CN117844877A - 一种通过生物酶制备普瑞巴林的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种通过生物酶制备普瑞巴林的方法，属于药物合成技术领域，具体是以化合物（Ⅰ）为原料在复合生物酶A的作用下，生成普瑞巴林和化合物（Ⅲ）；经过超临界流体萃取设备分离、回收得到的化合物（Ⅲ）在复合异构酶的作用下，发生构型翻转生成化合物（IV）；化合物（IV）又在复合生物酶B的作用下生成普瑞巴林。本发明通过将生物酶和异构酶进行复配使用，以及通过超临界流体萃取，提升了产物的收率和对映体过量值。本发明的方法产物普瑞巴林光学纯度高、易于工业化生产，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于药物合成技术领域，具体涉及一种通过生物酶制备普瑞巴林的方法。
背景技术
普瑞巴林(Pregabalin)化学名为(3S)-(+)-3-氨甲基-5-甲基己酸，结构式为：。是上个世纪九十年代初期发现的一种用于治疗癫痫、神经性疼痛、焦虑和社交恐惧症的GABA(γ-氨基丁酸)类似物型药物。较新的研究表明其对某些慢性疼痛的具有较好的疗效，同时也被发现可以作为抗痉挛剂使用。
普瑞巴林常用化学合成方法是以异戊醛和氰乙酸烷基酯为起始原料，依次经过缩合反应、迈克尔加成反应、水解反应和环酰胺化反应等步骤获得3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸，然后再经过拆分和霍夫曼消去得到普瑞巴林。但该方法收率不高，废物排放量大。鉴于普瑞巴林良好的药物前景，因此进一步亟需提高普瑞巴林制备方法的转化率以及所得产物光学纯度。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过生物酶制备普瑞巴林的方法，所述方法的转化率高，所得产物普瑞巴林光学纯度高，本发明的方法易于工业化生产，具有良好的应用前景。
为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
一种通过生物酶制备普瑞巴林的方法，所述方法包括以下步骤：按质量份数计，
（1）将50份化合物（Ⅰ）、480-500份水、60-80份甲乙酮混合，调节体系pH值为9-10，搅拌升温至37℃，加入12-15份复合生物酶A，有氧条件下保温搅拌6-8h，过滤，得到反应液，将反应液加入到超临界流体萃取设备的萃取釜中，将超临界流体萃取设备的萃取釜的温度加热至40℃，导入超临界流体二氧化碳，调节流量为24-26kg/h，升压至32-34MPa，萃取4-6h，化合物（Ⅲ）随二氧化碳进入三级串联分离釜，将化合物（Ⅲ）水洗至中性，干燥，得到化合物（Ⅲ）；将萃取釜中剩余的液体调节至pH为中性，降温至7-9℃，过滤、干燥，得到化合物（Ⅱ）；
；
（2）将20份化合物（Ⅲ）和150-170份甲乙酮混合，搅拌升温至40℃，加入6-8份复合异构酶，有氧条件下保温搅拌12-14h；过滤，得到滤液A，将滤液A浓缩至1/4体积，加入70-80份水，降温至3-5℃，过滤、干燥后得到化合物（IV）；
；
（3）将15份化合物（IV）、230-250份水和70-90份甲乙酮混合，搅拌升温至40℃，调节体系pH值为10，加入4-6份复合生物酶B，有氧条件下保温搅拌6-8h；过滤，得到滤液B，将滤液B减压浓缩至1/2体积，调节pH至中性，降温至7-9℃，过滤、干燥，得到化合物（Ⅱ）；
。
进一步地，所述步骤（1）、步骤（2）和步骤（3）中过滤的方法均为：先用0.22μm的微滤膜过滤，再用30KD的超滤膜过滤。
进一步地，所述三级串联分离釜中，一级分离釜分离温度为36℃，分离压力为8MPa；二级分离釜分离温度为26℃，分离压力为4MPa；三级分离釜分离温度为46℃，分离压力为4MPa。
本发明对超临界流体萃取的设备不做特别的限定，超临界流体萃取的设备和方法请参见《超临界CO2萃取装置》(JB\T20136-2011)/中华人民共和国制药机械行业标准、《超临界流体萃取》/化学工业出版社等。
进一步地，所述步骤（1）中复合生物酶A为皱褶假丝酵母脂肪酶、疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶和米根霉复配。
进一步地，所述步骤（1）中复合生物酶A为质量比0.4-0.6:1:3-5的皱褶假丝酵母脂肪酶、疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶和米根霉复配，其中，皱褶假丝酵母脂肪酶活力值为700U/mg；疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶的活力值为100U/mg；米根霉的活力值为10U/mg。
现有技术中通过使用单一酶对原料进行酶解，但是产物的收率和光学纯度并不理想。尤其是本发明的体系的三个步骤的产率之间环环相扣，对最终的目标产物结果影响较大。发明人通过使用特定的复配的生物酶进行反应，改善了目标产物和化合物（Ⅲ）的产率和光学纯度。猜测是本发明的酶经过复配后对原料具有高度的选择性，选择性地打开环结构和生成特定的化合物（Ⅲ），产率更高，光学纯度更好。但是发明人发现使用复合生物酶反应后，使用传统的膜过滤，过滤效果并不理想。可能因为体系更加复杂，仅使用微滤膜过滤，生物酶可以被有效滤除，但是在酶解过程中，由于反应物本身纯度的问题以及反应过程中生物酶的一些反应，体系可能会产生一些杂质，这些杂质不能被微滤膜有效的过滤，影响后续的操作。本发明的体系中使用复合生物酶、复合异构酶酶解后，先用0.22μm的微滤膜过滤，再用30KD的超滤膜过滤，可以有效除去体系中的杂质，同时反应液使用超临界流体萃取，进一步改善了目标产物的收率和光学纯度。
进一步地，所述步骤（2）中复合异构酶为D-木糖异构酶、蔗糖异构酶和D-阿洛酮糖-3-差向异构酶复配。
进一步地，所述步骤（2）中复合异构酶为质量比1:1.3-1.5:1.8-2.2的D-木糖异构酶、蔗糖异构酶和D-阿洛酮糖-3-差向异构酶复配；其中，D-木糖异构酶活力值为100U/mg；蔗糖异构酶活力值为100U/mg；D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活力值为100U/mg。
进一步地，所述复合生物酶B为疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶和南极假丝酵母脂肪酶复配。
进一步地，所述复合生物酶B为质量比2-5:1:6-7的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶和南极假丝酵母脂肪酶复配；其中，疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶的活力值为100U/mg；洋葱假单胞菌脂肪酶的活力值为30U/mg；南极假丝酵母脂肪酶的活力值为10U/mg。
在通过超临界流体萃取得到化合物（Ⅲ），发明人试图在步骤（2）和（3）中使用单一酶进行反应，但是结果仍不理想。发明人通过使用特定的复配的复合生物酶B和复合异构酶进行反应，进一步改善了目标产物的产率和光学纯度。猜测是，化合物（Ⅲ）在本发明复合异构酶作用下，不对称选择性更高，而复合生物酶B对化合物（IV）的开环效果更好。发明人在研发过程中发现，本发明的体系中酶之间的复配并不是简单相加的效果，有的酶复配后效果反而不如单一酶效果好。
进一步地，所述步骤（1）中化合物（Ⅲ）的收率为47.5-48.2%，化合物（Ⅲ）对映体过量值为98.5-99.2%；化合物（Ⅱ）的收率46.4-47.6%，化合物（Ⅱ）对映体过量值为99.7-99.9%。
进一步地，所述步骤（2）中化合物（IV）的收率89.1-89.5%，化合物（IV）对映体过量值为99.2-99.5%。
进一步地，所述步骤（3）中化合物（Ⅱ）的收率94.3-96.7%，化合物（Ⅱ）对映体过量值为99.5-99.8%。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果为：
1、本发明提供了一种通过生物酶制备普瑞巴林的方法，所述方法的转化率高，所得产物普瑞巴林光学纯度高，本发明的方法易于工业化生产，具有良好的应用前景。
2、发明人通过使用特定的复配的生物酶进行反应，改善了目标产物和化合物（Ⅲ）的产率和光学纯度。本发明的体系中使用复合生物酶、复合异构酶酶解后，先用0.22μm的微滤膜过滤，再用30KD的超滤膜过滤，可以有效除去体系中的杂质，同时反应液使用超临界流体萃取，进一步改善了目标产物的收率和光学纯度。
3、发明人通过使用特定的复配的复合生物酶B和复合异构酶进行反应，进一步改善了目标产物的产率和光学纯度。猜测是，化合物（Ⅲ）在本发明复合异构酶作用下，不对称选择性更高，而复合生物酶B对化合物（IV）的开环效果更好。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中的原料购自以下厂家：
皱褶假丝酵母脂肪酶，活力值700U/mg。购自上海源叶生物科技有限公司。
疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶，活力值100U/mg。购自上海康朗生物科技有限公司。
米根霉，活力值10U/mg。购自广州伟伯科技有限公司。
D-木糖异构酶，活力值100U/mg。购自西安达尔闻生物科技有限公司。
蔗糖异构酶，活力值100U/mg。购自西安达尔闻生物科技有限公司。
D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，活力值100U/mg。购自嘉兴欣贝莱生物科技有限公司。
疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶，活力值100U/mg。购自上海康朗生物科技有限公司。
洋葱假单胞菌脂肪酶，活力值30U/mg。购自广州伟伯科技有限公司。
南极假丝酵母脂肪酶，活力值10U/mg。购自上海颖心实验室设备有限公司。
实施例1
本实施例提供了一种通过生物酶制备普瑞巴林的方法，所述方法包括以下步骤：按质量份数计，
（1）将50份化合物（Ⅰ）、490份水、70份甲乙酮混合，调节体系pH值为9.5，搅拌升温至37℃，加入13份复合生物酶A，有氧条件下保温搅拌7h，过滤，得到反应液，将反应液加入到超临界流体萃取设备的萃取釜中，将超临界流体萃取设备的萃取釜的温度加热至40℃，导入超临界流体二氧化碳，调节流量为25kg/h，升压至33MPa，萃取5h，化合物（Ⅲ）随二氧化碳进入三级串联分离釜，将化合物（Ⅲ）水洗至中性，干燥，得到化合物（Ⅲ）；将萃取釜中剩余的液体调节至pH为中性，降温至8℃，过滤、干燥，得到化合物（Ⅱ）；
；
化合物（Ⅲ）的收率为48.3%，化合物（Ⅲ）对映体过量值为99.2%；化合物（Ⅱ）的收率47.1%，化合物（Ⅱ）对映体过量值为99.8%；
（2）将20份化合物（Ⅲ）和160份甲乙酮混合，搅拌升温至40℃，加入7份复合异构酶，有氧条件下保温搅拌13h；过滤，得到滤液A，将滤液A浓缩至1/4体积，加入75份水，降温至4℃，过滤、干燥后得到化合物（IV）；
；
化合物（IV）的收率89.4%，化合物（IV）对映体过量值为99.3%。
（3）将15份化合物（IV）、240份水和80份甲乙酮混合，搅拌升温至40℃，调节体系pH值为10，加入5份复合生物酶B，有氧条件下保温搅拌7h；过滤，得到滤液B，将滤液B减压浓缩至1/2体积，调节pH至中性，降温至8℃，过滤、干燥，得到化合物（Ⅱ）；
；
所述步骤（3）中化合物（Ⅱ）的收率95.2%，化合物（Ⅱ）对映体过量值为99.7%。
所述步骤（1）、步骤（2）和步骤（3）中过滤的方法均为：先用0.22μm的微滤膜过滤，再用30KD的超滤膜过滤。
所述步骤（1）中所述复合生物酶A为质量比0.5:1:4的皱褶假丝酵母脂肪酶、疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶和米根霉复配。
所述步骤（2）中所述复合异构酶为质量比1:1.4:2的D-木糖异构酶、蔗糖异构酶和D-阿洛酮糖-3-差向异构酶复配。
所述步骤（3）中复合生物酶B为质量比4:1:7的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶和南极假丝酵母脂肪酶复配。
所述三级串联分离釜中，一级分离釜分离温度为36℃，分离压力为8MPa；二级分离釜分离温度为26℃，分离压力为4MPa；三级分离釜分离温度为46℃，分离压力为4MPa。
实施例2
本实施例提供了一种通过生物酶制备普瑞巴林的方法，所述方法包括以下步骤：按质量份数计，
（1）将50份化合物（Ⅰ）、480份水、60份甲乙酮混合，调节体系pH值为9，搅拌升温至37℃，加入12份复合生物酶A，有氧条件下保温搅拌6h，过滤，得到反应液，将反应液加入到超临界流体萃取设备的萃取釜中，将超临界流体萃取设备的萃取釜的温度加热至40℃，导入超临界流体二氧化碳，调节流量为24kg/h，升压至32MPa，萃取4h，化合物（Ⅲ）随二氧化碳进入三级串联分离釜，将化合物（Ⅲ）水洗至中性，干燥，得到化合物（Ⅲ）；将萃取釜中剩余的液体调节至pH为中性，降温至7℃，过滤、干燥，得到化合物（Ⅱ）；
；
化合物（Ⅲ）的收率为47.8%，化合物（Ⅲ）对映体过量值为98.8%；化合物（Ⅱ）的收率47.0%，化合物（Ⅱ）对映体过量值为99.7%；
（2）将20份化合物（Ⅲ）和150份甲乙酮混合，搅拌升温至40℃，加入6份复合异构酶，有氧条件下保温搅拌12h；过滤，得到滤液A，将滤液A浓缩至1/4体积，加入70份水，降温至3℃，过滤、干燥后得到化合物（IV）；
；
化合物（IV）的收率89.2%，化合物（IV）对映体过量值为99.3%。
（3）将15份化合物（IV）、230份水和70份甲乙酮混合，搅拌升温至40℃，调节体系pH值为10，加入4份复合生物酶B，有氧条件下保温搅拌6h；过滤，得到滤液B，将滤液B减压浓缩至1/2体积，调节pH至中性，降温至7℃，过滤、干燥，得到化合物（Ⅱ）；
；
所述步骤（3）中化合物（Ⅱ）的收率95.7%，化合物（Ⅱ）对映体过量值为99.6%。
所述步骤（1）、步骤（2）和步骤（3）中过滤的方法均为：先用0.22μm的微滤膜过滤，再用30KD的超滤膜过滤。
所述步骤（1）中所述复合生物酶A为质量比0.4:1:3的皱褶假丝酵母脂肪酶、疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶和米根霉复配。
所述步骤（2）中所述复合异构酶为质量比1:1.3:1.8的D-木糖异构酶、蔗糖异构酶和D-阿洛酮糖-3-差向异构酶复配。
所述步骤（3）中复合生物酶B为质量比2:1:6的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶和南极假丝酵母脂肪酶复配。
所述三级串联分离釜中，一级分离釜分离温度为36℃，分离压力为8MPa；二级分离釜分离温度为26℃，分离压力为4MPa；三级分离釜分离温度为46℃，分离压力为4MPa。
实施例3
本实施例提供了一种通过生物酶制备普瑞巴林的方法，所述方法包括以下步骤：按质量份数计，
（1）将50份化合物（Ⅰ）、500份水、80份甲乙酮混合，调节体系pH值为10，搅拌升温至37℃，加入15份复合生物酶A，有氧条件下保温搅拌8h，过滤，得到反应液，将反应液加入到超临界流体萃取设备的萃取釜中，将超临界流体萃取设备的萃取釜的温度加热至40℃，导入超临界流体二氧化碳，调节流量为26kg/h，升压至34MPa，萃取6h，化合物（Ⅲ）随二氧化碳进入三级串联分离釜，将化合物（Ⅲ）水洗至中性，干燥，得到化合物（Ⅲ）；将萃取釜中剩余的液体调节至pH为中性，降温至9℃，过滤、干燥，得到化合物（Ⅱ）；
；
化合物（Ⅲ）的收率为47.5%，化合物（Ⅲ）对映体过量值为99.1%；化合物（Ⅱ）的收率47.3%，化合物（Ⅱ）对映体过量值为99.8%；
（2）将20份化合物（Ⅲ）和170份甲乙酮混合，搅拌升温至40℃，加入8份复合异构酶，有氧条件下保温搅拌14h；过滤，得到滤液A，将滤液A浓缩至1/4体积，加入80份水，降温至5℃，过滤、干燥后得到化合物（IV）；
；
化合物（IV）的收率89. 3%，化合物（IV）对映体过量值为99.5%。
（3）将15份化合物（IV）、250份水和90份甲乙酮混合，搅拌升温至40℃，调节体系pH值为10，加入6份复合生物酶B，有氧条件下保温搅拌8h；过滤，得到滤液B，将滤液B减压浓缩至1/2体积，调节pH至中性，降温至9℃，过滤、干燥，得到化合物（Ⅱ）；
；
所述步骤（3）中化合物（Ⅱ）的收率96.3%，化合物（Ⅱ）对映体过量值为99.5%。
所述步骤（1）、步骤（2）和步骤（3）中过滤的方法均为：先用0.22μm的微滤膜过滤，再用30KD的超滤膜过滤。
所述步骤（1）中所述复合生物酶A为质量比0.6:1: 5的皱褶假丝酵母脂肪酶、疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶和米根霉复配。
所述步骤（2）中所述复合异构酶为质量比1: 1.5: 2.2的D-木糖异构酶、蔗糖异构酶和D-阿洛酮糖-3-差向异构酶复配。
所述步骤（3）中复合生物酶B为质量比5:1: 7的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶和南极假丝酵母脂肪酶复配。
所述三级串联分离釜中，一级分离釜分离温度为36℃，分离压力为8MPa；二级分离釜分离温度为26℃，分离压力为4MPa；三级分离釜分离温度为46℃，分离压力为4MPa。
对比例1
本对比例与实施例1的区别为：所述步骤（1）、步骤（2）和步骤（3）中过滤的方法均为：使用0.4μm的微滤膜过滤。
所述步骤（1）中化合物（Ⅲ）的收率为45.3%，化合物（Ⅲ）对映体过量值为98.6%；化合物（Ⅱ）的收率45.2%，化合物（Ⅱ）对映体过量值为99.8%；
所述步骤（2）中化合物（IV）的收率87.2%，化合物（IV）对映体过量值为99.2%。
所述步骤（3）中化合物（Ⅱ）的收率93.1%，化合物（Ⅱ）对映体过量值为99.6%。
对比例2
本对比例与实施例1的区别为：所述复合生物酶A替换为皱褶假丝酵母脂肪酶；所述复合异构酶替换为D-木糖异构酶；所述复合生物酶B替换为疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶。
所述步骤（1）中化合物（Ⅲ）的收率为44.7%，化合物（Ⅲ）对映体过量值为96.1%；化合物（Ⅱ）的收率44.2%，化合物（Ⅱ）对映体过量值为97.3%；
所述步骤（2）中化合物（IV）的收率86.8%，化合物（IV）对映体过量值为97.3%。
所述步骤（3）中化合物（Ⅱ）的收率93.2%，化合物（Ⅱ）对映体过量值为97.9%。
对比例3
本对比例与实施例1的区别为：所述步骤（1）中复合生物酶A为质量比1:1:1的皱褶假丝酵母脂肪酶、疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶和米根霉复配，其中，皱褶假丝酵母脂肪酶活力值为700U/mg；疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶的活力值为100U/mg；米根霉的活力值为10U/mg。
所述步骤（2）中复合异构酶为质量比1:1:1的D-木糖异构酶、蔗糖异构酶和D-阿洛酮糖-3-差向异构酶复配；其中，D-木糖异构酶活力值为100U/mg；蔗糖异构酶活力值为100U/mg；D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活力值为100U/mg。
所述复合生物酶B为质量比1:1:1的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶和南极假丝酵母脂肪酶复配；其中，疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶的活力值为100U/mg；洋葱假单胞菌脂肪酶的活力值为30U/mg；南极假丝酵母脂肪酶的活力值为10U/mg。
所述步骤（1）中化合物（Ⅲ）的收率为46.2%，化合物（Ⅲ）对映体过量值为98.1%；化合物（Ⅱ）的收率45.7%，化合物（Ⅱ）对映体过量值为99.0%；
所述步骤（2）中化合物（IV）的收率88.5%，化合物（IV）对映体过量值为99.1%。
所述步骤（3）中化合物（Ⅱ）的收率93.1%，化合物（Ⅱ）对映体过量值为98.4%。
对比例4
本对比例与实施例1的区别为：所述步骤（1）中复合生物酶A为质量比1:1:1的粘红酵母酶、黑曲霉和米根霉复配，其中，粘红酵母酶活力值为700U/mg（购自上海康朗生物科技有限公司）；黑曲霉的活力值为100U/mg（购自上海康朗生物科技有限公司）；米根霉的活力值为10U/mg。
所述步骤（2）中复合异构酶为质量比1:1:1的、D-塔格糖3-差向异构酶、蔗糖异构酶和纤维二糖差向异构酶复配；其中，D-塔格糖3-差向异构酶活力值为100U/mg（购自西安达尔闻生物科技有限公司）；蔗糖异构酶活力值为100U/mg；纤维二糖差向异构酶活力值为100U/mg（购自西安达尔闻生物科技有限公司）。
所述复合生物酶B为质量比1:1:1的粘红酵母酶、黑曲霉和米根霉复配，其中，粘红酵母酶活力值为700U/mg（购自上海康朗生物科技有限公司）；黑曲霉的活力值为100U/mg（购自上海康朗生物科技有限公司）；米根霉的活力值为10U/mg。
所述步骤（1）中化合物（Ⅲ）的收率为44.0%，化合物（Ⅲ）对映体过量值为95.2%；化合物（Ⅱ）的收率42.9%，化合物（Ⅱ）对映体过量值为96.7%；
所述步骤（2）中化合物（IV）的收率84.8%，化合物（IV）对映体过量值为97.6%。
所述步骤（3）中化合物（Ⅱ）的收率92.2%，化合物（Ⅱ）对映体过量值为96.4%。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种通过生物酶制备普瑞巴林的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：按质量份数计，
（1）将50份化合物（Ⅰ）、480-500份水、60-80份甲乙酮混合，调节体系pH值为9-10，搅拌升温至37℃，加入12-15份复合生物酶A，有氧条件下保温搅拌6-8h，过滤，得到反应液，将反应液加入到超临界流体萃取设备的萃取釜中，将超临界流体萃取设备的萃取釜的温度加热至40℃，导入超临界流体二氧化碳，调节流量为24-26kg/h，升压至32-34MPa，萃取4-6h，化合物（Ⅲ）随二氧化碳进入三级串联分离釜，将化合物（Ⅲ）水洗至中性，干燥，得到化合物（Ⅲ）；将萃取釜中剩余的液体调节至pH为中性，降温至7-9℃，过滤、干燥，得到化合物（Ⅱ）；
；
（2）将20份化合物（Ⅲ）和150-170份甲乙酮混合，搅拌升温至40℃，加入6-8份复合异构酶，有氧条件下保温搅拌12-14h；过滤，得到滤液A，将滤液A浓缩至1/4体积，加入70-80份水，降温至3-5℃，过滤、干燥后得到化合物（IV）；
；
（3）将15份化合物（IV）、230-250份水和70-90份甲乙酮混合，搅拌升温至40℃，调节体系pH值为10，加入4-6份复合生物酶B，有氧条件下保温搅拌6-8h；过滤，得到滤液B，将滤液B减压浓缩至1/2体积，调节pH至中性，降温至7-9℃，过滤、干燥，得到化合物（Ⅱ）；
。
2.根据权利要求1所述的一种通过生物酶制备普瑞巴林的方法，其特征在于，所述步骤（1）、步骤（2）和步骤（3）中过滤的方法均为：先用微滤膜过滤，再用超滤膜过滤。
3.根据权利要求1所述的一种通过生物酶制备普瑞巴林的方法，其特征在于，所述步骤（1）中复合生物酶A为皱褶假丝酵母脂肪酶、疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶和米根霉复配。
4.根据权利要求3所述的一种通过生物酶制备普瑞巴林的方法，其特征在于，所述步骤（1）中复合生物酶A为质量比0.4-0.6:1:3-5的皱褶假丝酵母脂肪酶、疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶和米根霉复配，其中，皱褶假丝酵母脂肪酶活力值为700U/mg；疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶的活力值为100U/mg；米根霉的活力值为10U/mg。
5.根据权利要求1所述的一种通过生物酶制备普瑞巴林的方法，其特征在于，所述步骤（2）中复合异构酶为D-木糖异构酶、蔗糖异构酶和D-阿洛酮糖-3-差向异构酶复配。
6.根据权利要求5所述的一种通过生物酶制备普瑞巴林的方法，其特征在于，所述步骤（2）中复合异构酶为质量比1:1.3-1.5:1.8-2.2的D-木糖异构酶、蔗糖异构酶和D-阿洛酮糖-3-差向异构酶复配；其中，D-木糖异构酶活力值为100U/mg；蔗糖异构酶活力值为100U/mg；D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活力值为100U/mg。
7.根据权利要求1所述的一种通过生物酶制备普瑞巴林的方法，其特征在于，所述复合生物酶B为疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶和南极假丝酵母脂肪酶复配。
8.根据权利要求7所述的一种通过生物酶制备普瑞巴林的方法，其特征在于，所述复合生物酶B为质量比2-5:1:6-7的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶和南极假丝酵母脂肪酶复配；其中，疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶的活力值为100U/mg；洋葱假单胞菌脂肪酶的活力值为30U/mg；南极假丝酵母脂肪酶的活力值为10U/mg。
9.根据权利要求1所述的一种通过生物酶制备普瑞巴林的方法，其特征在于，所述三级串联分离釜中，一级分离釜分离温度为36℃，分离压力为8MPa；二级分离釜分离温度为26℃，分离压力为4MPa；三级分离釜分离温度为46℃，分离压力为4MPa。
10.根据权利要求2所述的一种通过生物酶制备普瑞巴林的方法，其特征在于，所述步骤（1）、步骤（2）和步骤（3）中过滤的方法均为：先用0.22μm的微滤膜过滤，再用30KD的超滤膜过滤。
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