CN114106348B - 苯硼酸修饰的胞内可降解超支化聚(β-氨基酯)及其制备方法和蛋白递送应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了苯硼酸修饰的胞内可降解超支化聚(β‑氨基酯)及其制备方法和蛋白递送应用,属于生物医用材料领域。采用的方案为:通过丙烯酸酯类单体(三丙烯酸酯类单体、四丙烯酸酯类单体等)和小分子胺,以迈克尔加成策略制备出超支化聚(β‑氨基酯);然后将超支化聚(β‑氨基酯)使用含苯硼酸基团的封端剂进行封端制备出苯硼酸修饰的功能性超支化聚(β‑氨基酯),再通过核磁确定产物结果。该制备方法简单高效,所用原料便宜易得,合成路径简单很好的降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域,具体涉及一种苯硼酸修饰的胞内可降解超支化聚(β-氨基酯)及其制备方法和蛋白递送应用。
背景技术
基因疗法是使用功能性的基因作为药物通过一定的手段转移至特定的细胞,从而去替换细胞中的错误基因促进功能蛋白质的合成或静默病变基因,来治疗一些遗传性缺陷和获得性疾病。由于这种方式是直接进行遗传物质的改变,而持续的基因表达会引起脱靶效应、应激反应和致癌作用等。研究人员发现将功能性基因表达的蛋白质直接胞质递送进入细胞可有效减少脱靶效应、增强特异性并且瞬时调控细胞功能等,避免了基因递送的局限性,从而为各种疾病的治疗提供了一种新的策略。而且与传统的化学药物相比,蛋白质治疗具有更高的特异性和更低的不良反应。
尽管蛋白质药物应用前景广泛,但是蛋白质的胞质递送过程仍面临严峻的问题。蛋白质的胞质递送过程主要包括细胞外与细胞内屏障,细胞外屏障是所递送蛋白的体外循环与细胞融合,细胞内屏障是胞内蛋白的释放和降解。由于细胞膜表面的电荷会排斥蛋白质的内吞作用,导致蛋白质无法直接有效地穿过细胞膜,而未及时进入细胞发挥作用的蛋白质容易被酶降解,这极大的限制了蛋白质作为药物的发展。因此需要采用一定的递送策略去促进蛋白质递送。非病毒载体由于合成工艺简单、结构可控、性能易于调节、安全性高、可以大规模合成已经成为最具潜力的递送材料。目前,相对较低的蛋白递送效率是限制非病毒载体向临床应用转化的核心瓶颈之一。
研究表明,在阳离子树枝状聚合物表面接枝功能性基团包裹蛋白质能够实现有效的蛋白递送,但是这种递送体系也存在极大的缺点。其一是树枝状聚合物合成困难;其二是树枝状聚合物难以降解,不能有效在胞内释放蛋白质,会产生极大的生物毒性。这些极大地限制了其临床应用和大规模生产制备。
发明内容
本发明的目的在于提供一种苯硼酸修饰的胞内可降解超支化聚(β-氨基酯) 及其制备方法和蛋白递送应用,能够解决树枝状聚合物降解困难,无法在胞内有效释放蛋白质以及具体生物毒性的技术缺陷。
为了达到上述目的,本发明采用以下技术方案予以实现:
本发明公开了一种苯硼酸修饰的胞内可降解超支化聚(β-氨基酯),其结构式如下:
其中,n=5-200。
本发明还公开了上述的苯硼酸修饰的胞内可降解超支化聚(β-氨基酯)的合成方法,包括以下步骤:
1)将丙烯酸酯类单体和小分子胺单体通过迈克加成反应制备得的超支化聚 (β-氨基酯);
2)以含苯硼酸单体作为封端剂,对超支化聚(β-氨基酯)进行功能化封端,制得苯硼酸修饰的胞内可降解超支化聚(β-氨基酯)。
优选地,步骤1)中,所述丙烯酸酯类单体包括三丙烯酸酯类单体和四丙烯酸酯类单体;丙烯酸酯类单体和小分子胺单体的反应摩尔比为(0.2-1.5):1。
优选地,步骤1)中,迈克加成反应是在60~120℃下反应3~120h。
优选地,步骤2)中,含苯硼酸单体包括含有胺基与苯硼酸基团的单体、含有双键与苯硼酸基团的单体和含其他官能团与苯硼酸基团的单体;所述含苯硼酸单体与丙烯酸酯类单体的摩尔比为(0.5-15):1。
优选地,步骤2)中,功能化封端反应温度为25℃,反应时间为48h。
更进一步优选地,所述丙烯酸酯类单体包括如下结构中的一种:
更进一步优选地,所述小分子胺类单体包括如下结构中的一种:
更进一步优选地,所述含苯硼酸单体为如下结构中的一种:
本发明还公开了上述的苯硼酸修饰的胞内可降解超支化聚(β-氨基酯)在制备蛋白药物递送载体中的应用。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明公开了一种功能性超支化聚(β-氨基酯),使用苯硼酸基团作为功能性基团,是一类结构全新的功能性超支化聚合物,具有较高的蛋白递送效率和细胞活性。与目前本领域技术中主要采用的商业化蛋白递送试剂PULSin相比,本发明公开的功能性超支化聚(β-氨基酯)具有较高的递送效率,毒性低,更具临床潜力。
进一步地,本发明使用的试剂包括商业化丙烯酸酯类单体(三丙烯酸酯类单体、四丙烯酸酯类单体等)、小分子有机胺,功能性苯硼酸基团单体,通过使用丙烯酸酯类单体(三丙烯酸酯类单体、四丙烯酸酯类单体等)和小分子胺,以迈克尔加成策略制备出超支化聚(β-氨基酯),通过凝胶渗透色谱监测聚合物分子量,分子量控制在3-50kDa。然后将上述产品使用含苯硼酸基团的封端剂进行封端制备出苯硼酸修饰的功能性的超支化聚(β-氨基酯),再通过核磁确定产物结构。本发明公开的上述制备方法,以低成本、合成路径简单的制备方法得到苯硼酸修饰的功能性超支化聚(β-氨基酯)。
本发明公开的上述功能性超支化聚(β-氨基酯),由于其主链丙烯酸酯类单体(三丙烯酸酯类单体、四丙烯酸酯类单体等)和小分子胺以及功能化封端剂组成,在细胞外具有好的蛋白包裹效果,在哺乳动物细胞中验证了发明的准确性和适用性,是一类全新结构的载体,因此能够作为高递送效率低细胞毒性的蛋白递送载体被广泛应用。
附图说明
图1为苯硼酸修饰的胞内可降解超支化聚(β-氨基酯)合成示意图;
图2为实施例1制得的苯硼酸修饰的胞内可降解超支化聚(β-氨基酯)的反应流程图;
图3为实施例1制得的苯硼酸修饰的胞内可降解超支化聚(β-氨基酯)在 25℃时的物理相态示意图;
图4为实施例1制得的苯硼酸修饰的胞内可降解超支化聚(β-氨基酯)的1H NMR谱图;
图5为实施例1制得的苯硼酸修饰的胞内可降解超支化聚(β-氨基酯)纯化后凝胶渗透色谱(GPC)曲线;
图6为实施例2制得的苯硼酸修饰的胞内可降解超支化聚(β-氨基酯)的合成流程图;
图7为实施例2制得的苯硼酸修饰的胞内可降解超支化聚(β-氨基酯)在 25℃时的物理相态示意图;
图8为实施例2制得的苯硼酸修饰的胞内可降解超支化聚(β-氨基酯)的1H NMR谱图;
图9为实施例2制得的苯硼酸修饰的胞内可降解超支化聚(β-氨基酯)纯化后凝胶渗透色谱(GPC)曲线;
图10为BSA蛋白包裹前后荧光强度变化结果图;其中,(a)为蛋白浓度为100mg/ml时孵育时间对包裹效率的影响结果;(b)为蛋白浓度为100mg/ml 时孵育10min并将原液进行稀释对包裹效率的影响结果;(c)为蛋白浓度为 100mg/ml时孵育20min并将原液进行稀释对包裹效率的影响结果;(d)为蛋白浓度为125mg/ml时孵育时间对包裹效率的影响结果;(e)为蛋白浓度为 125mg/ml时孵育10min并将原液进行稀释对包裹效率的影响结果;(f)为蛋白浓度为125mg/ml时孵育20min并将原液进行稀释对包裹效率的影响结果;
图11a为HeLa细胞进行蛋白递送的明场照片;
图11b为HeLa细胞进行蛋白递送的荧光显微镜照片;
图11c为HepG2细胞进行蛋白递送的明场照片;
图11d为HepG2细胞进行蛋白递送的荧光显微镜照片。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是,本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象,而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换,以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外,术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形,意图在于覆盖不排他的包含,例如,包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元,而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述:
参见图1,为本发明公开的苯硼酸修饰的胞内可降解的超支化聚(β-氨基酯)的合成示意图,合成方法包括以下步骤:
1)将一定量的丙烯酸酯类单体(三丙烯酸酯类单体、四丙烯酸酯类单体等) 和小分子有机胺加入有反应溶剂二甲基亚砜的烧瓶中并通过磁力搅拌使单体充分溶解,丙烯酸酯类单体(三丙烯酸酯类单体、四丙烯酸酯类单体等)、小分子有机胺的反应投料摩尔比为(0.2:1-1.5:1),60℃-120℃进行反应3-120h;
2)在反应过程中使用凝胶渗透色谱监测聚合物分子量,聚合物的分子量到达3-50kDa,终止反应;
3)将在反应体系中加入一定的含苯硼酸基团的封端剂和二甲基亚砜,对超支化聚(β-氨基酯)进行封端,消耗未反应双键或与胺基反应,封端剂与原料丙烯酸酯类单体(三丙烯酸酯类单体、四丙烯酸酯类单体等)投料摩尔比为(0.5:1-15:1),25℃,反应48h;
4)使用沉淀法对产物进行提纯,真空干燥,得到所需分子量和含苯硼酸基团的超支化聚(β-氨基酯)。
将制备得到的苯硼酸基团的超支化聚(β-氨基酯)用于蛋白递送的过程,包括:
将含苯硼酸基团的超支化聚(β-氨基酯)在细胞外进行蛋白包裹实验,聚合物与蛋白质质量比为0-200,蛋白质浓度0-250μg/mL,孵育时间为0-40min,判断苯硼酸修饰的超支化聚(β-氨基酯)对蛋白包裹性能的影响。同时,评价含苯硼酸基团的超支化聚(β-氨基酯)在哺乳动物细胞中的蛋白递送效率和细胞毒性。
实施例1
本实施例的合成路线图如图2所示,三羟甲基丙烷三丙烯酸酯和4-氨基-1- 丁醇的反应投料摩尔比为4:5,将其加入有反应溶剂二甲基亚砜并通过磁力搅拌,70℃进行反应4h,分子量为9kDa;加入三羟甲基丙烷三丙烯酸酯5倍的 4-氨甲基苯基硼酸(APBA),25℃下反应48h;使用沉淀法对产物进行提纯,真空干燥,得到的含苯硼酸基团的超支化聚(β-氨基酯)分子量为10kDa,n等于 20。结构式如下:
本实施例所得到的苯硼酸基团修饰的超支化聚(β-氨基酯)在25℃时的物理相态示意图如图3所示;本实施例制备得到的含硼酸基团的超支化聚(β-氨基酯)的1H NMR谱图如图4所示。
本实施例制备得到的含硼酸基团的超支化聚(β-氨基酯)的凝胶渗透色谱 (GPC)曲线如图5所示。是以DMF作为流动相测得苯硼酸修饰的超支化聚(β- 氨基酯)纯化后凝胶渗透色谱(GPC)曲线,能够得到的聚合物的分子量。
将本实施例制备的含苯硼酸基团的超支化聚(β-氨基酯)在细胞外进行蛋白包裹实验,使用BSA作为模型蛋白,常温下使用蛋白浓度为100μg/mL,聚合物与蛋白质比例为15:1,孵育时间为10min。进一步,评价含苯硼酸基团的超支化聚(β-氨基酯)在HeLa细胞中的蛋白递送效率和细胞毒性,使用96孔板,培养过夜,细胞状态良好情况下,进行蛋白递送实验,每孔加样量为10μL。
本实施例制备得到的苯硼酸修饰的超支化聚(β-氨基酯)进行BSA蛋白包裹前后荧光强度变化实验如图10所示;从图10的结果中可以看出,反应聚合物与蛋白质的包裹实验具有良好的效果。反应聚合物与蛋白质的包裹实验在蛋白浓度为100mg/ml和125mg/ml均有良好的包裹效果,孵育时间为10min和 20min对结果影响较小,并且将孵育后的溶液稀释后可进一步提高包裹效果。说明蛋白质经聚合物包裹后荧光强度显著下降,说明聚合物能有效地与蛋白质作用,形成纳米颗粒,从而有利于提高蛋白质在生理条件下复杂环境中的稳定性,为其临床利用提供了保障。
本实施例制备得到的苯硼酸修饰的超支化聚(β-氨基酯)递送BSA蛋白后 HeLa细胞和HepG2细胞的荧光照片如图11a、图11b、图11c和图11d所示;细胞经由聚合物包裹蛋白质形成的纳米颗粒培养后,显示强烈的绿色荧光。说明蛋白质由聚合物成功递送进入细胞并及时释放出来,证明了聚合物能够有效包裹并递送蛋白质进入细胞质中并顺利释放,为其在细胞中发挥治疗功能提供了保障。
实施例2
三羟甲基丙烷三丙烯酸酯和4-氨基-1-丁醇的反应投料摩尔比为1:2,将其加入有反应溶剂二甲基亚砜并通过磁力搅拌,70℃进行反应,反应5h,分子量为12kDa;加入三羟甲基丙烷三丙烯酸酯1倍的3-丙烯酰胺基苯基硼酸 (AAPBA),25℃下反应48h;使用沉淀法对产物进行提纯,真空干燥,得到的含苯硼酸基团的超支化聚(β-氨基酯)分子量为14kDa,n等于30。结构式如下:
本实施例所得到的苯硼酸基团修饰的超支化聚(β-氨基酯)合成示意图如图6所示;本实施例所得到的苯硼酸基团修饰的超支化聚(β-氨基酯)在25℃时的物理相态示意图如图7所示;本实施例制备得到的含硼酸基团的超支化聚 (β-氨基酯)的1H NMR谱图如图8所示。
本实施例制备得到的含硼酸基团的超支化聚(β-氨基酯)的凝胶渗透色谱 (GPC)曲线如图9所示。是以DMF作为流动相测得苯硼酸修饰的超支化聚(β- 氨基酯)纯化后凝胶渗透色谱(GPC)曲线,能够得到的聚合物的分子量。
含苯硼酸基团的超支化聚(β-氨基酯)在细胞外进行蛋白包裹实验,使用 BSA作为模型蛋白,常温下使用蛋白浓度为100μg/mL,聚合物与蛋白质比例为 15:1,孵育时间为10min。进一步,评价含苯硼酸基团的超支化聚(β-氨基酯) 在HeLa细胞中的蛋白递送效率和细胞毒性,使用96孔板,培养过夜,细胞状态良好情况下,进行蛋白递送实验,每孔加样量为10μL。
综上所述,本发明公开的含苯硼酸基团的功能性胞内可降解的超支化聚(β- 氨基酯)具有可重复实验,多次实验分子量差距小,全新的超支化结构,可生物降解,以及良好的生物相容性。通过改变丙烯酸酯类单体丙烯酸酯类单体(三丙烯酸酯类单体、四丙烯酸酯类单体等)和小分子胺的组成和比例所得聚合物的分子量及支化程度均不相同,通过调节聚合物与蛋白质比例及其他条件可对多种分子量和等电点的蛋白质进行有效包裹,递送至多种哺乳动物细胞具有临床应用的潜力。
以上内容仅为说明本发明的技术思想,不能以此限定本发明的保护范围,凡是按照本发明提出的技术思想,在技术方案基础上所做的任何改动,均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (7)
3.根据权利要求2所述的苯硼酸修饰的胞内可降解超支化聚(β-氨基酯)的合成方法,其特征在于,步骤1)中,丙烯酸酯类单体和小分子胺类单体的反应摩尔比为(0.2-1.5):1。
4.根据权利要求2所述的苯硼酸修饰的胞内可降解超支化聚(β-氨基酯)的合成方法,其特征在于,步骤1)中,迈克加成反应是在60~120℃下反应3~120h。
5.根据权利要求2所述的苯硼酸修饰的胞内可降解超支化聚(β-氨基酯)的合成方法,其特征在于,步骤2)中,所述含苯硼酸单体与丙烯酸酯类单体的摩尔比为(0.5-15):1。
6.根据权利要求2所述的苯硼酸修饰的胞内可降解超支化聚(β-氨基酯)的合成方法,其特征在于,步骤2)中,功能化封端反应温度为25℃,反应时间为48h。
7.权利要求1所述的苯硼酸修饰的胞内可降解超支化聚(β-氨基酯)在制备蛋白药物递送载体中的应用。
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