CN112089723B - 靶向FGF5的siRNA在治疗脱发中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于治疗脱发的siRNA组合，所述siRNA组合对皮肤组织中的FGF5有显著的抑制作用，此外本发明还提供一种用于递送该siRNA组合的递送系统。

Description

靶向FGF5的siRNA在治疗脱发中的应用

技术领域

本发明涉及包含抑制毛囊生长的物质的毛发生长促进剂，毛发再生促进剂或脱发治疗剂，以及筛选这些物质的方法。

背景技术

随着生活节奏的加快以及工作压力与日俱增，越来越多的人正承受着脱发的困扰，以最为常见的雄激素源性脱发(简称雄秃)为例，50岁以上的男性人群发病率高达50％左右，而且年龄每增加10岁，雄秃的发生率就增加10％。发际线的上移和毛发稀疏会给人带来心理负担和精神压力，影响秃发患者的生活质量，因此对防脱和生发治疗的需求很高。目前临床上治疗雄秃的药物主要有非那雄胺和米诺地尔，但疗效有限，而且有副作用。市场上防脱护发的产品虽然很多，但大多数没有确切疗效。因此，防脱护发产品的研发需要突破性的技术创新，包括新的作用靶点、新的治疗手段等。近年来对脱发的病理机制研究取得了一系列重要的进展，为新型防脱产品的研发提供了新的思路和作用靶点。

毛囊周期异常是脱发的重要病理特征，也是脱发的关键性病理机制之一。以最为常见雄秃为例，正常头部毛囊的生长期为2-6年，而雄秃患者头顶部毛囊的生长期可缩短为几个月到1年。雄秃毛囊生长期的不断缩短使毛囊不断微型化，毛囊的休止期不断延长，最终可能永久停留在休止期(ultimately arrest in telogen)，导致脱发。毛囊生长期缩短的原因是生长期提前终止(premature termination of anagen)和退行期的提前进入(premature entry into catagen)。因此，防治脱发的关键在于阻止毛囊生长期的不断缩短，防止其提前终止，而育发的关键在于动员处于休止期的毛囊进入生长期。

目前已经有相当充分的研究证据表明FGF5是推动毛囊由生长期向退行期转化的最关键调控因子。最有力的证据来自FGF5基因自发突变和靶向敲除的研究：最早发现一种被称为安哥拉鼠的小鼠带有FGF5基因自发突变，其毛囊生长期明显延长，处于生长期的毛囊比例异常增多，被毛长度比野生型小鼠长50％。最后发现人FGF5单基因突变是导致家族性睫毛粗长症(familial trichomegaly)的遗传基础，FGF5突变基因携带者表现为多毛和睫毛异常粗长。迄今已在小鼠、狗、猫、兔、羊等多种动物开展了FGF5基因编辑或基因敲除的研究，发现FGF5基因功能性缺失导致动物出现毛发异常增多变长的表型，因此FGF5已成为改善动物被毛长度和品质的主要靶标。

毛囊周期从生长期到是退行期的转换调控机制非常复杂，FGF5并非是唯一的衰退期诱导因子，其他的生长因子如TGF-β在诱导毛囊进入退行期过程中也起重要作用。TGF-β通过抑制毛囊的毛母质细胞和角质形成细胞增殖及诱导细胞凋亡来诱导毛囊的退行性改变，导致生长期缩短。研究发现TGF-β可能与雄激素诱导脱发的作用有关，在雄秃患者头顶部和颞部的雄激素敏感性毛囊中，雄激素被DPCs内的5-还原酶转变为活性更强的二氢睾酮，后者具有很强的诱导TGF-β表达的作用，因此雄激素诱导脱发的作用可能至少部分是由TGF-β介导的。与FGF5和TGF-β的作用相反，多种皮肤细胞分泌的其他内源性生长因子，包括IGF-1、FGF 1、FGF 2、FGF7、FGF10、PDGF等可促进毛囊细胞生长，抑制细胞凋亡，从而延长生长期，阻止衰退期的发生。这一系列具有促进毛囊生长的调控因子又被称为生长期维持因子(anagen maintaining factors)，而退行期的发生主要取决于生长期维持因子和衰退期诱导因子(包括FGF5和TGFβ1)之间的平衡。这些调控信号可来自毛囊内部，也可来自毛囊周围外部环境，包括来自附近毛囊的生长期刺激信号以及来自皮肤组织中其他细胞类型的输入信号，如皮下脂肪细胞可分泌PDGF、FGF2等，毛囊周围免疫细胞分泌的炎症因子也对毛囊生长具有调控作用，甚至于皮肤以外的组织产生的激素信号等。可见，毛囊的生长受其内部微环境及其周围环境中复杂信号的调控，而且毛囊具有感受并整合其周围环境中复杂刺激信号的能力，一种或多种调节信号的改变都有可能影响毛囊的生长。当然多种不同的刺激信号有可能生产协同或拮抗效应，从这个意义上，靶向FGF5的siRNA与TGF-β的拮抗剂或者FGF7/10等生长期维持因子联合使用有可能产生协同促进毛发生长的作用，因而值得进一步探讨。

除了通过延长毛囊生长期促进毛发不断生长之外，唤醒处于休止期的毛囊，动员其进入生长期是脱发治疗另一个重要方面。与毛囊生长期到退行期的转换调控机制类似，毛囊休止期到生长期的转换也是由两组作用相反的调节因子控制。Wnts被认为是激活毛囊干细胞动员休止期毛囊进入生长期的最基本刺激信号，而Wnts刺激信号又受到其抑制因子Dkk1和Sost等的拮抗；FGF7和FGF10在毛囊休止期后期表达水平逐渐增加，是诱导生长期起始的刺激信号；FGF2和PDGF-AA具有协同诱导毛乳头细胞表达内源性的FGF7和FGF10,进而诱导休止期毛囊进入生长期的作用。

siRNA药物的基本工作原理是通过定向传递特异性siRNA进入疾病相关组织，精准干扰细胞内致病基因的表达，最终达到治疗疾病的目的，因此siRNA在皮肤局部使用时需要克服至少两个障碍，即穿过表皮的角质层屏障和被皮肤细胞高效摄取。首个进入临床试验的siRNA药物采用了皮内注射的给药方式，这种给药方式可直接突破表皮的角质层屏障，并且由于皮内快速注射时产生的局部高压，可促进siRNA进入皮肤细胞，因此也可帮助siRNA突破第二道细胞膜的屏障。但这种给药方式会产生难以忍受的疼痛，而且siRNA的转染效率不高。近年来，研究者对微创或无创的皮内siRNA递送方法进行了广泛探索，其中包括超声导入、激光微孔、基因枪、离子导入、电穿孔和微针、各类纳米颗粒递送载体、以及各种化学修饰的siRNA等递送系统。在如此复杂多样的siRNA皮内递送方式中，筛选获得更为有效的siRNA以及选择具有更优递送效果的递送系统均是临床应用的技术壁垒之一。

发明内容

为了解决现有技术中存在的技术问题，获得更好的治疗脱发的技术效果，本发明提供一种用于治疗脱发的siRNA及其递送系统，以及上述siRNA及其递送系统的应用。

更为具体的，本发明提供一种用于治疗脱发的siRNA，所述siRNA靶向FGF5基因，更为具体的，所述siRNA的序列为如SEQ ID NO.:1所示。

本发明还提供了预防或治疗脱发的方法，包括将siRNA给予受试者。

本发明另一方面提供一种用于治疗脱发的递送系统，所述递送系统选自改性穿膜肽递送系统或胆固醇共价修饰递送系统。

本发明的另一方面提供一种上述siRNA以及递送系统在制备治疗脱发的产品中的应用。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1FGF5重组表达质粒的构建及其在NIH/3T3细胞中的过表达：(A)pEX-3载体的质粒图谱,(B)重组质粒的双酶切验证，M：分子量marker，1：酶切前的重组质粒，2：酶切后的重组质粒,(C)重组质粒的DNA测序比对验证,(D)将空载体和重组质粒分别转染NIH/3T3细胞，qPCR检测细胞内FGF5的mRNA水平；

图2不同的候选siRNA对FGF5基因表达的抑制作用；

图3不同浓度的siRNA对FGF5表达的抑制作用；

图4胆固醇修饰的siRNA对FGF5基因表达的抑制作用；

图5不同递送方式对FGF5表达的干扰作用；

图6不同递送方式的siRNA对小鼠皮肤组织中FGF5基因表达的抑制作用；

图7向小鼠皮内注射胆固醇修饰的siRNA或其阴性对照，空白对照组(Con)注射等量生理盐水，于注射后24h、72h、120h取注射区皮肤组织，通过qPCR分别检测的FGF5的mRNA水平，*P<0.05，**P<0.01vs阴性对照(NC)组；

图8胆固醇修饰的siRNA对小鼠皮肤组织FGF5基因表达的抑制作用以及对毛囊周期的调控作用；(A)动物实验流程图，(B)qPCR检测多次皮内注射胆固醇修饰的siRNA对小鼠皮肤组织中FGF5基因表达的抑制作用，(C)Western blotting检测胆固醇修饰的siRNA对小鼠皮肤组织中FGF5蛋白水平的影响，(D)皮肤组织HE染色检测胆固醇修饰的siRNA对小鼠毛囊周期的调控作用。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明所用细胞NIH/3T3细胞系购自中国科学院上海细胞库，所用实验小鼠为C57BL/6小鼠，雌性，7周龄，体重18～20g，购自温州医科大学动物房，按照SPF级饲养。

本发明所用实验试剂如下表所示：

本发明中所用试剂配方如下：

LB液体培养基：Tryptone 2g，Yeast extract 1g，NaCl 2g，超纯水定容200ml121℃，20min高压灭菌

LB固体培养基：Tryptone 2g，Yeast extract 1g，NaCl 2g，琼脂2g121℃，20min高压灭菌

50x TAE电泳液：Tris-base 121g，Na2EDTA-2H2O 18.6g，冰醋酸28.55ml，超纯水定容500ml，pH调至8.5

5x电泳缓冲液：Tris-base 15.1g，甘氨酸94g，SDS 5g，超纯水定容1000ml

电转缓冲液：Tris-base 3g，甘氨酸14.4g，甲醇200ml，超纯水定容1000ml，pH调至8.3

10％SDS溶液：SDS 10g，超纯水100ml

10％过硫酸铵溶液(AP)：过硫酸铵0.1g，超纯水1ml

1M Tris-HCl(PH 6.8)：Tris-base 121.1g，溶于1000ml超纯水，pH调至6.8

1.5M Tris-HCl(PH 8.8)：Tris-base 181.7g，溶于1000ml超纯水，pH调至8.8

Tris缓冲盐溶液(TBST)：NaCl 8.7g，Tris-base 12.1g，吐温1ml，超纯水定容至1000ml，PH调至7.4

封闭液：脱脂奶粉5g，溶于50ml 1％TBST

实施例1siRNA的设计、合成和胆固醇修饰

根据Gene Bank中小鼠FGF5的mRNA序列，采用在线开放软件进行siRNA设计。由于不同的设计软件采用的算法有所不同，设计原则也各有偏重，为例提高siRNA设计的准确性，我们通过比较各软件的特点，最终选定了3种技术支持较强并持续更新的软件SiDirect、Oligowalk和SiRNA Design用于siRNA设计，从输出序列中挑选重复率高siRNA的作为候选siRNA用于进一步的细胞生物学实验筛选，以确认其基因干扰活性。

候选siRNAs合成及其5’端胆固醇共价修饰均委托上海吉玛制药技术有限公司承担完成。

实施例2siRNA的筛选以及不同siRNA递送方式靶基因干扰效果的评价

由于目前无法获得表达FGF5的细胞系，本研究通过构建小鼠FGF5的真核表达质粒，转染NIH/3T3细胞，使用过表达小鼠FGF5的NIH/3T3细胞进行候选siRNA的筛选。小鼠FGF5的真核表达质粒可按照本领域常规方法制备。

(1)将已转染FGF5的表达质粒的NIH/3T3细胞以1×10⁵cells/孔的密度接种到6孔板，培养于2ml含有血清和双抗的完全培养基中，当细胞密度达到80％时，更换为2ml的无血清的细胞培养基；

(2)取200pmol的siRNA稀释于100μl无血清无双抗的培养基中，另取100μl无血清无双抗的培养基加入4μl lipofectamine 2000，分别轻柔混合，静置5min；

(3)再将稀释好的siRNA和lipofectamine 2000稀释液混匀，静置20min，加入到6孔板中，放在5％CO₂37℃细胞培养箱中培养6h,之后更换完全培养基继续培养24h；

(4)收集细胞，qPCR法检测细胞中FGF5的mRNA水平。

实施例3siRNA转染递送系统的筛选

1.胆固醇修饰的siRNA转染

(1)将已转染FGF5表达质粒的NIH/3T3细胞以1×10⁵cells/孔的密度接种到6孔板，培养于2ml含有血清和双抗的细胞培养基中，当细胞密度达到80％时，更换新鲜的完全培养基；

(2)取200pmol的胆固醇修饰(委托吉玛基因股份有限公司按照本领域常规技术手段修饰)的siRNA稀释于200μl无血清无双抗的培养基中，轻柔混合后，静置5min，加入到6孔板中，放在5％CO₂,37℃细胞培养箱中培养24h；

(3)收集细胞，qPCR法检测细胞中FGF5基因的mRNA水平。

2.穿膜肽介导的siRNA转染

(1)将已转染FGF5表达质粒的NIH/3T3细胞以1×10⁵cells/孔的密度接种到6孔板，培养于2ml含有血清和双抗的细胞培养基中，当细胞密度达到80％时，更换无血清无双抗的细胞培养基；

(2)取200pmol的siRNA稀释于100μl无血清无双抗的培养基中，另取100ul无血清无双抗的培养基加入600pmol的穿膜肽(，分别轻柔混合后，静置5min；所述穿膜肽为Stearyl-R8(Stearyl-RRRRRRRR-NH2)或STR-CH₂R₄H₂C(CH₃(CH₂)₁₆-CONH-Cys-(His)₂-(Arg)₄-(His)₂-Cys-COOH)；

(3)再将稀释好的穿膜肽和siRNA混匀穿膜肽：siRNA＝3:1(摩尔比))后静置20min，加入到6孔板中，放在5％CO₂,37℃细胞培养箱中培养24h；

(4)收集细胞，qPCR法检测细胞中FGF5的mRNA水平。

实施例4qPCR法检测细胞中FGF5的mRNA水平

1.参照Invitrogen RNA提取试剂盒说明书提取细胞中的RNA；

2.用酶标仪检测RNA含量，取2μl ddH₂O，点于检测板的孔上，做标定，置于酶标仪中检测。标定完后，取2μl RNA，点于检测板的孔上，置于酶标仪中检测，得出RNA浓度。参考仪器所得A260/A280比值分析RNA纯度，若A260/A280在1.9-2.1的范围内，说明提取的RNA符合实验要求；若A260/A280＜1.8，表明RNA中存在蛋白质污染；若A260/A280＞2.2时，表明RNA有水解；

3.按照PrimeScript^TM逆转录试剂盒的说明书进行逆转录反应的流程，委托上海生工生物公司进行引物设计和合成，引物序列见下表：

4.qPCR扩增：使用PowerUpTM SYBRTM Green进行qPCR扩增反应，反应总体系为10μl，各组分的加样量分别为：SYBRTM Green Master Mix 5μl；Forward Primer(10μM)0.4μl；Reverse Primer(10μM)0.4μl；cDNA模板0.8μl；RNase-free ddH2O补齐至10μl。按照设定好的扩增程序进行qPCR反应：UDG活化：50℃1min；95℃预变性2min；95℃15s 60℃1min条件下进行PCR扩增，次步骤循环40次；对所得溶解曲线进行分析。

5.结果分析：每个待测样品均设置3个复孔，用2-ΔΔCt(RQ值)表示实验组和对照组的目的基因mRNA水平的倍数关系，ΔCt＝Ct(目的基因)-Ct(GAPDH)，ΔΔCt＝ΔCt(实验组)-ΔCt(空白组)，空白组的RQ值为1。

实施例5小鼠皮肤组织FGF5的RNA干扰和毛囊周期的调控作用

1.采用拔毛诱导的毛发生长小鼠模型，拔毛模型的建立参照参考文献的描述进行：7周龄的雌性C57BL/6小鼠以小动物气体吸入式麻醉机麻醉，将松香和石蜡按1:1比例混合，加热融化后均匀地涂抹于小鼠后背，待脱毛蜡完全凝固后，使用镊子将脱毛蜡缓慢揭下，将小鼠毛发完全拔起，此时记为第0天。将小鼠分为如下几组：

外用乳剂(topical cream)组：将胆固醇修饰siRNA和阴性对照按下表配制成外用乳剂：

每只小鼠背部脱毛区均分为左右给药区，分别涂抹siRNA和阴性对照的乳剂，从脱毛后第1天开始给药，每日一次，连续给药15天；

皮内注射组：每只小鼠背部脱毛区均分为左右给药区，将胆固醇修饰的siRNA或其阴性对照用生理盐水配成20μM浓度的溶液，分别取50μl于左右注射区分5个点进行多点皮内注射，于脱毛后的第1，4，7，10天各注射一次。从第3天开始，每3天用数码相机和毛囊检测仪拍摄记录背部皮肤给药区毛发生长的情况，并采集给药区皮肤组织样品，将取到的皮肤组织样品分为3部分，一部分置于4％多聚甲醛固定液中用于组织切片染色，另外两部分分别置于不同的1.5ml EP管中，-80℃保存，用于进行qPCR和Western blotting。

2.通过qPCR和Western blotting检测小鼠皮肤组织的FGF5的mRNA水平

3.对小鼠皮肤进行组织切片染色

实施例6实验结果

1.本发明采用了多种设计软件，针对小鼠FGF5 mRNA特有序列进行了21bp长度的传统siRNA和25bp长度的25/27R模式siRNA设计，所获得的候选序列如下表，候选siRNA的阴性对照(Nagetive Control,NC)采用碱基组成相同但排序随机打乱的序列。

注：候选siRNA的名称代表其在靶基因的结合起始位点和序列长度，NC为相应siRNA的阴性对照序列。

2.本发明采用过表达FGF5的细胞系进行候选siRNA的筛选，以筛选出能够高效干扰FGF5表达的siRNA。利用lipofectamine 2000将空载体质粒和重组质粒分别转染NIH/3T3细胞，以qPCR法检测细胞中FGF5的mRNA表达水平，结果显示，转染了重组质粒的细胞中FGF5mRNA水平显著升高，说明FGF5能够在NIH/3T3细胞中高表达(图1)。将各候选siRNA及其阴性对照分别转染至过表达FGF5的NIH/3T3细胞内，24h后提取细胞总RNA，以qPCR法检测FGF5的mRNA水平，计算各候选siRNA对FGF-5表达的抑制率。在siRNA的转染浓度为100nM时，候选siRNA 623-21、624-21、565-25/27R、567-25/27R和635-25/27R对FGF5 mRNA表达的抑制率分别为66.06±2.00％，66.77±1.60％，72.72±1.20％，77.50±0.60％，74.61±0.80％，与正常组(Con，未转染对照)、阴性对照组(NC，转染相应siRNA的阴性对照序列)相比差异具有显著的统计学意义(P<0.01)，而正常组与阴性对照组之间差异无统计学意义。该结果说明，上述各候选siRNA序列对FGF5的表达均具有较高的干扰效率，25/27R模式的siRNA的干扰效果略优于21bp长度的siRNA(图2)。将不同浓度的各候选siRNA(25nM、50nM、75nM、100nM、125nM、150nM)转入过表达FGF5的NIH/3T3细胞，24h后以qPCR检测细胞内FGF5mRNA的表达水平，结果表明，各候选siRNA均能在25-100nM的浓度范围内剂量依赖性的抑制FGF5mRNA的表达，在转染浓度为100nM以上时，各候选siRNA对靶基因的干扰率基本都在70％以上；其中以567-25/27R的干扰效果最佳，在转染浓度为100nM及以上时，其对FGF5的抑制率可达90％；另外两条25/27R模式的候选siRNA 567-25/27R和635-25/27R在100nM以上浓度时的干扰效果也略高由于21bp长度的siRNA(图3)。综上，决定将565-25/27R、567-25/27R、635-25/27R作为后续实验中干扰FGF5表达的siRNA。

3.穿膜肽Stearyl-R8递送的siRNA能够显著抑制细胞内FGF5的表达，其递送的3条候选siRNA(565-25/27R，567-25/27R和635-25/27R)对FGF5mRNA水平的抑制率分别为55.67±6.98％、66.67±1.86％和49.11±6.58％；而穿膜肽STR-CH2R4H2C递送的siRNA对FGF5基因表达的干扰作用较弱，(按照NC组为参照重新计算抑制率)。因此，后续实验选用Stearyl-R8作为递送siRNA的穿膜肽。

4.将100nM胆固醇修饰的siRNA(565-25/27R,567-25/27R,635-25/27R)或其阴性对照序列与过表达FGF5的NIH/3T3细胞共孵育24h，qPCR检测细胞内FGF5的mRNA表达水平。结果表明，胆固醇修饰的siRNA能够有效降低细胞内FGF5的mRNA表达水平，与阴性对照序列相比，各候选siRNA FGF5基因的干扰效率分别为565-25/27R:48.96±4.83％，567-25/27R:60.33±9.67％，635-25/27R:69.67±4.91％(图4)。这一结果表明，胆固醇修饰的siRNA能有效地穿透细胞膜，干扰FGF5的表达。

5.为比较不同的siRNA递送方式对FGF5表达的干扰作用，将100nM浓度的裸siRNA(naked siRNA)、脂质体-siRNA混合物(lipo2000+siRNA)、胆固醇修饰的siRNA(chol-siRNA)、穿膜肽-siRNA混合物(Stearyl-R8+siRNA)分别与过表达FGF5的NIH/3T3细胞共孵育24h，qPCR检测FGF5 mRNA水平，结果显示：与裸siRNA组相比，脂质体组、胆固醇修饰组和穿膜肽组的FGF5 mRNA水平均有进一步的降低，说明这些递送方式均能促进siRNA转染进入细胞并增强其对靶基因表达的干扰作用，而且胆固醇修饰的siRNA与穿膜肽Stearyl-R8递送的siRNA相比，其抑制FGF5表达的作用更强(图5)，说明胆固醇修饰的siRNA更利于细胞内递送.

6.为进一步比较不同递送方式的siRNA在体内对靶基因的干扰效应，用生理盐水配制20μM的胆固醇修饰的siRNA以及Stearyl-R8和siRNA的混合溶液，于小鼠背部皮肤皮内注射50μl，空白对照组注射等量生理盐水的，24h后取注射区域皮肤组织，以qPCR法检测注射区域皮肤组织中FGF5的mRNA水平。结果显示：胆固醇修饰的siRNA和穿膜肽Stearyl-R8结合的siRNA与空白对照组相比，均能够有效的抑制FGF5的表达水平，但胆固醇修饰的siRNA干扰效率更高，且567-25/27R、635-25/27R的干扰效果优于565-25/27R(图6)。

7.通过建立小鼠拔毛模型，发现胆固醇修饰的siRNA在注射后24h和72h均能有效抑制FGF5的表达，和阴性对照组相比，抑制率分别为55.37±7.64％和73.62±0.69％，而在120h后siRNA的干扰作用几乎消失(图7)。这一结果说明，在72h小时内，皮内注射胆固醇修饰的siRNA具有持续的靶基因干扰作用。qPCR结果显示：胆固醇修饰的siRNA注射组皮肤组织的FGF5 mRNA水平在第15,19,23天的均保持在显著降低的水平，和阴性对照注射组相比，抑制率分别为59.32±4.37％，91.08±2.13％，55.14±0.48％。Western blot结果显示第15,19,23天胆固醇修饰的siRNA注射组FGF5的水平也较阴性对照组相比明显下降(图8B-C)，表明了皮下注射胆固醇修饰的siRNA能够有效的抑制FGF5的表达水平。组织切片染色的结果显示，siRNA注射组组和阴性对照组在第15,17,19天时皮肤毛囊的毛球部粗大，且位于真皮－皮下组织交界处，表明此时毛囊都处于生长期，且生长旺盛；但从第21天开始，阴性对照组毛囊开始萎缩并底部毛球缩小并向上迁移，说明毛囊已从生长期向退行期转变，在第23天毛囊已经基本处于退行期。而了胆固醇修饰的siRNA注射组的毛囊则是从第23天才开始萎缩并向上迁移，说明此时毛囊正从生长期转向退行期(图8D)。这一结果表明皮内注射胆固醇修饰的siRNA能够推迟生长期向退行期的转换，延长毛囊的生长期。上述结果表明，皮内注射胆固醇修饰的siRNA(567-25/27R)能够有效的抑制小鼠皮肤中的FGF5的表达，并延长毛囊的生长期，延缓其进入退行期。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 温州大学

<120> 靶向FGF5的siRNA在治疗脱发中的应用

<130> CP20661

<141> 2020-09-21

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

agaaggtggt gaagcaggca tc 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

cgaaggtgga agagtgggag ttg 23

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

aagtcaatgg ctcccacgaa gc 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ccgtaaattt ggcacttgca tgg 23

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ggaguuuuca gcaacaaauu u 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

auuuguugcu gaaaacuccu c 21

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

gccaagucaa uuguagauau u 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

uaucuacaau ugacuuggcu c 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

gaguuuucag caacaaauuu u 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

aauuuguugc ugaaaacucc u 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

gacaucuucg uauagaauau u 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

uauucuauac gaagaugucc u 21

<210> 13

<211> 25

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

gccagagagu uaaguauuuu ggaaa 25

<210> 14

<211> 27

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

uuuccaaaau acuuaacucu cuggcuu 27

<210> 15

<211> 25

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

gaaaugcuga aguagagguc auauu 25

<210> 16

<211> 27

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

aauaugaccu cuacuucagc auuucuu 27

<210> 17

<211> 25

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

caguguguua aguauuuugg aaaua 25

<210> 18

<211> 27

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

uauuuccaaa auacuuaaca cacuggc 27

<210> 19

<211> 25

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

guuguaaucu ugaugauaau gagua 25

<210> 20

<211> 27

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

uacucauuau caucaagauu acaacgc 27

<210> 21

<211> 25

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

gcaacaaauu uuuagcgaug ucaaa 25

<210> 22

<211> 27

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

uuugacaucg cuaaaaauuu guugcug 27

<210> 23

<211> 25

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

gugcacaaac auaauugcgu uaaua 25

<210> 24

<211> 27

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

uauuaacgca auuauguuug ugcacug 27

Claims (6)

1.一种用于制备治疗脱发的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有抑制FGF5表达的siRNA，所述siRNA的核苷酸序列选自SEQ ID NO:13-14、SEQ ID NO:17-18或SEQ IDNO:21-22。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述siRNA的核苷酸序列为SEQ IDNO:17-18。

3.如权利要求1-2所述的药物组合物，其特征在于，所述siRNA的递送方式为经过胆固醇修饰。

4.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的施用方式为皮下注射或皮外涂抹。

5.如权利要求3所述的药物组合物，所述组合物包括用于制备药物的辅料。

6.如权利要求3所述的药物组合物，所述组合物为软膏剂、外用溶液剂或注射剂。

Images