CN116396476A - 一类末端为两性离子功能化的高度支化聚（β-氨基酯）及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类末端为两性离子功能化的高度支化聚(β‑氨基酯)及其制备方法和应用，属于生物医用材料技术领域。通过选用不同的二丙烯酸酯类单体、三官能度的支化单体、小分子胺、二胺单体、两性离子单体制备出末端含有两性离子的高度支化聚(β‑氨基酯)，在动物细胞中实现高效递送蛋白质。该类聚合物与传统的阳离子聚合物相比，合成简单、细胞成活性更高、蛋白质包裹更有效、蛋白质递送性能更优，与代表性的的商业蛋白质递送试剂(PULSin)相比，原料易得、价格低廉，在蛋白质药物递送方面具有显著的临床应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及一类末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)及其制备方法和应用。
背景技术
蛋白质递送在灭活疫苗、肿瘤疾病、小分子药物替代与基因治疗等领域展现出了广阔的应用前景。相比于DNA和RNA，蛋白质递送具有显著优点，如无需进入细胞核、不会产生转基因插入突变、避免脱靶效应，不需转录翻译等步骤，蛋白作用在生物体更直接迅速作用，效率更高且动力学更快。此外，许多前沿的生物工程也需要在蛋白质的辅助下进行，如Cas9蛋白可以被用于基因编辑，进行疾病治疗。然而目前缺少安全高效的蛋白质递送载体，这严重限制了其临床化应用。
目前，常用的商用化试剂PULSin，具有一定的蛋白质递送能力和生物相容性，但其价格昂贵，需要配套的缓冲液等极大限制其在商业化中的应用；虽然可以通过控制金属离子、金属复合材料、无机纳米颗粒的尺寸和表面修饰来调节载体材料的潜在毒性，但是其体内累积性、难降解性的特点也严重限制了其生物体应用。
由于单体种类丰富、价格低廉、结构性能易调控以及生理环境可降解等优点，聚(β-氨基酯)作为一种高效的阳离子聚合物载体已在药物递送(如蛋白、核酸)方面显示出巨大的应用前景。而高度支化聚(β-氨基酯)(HPAE)由于其多重末端基团和拓扑结构在体内和体外已展现出极其优异的DNA和RNA递送性能。两性离子因其良好的生物相容性、同时存在的正负电荷、在仿生材料和医用器械领域被广泛使用。而两性离子功能化的聚(β-氨基酯)在蛋白质递送方面并没有相关报道，严重限制其在蛋白质载体的开发以及临床治疗中的潜在应用。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一类末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)及其制备方法和应用，解决蛋白质缺乏递送载体的问题。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一类末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)，其结构式如下：
其中，n＝5～30；m＝5～30；
R0为二丙烯酸酯类单体；R1为三丙烯酸酯类单体；R2为小分子胺；R3为二胺单体；R4为两性离子封端剂。
优选地，R0的结构式为下式中的一种：
R1的结构式为下式中的一种或多种：
R2的结构式为下式中的一种：
R3的结构式为下式中的一种：
R4的结构式为下式中的一种：
优选地，所述末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)的分子量在5,000～50,000Da范围内。
本发明还公开了上述一类末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)的制备方法，步骤如下：
1)将二丙烯酸酯类单体、三丙烯酸酯类单体、小分子胺单体加入到二甲基亚砜中混合均匀；
2)在步骤1)中加入二胺单体继续反应；
3)在步骤2)封端后的聚合物中加入两性离子封端剂封端，得到末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)；
其中，二丙烯酸酯类单体、三丙烯酸酯类单体和小分子胺单体的反应官能团的摩尔比为1:(0.2～0.6):(0.2～0.8)；二胺单体与过量丙烯酸酯官能团的摩尔比为(2～5):1。
优选地，步骤1)的反应条件为：在60～120℃反应6～48h。
优选地，步骤2)中，加入二胺单体之前，使用凝胶渗透色谱监测末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)，当分子量到达4,000～20,000Da，终止反应。
优选地，步骤2)的反应条件为：在20～50℃搅拌反应2～6小时。
优选地，步骤3)的反应条件为：在25℃反应4～24h。
本发明还公开了上述一类末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)在制备蛋白质药物递送载体中的应用。
优选地，末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)与蛋白质的质量比为(5～100):1。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的一类末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)，采用操作简单便捷的“一锅法”合成聚合物，丙烯酸酯类单体和胺类小分子利用“迈克尔加成”策略合成聚合物骨架，采用二胺单体进行封端和两性离子单体对封端后的聚合物进行功能化修饰。两性离子功能化的聚合物提纯后，将蛋白质进行包裹形成纳米粒子，应用于生物体的递送。通过使用不同的单体组合、调控支化结构比例，使用两性离子封端单体，合成一类结构组分、结构、表面电荷可调控的可生物降解的高度支化聚合物，由于聚合物主链含酯键(R0和R1单体中含酯键，生理环境下可水解)，因而具有良好的生物降解性能和支化结构调控性能；可离子化或带正电的基团(反应生成的叔胺以及封端得到的伯胺)能够有效的包裹蛋白质，从而完成递送。由于其超支化的三维拓扑结构和表面包裹提高对蛋白质的包裹和保护能力，显示出极高的蛋白质递送效率和细胞活性，具有一定的临床应用潜力。通过体外细胞递送实验中验证了末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)的蛋白质递送潜力，具有良好的临床转化前景。
本发明提供的一类末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)的制备方法，使用的试剂均为商业化二丙烯酸酯类单体、三丙烯酸酯类单体、小分子胺、小分子二胺单体以及两性离子封端单体，以简单的迈克尔加成方法制备出末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)，整个制备过程具有低成本(两性离子的高度支化聚(β-氨基酯)相较于主流的商业蛋白质递送试剂PULSin成本更低)，合成路径简单、化学组成和结构性能易调控等优势。
进一步地，通过凝胶渗透色谱监测聚合物分子量，二胺单体封端前，聚合物分子量控制在4,000～20,000Da，两性离子功能化后的聚合物分子量大约控制在5,000～50,000Da。
附图说明
图1为本发明的末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)的合成示意图；
图2为本发明的实施例1制得的末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)二胺单体封端前未纯化的凝胶渗透色谱(GPC)曲线图；
图3为本发明的实施例1制得的末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)的二胺单体封端后的1H NMR谱图；
图4为本发明的实施例1制得的分子量为18,700Da的末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)纯化后，两性离子封端前后的凝胶渗透色谱(GPC)曲线图；
图5为本发明的实施例1制得的末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)的物理形态图；
图6为本发明的实施例1制得的分子量为18,700Da的末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)对蛋白质包裹测试图；
图7为本发明的实施例1制得的分子量为18,700Da的末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)与蛋白质所形成复合物的粒径和粒子表面电位测试结果图；
图8为本发明的实施例1制得的分子量为18,700Da的末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)与蛋白质所形成复合物的微观形貌表征图；
图9为本发明的实施例1制得的分子量为18,700Da的末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)在HeLa细胞中蛋白质递送荧光标记蛋白质24h后HeLa细胞的荧光效果图；其中，从左到右，从上到下依次为商业化试剂PULSin、质量比为5:1的HPAE-E、质量比为5:1的HPAE-E-D、单独BSA-FITC、质量比为10:1的HPAE-E、质量比为10:1的HPAE-E-D递送BSA-FITC后24h的HeLa细胞荧光效果图；
图10为本发明的实施例1制得的分子量为18,700Da的末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)蛋白质递送24h后HeLa细胞的荧光强度结果图；
图11为本发明的实施例1制得的分子量为18,700Da的末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)蛋白质递送24h后，HeLa细胞的活性结果图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
本发明提供的一类末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)的合成方法，合成路线参见图1，包括以下步骤：
1)将二丙烯酸酯类单体、三丙烯酸酯类单体、小分子胺单体在60～120℃下反应6～48h；
其中，含二丙烯酸酯类单体、三丙烯酸酯类单体和小分子胺单体的反应官能团的摩尔比为1:(0.2～0.6):(0.2～0.8)。
所述二丙烯酸酯类单体(R0)为二丙烯酸酯类单体，包括下式中的一种：
所述的三丙烯酸酯类单体(R1)为下式中的丙烯酸酯类的一种或是多种：
小分子胺单体(R2)包括含不同氨基数量和分子结构的单体，其结构为下式中的一种：
2)在反应过程中使用凝胶渗透色谱监测末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)，当聚合物的分子量到达4,000～20,000Da，终止反应；加入小分子二胺单体进行封端，封端剂二胺单体与过量的丙烯酸酯官能团的摩尔比为(2～5):1；封端的条件为20～50℃搅拌反应2～6小时。
小分子二胺单体(R3)的结构为下式中的一种：
3)对二胺单体封端后的聚合物使用乙醚沉淀法进行提纯，得到HPAE-E，使用核磁进行表征，确定碳碳双键已被消耗完全。
4)将一定量的功能化两性离子封端剂和二甲基亚砜加入到步骤3)的反应体系中，在25℃下反应4h～24h。
其中，两性离子封端剂(R4)与聚合物过量的氨基官能团的摩尔比为(2～5):1；封端剂为两性离子单体，其结构为下式中的一种：
4)使用沉淀法对产物进行提纯，真空干燥，得到末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)，即HPAE-E-D，结构式如下：
其中，n＝5～30；m＝5～30。
将本发明制得的末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)用于蛋白质的递送，包括以下步骤：
1)细胞培养：将HeLa细胞在标准培养条件下进行培养，按照0.5×104～2.0×104个细胞每孔的密度接种在96孔板中。
2)待细胞密度达到60％～90％，将末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)的溶液与异硫氰酸酯(FITC)荧光标记的牛血清蛋白质(BSA)BSA-FITC的溶液高速涡旋15～60s，静置孵育10～30min，然后转移至细胞中进行蛋白质递送。其中聚合物:蛋白质质量比为(5～100):1，每孔蛋白质质量为0.1～10μg。
3)待蛋白质递送4h～48h后，在荧光显微镜下对蛋白质递送的绿色荧光蛋白的细胞进行观察和拍照。
4)待蛋白质递送4h～48h后，移除培养基，使用磷酸盐缓冲液清洗2～3次后，在酶标仪中快速检测荧光强度，测试经蛋白质递送后的细胞的荧光强度。
5)蛋白质递送4h～48h后，移除细胞上清液后，加入alamarBlue溶液，在培养箱中孵育30～120min，进行细胞活性测试。
实施例1
1.末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)的合成
1)将双酚A乙氧基化物二丙烯酸酯(EO/phenol＝1.5)、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、4-氨基-1-丁醇以摩尔比为8:2:5加入到二甲基亚砜中，采用“一锅法”在80℃进行迈克加成反应12～20h；
2)在反应过程中使用凝胶渗透色谱(GPC)监测末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)，当聚合物的分子量到达4,000～20,000Da，终止反应，凝胶渗透色谱曲线如图2所示；
3)然后将1,3-丙二胺和二甲基亚砜加入到步骤2)的反应体系中，并在25℃下反应4h，得到反应产物；其中，1,3-丙二胺与聚合物过量的丙烯酸酯官能团的摩尔比为5:1；
4)使用沉淀法对二胺单体封端的聚合物使用乙醚沉淀法进行提纯，得到HPAE-E，再进行核磁测定，结果如图3所示，确定碳碳双键被消耗完全；
5)将两性离子2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱作为封端剂，和步骤4)提纯后的聚合物溶于二甲基亚砜中，封端剂和聚合物的氨基比为3:1，并在25℃下反应6h，得到反应产物，反应产物的凝胶渗透色谱曲线如图4所示；
6)将步骤5)的反应产物使用乙醚沉淀法进行提纯，真空干燥后，冻干得到分子量为18,700Da的末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)，即HPAE-E-D，结构式如下：
上述得到的支化聚(β-氨基酯)在25℃时的物理相态示意图如图5所示。
2.对合成的末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)进行蛋白质包裹测试
首先，分别以质量比为5:1、10:1和30:1将末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)溶液溶于醋酸钠缓冲液(pH值＝5.2，0.025M)，将聚合物溶液加入到蛋白质(BSA-FITC)的磷酸盐缓冲液中，其中，蛋白质的用量为10μg，高速涡旋15～60s，然后静置10～30min，将复合物纳米粒子溶液使用蒸馏水稀释至1mL。纳米颗粒与BSA-FITC溶液在15000rpm下离心30min，用96孔板取100μL上清。荧光测量使用平板阅读器(Synergy HybridH1,Biotek)，激发波长为463nm，发射波长为525nm。所有实验均重复3次。以等量BSA-FITC(10μg)为阴性对照，不含BSA-FITC的样品为空白。检测激发的荧光强度，测试末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)对蛋白质包裹。最后采用DLS对其粒径和表面电位进行测试，同时对复合物纳米粒子溶液进行冷冻干燥，使用TEM对其微观形貌进行表征。
蛋白质包裹测试结果参见图6，图6证实在质量比为5:1、10:1和50:1时，实施例1中制备的分子量为18,700Da的末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)对蛋白质的包裹效率均超过50％，可以高达70％，证实其优异的蛋白质包裹。DLS分析结果参见图7，图7结果证实，实施例1中制备的分子量为18,700Da的末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)能够有效压缩蛋白质，将粒径为600nm的蛋白质在质量比为10:1形成为粒径300～500nm的纳米颗粒，进一步证实其所形成的复合物纳米粒子更有利于细胞摄取。同时图7结果证实，实施例1中制备的分子量为18,700Da的末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)能够有效屏蔽蛋白质自身的负电位，所形成的复合物纳米表面的Zeta电位越升高，形成带正电的纳米颗粒。TEM表征结果参见图8，图8结果证实，实施例1中制备的分子量为18,700Da的末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)与蛋白质形成的复合物纳米粒子粒径分布均匀，结构较为稳定，证实其良好的稳定性能。
3.将实施例1制备的末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)在细胞外进行蛋白质递送实验
HeLa细胞在标准培养条件下进行培养，按照2.0×104个细胞/孔的密度接种在96孔板中，待细胞密度达到50％～80％，进行蛋白质递送，其中至少设三个平行复孔。将对应质量的末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)溶液加入到蛋白质溶液中，其中，末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)与BSA-FITC的质量比为5:1和10:1，其每孔荧光蛋白用量1μg，高速涡旋15～60s，然后静置10～30min，静止孵育，形成复合纳米颗粒，然后转移至96孔板中进行蛋白质递送。继续培养24h后，弃去培养基，使用磷酸盐缓冲溶液清洗2～3次后，在荧光显微镜下对递送绿色荧光蛋白的细胞进行观察和拍照。并使用酶标仪对荧光强度进行测定，激发波长为463nm，发射波长为525nm(λex＝463nm，λem＝525nm)。
蛋白质递送性能评价结果参见图9，由图9可看出，本发明制备的末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)，由于其多重末端基团、灵活的化学组成、良好生物相容性，因此较未进一步两性离子功能化的末端为氨基的聚(β-氨基酯)展现较高的细胞荧光。
细胞荧光前度评价结果参见图10，由图10可看出，本发明制备的末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)，可显著改善聚(β-氨基酯)的蛋白质递送后的荧光强度。
4.将实施例1制备的支化聚(β-氨基酯)在细胞外定量蛋白质递送效率和细胞活性进行测试
HeLa细胞在标准培养条件下进行培养，按照2.0×104个细胞/孔的密度接种在96孔板中，待细胞密度达到50％～80％，进行蛋白质递送，其中至少设三个平行复孔。将对应质量的末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)溶液加入到蛋白质溶液中，其中，末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)与BSA-FITC的质量比为5:1和10:1，其每孔荧光标记的蛋白质用量1μg，高速涡旋15～60s，然后静置10～30min，静止孵育，形成复合纳米颗粒，然后转移至96孔板中进行蛋白质递送。继续培养24h后，弃去培养基，使用alamarBlue溶液，在培养箱中孵育30～120min，进行细胞活性测试。使用酶标仪对荧光强度进行测定，激发波长为530nm，发射波长为590nm。
细胞活性评价结果参见图11，从细胞成活率的结果可发现，由于末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)良好的生物相容性和降解性，因此，蛋白质递送后的细胞仍能保持较高的细胞活性，这说明末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)在蛋白质递送方面具有明显的优势。蛋白质递送性能评价结果参见图11，蛋白质递送结果表明在HeLa细胞中由于其多重末端基团、灵活的化学组成、良好生物相容性，末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)能够高效地介导以BSA-FITC为模型的蛋白质递送。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (10)
1.一类末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)，其特征在于，其结构式如下：
其中，n＝5～30；m＝5～30；
R0为二丙烯酸酯类单体；R1为三丙烯酸酯类单体；R2为小分子胺；R3为二胺单体；R4为两性离子封端剂。
2.根据权利要求1所述的一类末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)，其特征在于，R0的结构式为下式中的一种：
R1的结构式为下式中的一种或多种：
R2的结构式为下式中的一种：
R3的结构式为下式中的一种：
R4的结构式为下式中的一种：
3.根据权利要求1所述的一类末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)，其特征在于，所述末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)的分子量在5,000～50,000Da范围内。
4.权利要求1～3任意一项所述的一类末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)的制备方法，其特征在于，步骤如下：
1)将二丙烯酸酯类单体、三丙烯酸酯类单体、小分子胺单体加入到二甲基亚砜中混合均匀；
2)在步骤1)中加入二胺单体继续反应；
3)在步骤2)封端后的聚合物中加入两性离子封端剂封端，得到末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)；
其中，二丙烯酸酯类单体、三丙烯酸酯类单体和小分子胺单体的反应官能团的摩尔比为1:(0.2～0.6):(0.2～0.8)；二胺单体与过量丙烯酸酯官能团的摩尔比为(2～5):1。
5.根据权利要求4所述的一类末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)的制备方法，其特征在于，步骤1)的反应条件为：在60～120℃反应6～48h。
6.根据权利要求4所述的一类末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)的制备方法，其特征在于，步骤2)中，加入二胺单体之前，使用凝胶渗透色谱监测末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)，当分子量到达4,000～20,000Da，终止反应。
7.根据权利要求4所述的一类末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)的制备方法，其特征在于，步骤2)的反应条件为：在20～50℃搅拌反应2～6小时。
8.根据权利要求4所述的一类末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)的制备方法，其特征在于，步骤3)的反应条件为：在25℃反应4～24h。
9.权利要求1～3任意一项所述的一类末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)在制备蛋白质药物递送载体中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，末端为两性离子功能化的高度支化聚(β-氨基酯)与蛋白质的质量比为(5～100):1。
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