CN117843982A - 一类含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚（β-氨基酯）及其合成方法和mRNA递送应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β‑氨基酯)及其制备方法和mRNA递送应用，属于生物医学材料技术领域。本发明公开的一类含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β‑氨基酯)是由高度支化聚(β‑氨基酯)经过胆固醇和磷酸后修饰得到的，有效地结合了聚(β‑氨基酯)、胆固醇和磷酸基团，在HeLa细胞中可实现高效mRNA递送。本发明含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β‑氨基酯)合成方法简单、结构与性能易于调控，在mRNA药物递送方面具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及一类含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)及其合成方法和mRNA递送应用。
背景技术
聚(β-氨基酯)由于其合成使用的商业化单体种类多、合成过程相对简单、方便调控聚合物的结构与性能、以及可降解等优点被广泛地运用在药物递送领域。然而，聚(β-氨基酯)作为一种阳离子聚合物存在不耐血清、细胞毒性强、体内递送效率低等缺点限制了其临床应用前景。
目前，脂质纳米技术递送(LNP)技术已被成功用于制备mRNA新型冠状病毒疫苗，但受限于这种小分子自主装的缺陷，该疫苗的储存温度极为苛刻。因此，开发出一种兼具聚合物的大分子链结构和脂质小分子结构优势的递送载体是解决上述问题的有效方法之一。胆固醇和两性离子对在降低材料毒性、提高生物相容性、稳定性和递送效率方面具有显著的优势，已被用于合成不同功能的生物材料。但是如何制备含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)和其mRNA递送应用却鲜有报道。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一类含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)及其合成方法和mRNA递送应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一类含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)，其结构式如下所示：
其中，R1为下列结构式中的任意一种：
R2为下列结构式中的任意一种：
式中，m＝5～50，n＝4～16。
本发明还公开了一类含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)的合成方法，包括以下步骤：
1)将丙烯酸酯类单体和小分子胺单体通过迈克加成反应制备得到末端带双键的高度支化聚(β-氨基酯)；
2)以含氨基的封端单体作为封端剂，对末端带双键的高度支化聚(β-氨基酯)进行功能化封端，得到高度支化聚(β-氨基酯)；
3)添加N-(2-溴乙基)氨基甲酰基胆固醇和烷基化二氧磷烷氧化物对高度支化聚(β-氨基酯)进行后修饰，得到一类含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)。
优选地，步骤1)中，所述丙烯酸酯类单体和小分子胺单体的反应摩尔比为(1-2)：1，迈克加成反应是在50-120℃下反应12-48h；
其中，所述丙烯酸酯类单体由二丙烯酸酯类单体和三丙烯酸酯类单体组成，二丙烯酸酯类单体和三丙烯酸酯类单体的反应摩尔比为(9：1)-(3：7)。
进一步优选地，所述二丙烯酸酯类单体为如下结构中的一种：
所述三丙烯酸酯类单体为如下结构中的一种：
进一步优选地，所述小分子胺类单体为如下结构中的一种或多种：
优选地，步骤2)中，含氨基的封端单体与丙烯酸酯类单体的摩尔比为(0.6-4)：1；功能化封端反应温度为25℃，反应时间为24～48h。
进一步优选地，含氨基的封端单体为如下结构中的一种：
优选地，步骤3)中，后修饰的高度支化聚(β-氨基酯)反应浓度为200mg/mL，在70℃下反应3～5天。
优选地，步骤3)中，所用N-(2-溴乙基)氨基甲酰基胆固醇为如下结构：
所用烷基化二氧磷烷氧化物为如下结构中的一种：
本发明还公开了一类含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)在制备mRNA药物递送载体中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一类结构新颖的含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)，通过使用胆固醇和磷酸修饰高度支化聚(β-氨基酯)能够有效地调控聚合物的组成、结构和性能，从而制备出毒性低、生物相容性高、抗血清强的递送材料。这是一类全新生物材料，由于其组成、结构和性能易于调节，将丰富该类聚合物的种类，扩大了该类聚合物的潜在应用领域。
本发明还公开了上述含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)的合成方法，通过丙烯酸酯类单体和小分子胺单体之间的迈克尔加成反应制备出带乙烯基的高度支化聚(β-氨基酯)；然后通过氨基单体进行有效封端，进一步得到末端功能化的高度支化聚(β-氨基酯)；最后使用N-(2-溴乙基)氨基甲酰基胆固醇和烷基化二氧磷烷氧化物对得到的聚合物进行后修饰，从而制备出含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)。本发明公开的上述制备方法反应条件温和、成本便宜、能够快速合成不同分子量、结构、组成和性能的该类聚合物，具有重要的应用价值。此外，该方法为聚(β-氨基酯)阳离子聚合物的改性提供了一条新途径，丰富了该类聚合物的种类。
本发明还公开了上述含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)在制备mRNA药物递送载体中的用途，由于其具有两性离子对，能够降低材料的毒性和提高其在血清中的稳定性；胆固醇能够提高材料的生物相容性和增加其与细胞膜的融合性；同时，主链肽键结构，具有良好的生物降解性能；可离子化或带正电的氨基能够有效的压缩带负电的mRNA，都将共同提高该类聚合物的mRNA递送能力。该类聚合物已在体外细胞实验中验证了其递送mRNA的有效性和适用性，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)合成示意图；
图2为实施例1中含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)的GPC谱图；
图3为实施例1中含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)的1H NMR谱图；
图4为实施例1中含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)与mRNA所形成复合物的TEM微观形貌；
图5为实施例1中含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)与mRNA所形成复合物的粒径；
图6为实施例1中含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)与mRNA所形成复合物的电位；
图7为实施例1中含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)在HeLa细胞中转染编码绿色荧光蛋白mRNA后细胞的荧光照片；
图8为实施例1中含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)在HeLa细胞中转染后的细胞活性；
图9为实施例2中含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)的GPC谱图；
图10为实施例2中含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)的1HNMR谱图；
图11为实施例2中含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)在HeLa细胞中转染编码绿色荧光蛋白mRNA后细胞的荧光照片；
图12为实施例2中含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)在HeLa细胞中转染后的细胞活性；
图13为实施例3中含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)的GPC谱图；
图14为实施例3中含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)的1HNMR谱图；
图15为实施例3中含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)在HeLa细胞中转染编码绿色荧光蛋白mRNA后细胞的荧光照片；
图16为实施例3中含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)在HeLa细胞中转染后的细胞活性；
图17为本发明的含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)的结构式。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)的制备方法，合成路线，参见图1，包括以下步骤：
步骤一、将一定量的丙烯酸酯类单体和小分子胺单体加入含二甲基亚砜的烧瓶中，丙烯酸酯单体和小分子胺的总浓度为100-500mg/mL，丙烯酸酯类单体和小分子胺单体的反应摩尔比为(1-2)：1；其中二丙烯酸酯单体：三丙烯酸酯单体＝(9：1)-(3：7)；在50-120℃下反应12-48h，在反应过程中使用凝胶渗透色谱监测聚合物分子量，当聚合物的分子量到达4000-35000Da，终止反应；
步骤二、将一定量的封端剂和二甲基亚砜加入到反应瓶中，在25℃下反应24～48h，封端剂与丙烯酸酯类单体的摩尔比为(0.6-4)：1，使用沉淀法对产物进行提纯，真空干燥，得到高度支化聚(β-氨基酯)；
步骤三、将得到的高度支化聚(β-氨基酯)溶解在氯仿和乙腈的混合溶液中，浓度为200mg/mL，然后添加一定量的N-(2-溴乙基)氨基甲酰基胆固醇和烷基化二氧磷烷氧化物对高度支化聚(β-氨基酯)，在70℃下反应3-5天，得到一类含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)。
将本发明制得的含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)用于mRNA的递送，包括以下步骤：
1)细胞培养：HeLa细胞在标准培养条件下进行培养，按照0.5*104～2.0*104个细胞/孔的密度接种在96孔板中，培养24h后，进行换液；
2)将含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)与含编码绿色荧光蛋白的mRNA溶液混合均匀，静置孵育15～30分钟，然后转移至96孔板中进行转染，其中聚合物：mRNA质量比＝(10～100)：1，每孔mRNA质量为25～100ng；
3)转染24h后，在倒置荧光显微镜下对转染的细胞进行观察和拍照。
实施例1
丙烯酸酯类单体(双酚A乙氧基化物二丙烯酸酯，EO/phenol＝1.5：三羟甲基丙烷三丙烯酸酯投料摩尔比为＝7：1，)和小分子胺类单体(2-氨乙基吗啉：葵胺投料摩尔比为5：3)的投料摩尔比为1.2：1，体系反应物料在二甲基亚砜中的总浓度为350mg/mL。在90℃下反应23h；然后加入丙烯酸酯类单体摩尔用量0.8倍的4-吗啉丙胺，并在25℃下反应24h；提纯干燥后得到的高度支化聚(β-氨基酯)分子量为25000Da，分子量分布为2.7。将100mg聚合物重新溶解在氯仿和乙腈的混合溶液(1/1,v/v)中，浓度为200mg/mL，然后添加16.1mg的N-(2-溴乙基)氨基甲酰基胆固醇和10.5mg的2-(十二氧基)-1,3,2-二氧磷烷2-氧化物到溶液中，在70℃下反应5天，得到一种含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)，结构式如下：
本实施例制备得到的含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)的GPC曲线如图2所示。本实施例制备得到的含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)的1H NMR谱图如图3所示。
将本实施例制备的含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)在细胞HeLa细胞中进行mRNA递送实验。将HeLa细胞以每孔10000个接种在96孔板里培养24h后，更换新鲜的培养基。分别将聚合物和mRNA稀释在柠檬酸钠缓冲溶液中，以聚合物与mRNA质量比20：1均匀混合，静止孵育30分钟形成复合纳米颗粒，然后转移至96孔板中进行转染，其中每孔mRNA用量为25ng。纳米颗粒微观形貌如图4所示，粒径如图5所示，电位如图6所示。聚合物在HeLa细胞中的mRNA递送效率如图7所示，转染后细胞活性如图8所示。
实施例2
丙烯酸酯类单体(1,1'-异亚丙基双(对亚苯氧基)二-2-丙醇二丙烯酚酯：三羟甲基丙烷三丙烯酸酯投料摩尔比为＝5：1，)和小分子胺类单体(5-氨基-1-戊醇：正辛胺投料摩尔比为1：1)的投料摩尔比为1.1：1，体系反应物料在二甲基亚砜中的浓度为300mg/mL。在90℃下反应18h；然后加入丙烯酸酯类单体摩尔用量1.2倍的1,11-二氨基-3,6,9-三氧杂十一烷，并在25℃下反应36h；提纯干燥后得到的高度支化聚(β-氨基酯)分子量为15000Da，分子量分布为2.4。将100mg聚合物重新溶解在氯仿和乙腈的混合溶液(1/1,v/v)中，浓度为200mg/mL，然后添加24.2mg的N-(2-溴乙基)氨基甲酰基胆固醇和7.1mg的2-(己氧基)-1,3,2-二氧磷烷2-氧化物到溶液中，在70℃下反应5天，得到一种含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)，结构式如下：
本实施例制备得到的含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)的GPC曲线如图9所示。本实施例制备得到的含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)的1H NMR谱图如图10所示。
将本实施例制备的含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)在细胞HeLa细胞中进行mRNA递送实验。将HeLa细胞以每孔10000个接种在96孔板里培养24h后，更换新鲜的培养基。分别将聚合物和mRNA稀释在柠檬酸钠缓冲溶液中，以聚合物与mRNA质量比30：1均匀混合，静止孵育30分钟形成复合纳米颗粒，然后转移至96孔板中进行转染，其中每孔mRNA用量为25ng。聚合物在HeLa细胞中的mRNA递送效率如图11所示，转染后细胞活性如图12所示。
实施例3
丙烯酸酯类单体(1,4-丁二醇二丙烯酸酯：季戊四醇三丙烯酸酯投料摩尔比为＝4：1，)和小分子胺类单体(1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪：正辛胺投料摩尔比为2：1)的投料摩尔比为1.3：1，体系反应物料在二甲基亚砜中的浓度为250mg/mL。在80℃下反应13h；然后加入丙烯酸酯类单体摩尔用量0.8倍的乙二胺，并在25℃下反应24h；提纯干燥后得到的高度支化聚(β-氨基酯)分子量为26000Da，分子量分布为2.6。将100mg聚合物重新溶解在氯仿和乙腈的混合溶液(1/1,v/v)中，浓度为200mg/mL，然后添加20.6mg的N-(2-溴乙基)氨基甲酰基胆固醇和14.7mg的2-(十四氧基)-1,3,2-二氧磷烷2-氧化物到溶液中，在70℃下反应4天，得到一种含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)，结构式如下：
本实施例制备得到的含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)的GPC曲线如图13所示。本实施例制备得到的含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)的1H NMR谱图如图14所示。
将本实施例制备的含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)在细胞HeLa细胞中进行mRNA递送实验。将HeLa细胞以每孔10000个接种在96孔板里培养24h后，更换新鲜的培养基。分别将聚合物和mRNA稀释在柠檬酸钠缓冲溶液中，以聚合物与mRNA质量比60：1均匀混合，静止孵育30分钟形成复合纳米颗粒，然后转移至96孔板中进行转染，其中每孔mRNA用量为25ng。聚合物在HeLa细胞中的mRNA递送效率如图15所示，转染后细胞活性如图16所示。
综上所述，本发明选择迈克尔加成法，该方法反应条件温和、单体适用范围广，其合成的聚合物组成和结构易于调控等优势而被广泛应用于聚合物的制备。首先，通过一锅法制备出高度支化聚(β-氨基酯)，调控其组成与性能。接着通过后化学修饰的方法合成含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)。这类组合合成的方法简单高效，通过使用不同的商业化单体，制备出不同分子量、结构、组成与性能的含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)，其在mRNA递送领域具有巨大的应用潜力。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (10)
1.一类含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)，其特征在于，其结构式如下所示：
其中，R1为下列结构式中的任意一种：
R2为下列结构式中的任意一种：
式中，m＝5～50，n＝4～16。
2.权利要求1所述的一类含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将丙烯酸酯类单体和小分子胺单体通过迈克加成反应制备得到末端带双键的高度支化聚(β-氨基酯)；
2)以含氨基的封端单体作为封端剂，对末端带双键的高度支化聚(β-氨基酯)进行功能化封端，得到高度支化聚(β-氨基酯)；
3)添加N-(2-溴乙基)氨基甲酰基胆固醇和烷基化二氧磷烷氧化物对高度支化聚(β-氨基酯)进行后修饰，得到一类含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)。
3.根据权利要求2所述的一类含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)的合成方法，其特征在于，步骤1)中，所述丙烯酸酯类单体和小分子胺单体的反应摩尔比为(1-2)：1，迈克加成反应是在50-120℃下反应12-48h；
其中，所述丙烯酸酯类单体由二丙烯酸酯类单体和三丙烯酸酯类单体组成，二丙烯酸酯类单体和三丙烯酸酯类单体的反应摩尔比为(9：1)-(3：7)。
4.根据权利要求3所述的一类含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)的合成方法，其特征在于，所述二丙烯酸酯类单体为如下结构中的一种：
所述三丙烯酸酯类单体为如下结构中的一种：
5.根据权利要求3所述的一类含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)的合成方法，其特征在于，所述小分子胺类单体为如下结构中的一种或多种：
6.根据权利要求2所述的一类含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)的合成方法，其特征在于，步骤2)中，含氨基的封端单体与丙烯酸酯类单体的摩尔比为(0.6-4)：1；功能化封端反应温度为25℃，反应时间为24～48h。
7.根据权利要求6所述的一类含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)的合成方法，其特征在于，含氨基的封端单体为如下结构中的一种：
8.根据权利要求2所述的一类含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)的合成方法，其特征在于，步骤3)中，后修饰的高度支化聚(β-氨基酯)反应浓度为200mg/mL，在70℃下反应3～5天。
9.根据权利要求2所述的一类含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)的合成方法，其特征在于，步骤3)中，所用N-(2-溴乙基)氨基甲酰基胆固醇为如下结构：
所用烷基化二氧磷烷氧化物为如下结构中的一种：
10.权利要求1所述的一类含胆固醇和磷酸修饰的高度支化聚(β-氨基酯)在制备mRNA药物递送载体中的应用。
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