JP2002522014A - 癌治療におけるプロヒビチンｒｎａの使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 今回、ＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖オリゴヌクレオチド、具体的には野生型プロヒビチン３’ＵＴＲの一部から転写されたＲＮＡを腫瘍に導入すると、細胞増殖の抑止がもたらされることを見いだした。プロヒビチン３’ＵＴＲ ＲＮＡの直接投与後に、一次腫瘍のサイズに著しい減少が観察された。プロヒビチンＲＮＡ療法後に再テストした動物における転移の消失と腫瘍増殖の欠如とにより分かるように、全身性免疫の誘発が観察された。したがって、プロヒビチン３’ＵＴＲの一部から転写された野生型ＲＮＡ、またはプロヒビチン３’ＵＴＲの一部からなる一本鎖ＤＮＡ、または同じ配列の合成的に製造されたオリゴヌクレオチドを、腫瘍に対する治療剤として直接投与することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の技術分野） 本発明は、一般的には癌を治療するための一本鎖オリゴヌクレオチドの使用法
、具体的には動物において癌細胞の増殖を阻害するためのプロヒビチン（ｐｒｏ
ｈｉｂｉｔｉｎ）遺伝子（ＤＮＡ）からの３’ＵＴＲの一部またはその転写物（
ＲＮＡ）の使用法に関する。

【０００２】 （発明の背景） 正常細胞の分裂は、細胞に分裂を指示する因子と、細胞に分裂を停止するよう
に指示する他の因子との間の複雑な相互作用によって制御されている。細胞分裂
の諸段階の制御は、まとめて細胞周期と呼ばれ、プロモーター遺伝子（オンコジ
ーン）と抑制遺伝子（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅｓ）との間の複雑な相互
作用である。

【０００３】 癌は、プロモーター遺伝子（オンコジーン）および／または抑制遺伝子におけ
る変異によって引き起こされる無秩序な細胞分裂に起因する疾患である。癌細胞
中では、オンコジーン産物が過剰発現し、癌抑制遺伝子産物は認められない。癌
抑制遺伝子の存在に関する最初の証拠は、家族性癌症候群における染色体欠損に
関する研究から明らかとなった。これらと同じ領域における欠損はまた、散発性
の癌においてもしばしば観察される。失われるか変化してしまった癌抑制遺伝子
（ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ）の単一コピーの回復は、癌性
細胞系の増殖制御を回復させ、動物癌モデルにおける腫瘍形成を抑制することが
多い。

【０００４】 増殖因子およびそれらのコグネイト受容体（ｃｏｇｎａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏ
ｒｓ）、転写因子、ならびにサイクリンおよびサイクリン依存性キナーゼなどの
、細胞増殖に対してポシティブな効果を持つ多くの遺伝子およびそれらの産物が
同定され、広く研究されてきた。これらは、その異常な過剰発現が無秩序な増殖
をもたらすオンコジーンに相当する。細胞周期の抑止に関与する遺伝子は劣性で
あるため、単離して特徴を明らかにするのがより困難であった。これらの腫瘍サ
プレッサーまたは細胞増殖のネガティブな制御因子は、腫瘍中で機能の喪失を呈
する。

【０００５】 癌抑制遺伝子は、細胞の増殖を抑制する負の制御因子をコードし、正常および
癌性の細胞増殖を理解するのに重要であることから広く興味を持たれている。プ
ロヒビチン３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）は、ＤＮＡ合成の阻害剤である癌サプ
レッサーの主要な範疇に入る。プロヒビチンをコードするｃＤＮＡは、再生ラッ
ト肝に比べて正常な肝において高度に発現される老化調節ｍＲＮＡを発見するた
めのスクリーニングにおいて、最初に同定され、クローン化された。（ＭｃＣｌ
ｕｎｇ他「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ｔｈａｔ ｈｙｂｒｉｄ
ｓｅｌｅｃｔｓ ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｍＲＮＡ ｆｒｏｍ
ｒａｔ ｌｉｖｅｒ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ
、１６４巻、１３１６〜１３２２ページ、１９８９年；およびＮｕｅｌｌ他「Ｐ
ｒｏｈｉｂｉｔｉｎ、ａｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅ
ｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｂｌｏｃｋｓ
ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ
ａｎｄ ＨｅＬａ ｃｅｌｌｓ」、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ、１１巻、１３７
２〜１３８１ページ、１９９１年。

【０００６】 ヒトプロヒビチン遺伝子は、ＢＲＣＡ１近傍のｑ２１の１７番染色体にマップ
しており、２つの対立遺伝子（「Ｂ」および「非Ｂ」と称する）が記載されてい
る。（Ｊｕｐｅ他「Ｐｒｏｈｉｂｉｔｉｎ ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖ
ｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａ ｌａｃｋ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓ
ｉｔｙ ｉｎ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ」、Ｅｘｐ
Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、２１８巻、５７７〜５８０ページ、１９９５年；Ｊｕｐｅ他
「Ｔｈｅ ３’ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｈｉ
ｂｉｔｉｎ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ」、
Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、２２４巻、１２８〜１３５ページ、１９９６年；Ｊ
ｕｐｅ他「Ｐｒｏｈｉｂｉｔｉｎ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌ
ｌ ｌｉｎｅｓ：ｌｏｓｓ ｏｆ ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｃ
ｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ３’ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ
ｒｅｇｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ」、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉ
ｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、７巻、８７１〜８７８ページ、１９９６年；およ
び、Ｗｈｉｔｅ他「Ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｒｏ
ｈｉｂｉｔｉｎ ｇｅｎｅ（ＰＨＢ） ｔｏ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １７ ａ
ｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈ
ｉｓｍ」、Ｇｅｎｏｉｍｉｃｓ、１１巻、２２８〜２３０ページ、１９９１年）
。ヒトとラットでは共に、プロヒビチン遺伝子は６個のイントロンと７個のエク
ソンを有し（Ａｌｔｕｓ他「Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ
ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒａｔ ａｎｄ ｈｕｍａｎ
ｐｒｏｈｉｂｉｔｉｎ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅｓ」、Ｇｅｎｅ、１５８巻
、２９１〜２９４ページ、１９９５年）、ノーザンブロッティング実験によって
確認されたように一方が１．２で他方が１．９ｋｂの見かけの長さである２つの
転写物を生成する（Ｎｕｅｌｌ他、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ、１１巻、１３７
２〜１３８１ページ、１９９１年；Ｊｕｐｅ他、Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、２
１８巻、５７７〜５８０ページ、１９９５年；Ｊｕｐｅ他、Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ
Ｒｅｓ、２２４巻、１２８〜１３５ページ、１９９６年；および、Ｊｕｐｅ他、
Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、７巻、８
７１〜８７８ページ、１９９６年）。両転写物は、同じ３０，０００ダルトンの
タンパク質をコードし、哺乳動物の組織中では、タンパク質の発現レベルは一般
に、総メッセージレベルに対応する。（Ｎｕｅｌｌ他、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉ
ｏ、１１巻、１３７２〜１３８１ページ、１９９１年；Ｊｕｐｅ他、Ｅｘｐ Ｃ
ｅｌｌ Ｒｅｓ、２１８巻、５７７〜５８０ページ、１９９５年；Ｊｕｐｅ他、
Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、２２４巻、１２８〜１３５ページ、１９９６年；Ｊ
ｕｐｅ他、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
、７巻、８７１〜８７８ページ、１９９６年；Ｗｈｉｔｅ他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ
、１１巻、２２８〜２３０ページ、１９９１年；Ａｌｔｕｓ他、Ｇｅｎｅ、１５
８巻、２９１〜２９４ページ、１９９５年；および、ＭｃＣｌｕｎｇ他「Ｐｒｏ
ｈｉｂｉｔｉｎ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ
、ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ」、
Ｅｘｐ Ｇｅｒｏｎｔｏｌ、３０巻、９９〜１２４ページ、１９９５年）。プロ
ヒビチンは、ラットおよびヒトばかりでなく、マウス（Ｔｅｒａｓｈｉｍａ他「
Ｔｈｅ ＩｇＭ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｆ Ｂ ｌｙｍｐｈｏ
ｃｙｔｅｓｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｒｏｈｉｂｉｔｉｎ ａ
ｎｄ ａ ｐｒｏｈｉｂｉｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ」、ＥＭＢ
Ｏ Ｊ、１３巻、３７８２〜３７９２ページ、１９９４年）、酵母（Ｆｒａｎｋ
ｌｉｎ、Ｄ．Ｓ．およびＪａｚｗｉｎｓｋｉ、Ｓ．Ｍ．、「Ａ ｙｅａｓｔ ｈ
ｏｍｏｌｏｇ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔ ｐｒｏｈｉｂｉｔｉｎ ｇｅｎｅ ｉｓ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍ
ｉｎｅｓ ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ」、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｕｐｐｌ １７Ｄ：１５９
巻、１９９３年）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）（Ｅｖｅｌｅｔ
ｈ、Ｄ．Ｄ．Ｊ．およびＭａｒｓｈ、Ｊ．Ｌ．、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｃ ｇｅｎｅ、ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏ
ｆ ｔｈｅ ｄｏｐａ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅ
ｒ ｏｆ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ：ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ
ａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ」、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、１４
巻、６１６９〜６１８３ページ、１９８６年）、およびニューモシスティス・カ
リニ（ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｎｓ ｃａｒｉｎｉｉ）（Ｎａｒａｓｉｍｈａｎ他「
Ｐｒｏｈｉｂｉｔｉｎ、ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒ
ｏｌ ｅｌｅｍｅｎｔ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃ
ａｒｉｎｉｉ」、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６５巻、５
１２５〜５１３０ページ、１９９７年）からもクローン化されている。タンパク
質は、進化を通じて高度に保存され、ヒトおよびラットプロヒビチンの推定アミ
ノ酸配列は、１つの保存的アミノ酸変化以外は同じである（ＭｃＣｌｕｎｇ他、
Ｅｘｐ Ｇｅｒｏｎｔｏｌ、３０巻、９９〜１２４ページ、１９９５年；および
、Ｓａｔｏ他「Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｈｉｂｉｔｉｎ ｇｅｎｅ ｌｏｃ
ａｔｅｄ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １７ｑ２１ ｉｓ ｍｕｔａｔｅｄ
ｉｎ ｓｐｏｒａｄｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ」、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ、５２巻、１６４３〜１６４６ページ、１９９２年）。タンパク質の大部分は
ミトコンドリアに局在し、酵母における細胞老化（Ｊａｚｗｉｎｓｋｉ、Ｓ．Ｍ
．、「Ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ、ｇｅｎｅｓ、ａｎｄ ａｇｉｎｇ」、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ、２７３巻、５４〜５９ページ、１９９６年；およびＣｏａｔｅｓ他「Ｔｈｅ
ｐｒｏｈｉｂｉｔｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｒｅｇｕｌ
ａｔｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ｌｉｆｅｓｐａｎ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、７巻、Ｒ６０７〜Ｒ６１０ページ、１９９７年）、ショウジョウバ
エにおける発生および生育能力（Ｅｖｅｌｅｔｈ、Ｄ．Ｄ．Ｊ．およびＭａｒｓ
ｈ、Ｊ．Ｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、１４巻、６１６９〜６１
８３ページ、１９８６年）、および哺乳動物における顆粒膜細胞増殖（Ｔｈｏｍ
ｐｓｏｎ他「Ｓｔｅｒｏｉｄｏｇｅｎｉｃ ａｃｕｔｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ
（ＳｔＡＲ） ｐｒｏｔｅｉｎ（ｐ２５） ａｎｄ ｐｒｏｈｉｂｉｔｉｎ（ｐ
２８）ｆｒｏｍ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｒａｔ ｏｖａｒｉａｎ ｇｒａｎｕｌｏ
ｓａ ｃｅｌｌｓ」、Ｊ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔ Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ、１０９巻
、３３７〜３４８ページ、１９９７年）などの様々な過程における役割が報告さ
れている。酵母およびニューモシスティスでは、プロヒビチンタンパク質がｒａ
ｓシグナル伝達経路に役割を持つらしいことが分かった（Ｎａｒａｓｉｍｈａｎ
他、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６５巻、５１２５〜５１
３０ページ、１９９７年；およびＪａｚｗｉｎｓｋｉ、Ｓ．Ｍ．、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ、２７３巻、５４〜５９ページ、１９９６年）。プロヒビチンがｉｎ ｖｉｖ
ｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで網膜芽腫癌抑制タンパク質（Ｒｂ）と相互作用する
ことが分かり、Ｅ２Ｆを介する転写を抑制するのに有効であったが、プロヒビチ
ン変異体はＲｂと結合してＥ２Ｆ活性を抑制し、細胞増殖を阻害することはでき
なかった（Ｗａｎｇ他「Ｐｒｏｈｉｂｉｔｉｎ、ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｕ
ｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ、ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ＲＢ ａｎｄ
ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｅ２Ｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１８
巻、３５０１〜３５１０ページ、１９９９年）。

【０００７】 プロヒビチン遺伝子の構造および機能は、４つの相補的な群（Ａ〜Ｄ）に分類
された１１種の不死化ヒト細胞系で調べられた（Ｊｕｐｅ他、Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ
Ｒｅｓ、２１８巻、５７７〜５８０ページ、１９９５年；およびＪｕｐｅ他、
Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、２２４巻、１２８〜１３５ページ、１９９６年）。
ヒト乳癌細胞系も調べられたが、これは散発性および家族性乳癌においてヘテロ
接合性の消失（ＬＯＨ）を受けることが多い染色体領域である１７ｑ２１に遺伝
子が位置しているからである（Ｎａｇａｉ他「Ｄｅｔａｉｌｅｄ ｄｅｌｅｔｉ
ｏｎ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｓｅｇｍｅｎｔ １７ｑ
１２〜２１ ｉｎ ｓｐｏｒａｄｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｒｓ」、Ｇｅｎ
ｅｓ、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ、ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ、１１巻、５８〜６２ペ
ージ、１９９４年）。完全長（１．９ｋｂ）野生型プロヒビチンＲＮＡの導入後
に行われた細胞増殖アッセイは、正常なヒト二倍体線維芽細胞（ＨＤＦ）、被験
乳癌細胞系の７５％、および４種のＢ群細胞系すべて（他の群由来のどの細胞系
でもない）が、細胞周期のＧ１−Ｓ転移で阻害されることを示した（Ｊｕｐｅ他
、Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、２１８巻、５７７〜５８０ページ、１９９５年；
Ｊｕｐｅ他、Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、２２４巻、１２８〜１３５ページ、１
９９６年；およびＪｕｐｅ他、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒ
ｅｎｔｉａｔｉｏｎ、７巻、８７１〜８７８ページ、１９９６年）。驚くべきこ
とに、プロヒビチン遺伝子の配列解析により、プロヒビチン感受性癌細胞系の３
’ＵＴＲは、野生型とは１つまたは複数の塩基が異なり、一方、非感受性の系の
３’ＵＴＲは野生型の配列であることを示した。いずれの細胞系にもコード領域
配列の変化はなかった（Ｊｕｐｅ他、Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、２１８巻、５
７７〜５８０ページ、１９９５年；Ｊｕｐｅ他、Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、２
２４巻、１２８〜１３５ページ、１９９６年；およびＪｕｐｅ他、Ｃｅｌｌ Ｇ
ｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、７巻、８７１〜８７８
ページ、１９９６年）。これらの知見は、癌細胞における増殖制御の喪失が、プ
ロヒビチン３’ＵＴＲ中の変異によるものであることを示唆している。

【０００８】 １９９６年、１２月１９日公開の国際公開第９６／４０９１９号は、Ｂ型対立
遺伝子の３’ＵＴＲ中の変異が、乳癌に対する感受性増加の診断となり、早期癌
にプロヒビチン遺伝子の正常な３’ＵＴＲの一部あるいは全体を再導入すること
が癌治療における治療剤として用いることができることを開示した。

【０００９】 １９９８年５月１４日公開の国際公開第９８／２０１６７号は、ゲノムＤＮＡ
またはプロヒビチン遺伝子の３’ＵＴＲを含むゲノムＤＮＡから転写されたＲＮ
Ａのプロヒビチン３’ＵＴＲ（配列番号２）中の７２９位の生殖系列（ｇｅｒｍ
ｌｉｎｅ）遺伝子型を識別することにより、乳癌に対する患者の感受性を決定す
る方法を開示した。

【００１０】 １９９９年５月２０日公開の国際公開第９９／２４６１４号は、ゲノムＤＮＡ
またはプロヒビチン遺伝子の３’ＵＴＲを含むゲノムＤＮＡから転写されたＲＮ
Ａのプロヒビチン３’ＵＴＲ（配列番号２）中の７２９位の患者の生殖系列遺伝
子型を識別することにより、乳癌ばかりでなく他のタイプの癌（例えば、前立腺
癌または子宮癌）に対する患者の感受性を決定する方法を開示した。

【００１１】 １９９８年７月７日発行の米国特許第５，７７６，７３８号および１９９９年
７月１３日発行の米国特許第５，９２２，８５２号は、乳癌および他の癌に対す
る患者の感受性を決定するのに使用できる、プロヒビチン遺伝子の３’ＵＴＲ領
域の一部からなる精製核酸フラグメントを開示した。

【００１２】 一本鎖オリゴヌクレオチド、好ましくは、野生型プロヒビチンの３’ＵＴＲか
らのＤＮＡまたはそれから転写されたＲＮＡもしくは類似配列をもつ合成的に製
造されたオリゴヌクレオチド、最も好ましくは野生型プロヒビチン３’ＵＴＲか
ら転写されたＲＮＡを３種の乳癌細胞系に導入すると、細胞増殖の抑止がもたら
される一方、変異したプロヒビチン３’ＵＴＲから転写されたＲＮＡは抗増殖活
性を有しないことを今や見いだした。したがって、野生型プロヒビチンＲＮＡを
導入すると増殖制御が回復する。一方、細胞増殖アッセイによって、ｐ５３また
はｐ２１サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（すなわち、ＷＡＦ１、ＳＤＩ１、Ｃ
ＡＰ２０またはＣＩＰ１）をコードする遺伝子の導入後における細胞周期の抑止
と、それに続く機能性タンパク質の産生とが既に明らかにされているが、今や、
プロヒビチン３’ＵＴＲの一部から転写された野生型ＲＮＡ（または本明細書に
記載の他のオリゴヌクレオチド）を癌に対する治療剤として直接投与することで
、タンパク質産生遺伝子を細胞または染色体に導入するようなより「伝統的な」
遺伝子療法アプローチの要件を回避できることを見いだした。

【００１３】 （発明の概要） 本発明は、プロヒビチン遺伝子の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）の配列に由来
するオリゴヌクレオチドを含む。一実施態様において、本発明は、プロヒビチン
遺伝子の３’非翻訳領域の一部から転写された、動物、好ましくは哺乳動物にお
ける癌抑制（ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｒｅｓｓｏｒ）活性を有する単離されたリボ核
酸を含む。好ましいリボ核酸は、配列番号１の８６７位から１８０３位までに示
される、プロヒビチン遺伝子の全３’非翻訳領域の転写物である。より好ましい
リボ核酸は、配列番号２としても示されている、配列番号１の９５２位から１８
０３位までの転写物である。別の好ましいリボ核酸は、プロヒビチン遺伝子の３
’非翻訳領域の３’末端の最後の２３８個のヌクレオチドである配列１の１５６
６位から１８０３位までの転写物である。配列番号３は、Ｔ７プロモーターが前
に置かれたこの好ましい配列を示している。

【００１４】 上記のＲＮＡの三次元コンフォメーション（ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ
ａｌ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に模する３’ＵＴＲに由来する一本鎖ＤＮＡ
も、本発明のオリゴヌクレオチドを構成する。配列番号１の８６７〜１８０３位
、配列番号１の９５２〜１８０３位の塩基からなることが好ましく、配列番号１
の１５６６〜１８０３位の塩基からなることが最も好ましい。

【００１５】 本発明には、ＲＮＡ転写物が転写されたＤＮＡも含まれる。さらに、ＲＮＡお
よびＤＮＡは、本明細書に記載の配列情報を用い当技術分野で知られている方法
により、合成的に製造することができる。

【００１６】 別の実施態様において、本発明は、抗癌作用を得るための投与用に適合された
、増殖阻害量の活性な単離オリゴヌクレオチドを含む薬剤である。一実施態様に
おいて、プロヒビチン遺伝子の３’非翻訳領域の一部から単離されたリボ核酸を
薬剤中で使用することができる。該薬剤には、前述のＲＮＡまたはＤＮＡのいず
れが含まれていてもよい。リボ核酸を含む薬剤は、直接腫瘍と接触するように投
与することができる。腫瘍内注入による方法が好ましい。腫瘍と直接接触させる
場合の投与量は、腫瘍１立方センチメートル当たり約２マイクログラムから約１
２０マイクログラムである。腫瘍の体積は、超音波可視化または医学分野で知ら
れている他の評価方法によって評価することができる。薬剤は全身的に投与する
こともできる。連続注入（ｉｖ）による全身投与の投与量は、１から１５日間に
１日につき体重１ｋｇあたり約０．５ミリグラムから約２００ミリグラムである
。投与量は１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日がより好ましい。

【００１７】 別の実施態様において、前述の一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いること
ができる。

【００１８】 さらに別の実施態様において、本発明は、癌細胞の増殖を阻害する方法であっ
て、癌細胞を増殖阻害量の活性な単離オリゴヌクレオチドと接触させることを含
む方法である。一実施態様において、プロヒビチン遺伝子の３’非翻訳領域の一
部から単離されたリボ核酸転写物を、動物での癌抑制に使用することができる。
この方法には、前述のＲＮＡまたはＤＮＡのいずれの使用法も含まれる。

【００１９】 （詳細な説明） プロヒビチン遺伝子の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に由来する新規なオリゴ
ヌクレオチドを用い、癌細胞の増殖を減らし、腫瘍を退縮させ、癌を治療するこ
とができる。例えば、非コードプロヒビチン３’ＵＴＲに由来するＲＮＡ、また
は非コード野生型プロヒビチン３’ＵＴＲに由来するＲＮＡの三次元コンフォメ
ーションに模する非コードプロヒビチン３’ＵＴＲの一本鎖センスＤＮＡを細胞
または腫瘍に投与するか、治療が必要な患者に投与することにより、前述の恩恵
を得ることができる。より具体的には、新規なオリゴヌクレオチドは、野生型プ
ロヒビチン１．９ｋｂ転写物のヒト非コード３’ＵＴＲに由来することが好まし
い（図１および配列番号１）。１．９ｋｂ転写物において、タンパク質コード領
域は塩基番号８６６で終わる。１．９ｋｂ転写物は、１０２７位から始まる、約
７７７塩基の特有の３’ＵＴＲを含む（図１および配列番号１）（Ｊｕｐｅ他、
Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、２２４巻、１２８〜１３５ページ、１９９６年）。

【００２０】 本発明のオリゴヌクレオチドには、ヒトおよび他の動物で癌を治療するための
動物変異株も含まれる。例えば、ヒトプロヒビチン遺伝子の３’ＵＴＲと５０％
以上の相同性、より好ましくは７０％以上の相同性を有するヒト以外の動物のプ
ロヒビチン遺伝子の３’ＵＴＲに由来するオリゴヌクレオチドは、ヒトおよび他
の動物の癌治療に用いることができる。より具体的には、図４に示す野生型ヒト
のプロヒビチン３’ＵＴＲの３’末端とのアラインメントで図示するように、ラ
ットプロヒビチン遺伝子の３’ＵＴＲの３’末端は、ヒトプロヒビチン遺伝子の
３’ＵＴＲの３’末端と７８％の相同性を有しており、したがって、ラット３’
ＵＴＲの３’末端を含むオリゴヌクレオチドを用いてヒトおよび他の動物の癌を
治療することができる。実験的には、塩溶液中のヒト配列と、ナイロン膜に結合
した他の動物のＤＮＡ（またはＲＮＡ）とのハイブダイゼーションによって、相
同性を明らかにすることができる。反応のストリンジェンシーは、融点Ｔ_ｍを式
Ｔ_ｍ＝８１．５＋０．４１（Ｇ＋Ｃ）＋１６．６ｌｏｇ［Ｎａ^＋］−０．６３（
％ホルムアミド）−［３００＋２０００［Ｎａ^＋］÷ｄ］（式中、Ｇ＋Ｃは、既
知配列のプローブ中の％グアノシンおよびシトシン、［Ｎａ^＋］は、Ｎａ^＋のモ
ル濃度または等価の一価カチオン、ｄは、ヌクレオチド中のハイブリダイズした
二重鎖の長さ）で定義することによって測定する。極めて遠い相同体にはＴ_ｍ以
下の４０〜５０℃の条件を使用することができる。より近縁関係にある相同体を
識別するためには通常、Ｔ_ｍ以下の３０〜３５℃でスクリーニングすることが好
ましい。

【００２１】 （オリゴヌクレオチド療法） 以下に示すデータは、プロヒビチン３’ＵＴＲ ＲＮＡ転写物の短いフラグメ
ントが、癌抑制活性を有する調節ＲＮＡとして機能し、治療剤として投与したと
きにｉｎ ｖｉｖｏで乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｒ）細胞の増殖を効果的に
制御できることを示している。これらの結果は、ヒトおよび他の動物での乳癌（
ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）に対する直接的プロヒビチン３’ＵＴＲ ＲＮＡ
療法の有効性を示している。プロヒビチン３’ＵＴＲにおける変異の存在は他の
タイプの癌にも見いだされ、野生型プロヒビチンＲＮＡは他のタイプの腫瘍に由
来する生細胞の細胞周期の進行を阻害することができる。したがって、直接的プ
ロヒビチン３’ＵＴＲオリゴヌクレオチド療法は、他のタイプの癌治療にも使用
することもできる。

【００２２】 プロヒビチン３’ＵＴＲ由来のオリゴヌクレオチドは、固形腫瘍（ｓｏｌｉｄ
ｔｕｍｏｒ）中に直接または全身的に投与することができる。腫瘍の外科的除
去の前に投与すれば、腫瘍は十分に退縮して外科手術はもはや不必要となり、外
科手術の合併症である腫瘍細胞の循環系への望ましからぬ放出の可能性を回避す
ることができる。癌治療において固形腫瘍に直接注入するオリゴヌクレオチドの
好ましい初回投与量は、腫瘍１立方センチメートル当たり約２マイクログラムか
ら約１２０マイクログラムであり、全身治療の場合には１から１４日間に０．５
ｍｇ／ｋｇ／日から２００ｍｇ／ｋｇ／日である。癌治療において全身的に投与
するオリゴヌクレオチドのより好ましい投与量は、１日につき体重１ｋｇ当たり
約１から約１００ミリグラムである。所望であれば治療を繰り返すことができる
。

【００２３】 本発明のオリゴヌクレオチドは、増殖阻害量のオリゴヌクレオチドを悪性細胞
に送るいかなる手段によっても投与することができる。他の投与方法には、肝門
脈系による肝臓への直接送達、鞘内注射による神経系への直接送達、および吸入
による肺への直接送達が含まれる。使用する坦体は等張食塩水であってもよいが
、陽イオン性または陰イオン性リポソームがより好ましい。代替法は、腫瘍を取
り囲む組織にオリゴヌクレオチド薬剤を挿入し、オリゴヌクレオチドを悪性細胞
に移動させる方法である。オリゴヌクレオチド薬剤は、静脈内、筋肉内、腹腔内
、皮下、または局所的に、接近可能な腫瘍または接近可能な腫瘍を取り囲む組織
中に直接注射器で注入することができる。クリーム剤、スプレー剤、液剤および
綿棒による粘膜表面への投与も企図している。組成物は、肺吸入器により肺に投
与することができる。経口投与も用いることができる。

【００２４】 プロヒビチン３’ＵＴＲ由来のオリゴヌクレオチドは、静脈内、筋肉内、腹腔
内、あるいは皮下により全身に送達するが、当技術分野で知られている他の方法
も本発明の範囲内にある。組成物は、送達のために医薬品技術分野で使用される
運搬体、例えばリポソームなどに封入または組み込むことができる。

【００２５】 さらに、直接あるいは全身治療の場合には、オリゴヌクレオチドを発現ベクタ
ー中で投与することができる。本発明のオリゴヌクレオチドに適当な発現ベクタ
ーには、ウイルスベクター、プラスミドベクター、およびプロヒビチン３’ＵＴ
Ｒをコードする配列の挿入で操作された当技術分野で知られている他の運搬体が
含まれる。好ましい発現ベクターには、真核生物のウイルスベクター、例えば、
ブタパミローマウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスが含まれ
る。発現ベクターは、患者において関心のあるオリゴヌクレオチドの効率のよい
、好ましくは構成的な産生を容易にするプロモーターを含む。構成的活性に最も
好ましいのは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。標的悪性
細胞のタイプに特異的なプロモーター、すなわち乳癌治療には乳癌ウイルスプロ
モーターが有利である。乳房組織に特異的な好ましいプロモーターには、乳タン
パク質に特異的なプロモーター、例えば、β−カゼイン、β−ラクトグロビン、
またはホエー酸性タンパク質が含まれる。

【００２６】 あるいは、オリゴヌクレオチドを、投与方法に基づいて選択された、薬剤とし
て許容される坦体または賦形剤と混合することができる。賦形剤には、懸濁剤、
乳剤、水剤、クリーム剤、ゲル剤、軟膏、および注射用液体調製物を含む様々な
剤形で使用される充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、表面活性剤、または滑沢剤
が含まれる。経口投与には、錠剤、散剤、顆粒剤、およびカプセル剤を使用する
ことができる。プロヒビチン３’ＵＴＲ由来のオリゴヌクレオチドの送達には様
々な坦体を使用することができる。坦体の例には、食塩水、陽イオン性リポソー
ム、（メチル硫酸Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，
Ｎ，Ｎ−トリ−メチルアンモニウム）（ＤＯＴＡＰ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、および他の陽イオン性ま
たは陰イオン性リポソームが含まれる。

【００２７】 さらに、プロヒビチンＲＮＡの腫瘍への直接注入の成功において、ＲＮＡの構
造がある程度の固有の安定性およびヌクレアーゼ抵抗性を有することが示されて
おり、二次構造を形成する傾向によると思われる（図５）。未変性ゲル上のプロ
ヒビチンＲＮＡの移動は、分子が本質的に二本鎖であることと一致した。さらに
、ヌクレアーゼ抵抗性および分子の安定性を改善する本発明のオリゴヌクレオチ
ドの修飾は、癌治療に使用することができる。例えば、５’末端の７−メチルグ
アノシンキャップまたはポリ−Ａ尾部の付加は、より大きな安定性をＲＮＡにも
たらす。

【００２８】 本発明のプロヒビチン３’ＵＴＲ ＲＮＡの製造方法およびＲＮＡによる治療
方法を以下に述べる。特定の説明および実施例に関して本明細書に本発明を示し
たが、発明の真の精神および範囲を逸脱することなく本発明にある種の改変を行
えることは当業者は理解するであろう。

【００２９】 （抗増殖活性の局在） プロヒビチン３’ＵＴＲのサブフラグメントに抗増殖活性が局在していること
はまず、実施例４に示す微量注入アッセイ手順に従って行った。プロヒビチン３
’ＵＴＲの完全長１．９−キロベース（ｋｂ）ｃＤＮＡおよびｐＢＳＩＩＳＫ＋
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）またはｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）にクローン化したいくつかの切断
ｃＤＮＡを用い、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ
．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡ転写物を合成した
。切断転写物は、翻訳信号ならびにＡＵＧ開始部位およびプロヒビチンタンパク
質の最初の４０アミノ酸をコードする領域を失ったクローンから、センスおよび
アンチセンス方向の双方で合成した。ＵＧＡ停止コドンから約８０塩基下流から
始まる８５２塩基の３’ＵＴＲ転写物は、野生型配列を有する３’ＵＴＲクロー
ンから合成した。転写物は、３’ＵＴＲの８５２個のフラグメントの最初の２３
８塩基および３’ＵＴＲの最後の２３８塩基からも合成した。

【００３０】 正常ＨＤＦに微量注入したときに細胞周期の進行を阻害する完全長および切断
転写物の能力を比較することにより、野生型プロヒビチン転写物において抗増殖
活性が局在化していた（図６）。５’末端で切断された完全長センス転写物、８
５２塩基非コード３’ＵＴＲ単独（図２および配列番号２）、および３’ＵＴＲ
の最後の２３８塩基（図３および配列番号３）はすべて、完全長１．９ｋｂ転写
物に匹敵する抗増殖活性を示した。切断アンチセンス転写物および８５２塩基３
’ＵＴＲの５’末端からの２３８塩基には、ほとんどあるいはまったく抗増殖活
性がなかった。したがって、抗増殖活性は３’ＵＴＲの最後の２３８塩基にマッ
プしており、この領域の変異が抗増殖活性の喪失をもたらすことが明らかとなっ
た。

【００３１】 （ＨＤＦおよび乳癌細胞系における変異プロヒビチン転写物の抗増殖活性） ３種の乳癌細胞系（ＢＴ−２０、ＭＣＦ７、およびＳＫ−ＢＲ−３）から単離
したプロヒビチンＲＮＡに対応するプロヒビチンＲＮＡの抗増殖活性を、実施例
４に示す微量注入アッセイ手順に従って行った。ＲＮＡ転写物は、Ｊｕｐｅ他、
Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、２２４巻、１２８〜１３５ページ、１９９６年に示
す方法に従って生成した。３種の乳癌細胞系からのプロヒビチンＲＮＡに対応す
る変異ＲＮＡは（表１）、正常ＨＤＦにおける細胞周期の進行を阻害できなかっ
た（図７）。対立遺伝子多型を示すＵＴＲ−７２９における単一のシトシン（Ｃ
−７２９）からチミン（Ｔ−７２９）への転移であっても、ＭＣＦ７においては
３’ＵＴＲの最後の２３８塩基から活性を無くするのに十分であった。しかしな
がら、Ｃ−７２９を有するが別の２つの部位で変異しているＢＴ−２０も抗増殖
活性を欠いており、複数の変化が３’ＵＴＲの抗増殖活性の喪失を引き起こすこ
とを示している。図８に示す別の実験では、ＨＤＦの場合と同様、最後の２３８
塩基に変異を有する乳癌細胞系において、野生型８５２塩基および最後の２３８
塩基ＲＮＡは共に抗増殖活性を有する一方、変異体は不活性であることを示した
。これらのデータは、抗増殖活性が、乳癌細胞系（Ｊｕｐｅ他、Ｃｅｌｌ Ｇｒ
ｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、７巻、８７１〜８７８ペ
ージ、１９９６年）および乳癌で最も変異しやすい領域である３’ＵＴＲの３’
末端に局在していることを示している。

【００３２】 （動物モデルにおけるプロヒビチン３’ＵＴＲ ＲＮＡの抗増殖活性） プロヒビチン３’ＵＴＲの２３８塩基フラグメント（図３および配列番号３）
のｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写によって調製したＲＮＡを用い、ラット乳癌を治療
した。ＲＮＡは、最近出現した触診可能な腫瘍に直接注入することによって投与
した。初回の実験は、投与のために等張食塩水に再懸濁したＲＮＡで行った。こ
の送達法を用いると、治療動物の５０％において腫瘍が完全に治癒した。真核生
物のＲＮＡを安定化することが知られている５’末端への７メチルグアノシンキ
ャップの付加による治療用ＲＮＡの修飾に加え、陽イオン性リポソームＤＯＴＡ
Ｐ（メチル硫酸Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ
，Ｎ−トリ−メチルアンモニウム）と複合体形成したＲＮＡを送達すると、治癒
率の改善がもたらされた。これらの条件下での長期生存率は、７５％まで上昇し
た。治療が奏功した動物は、治療した一次腫瘍ばかりでなく未治療遠隔転移も退
縮した。

【００３３】

【表１】

【００３４】 （ＲＮＡ生成）プロヒビチンＲＮＡは、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ
（商標）あるいはＭＥＧＡＳｃｒｉｐｔ（商標）転写キット（Ａｍｂｉｏｎ）を
用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって調製した。ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨ
ＩＮＥには、反応中に５’末端Ｇを転写物に取り込むキャップアナログ（ｍ^７Ｇ
（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ）が含まれる。真核生物ＲＮＡの５’末端のこの７−
メチルグアノシンキャップ構造は、分子に大きな安定性をもたらす。用いた転写
鋳型は、野生型ヒト（またはラット）プロヒビチン３’ＵＴＲを含むクローン化
され配列決定されたプラスミド、あるいは最小ファージプロモーター（Ｔ７また
はＳＰ６）が結合されたプロヒビチンプライマー（転写結合プライマー）を用い
てクローン化されたプラスミドから合成されたＰＣＲ生成物サブフラグメントと
した（図３および配列番号３）。転写後、反応物のアリコートを変性アガロース
ゲル上で分析し、完全性を確認し、完全長転写物の収率を評価した。ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏの転写物をＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅＩで消化した。次いで、１．５％
アガロースゲル上でＲＮＡを精製し、ゲルから溶出し、エタノール沈殿させてＲ
Ｎａｓｅ非含有水に再懸濁した。あるいは、ＤＮａｓｅＩ消化の後、ヌクレアー
ゼ非含有水および酢酸アンモニウムを加えて反応を停止した。次いで、混合物を
フェノール／クロロホルム抽出し、クロロホルム抽出し、イソプロピルアルコー
ルで沈殿させた。沈殿した試料を滅菌したＲＮａｓｅ非含有水に再懸濁した。Ｒ
ＮＡ濃度は、分光光度法で測定した。

【００３５】 （等張食塩水での製剤化）所望の投与量を得るのに必要な量のＲＮＡを、酢酸
アンモニウムおよびイソプロパノールを用いて予め沈殿させ、投与のために０．
５〜１．０マイクログラム／マイクロリットル（μｇ／μｌ）の濃度でパイロジ
ェンを含まない等張食塩水（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．
、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ、０．９％塩化ナトリウム）に再懸濁した。注入用
のＲＮＡは、さらに１０〜１００マイクログラムで希釈して、等張食塩水の最終
体積を１００〜２００マイクロリットルとすることにより調製した。

【００３６】 （ＤＯＴＡＰでの製剤化）ＲＮＡ送達の好ましい方法は、真核生物細胞の陽イ
オン性リポソーム仲介トランスフェクションで一般に用いられる試薬であるＮ−
［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルア
ンモニウムメチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）との複合体の
形成に関するものである。ＲＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体は、製造者の使用説明書に
示される一般ガイドラインに従い、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＨＢＳ）（１ＸＨＢ
Ｓ＝２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で形成した
。注入用の混合物は、ＲＮＡ２０マイクログラムの投与量を含む２００マイクロ
リットルの送達体積の場合、以下のように調製した。ＤＯＴＡＰストック（１マ
イクログラム／マイクロリットル）３０マイクロリットルを１ＸＨＢＳ７０マイ
クロリットルに加えることによりＤＯＴＡＰ溶液１００マイクロリットルを調製
した。ＲＮＡ２０マイクログラム（通常２０マイクロリットル）および１０ＸＨ
ＢＳ１０マイクロリットルをＲＮＡａｓｅ非含有水７０マイクロリットルに加え
ることによりＲＮＡ保存溶液１００マイクロリットルを調製した。核酸溶液をＤ
ＯＴＡＰ溶液に滴下しながら移し、５〜１０回ピペッティングすることにより混
合した。注入の前にＲＮＡ／ＤＯＴＡＰ混合物を室温で少なくとも１０分間イン
キュベートした。

【００３７】 （治療）等張食塩水中でまたはＤＯＴＡＰ複合体として送達するために調製し
たＲＮＡは、２８ゲージの１ｃｃインスリン注射器を用い、触診可能な腫瘍に直
接注入した。ラット乳癌では通常、溶液１００〜２００マイクロリットルを送達
した。腫瘍半径は、測径器で最大長（Ｄ_１）および最大幅（Ｄ_２）の地点で直径
を測定し、２で割って半径Ｒ_１およびＲ_２をそれぞれ算出することにより測定し
た。立方センチメートル単位の体積は、式４／３πＲ_１ ^２Ｒ_２（式中Ｒ_１≦Ｒ_２ ）により算出する。内部の腫瘍体積は、超音波またはＸ線技法によって評価する
ことができる。

【００３８】 一本鎖ＤＮＡの生成。選択した鎖の一本鎖ＤＮＡを製造する方法の１つは、等
しくない濃度の２種類の増幅プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）の変法である（非対称ＰＣＲ）。この方法によって生成する一本鎖ＤＮＡは
、未変性または変性ゲル上で精製することができる。ＲＮＡ用に上述したように
、有機抽出およびエタノール沈殿により、使用のための一本鎖ＤＮＡのバンドを
切り取し、調製する。例えば、Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ、Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ、
Ｊ．Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ、Ｔ．Ｊ．Ｗｈｉｔｅ編、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、７６〜９１ページ、１
９９０年中のＰｅｔｅｒ ＭｃＣａｂｅ、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎ
ｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｂｙ Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ＰＣＲを参
照されたい。配列は、上記のＲＮＡへの転写に適当と思われる配列から選択する
が、ＤＮＡが治療剤として使用できることから転写の必要はない。本明細書に記
載の治療法では、ＲＮＡ転写物の代わりにむしろ調製された一本鎖ＤＮＡを利用
する。

【００３９】 （合成オリゴヌクレオチド） ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドは、合成的に、すなわち、自動化学合
成法または当技術分野で知られている他の方法または利用できるようになった他
の方法を用いることにより製造することができる。合成用の配列は、プロヒビチ
ン遺伝子の３’ＵＴＲ由来の転写ＲＮＡまたはＤＮＡについて記載した配列から
選択する。

【００４０】 （実施例１） プロヒビチンの３’ＵＴＲ ＲＮＡの効力は、触診可能な７，１２−ジメチル
ベンズ（ａ）アントラセン（ＤＭＢＡ）誘発性ラット乳癌への直接注入により測
定した。これらは、急激に増殖し、移植可能であり、かつ転移性の乳癌（ｍａｍ
ｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ）で、ｐ５３を過剰発現し雌性のＷｉｓｔａｒ−Ｆｕｒｔ
ｈラットが罹りやすい。このラット乳癌は、ＤＭＢＡ４０ｍｇの曝露後に雌性Ｗ
ｉｓｔａｒ−Ｆｕｒｔｈラットにまず誘発させた（Ｋｏｌｌｍｏｒｇｅｎ他「Ｉ
ｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｄｉｅｔｒａｒｙ ｆａｔ ａｎｄ ｉｎｄｏｍｅｔ
ｈａｃｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｂｌ
ｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒｓ ｉｎ ｒａｔｓ」、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ
、４３巻、４７１４〜４７１９ページ、１９８３年；Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｋ．、Ｈ
ｉｌｇａｒ，Ｐ．、およびＥｃｃｌｅｓ，Ｓ．編、ＥＯＲＴＣ Ｍｅｔａｓｔａ
ｓｉｓ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏ
ｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ
ｏｆ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ、Ｔｈｅ Ｈａｇｕｅ：Ｍａｒｔｉｎｕｓ Ｎｉｊ
ｈｏｆｆ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ、２１０〜２１４ページ、１９８０年のＫｉｍ，
Ｕ．、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｓｉｚｉｎｇ
ａｎｄ ｎｏｎ−ｍｅｔａｓｔａｓｉｚｉｎｇ ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ ｔｈ
ｅｉｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｏｓｔ ｉｍｍｕｎｅ
ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅｔａｓｔ
ａｓｉｓ」）。腫瘍は、２１日齢の雌性Ｗｉｓｔａｒ−Ｆｕｒｔｈラット（１３
０〜１４０ｇ）において、３０日ごとに継代することによって維持した。一次腫
瘍をホモゲナイズし、ゲンタマイシン５０μｇ／ｍｌおよび７％仔牛血清を加え
たＤｕｌｂｅｃｃｏの改良Ｅｇａｌ培地（ＤＭＥＭ）中で単一細胞懸濁液とした
（１×１０^７細胞／ｍｌ）。各動物には２００マイクロリットル中の送達される
１×１０^６個の細胞を投与し、右鼠径部リンパ節に隣接する第６乳腺の脂肪パッ
ドに注入した。注入部位の触診可能な一次腫瘍は、１０〜１２日目に明確となり
、注入後２０〜３０日までにリンパ節、肺、および肝臓に転移が認められた。腫
瘍がｐ５３を過剰発現し、変異プロヒビチン３’ＵＴＲを有することが初めて分
かった（図９）。

【００４１】 プロヒビチン３’ＵＴＲの３’末端からの２３８塩基ＲＮＡは、ＭＥＧＡＳＣ
ＲＩＰＴ（商標）転写キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いるＴ７ポリメラーゼによる
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により、クローン化され配列決定されたプラスミドから調
製した。転写後、反応の一部を変性アガロースゲル上で分析し、完全長転写物の
生成を確認した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物をＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅで２回
処理した。次いで、１．５％アガロースゲル上でＲＮＡを精製し、ゲルスライス
から溶出し、エタノール沈殿させてＲＮａｓｅ非含有水に再懸濁した。濃度は、
分光光度法で測定し、試料は予め沈殿させ、投与のためにパイロジェンを含まな
い等張食塩水（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．）に再懸濁し
た。

【００４２】 ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成したプロヒビチン３’ＵＴＲ転写物を、継代後９〜１
２日目に出現する触診可能な固形腫瘍に直接注入すると、腫瘍の増殖速度と最終
サイズが共に著しく減少した。細胞系の細胞周期の進行を阻害する能力を示した
野生型２３８塩基プロヒビチン３’ＵＴＲ ＲＮＡ（図６〜８）を用いた。細胞
増殖の阻害は、ＲＮＡ１０ミリグラムの単回注入で一次腫瘍を治療したときに観
察された。一連の治療動物１０匹（１回の注入につきＲＮＡ１０ｍｇの投与量で
２回注入）および１０匹のコントロール動物（食塩水坦体を投与する）では、継
代３０日後の治療された一次腫瘍の平均サイズ（立方センチメートル単位の体積
）は、コントロール一次腫瘍に比べて４２％（範囲２０〜８０％）小さかった（
図１０）。コントロール群の動物はすべて死亡したが（平均寿命＝３６±４日）
、治療動物のうち４匹は明らかな無病状態まで回復し、腫瘍注入後１２０日目で
も健康であった。この４匹は、４５日目までには転移と一次腫瘍の双方の完全な
退縮を受け、全身性の抗腫瘍活性が誘発されたことを示している。

【００４３】 （実施例２） 野生型プロヒビチン３’ＵＴＲの３’末端からの２３８塩基ＲＮＡの抗増殖活
性についてＷｉｓｔａｒ−Ｆｕｒｔｈラットのラット乳癌に注入して調べた。プ
ロヒビチン野生型ＲＮＡで抗増殖活性が認められたが、コントロールＲＮＡは腫
瘍増殖に効果がなかった。

【００４４】 それぞれ５匹の動物群を一次腫瘍への３回の注入を利用して治療した。２つの
コントロール群をおき、一方には食塩水を与え、もう一方には細胞増殖アッセイ
で使用したのと同じコントロールである３’ＵＴＲの５’末端由来のＲＮＡを与
えた（図６）。２つの治療群は、低用量（１００マイクロリットル中１０マイク
ログラム）および高用量（１００マイクロリットル中２０マイクログラム）の３
’ＵＴＲの３’末端由来の野生型ＲＮＡとした。治療後１６日目までに、両コン
トロール群は平均体積約３０立方センチメートルの腫瘍を有していたが、低用量
野生型治療群の腫瘍は８立方センチメートルに過ぎず、高用量群の腫瘍は５立方
センチメートルであった（図１１）。本実験における１０匹の治療動物のうち、
６匹の動物は腫瘍注入１２０日後にもまだ生存して腫瘍もなく、対照的にコント
ロール群に生存する動物はいなかった。これらの結果は、送達の用量と回数が共
に治療効果を変えたことを示していた。

【００４５】 （実施例３） 実施例１の４匹の治療動物および実施例２の６匹の治療動物は、完全な退縮を
受けた。一般に、退縮を受けた動物の一次腫瘍の増殖はゆっくりとしていたが、
左および右の腋窩に転移を発生した。初回治療後約１５日目には、一次腫瘍は増
殖を停止し、転移も退縮し始めた。２５日目までには触診可能な転移はもはや存
在せず、一次腫瘍の体積はピーク時の２０〜３０立方センチメートルからほんの
約１０立方センチメートルまでに減少した。一次腫瘍は消失し、３５〜４５日目
には完全治癒が観察された。初回の腫瘍注入から１２０日後には実施例１および
２の治癒した動物は無病のままであったが、コントロール動物の平均生存時間は
３６日に過ぎなかった。未治療動物およびコントロールＲＮＡで治療した動物に
は自然的な軽減は観察されなかった。

【００４６】 この退縮様式は、プロヒビチン治療が抗腫瘍免疫応答の発現を誘発することを
示しており、次に５０匹の治癒動物（初回テスト後１２０日目）をＤＭＢＡ−４
腫瘍の新たな接種で再テストすることによって試験した。再テスト６０日後にお
いて、再テストした動物のうち２匹だけが腫瘍を発生し、残りの４８匹には腫瘍
がないままであり、このことはプロヒビチンＲＮＡ療法が成功した後に腫瘍に対
する長期免疫が誘発されることを示している。

【００４７】 （実施例４） プロヒビチンＲＮＡの抗増殖活性を、ＲＮＡ転写物の微量注入後に分析した（
Ｎｕｅｌｌ他、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１１巻、１３７２〜１３８１ペー
ジ、１９９１年）。Ｋｅｙｏｍａｒｓｉ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、５１巻、３
６０２〜３６０９ページ、１９９１年の方法に従い、ロバスタチン（Ｍｅｒｃｋ
、Ｓｈａｒｐ ａｎｄ Ｄｏｈｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａｌｓ、Ｒａｈｗａｙ、ＮＪのＡ．Ｗ．ａｌｂｅｒｔｓより提供された）で
初期Ｇ１に細胞を同調させた。同調細胞（１実験当たり２００〜３００個）に、
エッペンドルフ５２４２型微量注入器を用い、１ｍｇ／ｍｌの濃度でＲＮＡ転写
物を微量注入した。微量注入した細胞を、［^３Ｈ］チミジンの存在下に細胞周期
を進ませ、オートラジオグラフィにより阻害活性を算出した（Ｎｕｅｌｌ他、Ｍ
ｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１１巻、１３７２〜１３８１ページ）。これらの実
験は、抗増殖活性が３’ＵＴＲの３’末端の２３８塩基領域に局在していること
を示している（図６）。この領域の変異は、正常細胞と乳癌細胞の双方で抗増殖
活性の喪失をもたらす（図７および８）。

【００４８】 （実施例５） 本治験では、１６匹のＷｉｓｔａｒ−Ｆｕｒｔｈラットを８匹の２群に分けた
。コントロール群の動物には、Ｘｅｎｏｐｕｓ伸長因子１−α遺伝子（Ａｍｂｉ
ｏｎ Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）の５’末端から転写した２００塩
基長のＲＮＡを与えた。治療群には、プロヒビチン３’ＵＴＲの３’末端からの
２３８塩基ＲＮＡ転写物を与えた。コントロールおよびプロヒビチンＲＮＡは、
ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ転写キットを用いて、７−ｍＧキャップし
て生成した。腫瘍注入後１２および１７日目に、注射器からの腫瘍内注入により
ＲＮＡをそれぞれ２０マイクログラム含む投与量をＤＯＴＡＰ担体で与えた。転
写物のキャッピングおよびＤＯＴＡＰ担体の送達により、等張食塩水で見られる
退縮と同様の腫瘍退縮速度となった。しかしながら、生存率に大きな改善が観察
された。５５日目までのこの実験では、コントロール群の動物はすべて死亡した
が、治療群のうち７匹は生存した。プロヒビチンＲＮＡ治療動物のうち６匹（７
５％）は治癒し、腫瘍接種１２０日後に腫瘍がないままであった。

【００４９】 （実施例６） 一次腫瘍および／または転移のある患者は、本発明の少なくとも１つのプロヒ
ビチン３’ＵＴＲオリゴヌクレオチドにより、好ましくは担体ＤＯＴＡＰと複合
体形成させて治療することができる。一次腫瘍のある患者の場合には、腫瘍体積
１立方センチメートル当たり約２から約１２０マイクログラムで一次腫瘍に直接
注入することによりオリゴヌクレオチドを投与することができる。一次腫瘍の外
科的除去後に転移のある患者の場合には、体重１キログラム当たり約０．５から
約２００ミリグラムでオリゴヌクレオチドを全身投与することができる。投与サ
イクルは、１から約１５日とすることができる。投与サイクルは複数回繰り返す
ことができる。一次腫瘍および二次転移のある患者の場合には、腫瘍体積１立方
センチメートル当たり約２から約１２０マイクログラムで一次腫瘍に直接注入し
、続いて体重１キログラム当たり約０．５から約２００ミリグラムで全身投与す
ることによりオリゴヌクレオチドを投与することができる。患者の経過は超音波
技法などの医学界で知られている方法によりモニターし、腫瘍サイズおよび状態
を確かめる。

【００５０】 （実施例７） 乳癌と診断された患者には、外科手術の前に前記実施例に示したパラメータに
従って、オリゴヌクレオチド療法を提供することができる。本発明のオリゴヌク
レオチドの投与は、腫瘍退縮および／または腫瘍除去の機械的過程の中で細胞が
かく乱されるような外科的手術によって促されるであろう転移の予防といった恩
恵をもたらすことができる。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ノーザンブロッティング実験によって検出され１．９ｋｂ転写物と呼ばれるＲ
ＮＡをコードする１８０３塩基のヒトプロヒビチンｃＤＮＡのセンス鎖の配列（
５’→３’）を示す図である（配列番号１）。転写物のタンパク質コード領域は
、８６６位で終わる。歴史的に１．２ｋｂと呼ばれる転写物は１０２６位で終わ
る。したがって、１０２７位から１８０３位の配列は、より長い転写物に特有の
３’ＵＴＲである。１．２ｋｂ転写物の３’ＵＴＲと約７５塩基分重なり合う８
５２塩基の転写物は、１．９ｋｂ転写物（配列番号１）の９５２位に始まり１８
０３位で終わる。これは、抗増殖活性を有することが分かった最初の３’ＵＴＲ
特異的フラグメントであった（図２）。さらに今回、抗増殖活性が３’ＵＴＲの
最後の２３８塩基に局在していることが分かった（図３、配列番号３）。このサ
ブフラグメントは、より長い転写物に特有の３’ＵＴＲの一部に相当する。

【図２】 野生型プロヒビチン３’ＵＴＲの８５２塩基転写物をコードする領域のセンス
鎖（５’→３’）のＤＮＡ配列を示す図である（配列番号２）。

【図３】 ２３８塩基転写物（１．９ｋｂ野生型プロヒビチン３’ＵＴＲの３’末端）を
コードする領域のセンス鎖（５’→３’）のＤＮＡ配列を示す図である（配列番
号３）。ＰＣＲ生成物からＲＮＡを生成するために使用したＴ７プライマー配列
は、５’末端に下線で示す。ＰＣＲ生成物に含まれるＴ７プロモーターからのＲ
ＮＡの転写は、プロモーター末端のＧＧＧの最初のＧから始まる。これは、プロ
ヒビチン配列の２３８塩基および５’末端上に２つの追加Ｇを有するＲＮＡを生
成する。

【図４】 野生型ヒト（上部）およびラット（配列番号４）（下部）プロヒビチン遺伝子
の３’ＵＴＲの３’末端のアラインメントを示す図である。ウィスコンシン大学
ＧＣＧパッケージ中のＧＡＰプログラムにより決定され、７８％の同一性を示す
。

【図５】 野生型治療用ＲＮＡによって形成される推定二次構造を示す図である。このモ
デルは、ＭＦＯＬＤプログラムによって作成し、図解はＰＬＯＴＦＯＬＤプログ
ラムで作成した。両プログラムは、ウィスコンシン大学ＧＣＧパッケージを用い
て実行した。

【図６】 プロヒビチンＲＮＡの抗増殖性活性が３’ＵＴＲサブフラグメントに局在して
いることを示す図である。３’ＵＴＲの３’末端に対する活性をマップするのに
用いた転写物の概略図は、図下に示し、次のように符号化する：黒棒＝完全長、
１．９ｋｂ（図１）；縞棒＝開始部位およびプロヒビチンタンパク質の最初の４
０個のアミノ酸に対するコドンのない切断転写物；点棒＝切断転写物のアンチセ
ンス；交差斜線棒＝８５２塩基の３’ＵＴＲ特異的転写物（図２）；半斜線（灰
色）棒＝８５２塩基３’ＵＴＲの最初の２３８塩基；白棒＝３’ＵＴＲの３’末
端からの最後の２３８塩基（図３）。開始（ＡＵＧ）および停止（ＵＧＡ）コド
ンの位置を示す。報告値は、３つの別々の実験から算出された細胞周期のＳ期に
おける細胞の平均阻害パーセンテージ±ＳＥＭである。すべての実験で、指示さ
れたＲＮＡを正常ＨＤＦに微量注入した。

【図７】 変異したプロヒビチン３’ＵＴＲ転写物を正常ＨＤＦに微量注入することによ
る細胞周期の進行に対する効果を示す図である。各実験で用いた３’ＵＴＲ転写
物の概略図は図下に示し、次のように符号化する：黒棒＝野生型、８５２塩基転
写物；縦縞棒＝ＳＫ−ＢＲ−３の激しく変異した８４９塩基転写物；交差斜線棒
＝野生型３’ＵＴＲの３’末端、２３８塩基転写物；点棒＝ＭＣＦ７ ３’ＵＴ
Ｒ転写物の３’末端、２３８塩基転写物；白棒＝ＢＴ−２０ ３’ＵＴＲ転写物
の３’末端、２３８塩基転写物。「ｘ」の表示は、変異のおよその位置を示す。
報告値は、３つの別々の実験から算出された細胞周期のＳ期における細胞の平均
阻害パーセンテージ±ＳＥＭである。すべての実験で、指示されたＲＮＡを正常
ＨＤＦに微量注入した。負の値の棒は、細胞増殖のわずかな刺激を表す。

【図８】 野生型および突然変異した３’ＵＴＲ転写物を乳癌細胞系に微量注入すること
による細胞周期の進行に対する効果を示す図である。野生型（黒棒）または突然
変異した（白棒）転写物を様々な乳癌細胞系に微量注入した（図下に示す）。各
棒は、１つの実験（２００〜４００細胞を試験）について観察された細胞周期の
Ｓ期における細胞の阻害パーセンテージのレベルを示し、微量注入した転写物で
標識されている。負の値の棒は、細胞増殖のわずかな刺激を表す。

【図９】 ラットプロヒビチン３’ＵＴＲをコードする野生型および変異したＤＮＡ配列
の一部のアラインメント示す図である。野生型ラット配列（上部）は以前に報告
されているが（Ｎｕｅｌｌ他、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１１巻、１３７２
〜１３８１ページ、１９９１年）、変異した分子は、７，１２−ジメチルベンズ
（ａ）アントラセン（ＤＭＢＡ）誘発ラット乳癌組織からクローン化した。この
１００塩基領域に９個の変異があった。

【図１０】 実施例１における野生型ヒト２３８塩基３’ＵＴＲ ＲＮＡ（図３および配列
番号３）のｉｎ ｖｉｖｏでの注入の腫瘍増殖に対する効果を示す図である。棒
は腫瘍注入後３０日目の平均腫瘍サイズおよび標準偏差を示し、これは初回治療
２０日後に等しかった。治療群では、１０日目および１５日目に２回の投与量を
合わせて１０マイクログラムの２３８塩基プロヒビチン３’ＵＴＲ ＲＮＡを触
診可能な一次腫瘍に注入した。同時に、コントロール群を等張食塩水で治療した
。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により、値には有意差がある（ｐ≦０．０１）。

【図１１】 実施例２の治療群に対するプロヒビチン３’ＵＴＲ ＲＮＡの効果を示す図で
ある。４日間隔で測定した腫瘍体積を群毎に示す。黒丸＝食塩水コントロール；
黒四角＝３’ＵＴＲの５’末端コントロール；白四角＝低用量の野生型３’ＵＴ
Ｒの３’末端（注射１回あたりＲＮＡ１０マイクログラム）；および白丸＝高用
量の野生型３’ＵＴＲの３’末端（注射１回あたりＲＮＡ２０マイクログラム）
。標準偏差とともに平均値をプロットする。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年９月２０日（２０００．９．２０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 825 Ｎ．Ｅ． 13ｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｃｉｔｙ，Ｏｋｌａｈ ｏｍａ 73104，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔ ｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA03 CA11 4C076 AA19 CC27 4C084 AA13 NA14 ZB261 ZB262 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB26

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 プロヒビチン遺伝子の３’非翻訳領域の一部に由来すること
   を特徴とするオリゴヌクレオチド。
2. 【請求項２】 ＲＮＡを含むことを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌク
   レオチド。
3. 【請求項３】 前記ＲＮＡが前記領域の前記部分から転写されることを特徴
   とする請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
4. 【請求項４】 前記ＲＮＡが、前記領域の前記部分によってコードされる配
   列に従って合成的に製造されることを特徴とする請求項２に記載のオリゴヌクレ
   オチド。
5. 【請求項５】 前記領域の前記部分の配列を有する一本鎖ＤＮＡを含むこと
   を特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
6. 【請求項６】 前記ＤＮＡが前記領域の前記部分であることを特徴とする請
   求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
7. 【請求項７】 前記ＤＮＡが前記領域の前記部分を含む配列に従って合成的
   に製造されることを特徴とする請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
8. 【請求項８】 前記部分が配列番号１の約８６７位から１８０３位までのプ
   ロヒビチン遺伝子の全３’非翻訳領域を含むことを特徴とする請求項１から７の
   いずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
9. 【請求項９】 前記部分が配列番号１の約９５２位から１８０３位までを含
   むことを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド
   。
10. 【請求項１０】 前記部分が配列番号１の約１５６６位から１８０３位まで
    を含むことを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオ
    チド。
11. 【請求項１１】 抗腫瘍効果を得るための投与用に適合された薬剤であって
    、プロヒビチン遺伝子の３’非翻訳領域の一部に由来する増殖阻害量のオリゴヌ
    クレオチドを含み、前記薬剤が動物において増殖阻害活性を有することを特徴と
    する薬剤。
12. 【請求項１２】 前記部分が配列番号１の約８６７位から１８０３位までの
    プロヒビチン遺伝子の全３’非翻訳領域を含むことを特徴とする請求項１１に記
    載の薬剤。
13. 【請求項１３】 前記部分が配列番号１の約９５２位から１８０３位までを
    含むことを特徴とする請求項１１に記載の薬剤。
14. 【請求項１４】 前記部分が配列番号１の約１５６６位から１８０３位まで
    を含むことを特徴とする請求項１１に記載の薬剤。
15. 【請求項１５】 癌細胞の増殖を阻害する方法であって、癌細胞をプロヒビ
    チン遺伝子の３’非翻訳領域の一部に由来する増殖阻害量のオリゴヌクレオチド
    と接触させることにより前記癌細胞の増殖を阻害することを特徴とする方法。
16. 【請求項１６】 前記オリゴヌクレオチドが、請求項２、３または４のいず
    れか１項に記載のリボ核酸および請求項５、６、または７のいずれか１項に記載
    の一本鎖デオキシリボ核酸からなる群から選択されることを特徴とする請求項１
    ５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 癌細胞の増殖の阻害に使用するための薬剤組成物を製造す
    るために請求項１から１０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを使用す
    ることを特徴とする方法。
18. 【請求項１８】 配列番号１のＤＮＡ。
19. 【請求項１９】 配列番号２のＤＮＡ。
20. 【請求項２０】 約塩基２３から塩基２６０までの配列番号３のＤＮＡ。
21. 【請求項２１】 患者に送達するためのベクターをさらに含むことを特徴と
    する請求項１から１０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
22. 【請求項２２】 患者に送達するためのリポソームをさらに含むことを特徴
    とする請求項１から１０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
23. 【請求項２３】 請求項１から１０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオ
    チドとハイブリズすることを特徴とするオリゴヌクレオチド。