CN117860773A

CN117860773A - 促进ar基因甲基化的药物及其在预防或治疗雄性激素脱发中的用途

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Publication number: CN117860773A
Application number: CN202311597021.1A
Authority: CN
Inventors: 粟东升; 成福义; 邓洪新
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2023-11-28
Filing date: 2023-11-28
Publication date: 2024-04-12

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种促进AR基因甲基化的药物及其在预防或治疗雄性激素脱发中的用途。针对现有治疗雄脱的药物需长期服药，副作用大等问题，本发明提供了一种促进AR基因甲基化的药物，其包括介导AR基因启动子区域甲基化的DNA，RNA或蛋白质中的至少一种，优选为引导基因特异靶向的gRNA和CRISPR介导的甲基化修饰工具的组合。本发明的药物作用于AR基因，无需改变AR基因序列，仅通过增加AR基因启动子的甲基化水平，实现精准高效又持久的AR表达下调，进而实现对雄脱的预防和治疗，具有很好的治疗效果与前景。本发明方法操作简便，经济高效，产品可制备成质粒或mRNA形式，即可实现规模化量产，又能提高产品安全性。

Description

促进AR基因甲基化的药物及其在预防或治疗雄性激素脱发中的用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种促进AR基因甲基化的药物及其在预防或治疗雄性激素脱发中的用途。

背景技术

雄激素性脱发(雄脱)是一种具有遗传倾向的多基因隐性遗传疾病，是起始于青春期或青春后期的一种进行性毛囊微小化的脱发疾病，占脱发总数的90％以上。雄脱虽不影响身体健康，但却严重影响患者的心理健康和生活质量。目前普遍研究表明，雄激素在雄脱的发病中占有决定性因素。过多的雄激素在类固醇5-α还原酶作用下被还原为二氢睾酮(dihydrotestosterone,DHT)。DHT与雄激素受体(androgen receptor,AR)具有极强的结合亲和力，两者结合后诱导或抑制下游靶基因的转录，其中皮肤毛囊中TGF-β、DKK1和IL-6等负性因子表达增加，而促进毛囊细胞增殖的Wnt/β-catenin信号通路显著下调，最终引起毛囊微小化直至消失，导致脱发的发生。根据卫健委数据，截至2020年末我国脱发人群已突破2.52亿人，脱发人群基数庞大，且呈年轻化发展趋势，开发防治脱的市场潜力巨大。

目前治疗雄脱的一线用药为非那雄胺和米诺地尔，但这两种药物均需要长期使用，停药后极易恢复脱发，而且长期用药容易造成药物耐受及其他不良反应，包括性功能障碍、抑郁、冠脉硬化等。植发手术通过将毛囊移植到脱发区域，则存在成本高，存活率低，安全性也值得商榷。近年来已有多项研究在探索雄脱新的治疗方法，其中将AR基因作为关键靶点预防和治疗雄脱已越来越受到大家的重视。与非那雄胺系统性抑制雄激素DHT合成从而刺激毛发生长不同，新方法通过与标靶组织者中雄激素竞争结合AR，发挥局部抑制雄激素及其受体AR所介导的信号通路的传导。这一机制在阻断信号传导刺激生发的同时，避免了系统性雄激素水平降低带来的临床副作用。开拓药业的福瑞他恩是国内首个针对AR的小分子拮抗剂，目前已批准进入三期临床实验。2023年3月，澳大利亚也批准了全球首个针对AR的siRNA疗法。尽管在前期临床实验中福瑞他恩和针对AR的siRNA疗法展示出对雄脱良好的治疗效果，但是它们仍摆脱不了需要长期用药的不便，以及长期用药后产生的副作用，且停用后依然容易恢复脱发。因此，开发安全有效，使用简便且无需重复使用的雄脱防治产品，具有显著的应用创新性。

DNA甲基化是由DNA甲基转移酶催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将甲基选择性地添加到目标基因特定碱基上而产生的甲基化修饰，是最重要的表观遗传调控方式之一。DNA甲基化能够在不改变DNA序列的前提下，使靶基因沉默并失去功能。雄脱是一种区域性脱发，据已有的研究报道，脱发区毛囊的AR基因呈现核苷酸多态性与启动子区域低甲基化，导致AR表达上调，加重了毛发脱落。近几年大热的CRISPR技术，是最有潜力运用到临床的基因编辑技术，为遗传疾病，肿瘤，表观疾病等的治疗带来了极大的应用前景。靶向基因表观修饰是基于CRISPR改造产生的一门技术，可以通过靶向目标基因特定区域甲基化修饰，促进基因激活或抑制。目前还未有文献报道，能否通过调控AR启动子区域靶向甲基化修饰来预防和治疗雄脱。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：现有治疗雄脱的药物需长期服药，副作用大等问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供了一种促进AR基因甲基化的药物。所述促进AR基因甲基化的药物，包括介导AR基因启动子区域甲基化的DNA，RNA或蛋白质中的至少一种。

优选的，上述促进AR基因甲基化的药物中，所述药物包括引导基因特异靶向的gRNA。

进一步的，所述的gRNA的核苷酸序列如SEQ NO：1～SEQ NO：8中的至少一种。

进一步的，所述的gRNA的核苷酸序列如SEQ NO：9～SEQ ID NO：112中的至少一种。优选的，所述的gRNA的核苷酸序列如SEQ NO：9～SEQ ID NO：17中的至少一种。

其中，上述促进AR基因甲基化的药物中，还包括CRISPR介导的甲基化修饰工具。

进一步的，所述的CRISPR介导的甲基化修饰工具为(CRISPRoff，spCas9，SpCas9-VRQR，SpCas9-VRER，evoCas9，xCas9(3.7)，SpG，SpRY，SpCas9-NG，SaCas9),Cas12a,Cas12b,Cas12d,Cas12e,Cas12f(RhCas12f1,OsCas12f1,UnCas12f1,AsCas12f1)，Cas12l，Cas12j或miniCRISPRoff中的至少一种。

优选的，上述进AR基因甲基化的药物中，所述的CRISPR介导的甲基化修饰工具为dCas9-DNMT3A。

其中，上述促进AR基因甲基化的药物中，还包括了递送载体。

进一步的，所述的递送载体包括：质粒载体，脂质体，病毒载体，纳米囊泡，穿膜肽修饰或电穿孔中的至少一种。

其中，上述促进AR基因甲基化的药物中，药物的给药方式为皮下注射，外敷，喷涂或微针中的至少一种。

本发明还提供了一种上述促进AR基因甲基化的药物在预防或治疗雄性激素脱发中的用途。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种针对AR基因靶向甲基化的药物及其用途，该药物主要由dCas9-DNMT3A与特异性靶向AR基因的gRNA组成，该药物作用于AR基因，无需改变AR基因序列，仅通过增加AR基因启动子的甲基化水平，实现AR表达的长期性降低，进而实现对雄脱的预防和治疗。本发明的药物应用形式广泛，包括可制备成mRNA药物制剂，进一步增加AR靶向甲基化防治雄脱的安全性和有效性。其应用方法可通过头皮表层涂抹，微针，贴片等非侵入性治疗措施进行治疗，有望成为未来市场中极具吸引力的雄脱治疗药物，并开拓雄脱的核酸药物市场，打破国外药企在雄脱药物领域的垄断地位。

附图说明

图1所示为实施例1中靶向小鼠Ar基因启动子的gRNA设计和慢病毒包装；图片展示不同序列gRNA进行慢病毒包装3天后镜下各组观察荧光表达情况。

图2所示为实施例1中靶向小鼠Ar基因启动子的gRNA筛选；其中A为原代分离的小鼠毛囊干细胞形态和鉴定结果；B为dCas9-DNMT3A病毒联合gRNA病毒感染小鼠毛囊干细胞，qPCR检测细胞Ar表达情况。

图3所示为实施例2中小鼠雄性脱发模型的建立。

图4所示为实施例2中靶向小鼠Ar基因启动子的gRNA体内筛选；其中A为gAr4、gAr5、gAr6的体内筛选结果展示；B为gAr4、gAr7、gAr8、gAr9的体内筛选结果展示。

图5所示为实施例2中，混合gRNA靶向甲基化修饰小鼠皮肤Ar基因的动物实验与疗效观察；其中A为不同时间点，不同处理组小鼠毛发再生情况；B为小鼠背部毛发再生统计分析；C为小鼠背部皮肤H&E染色毛囊数量和体积的观察；D为每毫米皮肤组织内毛囊数量统计。

图6所示为实施例2中建模组和gRNA混合治疗组(即MIX组)雄脱模型小鼠皮肤组织的荧光染色观察；

图7所示为实施例3中建模组和MIX组雄脱模型小鼠毛发再生的长期观察；其中A为第二轮脱发实验后20天的观察期内小鼠毛发再生情况；B为小鼠背部毛发再生统计分析；C为小鼠背部皮肤H&E切片染色观察；D为每毫米皮肤组织内毛囊数量统计分析；E为小鼠毛囊荧光染色的观察；

图8所示为dCas9-DNMT为模板的转录产物mRNA；

图9所示为实施例4中混合gRNA+mRNA形式发挥促雄脱模型小鼠毛发再生的疗效观察；其中A为不同时间小鼠毛发再生情况观察；B为小鼠背部皮肤H&E染色毛囊数量和体积的观察；C为小鼠皮肤组织的荧光染色观察。

图10所示为实施例5中靶向人AR基因启动子的gRNA的qPCR检测结果；

图11所示为hDPC细胞AR基因启动子CpG岛区域的CG位点的甲基化修饰。

具体实施方式

针对目前雄脱治疗方案的诸多问题，本发明提出了一种基于CRISPR改造技术，通过调控AR启动子区域靶向甲基化修饰有效防治雄脱的新方法。本发明的方法充分利用改良CRISPR系统的“定点靶向甲基化”能力，即当gRNA将Cas9引导到目标基因的靶位点，Cas9与DNA甲基转移酶Dnmt3A相融合，从而达到靶位点DNA甲基化的效果，诱导目标基因表达下调。本发明首次将改良CRISPR系统用于AR启动子区域靶向甲基化修饰，该方法将克服脱靶效应、计划外的DNA片段丢失，以及激活的DNA修复机制可能引起细胞复杂的应激反应等障碍，实现精准高效又持久的AR表达下调。随着mRNA疫苗制备和递送技术的不断完善，靶向AR启动子甲基化修饰的CRISPR系统有望制备成mRNA或蛋白产品形式，结合微针、贴片等高分子材料，通过表层头皮组织非侵入性方式，最终实现安全高效且简便的雄脱预防和治疗，具有临床转化可行性和极大的市场应用前景，有望打破西方药企在雄脱治疗领域的垄断地位。

本发明首次发现通过介导雄激素受体AR基因启动子区域甲基化，可以使AR表达的长期抑制，进而阻断AR下游通路激活所诱导的毛囊生长抑制，实现雄脱的预防和治疗。

进一步的，本发明对介导雄激素受体AR基因启动子区域甲基化的方法和药物进行了研究。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，dCas9-DNMT3A通过与特异性靶向AR基因的gRNA发挥甲基化修饰功能，能够定向的介导AR基因启动子区域甲基化，是基因治疗疗法中最新的生物治疗手段。

本发明通过小鼠细胞治疗实验，小鼠治疗实验研究发现，所述的gRNA的核苷酸序列如SEQ NO：1～SEQ NO：8中的至少一种。进一步的，本发明可以通过表型观察，qPCR，BSP靶向甲基化测序获得优选的gRNA药物。

之后，本发明进行了人源细胞治疗实验。研究发现，所述的gRNA的核苷酸序列为SEQNO：9～SEQ ID NO：112中的至少一种。进一步的，本发明可以通过qPCR，BSP靶向甲基化测序获得优选的gRNA药物。

本发明通过对AR基因甲基化修饰来预防或治疗雄脱，不会对基因组产生结构性破坏，安全性比现有方法更高。同时，本发明通过甲基化药物治疗雄脱与其他方法不同，本发明可能永久增加AR基因甲基化水平，永久降低其表达，兼具有预防和治疗雄性激素性脱发的作用。

本发明有望通过甲基化修饰结合mRNA合成与递送技术，极大提高本发明产品的有效性和安全性，提高本发明产品的临床转化价值和可行性。头皮作为表层组织，可通过结合微针，贴片等非侵入性治疗措施进行治疗，预计会成为市场中极受欢迎的治疗手段。

下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。

除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。通常，本文中所用的命名法是熟知的并且是本领域中通用的。

实施例1 Guide RNA(gRNA)的设计和筛选

1.gRNA的设计和转化

(1)小鼠Ar基因(ID:11835，参考基因组序列：NC_000086.8 Chromosome XReference GRCm39 C57BL/6J)的启动子序列通过NCBI查询获取。gRNA设计所针对的小鼠Ar基因启动子序列:位于小鼠参考基因组位点NC_000086.8(97191285-97193387)。

(2)通过在线网站(MethPrimer)预测小鼠Ar基因启动子区域的CpG岛富集区域碱基序列后，并将序列输入到在线网站CRISPRdirect-DBCLS(http://crispr.dbcls.jp/)设计gRNA。gRNA特异性检查对比的基因组选择相应的小鼠的参考基因组，gRNA序列的选择要求不存在连续多于4个T，GC含量在40％-75％之间，且遵循潜在脱靶少的原则，选择连续20个碱基配对的基因组位点等于1、连续12个碱基配对位点最小的前20的gRNA序列作为候选序列。

(3)在小鼠实验中，我们选择了间隔序列临近基序PAM为NGG(N为A,G,C,T任意一个)的候选gRNA作为靶向小鼠Ar基因启动子甲基化修饰工具的治疗组成分。PAM序列限定下针对小鼠Ar基因设计的候选gRNA序列如下表1所示。

表1 AM序列限定下针对小鼠Ar基因设计的候选gRNA序列

(3)将设计的gRNA序列以引物形式合成，退火处理后形成双链DNA，分别插入LentiGuide Puro-P2A-EGFP(addgene Plasmid#137729)慢病毒载体BsmBI酶切位点，gRNA表达受hU6启动子驱动，其中插入位点后的76nt作为gRNA的固定成分。慢病毒载体转化到大肠杆菌感受态细胞，经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，纯化步骤参照试剂盒说明书，获得重组表达载体的高品质质粒。

2.gRNA与dCas9-DNMT3a V2包装的病毒液的获取：

(1)将接近90％汇合的293T细胞按1:5传代至6孔板中，20-24小时后，细胞密度约为80-90％。

(2)将目的gRNA质粒与包装质粒pspAX2，辅助质粒pMD2G按质量比2:2:1的比例混合，用2.5倍质量的PEI辅助转染293T。6小时之后更换为新鲜DMEM完全培养基。转染后第2-3天，荧光显微镜下观察细胞的荧光表达情况(图1)。

(3)40小时后收集病毒上清，0.22μm滤器过滤细胞碎片，70000g离心2小时浓缩病毒上清，用无菌生理盐水重悬。除用一小部分病毒感染293T细胞确定病毒MOI值外，余下的及时分装-80℃保存。

(4)用同样的方法包装融合了甲基化酶的质粒LLP185 pLVP-dCas9-DNMT3a V2puro(addgene：Plasmid#100936)获取病毒液，浓缩后分装-80℃保存。

3.小鼠毛囊干细胞(HFSCs)分离培养。

(1)选用4-5周龄C57小鼠，背部皮肤脱毛后，剪取大小约4cm2皮肤组织，放入含2％双抗PBS溶液里浸洗5遍。

(2)剔除皮下筋膜后，将皮肤组织置入0.2％Ⅰ型胶原酶37℃消化约4小时。

(3)取出皮肤组织用DMEM/F12基础培养基洗2遍，转入1mL毛囊干细胞培养基中剪成约1mm2组织块，再加入9mL毛囊干细胞培养基重悬后铺种于10cm2平皿中。

(4)5-7天后，镜下可见毛囊隆突部有铺路石样细胞爬出，形成克隆，内大部分细胞表达CD34(图2A)；细胞在胰酶作用下可以消化、传代。所述的毛囊干细胞培养基成分为：44mlDMEM/F12培养液、5mlKSR血清替代物、500μl青链霉素混合液、500μl L-谷氨酰胺、500μl非必需氨基酸、20ng/ml重组人表皮细胞生长因子、10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子。

3.gRNA的筛选

(1)选择对数生长期的HFSCs消化传代，细胞密度达到60％-70％，更换新鲜培养基备用。

(2)gRNA与dCas9-DNMT3A的递送使用慢病毒系统。首先，dCas9-DNMT3A病毒混合不同gRNA病毒(gAr1、gAr2、gAr4、gAr5、gAr6、gAr7、gAr8、gAr9)分别感染HFSCs。混匀后放置37℃孵箱培养。

(3)病毒感染HFSCs 8-12小时后，更换新鲜培养液。

(4)感染48小时后，细胞密度达到80％左右加入嘌呤霉素进行抗性筛选。经3-4天嘌呤霉素筛选后，获取靶向Ar基因甲基化的转基因HFSCs。

(5)收集不同组HFSCs，利用qPCR检测细胞Ar表达，筛选出能靶向小鼠Ar启动子甲基化修饰的gRNA。小鼠Ar基因的qPCR引物序列为F1(核苷酸序列为SEQ ID NO:113)：CATCTTGTCGTCTCCGGAAATGT；R1(核苷酸序列为SEQ ID NO:114)：GGTTGTTGTCATGTCCGGCACAC。qPCR结果显示，相对于未经处理的HFSCs，gRNA包装产生的病毒，包括gAr4、gAr5、gAr6、gAr7、gAr8、gAr9联合dCas9-DNMT3A病毒均可有效下调HFSCs的Ar表达，其中gAr4、gAr8、gAr9下调Ar表达最显著，可作为引导甲基化编辑效率较高的成分用做后续治疗成分(图2B)。

通过实施例1的研究，我们设计并筛选出了能特异性靶向小鼠毛囊干细胞雄激素受体Ar基因，并能联合CRISPR甲基化修饰工具阻断Ar表达的gRNA序列。初步证明了本发明设想的研究方案的创造性和可行性。

实施例2dCas9-DNMT3A联合gRNA混合病毒液皮下注射促进雄脱模型小鼠毛发再生

1.建立雄脱小鼠模型：

配置双氢睾酮DHT(GLPBIO，GC19064)。称取0.1g DHT粉末，加入0.5mL二甲亚砜溶解，再用9.5mL玉米油(索莱宝)稀释，待粉末颗粒完全溶解后，分装4℃避光保存。选取6-7周龄C57BL/6小鼠，按照50mg/kg的剂量腹腔注射，每天一次，连续一周，使用脱毛膏脱去小鼠背部毛发建立雄性脱发模型，之后每天腹腔注射DHT一次，动态观察小鼠毛发生长情况。单纯脱毛的正常小鼠作对照(正常组)。在15天观察期内，5只建模小鼠均未见明显毛发生长，而正常小鼠脱毛后9天可完全长出毛发，结果提示持续DHT腹腔注射是建立小鼠雄脱模型的有效方法(图3)。

2.慢病毒注射治疗

(1)利用雄脱小鼠模型，按照lv-gRNA0.5×108vg/只,lv-dCas9-DNMT3A0.5×108vg/只的病毒剂量，两种病毒液混合后皮下注射到小鼠背部。根据有效病毒滴度稀释，注射剂量控制在100μL/只。gRNA包含有gAr4、gAr5、gAr6、gAr7、gAr8和gAr9。结果显示，与建模小鼠相比，在16天观察期后，各个病毒治疗组均可见小鼠毛发再生，其中gAr4、gAr8或gAr9效果明显，但是毛发再生率不足100％，且再生毛发均未能完全覆盖小鼠背部皮肤(图4)。

(2)为了提高治疗效果，我们尝试将有显著治疗效果的单独gAr4，gAr8和gAr9病毒液按有效病毒量1：1：1的比例混合配制成MIX gRNAs。

(3)本次实验共有5组：分别是DHT建模未治疗组(建模组)，病毒治疗组。其中病毒治疗组包括dCas9-DNMT3A+gNon-Target(简写为Mock组)，dCas9组，dCas9-DNMT3A+gAr4病毒组(简写为gAr4组)，以及dCas9-DNMT3A+MIX gRNA病毒组(简写为MIX组)。每组10只小鼠。

(4)病毒液皮下注射：按照前述病毒使用剂量，混合后皮下注射到小鼠背部。保持每天腹腔注射DHT一次，直到治疗组小鼠毛发完全长出。

3.评价小鼠背部毛发再生情况。

(1)动态观察小鼠背部毛发再生情况。结果显示MIX组内10只小鼠脱毛

后16天均长出毛发，生发效果达到100％，且再生毛发能完全覆盖背部皮肤。gAr4治疗组小鼠背部出现局部毛发再生，而建模组，MOCK组和单纯dcas9组在16天的观察期内未见毛发生长。以上结果表明gRNAs混合后促毛发再生效果显著增强(图5A)，统计分析具有显著差异(图5B)。

(2)治疗16天后，剪取大小约0.5cm2 x 0.5cm2的小鼠背部皮肤，一部分作H&E染色，观察不同组小鼠毛囊数量和体积变化。结果显示MIX组的毛囊数量丰富，毛囊体积较建模组，Mock组和单纯dcas9组显著增大(图5C)。统计分析每毫米皮肤组织内毛囊数量，MIX组与其他组具有显著差异(图5D)，提示MIX治疗组小鼠毛发处于再生期，毛发生长旺盛。

(3)选择荧光抗体，包括AR(ABclonal,A2053)、KLR14(BioLegend,906004)和CD34(ABclonal,A0761)，利用剩余皮肤组织作冰冻切片免疫荧光染色，观察毛囊相关蛋白在组织中的表达情况。镜下观察可见，与其他处理组相比，标记毛囊细胞的KLR14蛋白在MIX治疗组中表达量显著增多。标记毛囊干细胞的CD34蛋白的表达与KLR14蛋白的表达趋势类似，集中表达于MIX治疗组中。相反的，Ar蛋白在建模组，MOCK组和单纯dcas9组残留的毛囊中有表达，且表达量显著高于MIX治疗组。我们将MIX治疗组与建模组的结果展示如图6。该结果证明AR蛋白的表达与雄脱的发生和发展具有反向调节作用。本发明的方法通过特异性靶向Ar基因甲基化修饰，促进毛囊再生。

由实施例2可见，本发明筛选出能特异性靶向小鼠Ar基因的gRNA序列。同时，首次证明通过递送CRISPR甲基化修饰工具与特异性靶向小鼠Ar基因的gRNA组合，实现了对小鼠Ar基因的靶向甲基化修饰，阻断Ar表达，促进毛囊再生，增加雄脱模型小鼠毛发生长。

实施例3dCas9-DNMT3A联合MIX gRNA病毒注射促进雄脱模型小鼠毛发再生的长期性考察

1.动物实验方案设计

(1)本次实验保留实施例2中的其中2组：分别是建模组和MIX组。

(2)实施例2中的实验小鼠，第一次病毒液注射约一个月后，MIX组小鼠毛发均重新长出，随即停止DHT注射，再约1个月后，建模组小鼠毛发也长出，2组小鼠毛发生长均进入静止期。

(3)开始第二轮DHT建模注射，即2组小鼠DHT腹腔注射并同时剃除小鼠背部毛发，用于观察长期药效价值。值得注意的是，我们此次并没有给予小鼠背部病毒注射治疗，以观察给予DHT注射和脱毛处理后小鼠是否能再次长出毛发。

2.评价小鼠背部皮肤毛发再生情况。

(1)动态观察小鼠背部毛发再生情况。结果显示MIX组小鼠第二次建模后20天可长出毛发，生发效果达到100％，且再生毛发完全覆盖背部皮肤。建模组小鼠在20天的观察期内未见毛发生长(图7A)，统计分析具有显著差异(图7B)。

(2)观察期结束后，剪取大小约0.5cm2 x 0.5cm2的小鼠背部皮肤，一部分H&E染色。结果显示MIX组毛囊数量丰富，毛囊体积较建模组增大(图7C)，统计分析具有显著差异(图7D)，提示MIX组小鼠毛发处于再生期，毛发生长旺盛。

(3)利用剩余皮肤组织作冰冻切片免疫荧光染色，结果显示MIX治疗组KLR14表达量显著高于建模组，而Ar蛋白表达则呈现相反趋势，建模组高于MIX组，结果展示如图7E。

由实施例3可见，本发明首次提供了能长期促进雄脱模型小鼠毛发再生的方法。从理论上说，该治疗方法使用一次后，可以永久沉默AR基因表达，减少雄脱患者治疗的频次和药物副作用。

实施例4dCas9-DNMT3A联合MIX gRNAmRNA促进雄脱模型小鼠毛发再生

为了提高该治疗方法的安全性，我们将mRNA替代慢病毒作为新的递送方式，验证dCas9-DNMT3A联合MIX gRNA的mRNA形式促毛发再生的效果。

1.mRNA制备及检验

(1)设计dCas9-DNMT3A的PCR引物，在正向引物前面加上T7启动子序列(SEQ IDNO:115：TAATACGACTCACTATAGG)。

(2)PCR获取转录模板并纯化回收，核酸电泳图结果如图8所示。

(3)使用T7体外转录试剂盒(翊圣生物：10673ES50)转录获取mRNA及gRNA，37℃转录3小时，其中gRNA转录无需添加加帽类似物。使用Trizol法回收转录的RNA，并进行浓度标定及核酸电泳鉴定条带大小。

(4)用lip3000质量比lip3000：mRNA＝1:1对RNA进行封装。

3.动物实验方案设计。

(1)实验分为4组：分别是建模组，MIX病毒组，以及MIX的mRNA组。

(2)根据文献报道，我们按照LNP-mRNA+gRNA(50ug，50ug)/只的剂量皮下注射给药。观察mRNA是否具有与病毒类似的促毛发再生效果。

4.评价小鼠背部皮肤毛发再生情况。

(1)动态观察小鼠背部毛发再生情况。治疗15天后，2个治疗组小鼠背部皮肤变黑，毛发逐渐长出，MIX病毒组毛发量增加最显著，而建模组小鼠背部未见毛发长出。治疗22天后，3个治疗组小鼠背部长出毛发，生发效果均达到100％，且再生毛发能完全覆盖背部皮肤，而建模组小鼠局部背部皮肤变黑，仅有少许毛发再生(图9A)。

(2)观察期结束后，剪取大小约0.5cm2 x 0.5cm2的小鼠背部皮肤，一部分H&E染色。结果显示建模组毛囊数量稀少，毛囊体积小，相比较而言，2个治疗组的毛囊数量均较建模组更丰富，毛囊体积也比建模组大(图9B)。

(3)剩余皮肤作冰冻切片免疫荧光染色，结果显示2个治疗组的毛囊样结构高表达KLR14，表达量显著高于建模组。而AR蛋白表达则呈相反趋势，在建模组内的表达高于2个治疗组，结果展示如图9C。

由实施例4可见，本发明首次提供了CRISPR甲基化修饰工具与特异性靶向Ar的gRNA新的递送方式mRNA，并证实新的递送方式同样能实现对Ar基因靶向甲基化修饰，促进小鼠毛囊再生。相较于慢病毒递送，mRNA的递送方式更安全，更具有临床转化潜能。

实施例5靶向人AR启动子甲基化修饰的gRNA具有显著的AR表达沉默效果

1.gRNA的设计和转化

(1)人AR基因(ID:367，参考基因组序列：NC_000023.11Chromosome X ReferenceGRCh38.p14 Primary Assembly)的启动子序列通过NCBI查询获取。gRNA设计所针对的AR启动子序列分别是:位于人参考基因组位点NC_000023.11(67543843-67545146)。

(2)通过在线网站(MethPrimer)预测AR基因启动子区域的CpG岛富集区域碱基序列后，并将序列输入到在线网站CRISPRdirect-DBCLS(http://crispr.dbcls.jp/)设计gRNA。设计条件中，间隔序列临近基序PAM(Protospacer adjacent motif)序列要求视具体的CRISPR工具而定，CRISPR工具如(NGG,NRN,NYN,NG,TTTV,TTV,NCCD等)，gRNA特异性检查对比的基因组选择相应的人的参考基因组，gRNA序列的选择要求不存在连续多于4个T,GC含量在40-75％之间，且遵循潜在脱靶少的原则，选择连续20个碱基配对的基因组位点等于1、连续12个碱基配对位点最小的前20的gRNA序列作为候选序列。

(3)根据不同CRISPR工具发挥功能的PAM序列要求，我们预测了不同PAM序列要求下发挥潜在治疗功能的gRNA序列，在其gRNA序列对应的转录产物中，胸腺嘧啶核苷酸T替换为相应的尿嘧啶核苷酸U。

各种PAM序列限定下针对人AR设计的候选gRNA序列如下表2-表7所示。

表2 PAM:NGG设计的gRNA序列

SEQ ID NO：	gRNA	核苷酸序列
			9	hgAR1	aacaagtgctggcgcagcgt
10	hgAR2	aatgcaacagtttgcgagtc
			11	hgAR3	tggctccccgggatctcgga
12	hgAR4	cagcactggagcggctagct
			13	hgAR5	caagaggcgttggctgtcgc
14	hgAR6	tgcgggagagaagacggggg
			15	hgAR7	aactccctttggctgcgagc
16	hgAR8	gctggcagcgctgggccgac
			17	hgAR9	cagccacgacccgcctggtt

表3 PAM：NG设计的gRNA序列

表4 PAM：NRN/NYN设计的gRNA序列

表5PAM：TTTV设计的gRNA序列

表6 PAM：TTV设计的gRNA序列

SEQ ID NO：	核苷酸序列
		72	gctctccacctcccagcgcc
73	ctgggagagcgggacggtcc
		74	tctcccgcagctgcctcagt
75	cagagaggtaactccctttg
		76	gctgcgagcgggcgagctag
77	caaagaaggctcttaggagc
		78	ggagccaggcgactggggag
79	agcactgcagccacgacccg
		80	ctccggaccgtcccgctctc
81	ctccggaccgtcccgctctc
		82	cctctgtcgcctcctctgcc
83	tccctctgtcgcctcctctg
		84	ggctcctgtacagcactgga
85	gctgtcgctggagccgggct
		86	gaagccgccgcgctgcaaga
87	accgaagaggaaagggcagc
		88	ctccgagtctttagcagctt
89	cttcctccgagtctttagca
		90	gctgagagtagccgactgag
91	gcaatgtgcagctagctcgc
		92	tttgcaatgtgcagctagct

表7 PAM：NCCD设计的gRNA序列

SEQ ID NO：	核苷酸序列
		93	ctaggcaggcgttagcgcgc
94	agctagccgctccagtgctg
		95	aagggacgcaccacgccagc
96	gcgacagccaacgcctcttg
		97	actcgcaaactgttgcattt
98	agatcccggggagccagctt
		99	cttgcagcgcggcggcttcg
100	ccgcccggagctgccctttc
		101	acgcctcttgcagcgcggcg
102	ttcctcttcggtgaagtttt
		103	ggtaggactgacggctgcct
104	ccgcgctgcaagaggcgttg
		105	cgcgctaacgcctgcctagt
106	caccgcgcgctaacgcctgc
		107	gaccgtcccgctctcccagc
108	ccgagtctttagcagctttt
		109	tcggctcctgtacagcactg
110	ctcgcagccaaagggagtta
		111	gtcgcctggctcctaagagc
112	ggcgggtcgtggctgcagtg

(4)其中我们选择了PAM为NGG的候选gRNA序列中的SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:17(hgAR1-hgAR9)，作为基于dCas9系统的基因组靶向人AR基因启动子甲基化修饰工具的治疗组成分进行有效性检测。

(5)将设计的gRNA序列以引物形式合成，退火处理后形成双链DNA,分别插入LentiGuide Puro-P2A-EGFP(addgene Plasmid#137729)慢病毒载体BsmBI酶切位点，gRNA表达受hU6启动子驱动，其中插入位点后的76nt作为gRNA的固定成分。慢病毒载体转化到大肠杆菌感受态细胞，经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，纯化步骤参照试剂盒说明书，获得重组表达载体的高品质质粒。

2.gRNA与dCas9-DNMT3A慢病毒包装

(2)将目的gRNA质粒与包装质粒pspAX2，辅助质粒pMD2G按质量比2:2:1的比例混合，用2.5倍质量的PEI辅助转染293T。

(3)8小时之后更换为新鲜DMEM完全培养基，40小时后收集病毒上清，0.22μm滤器过滤细胞碎片，70000g离心2小时浓缩病毒上清，用无菌生理盐水重悬。除用一小部分病毒感染293T细胞确定病毒MOI值外，余下的及时分装-80℃保存。

(4)用同样的方法包装融合了甲基化酶的质粒pLVP-dCas9-DNMT3a V2 puro获取病毒液，浓缩后分装-80℃保存。

3.筛选靶向人AR启动子甲基化修饰的gRNA。

(1)通过qPCR检测，我们确定男性真皮毛乳头细胞hDPCs(普诺赛，CP-H249)AR基因高表达，因此，hDPCs被选择为目标细胞进行gRNA筛选实验。我们将对数生长期的hDPCs消化传代，细胞密度达到60％-70％，更换新鲜培养基备用。

(2)gRNA与dCas9-DNMT3A的递送使用慢病毒系统。首先，dCas9-DNMT3A病毒联合不同gRNA病毒(hgAr1、hgAr2、hgAr3、hgAr4、hgAr5、hgAr6、hgAr7、hgAr8、hgAr9)各取10^6vg分别感染hDPCs，混合均匀后即可放入37孵箱培养。

(3)病毒感染细胞8-12小时后，更换新鲜培养液。

(4)细胞达到90％汇合后消化传代，待细胞密度达到80％左右加入嘌呤霉素进行抗性筛选。经3-4天嘌呤霉素筛选后，获得纯化的转基因hDPC细胞。

(5)收集不同组的hDPCs，利用qPCR检测细胞AR表达，筛选出能靶向人AR启动子甲基化修饰的gRNA。人AR基因的qPCR引物序列为F1(核苷酸序列如SEQ ID NO:116所示)：CCAGGGACCATGTTTTGCC；R1(核苷酸序列如SEQ ID NO:117所示)：CGAAGACGACAAGATGGACAA。qPCR结果显示，gRNA病毒，包括hgAr1、hgAr2、hgAr3、hgAr4、hgAr5、hgAr7、hgAr8联合dCas9-DNMT3A病毒处理组hDPCs的AR表达均比非处理的hDPCs有所下调，其中hgAr1、hgAr3、hgAr4、hgAr5下调能力最为显著(图10)。

(6)人AR启动子甲基化BSP测序检测。通过在线网站(MethPrimer)设计人AR启动子甲基化BSP测序引物：

hAR-BSP-F6：SEQ ID NO:118

AGGGGTTTTTTAGGGTTAGAGTTAGT；

hAR-BSP-R3：SEQ ID NO:119CTAACTCCACACTCAAAATAAAAAAAACAAA。

使用脯乳动物基因组提取试剂盒(碧云天：D0061)提取DNA，使用重亚硫酸盐转化试剂盒(Thermo Scientific^TM K14461)处理DNA并回收。取10ng转化后的基因组DNA使用taq酶(vazyme：P222-A)进行扩增(核酸电泳图512bp)，连接T载体挑取阳性单克隆测序。相比于父本hADSC细胞，经本发明处理过的hADSC细胞的AR基因启动子CpG岛区域的CG位点成功被甲基化修饰(图11)，AR基因表达得以下调。

如图11所示，相比于未进行甲基化修饰的父本hDPC细胞，我们在本专利中采用的靶向甲基化疗法成功将AR基因启动子CpG岛区域的CG位点进行甲基化修饰，从而下调AR基因表达。

实施例5可见，本发明首次筛选出能特异性靶向人AR基因的gRNA序列。同时，本发明提供了一种方法，通过递送CRISPR甲基化修饰工具与特异性靶向人AR基因的gRNA组合，实现了对人源细胞AR基因的靶向甲基化修饰，下调AR表达。本发明提供的方法具备促进雄脱患者毛发再生的潜能。

Claims

1.一种促进AR基因甲基化的药物，其特征在于：所述药物包括介导AR基因启动子区域甲基化的DNA，RNA或蛋白质中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的促进AR基因甲基化的药物，其特征在于：所述药物包括引导基因特异靶向的gRNA。

3.根据权利要求1所述的促进AR基因甲基化的药物，其特征在于：所述的gRNA的核苷酸序列如SEQ NO：9～SEQ NO：112中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的促进AR基因甲基化的药物，其特征在于：还包括CRISPR介导的甲基化修饰工具。

5.根据权利要求4所述的促进AR基因甲基化的药物，其特征在于：所述的CRISPR介导的甲基化修饰工具为(CRISPRoff，spCas9，SpCas9-VRQR，SpCas9-VRER，evoCas9，xCas9(3.7)，SpG，SpRY，SpCas9-NG，SaCas9),Cas12a,Cas12b,Cas12d,Cas12e,Cas12f(RhCas12f1,OsCas12f1,UnCas12f1,AsCas12f1)，Cas12l，Cas12j或miniCRISPRoff中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的促进AR基因甲基化的药物，其特征在于：所述的CRISPR介导的甲基化修饰工具为dCas9-DNMT3A。

7.根据权利要求1所述的促进AR基因甲基化的药物，其特征在于：还包括了递送载体。

8.根据权利要求1所述的促进AR基因甲基化的药物，其特征在于：所述的递送载体包括：质粒载体，脂质体，病毒载体，纳米囊泡，穿膜肽修饰或电穿孔中的至少一种。

9.根据权利要求1所述的促进AR基因甲基化的药物，其特征在于：所述药物的给药方式为皮下注射，外敷，喷涂或微针中的至少一种。

10.权利要求1-9任一项所述的促进AR基因甲基化的药物在预防或治疗雄性激素脱发中的用途。