和DEPT谱；
图4为化合物(1)的1H-1H COSY谱；
图5为化合物(1)的HSQC谱；
图6为化合物(1)的HMBC谱；
图7为化合物(1)的NOESY谱；
图8为化合物(1)的HR-ESI-MS谱；
图9为化合物(1)的抗菌活性。
图中A为抑制葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)，B为抑制灰葡萄孢(Botrytis cinerea)，C为抑制辣椒刺盘孢(Colletotrichum capsici)，D为抑制尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，E为抑制香蕉炭疽盘长孢菌(Gloeosporium musarum)，F为抑制可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)，G为抑制稻黑孢霉(Nigrospora oryzae)，H为抑制立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，I为抑制核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)，J为抑制枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，K为抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
本发明的技术方案是，该化合物命名为(6E,8E)-13-acetoxy-3-hydroxy-8,10,12,14-tetramethylhexadeca-6,8-dienoic acid，具体结构式如下化合物(1)。
进一步地，化合物(1)是从病原菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和内生真菌Epicoccum latusicollum共同发酵的代谢产物中分离得到的。
本发明还涉及所述化合物(1)的分离方法，包括以下步骤：
a.将病原菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)中活化培养，活化培养温度28±1℃，培养时间3～7d，所用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，pH自然；养得到种子菌块，种子菌块4℃低温保存5～30d或直接使用，挑选种子菌块接入马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)中培养得到尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的种子液。
b.将内生真菌(Epicoccum latusicollum)接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)中活化培养，活化培养温度28±1℃，培养时间3～7d，培养得到种子菌块，种子菌块4℃低温保存5～30d或直接使用，挑选种子菌块接入马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)中培养得到内生真菌(Epicoccum latusicollum)的种子液。
c.将步骤a和b中获得的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和内生真菌Epicoccumlatusicollum的种子液或种子菌块按1:1～1:5接种量接种到马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)中，置于摇床，18～28℃，160～220r/min培养5～30d得到发酵产物。
d.将c步骤中发酵产物通过抽滤或10,000～12,000r/min高速离心分离成发酵液和菌丝体，弃去菌丝体，取上清液进行大孔吸附树脂富集。具体为：首先用大孔吸附树脂装填50×500mm的层析柱，然后用无水乙醇洗涤树脂，接着用纯水洗脱平衡；将收集的上清液上样，随后用纯水洗涤至流出液近无色；再用80％甲醇/水(v/v)洗脱至流出液近无色，收集该部分洗脱液，50℃下用旋转蒸发仪减压浓缩至恒重，得到粗品。
e.将d步骤中获得的中粗品进行高效液相制备分离，获得化合物纯品。具体为：采用10～50mL含50％乙腈/0.1％乙酸的水溶液溶解粗品，0.45μm滤膜过滤，经高效液相制备分离(流动相为乙腈-0.1％乙酸水溶液，梯度洗脱50～90min，流速50～100mL/min，检测波长为210nm和254nm)，高效液相色谱法(HPLC)检测并收集分离液，依次合并目标物，旋转蒸发浓缩至小体积。反复纯化，直至获得化合物纯品。
所述马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)为：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、蒸馏水1000mL，pH自然。
本发明所述的内生真菌Epicoccum latusicollum，2022年3月8日保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，生物保藏号：CGMCC NO.40110，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，请求保藏人对其培养物指定的名称、株号或符号：Epicoccum latusicollum HGUP191049。ITS序列GenBank基因登录号为：MZ541971.1，与该菌株ITS序列相似度≥98％视为同一物种。
本发明所述的病原真菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)分离自太子参根腐病，来自贵州大学植物病理学实验室，菌株号：FO44。ITS序列GenBank基因登录号为：MN538904.1。与该菌株ITS序列相似度≥98％视为同一物种。
本发明通过实验发现，化合物(1)对葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)、稻黑孢霉(Nigrospora oryzae)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的最低抑菌浓度(MIC)均为15.6μg/mL；对辣椒刺盘孢(Colletotrichum capsici)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、香蕉炭疽盘长孢菌(Gloeosporium musarum)和尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)的最低抑菌浓度(MIC)均为62.5μg/mL；此外，对枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)也有抑制活性。此结果表明：本发明的化合物(1)具有比较显著的广谱抗菌活性。
对化合物(1)的结构鉴定
化合物(1)：白色粉末，根据HR-ESI-MS数据，准分子离子峰m/z 381.2640[M-H]-(C22H37O5计算值为381.2746)，确定其分子式为C22H38O5，不饱和度为4。化合物(1)的1H-NMR谱中显示了3个烯氢质子信号δH 5.66(d,J＝15.6Hz,1H,H-7)、5.53(dt,J＝15.6,6.9Hz,1H,H-6)、5.19(d,J＝9.2Hz,1H,H-9)，2个连氧次甲基氢质子信号δH 4.56(dd,J＝7.2,5.1Hz,1H,H-13)、3.77(tt,J＝8.0,4.7Hz,1H,H-3)，5个脂肪族亚甲基氢质子δH 2.26(dd,J＝14.8,4.8Hz,1H,H-2)&2.17(dd,J＝14.8,8.2Hz,1H,H-2')、2.17(m,1H,H-5)&2.06(m,1H,H-5')、1.43(m,2H,H-4)、1.40(m,1H,H-15)&0.99(m,1H,H-15')、1.28(ddd,J＝13.1,9.3,3.3Hz,1H,H-11)&0.98(m,1H,H-11')，3个脂肪族次甲基氢质子δH 2.48(m,1H,H-10)、1.77(m,1H,H-12)、1.63(m,1H,H-14)，6个甲基质子δH 1.66(s,3H,H-20)、0.87(d,J＝7.2Hz,3H,H-19)、0.83(t,J＝7.2Hz,3H,H-16)、0.83(t,J＝7.2Hz,3H,H-22)、0.82(d,J＝7.2Hz,3H,H-18)、0.81(d,J＝7.2Hz,3H,H-17)。
化合物(1)的13C-NMR谱结合DEPT谱显示了2个羰基碳信号δc 173.6(C-1)、170.4(C-21)，1个sp2杂化的季碳信号δc 130.9(C-8)，3个sp2杂化的次甲基碳信号δc 137.1(C-9)、134.6(C-7)、127.4(C-6)，2个连氧次甲基碳信号δc 81.0(C-13)、66.7(C-3)，5个脂肪族亚甲基碳信号δc 42.9(C-2)、38.0(C-11)、36.9(C-4)、28.4(C-5)、23.6(C-15)，3个脂肪族次甲基碳信号δc 35.0(C-14)、31.3(C-12)、29.4(C-10)，6个甲基碳信号δc 19.7(C-19)、16.9(C-18)、15.3(C-17)、12.4(C-20)、11.0(C-16)、11.0(C-22)。
根据J6,7(15.6Hz)将C-6和C-7之间的双键确定为反(E)式。根据NOESY谱中H-9与H-7的相关信号将C-9和C-8之间的双键确定为反(E)式。根据1H-1H COSY谱中的相关信号得到如图4中粗实线所示的两个结构片段。HMBC谱中H-13和H-22到C-21存在相关信号，H-20到C-9，C-8，C-7存在相关信号，H-3和H-2到C-1存在相关信号。综上推测化合物(1)的平面结构如图1所示。经SciFinder Scholar检索，未发现文献报道此化合物，命名为(6E,8E)-13-acetoxy-3-hydroxy-8,10,12,14-tetramethylhexadeca-6,8-dienoic acid，该化合物(1)为新化合物。
表1化合物(1)的1H-NMR和13C-NMR数据(600/150MHz,DMSO-d6)
采用微量二倍稀释法测试化合物(1)的抗菌活性。
1.试验用试剂：将制备的化合物(1)用二甲基亚砜(DMSO)溶解得浓度为0.5mg/mL的浓度。
2.本实验所用病原真菌为葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、辣椒刺盘孢(Colletotrichum capsici)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、香蕉炭疽盘长孢菌(Gloeosporium musarum)、可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)、稻黑孢霉(Nigrospora oryzae)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)；病原细菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
3.抗真菌试验如下：
供试真菌活化：将植物病原真菌葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、辣椒刺盘孢(Colletotrichum capsici)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、香蕉炭疽盘长孢菌(Gloeosporium musarum)、可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)、稻黑孢霉(Nigrospora oryzae)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)在超净工作台中接种于PDA培养基，28±1℃恒温培养箱中培养3～7d，作为供试真菌。
取步骤1中1～3mL化合物(1)试剂，经微孔滤膜(0.22μm)过滤后备用。采用滤纸片扩散法进行抗真菌试验：将滤纸用打孔器制成直径为6mm的圆形滤纸片，121℃，30min高温灭菌后备用。在超净工作台上，将供试菌的菌饼(直径：6mm)接种到PDA平板(直径：9cm)上。并将无菌滤纸片以相等的距离放在平板的另一边缘，然后用10μL化合物(1)试剂(0.5mg/mL)浸渍滤纸片。DMSO作为阴性对照。所有平板在28℃下培养2～7d，测量阴性对照平板菌丝径向生长半径R1和含有化合物(1)试剂的实验平板菌丝径向生长半径(R2)，抑制率(％)＝(R1-R2)/R1×100％。抑制率越大，说明对供试菌的抑菌效果越好。以2倍梯度稀释法依次进行稀释再进行抗真菌试验，抑制率接近于0，则说明没有抑菌效果，即为最低抑菌浓度，重复三次。确定化合物的MIC值。
PDA培养基组成：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，自然pH。
4.抗细菌试验如下：
供试菌活化：在超净工作台中，将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)通过划线接种于营养琼脂(NA)培养基，37℃恒温培养箱中培养12～24h后，挑取单菌落接种于LB培养基中，220r/min，37℃培养12～24h，作为供试细菌。
取步骤1中1～3mL化合物(1)试剂，经微孔滤膜(0.22μm)过滤后备用。采用滤纸片扩散法进行抗细菌试验：将滤纸用打孔器制成直径为6mm的圆形滤纸片，121℃，30min高温灭菌后备用。在超净工作台上，将供试细菌菌悬液，迅速加入到尚未凝固的NA培养基(45～65℃)中，每100mL NA培养基加10mL供试细菌菌悬液，摇匀后迅速倒入平板中，冷却后得到不同供试细菌的培养基。将无菌滤纸片(直径：6mm)置于供试细菌的NA板中心，然后用10μL化合物(1)试剂(0.5mg/mL)浸渍滤纸片。DMSO作为阴性对照。平板置于37℃恒温培养箱，培养12～24h后，观察化合物(1)对供试细菌的抑制效果。当抑菌圈直径大于7mm，说明该化合物具有抗细菌活性，抑菌圈直径越大，说明对供试细菌的抑菌效果越好。以2倍梯度稀释法依次进行对化合物(1)稀释再进行抗细菌试验，抑菌圈直径小于等于7mm，则说明没有抑菌效果，重复三次，确定化合物的MIC值。
NA培养基组成：蛋白胨10.0g，牛肉粉3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH7.3±0.1。
LB培养基组成：蛋白胨10.0g，酵母浸出粉5.0g，氯化钠10.0g，pH值7.0。
5.抗真菌试验结果：化合物(1)对葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)、稻黑孢霉(Nigrospora oryzae)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的MIC值均为15.6μg/mL；对辣椒刺盘孢(Colletotrichum capsici)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、香蕉炭疽盘长孢菌(Gloeosporium musarum)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的MIC值均为62.5μg/mL。
6.抗细菌试验结果：化合物(1)对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有抑制活性，MIC值为125～250μg/mL。
上述的实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本申请中的实施例及实施例中的特征在不冲突的情况下，可以相互任意组合。本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种新抗菌化合物，其特征在于：该化合物命名为(6E,8E)-13-acetoxy-3-hydroxy-8,10,12,14-tetramethylhexadeca-6,8-dienoic acid，具体结构式如下化合物(1)
2.根据权利要求1所述的新抗菌化合物或其药用盐在制备抗菌药物中的应用和药学上可接受的载体。
3.如权利要求1所述的新抗菌化合物，其特征在于：所述的新抗菌化合物或其药用盐作为葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、辣椒刺盘孢(Colletotrichum capsici)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、香蕉炭疽盘长孢菌(Gloeosporium musarum)、可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)、稻黑孢霉(Nigrospora oryzae)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)病原真菌的抗真菌药物；所述的新抗菌化合物或其药用盐作为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)病原细菌的抗细菌药物。
4.如权利要求1或2所述的新抗菌化合物的制备方法，其特征在于：将病原菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)胁迫内生真菌(Epicoccum latusicollum)同时接种于培养基发酵培养获得培养液，通过抽滤或高速离心将培养液分离成发酵液和菌丝体；弃去菌丝体，发酵液经大孔吸附树脂富集，采用高效液相制备分离，获得新抗菌化合物。
5.根据权利要求4所述的新抗菌化合物的制备方法，其特征在于：所述培养基为马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB)，其培养培养参数为18～28℃，160～220r/min培养5～30d，高速离心的转速为10,000～12,000r/min。
6.如权利要求3-5任意一项所述的新抗菌化合物的制备方法，其特征在于：所述病原菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和内生真菌(Epicoccum latusicollum)发酵前先活化培养，然后4℃低温保存5～30d或直接接种于发酵培养基。
7.如权利要求6所述的新抗菌化合物的制备方法，其特征在于：所述尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和内生真菌(Epicoccum latusicollum)的接种量为1:1～1:5；所述活化培养为：将尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和内生真菌(Epicoccum latusicollum)接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)中，28±1℃，培养3～7d。
8.根据权利要求7所述的新抗菌化合物的制备方法，其特征在于：所述大孔吸附树脂富集中采用大孔吸附树脂装填50×500mm的层析柱，用无水乙醇洗涤树脂，然后纯水洗脱平衡；将收集的上清液上样，随后用纯水洗涤至流出液近无色；再用80％甲醇/水(v/v)洗脱至流出液近无色，收集该部分洗脱液，50℃下用旋转蒸发仪减压浓缩至恒重，得到粗品。
9.根据权利要求8所述的新抗菌化合物的制备方法，其特征在于：所述高效液相制备分离采用10～50mL含50％乙腈/0.1％乙酸的水溶液溶解粗品，0.45μm滤膜过滤，经高效液相制备分离；所述高效液相制备分离中的流动相为乙腈-0.1％乙酸水溶液，梯度洗脱50～90min，流速50～100mL/min，检测波长为210nm和254nm，高效液相色谱法(HPLC)检测并收集分离液，依次合并目标物，旋转蒸发浓缩至小体积，反复纯化，获得化合物纯品。
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