CN117843731A

CN117843731A - 一种用于检测pcv2的重组抗原蛋白及其构建方法、检测方法和应用

Info

Publication number: CN117843731A
Application number: CN202311817765.XA
Authority: CN
Inventors: 潘杰; 李群; 徐萍; 丁国伟; 王绍君; 李晓明; 高新芳; 潘晨
Original assignee: Yangzhou Uni Bio Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Yangzhou Uni Bio Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2023-12-27
Filing date: 2023-12-27
Publication date: 2024-04-09

Abstract

本发明公开了一种用于检测PCV2的重组抗原蛋白及其构建方法、检测方法和应用，以所述重组抗原蛋白为抗原，通过抗原‑抗体反应检测出PCV2的抗体来诊断PCV2的方法。采用本发明技术方案提供的ELISA检测试剂盒对于猪瘟病毒(CFSV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRSV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)的阳性血清的检测结果均为阴性，PCV2阳性血清则为阳性，说明本发明的ELISA检测试剂盒与其他病原体之间无交叉反应，具有良好的特异性。

Description

一种用于检测PCV2的重组抗原蛋白及其构建方法、检测方法和应用

技术领域

本发明涉及一种用于检测PCV2的重组抗原蛋白及其构建方法、检测方法和应用，属于检测技术领域。

背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus Type 2，PCV2)是引起猪圆环病毒相关疾病(Porcine Circoviral Associated Diseases，PCVAD)的主要病原。PCV2感染后会导致断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、猪繁殖障碍症、肉芽肿性肠炎、急性肺水肿(APE)、增生性坏死性肺炎(PNP)等疾病。PCV2主要造成猪免疫器官损伤、淋巴细胞减少、淋巴组织增殖能力下降，引起免疫功能下降或紊乱，最终因缺乏有效的免疫应答能力，导致感染猪共感染其他病原，如猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)等。PCV2在世界范围内广泛流行，已成为诱发猪群感染的主要病原体，对养猪业造成了不可估计的损失。

猪圆环病毒2型属于圆环病毒科圆环病毒属，呈对称的二十面体，无囊膜，基因组大小约1.7kb，包含11个开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)。ORF1编码与病毒复制相关蛋白，即Rep蛋白和Rep’蛋白；ORF2编码病毒的主要结构蛋白，即Cap蛋白，ORF2是病毒保护性抗原的主要成分，具有很好的免疫原性；ORF3编码与细胞凋亡相关蛋白，其与病毒在体内的致病性有关；ORF4基因嵌入于ORF3中，编码一种对PCV2复制非必需的非结构蛋白，抑制细胞的凋亡；ORF5为最新发现的一种非结构蛋白，是病毒复制、转录和翻译的非必需蛋白。

PCV2为单股环状DNA病毒，大小约为1.7kb，编码衣壳蛋白(Cap)和复制酶(Rep)蛋白两个主要功能性蛋白。衣壳蛋白是构成病毒衣壳的唯一结构蛋白和最主要免疫原性蛋白。已有研究证实，衣壳蛋白N端核定位信号肽(NLS)序列26～36区段存在一个抗原中和表位，同时氨基酸残基第65～87、113～147、102～107、119～128、157～183、193～233六个区段能够诱导实验动物产生抗衣壳蛋白免疫反应。目前，PCV2的实验室诊断方法有很多，包括高度特异性的病毒学、免疫学以及分子生物学诊断方法，如病毒的分离和鉴定、间接免疫荧光技术(IFA)、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、原位杂交技术(ISH)、聚合酶链式反应(PCR)技术方法等，但这些技术对试验条件和专业技能要求较高，操作过程繁琐，不适合兽医临床快速检测和大规模检测的需求，而且，现有技术中针对PCV2的ELISA检测试剂盒多是以衣壳蛋白为检测抗原，灵敏度不足以进行低浓度样本的检测。

因此，亟需研发出操作简便、特异性好、敏感性高、可大规模推广的PCV2抗体检测试剂盒，对群猪PCV2免疫水平进行实时监测，建立科学灵活的猪群疫病免疫程序，对PCV2的预防和控制有重要意义。

基于上述现有技术存在的技术问题，亟需一种针对猪圆环病毒2型，且具有检测特异性高、灵敏性好的抗体检测试剂盒。

发明内容

目前市场上的针对猪圆环病毒2型的检测试剂盒存在操作过程繁琐，也灵敏度不足以满足低浓度样本检测的问题，本发明提供了一种猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒制备方法和应用，并证明该试剂盒可以用于猪群PCV2抗体检测，检测特异性高、灵敏性好，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域，其目的在于提供一种可大规模工业化生产的猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒的制备方法。

本发明的第一个目的是提供一种检测猪圆环病毒2型的重组抗原蛋白，如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过增加或截短的且具有与猪圆环病毒2型抗体结合能力的由(a)衍生的蛋白质。

在这里，衍生蛋白质是将SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过替换、截短(缺失)或增加(添加、插入)后得到与其仍具有等同功能的蛋白质，优选地，增加的碱基与SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列相比至少具有70％以上的序列同源性的蛋白质，或，碱基的替换或缺失至少具有90％以上的序列同源性的蛋白质，其与猪圆环病毒2型抗体结合能力与由SEQ IDNO:2表示的氨基酸序列编码的蛋白质基本相同。例如，上述的氨基酸序列通过截短、替换或增加等手段进行了修饰，但依旧具有可以执行与猪圆环病毒2型抗体结合的功能。

本发明的第二个目的是提供编码上述重组抗原蛋白的基因。

在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；或，编码如SEQID NO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或，编码具有与PCV2抗体结合能力的衍生蛋白质的核苷酸序列，所述衍生蛋白质由如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过替换、增加或截短得到的。

本发明第三个目的是提供携带上基因的重组表达载体。

在一种实施方式中，所述重组表达载体的制备包括将核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的PCV2-Fu基因克隆至PUC载体上，得到pUC-Fu质粒载体；以所述pUC-Fu质粒载体为模板、Fu-F、Fu-R分别作为上游引物和下游引物，进行PCR扩增后纯化得到PCV2-Fu基因片段；将所述PCV2-Fu基因片段和表达质粒经酶切、纯化回收，再通过连接酶进行连接得到连接产物；将所述连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞进行阳性筛选和扩增，构建含有PCV2-Fu基因的转移载体，即得到所述重组表达载体。

其中，所述pUC质粒选自pUC17质粒、pUC18质粒和pUC19质粒中的任意一种。

所述表达载体包括pFastBac 1、pVL1393、pFastBac dual中的任一种。

优选地，消化酶包括BamHⅠ酶和HindⅢ酶；

优选地，上述的上游引物Fu-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

下游引物Fu-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

进一步地，构建上述重组表达载体的微生物细胞也在本发明所保护的范围之内。

优选地，构建上述重组表达载体的微生物细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。

在一些优选的实施方式中，所述微生物细胞包括大肠杆菌E.coli DH5α和E.coliDH10Bac。

本发明还提供了一种重组抗原蛋白的制备方法，具体步骤包括：将上述的表达载体同源重组到杆状病毒基因组中并转染昆虫细胞，构建得到重组杆状病毒。

具体地，所述表达载体同源重组到杆状病毒基因组中，得到重组杆状病毒基因组；用所述重组杆状病毒基因组转染昆虫细胞后，培养被感染的昆虫细胞，分离和纯化后产生的外源蛋白，即为所述重组抗原蛋白；其中，所述昆虫细胞包括Sf9昆虫细胞。

基于上述技术方案提供的重组抗原蛋白为抗原，通过抗原-抗体反应检测出猪圆环病毒2型的抗体来诊断猪圆环病毒2型的方法。

具体地，所述检测方法的具体步骤包括：将上述的重组抗原蛋白包被于酶标板中得到抗原包被板，经第一次孵育后加入酶标二抗，进行第二次孵育，避光进行显色反应，最后，加入终止液终止反应，最后进行OD_450nm值的检测。

优选地，所述第一次孵育和所述第二次孵育的条件为，35～38℃孵育0.5～1h。

采用上述技术方案提供的重组抗原蛋白并以其作为抗原进行的猪圆环病毒2型的诊断方法，本发明将其制备分子检测制品进行使用。

在一种实施方式中，所述分子检测制品为ELISA检测试剂盒或胶体金试纸条。

本发明还提供了一种猪圆环病毒2型ELISA检测试剂盒，所述ELISA检测试剂盒包括上述重组抗原蛋白。

在一种实施方式中，所述检测试剂盒还含有猪圆环病毒2型阳性血清、抗原包被板、酶标二抗、底物显色液、样品稀释液、洗涤液和终止液；其中，

所述抗原包被板中包被上述的重组抗原蛋白；

和/或，所述底物显色液包括等比例混合的显色液A和显色液B；所述显色液A为四甲基联苯胺(TMB)的乙醇溶液；所述显色液B包括柠檬酸、磷酸氢二钠和过氧化氢合尿素；

和/或，所述酶标二抗为HRP辣根过氧化物酶标记的二抗；

和/或，所述洗涤液为20×PBST溶液；

和/或，所述终止液为硫酸溶液。

本发明还提供了一种猪圆环病毒2型胶体金试纸条，所述胶体金试纸条的诊断抗原为上述重组抗原蛋白。

有益效果：

(1)通过本发明提供的ELISA检测试剂盒进行特异性验证，结果显示，本发明提供的ELISA检测试剂盒对于猪瘟病毒(CFSV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRSV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)的阳性血清的检测结果均为阴性，PCV2阳性血清则为阳性，说明本发明的ELISA检测试剂盒与其他病原体之间无交叉反应，具有良好的特异性。

(2)通过本发明提供的ELISA检测试剂盒进行灵敏度验证，并与使用CAP蛋白全长抗原制备的ELISA试剂盒作比较，结果显示，本发明提供的ELISA检测试剂盒的灵敏度显著高于使用CAP蛋白全长抗原制备的ELISA试剂盒。

(3)本发明试剂盒组分中，包被酶标板的抗原为使用Sf9细胞表达重组PCV2-Fu蛋白，抗原纯度高，且可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养，由此抗原包被的包被板所建立的ELISA抗体检测试剂盒，检测灵敏度高、特异性高、与PCV2抗体的结合能力强，易于大规模推广应用。

(4)采用本发明的技术方案提供的重组抗原蛋白，替代现有技术中的衣壳蛋白为检测抗原，提高检测的灵敏度，针对低浓度样本的检测也具有良好的检测效果。

附图说明

图1为本发明实施例1中PCV2-Fu基因片段验证凝胶电泳图。

图2为本发明实施例1中菌落PCR验证凝胶电泳图。

图3为本发明实施例1中转移载体pF-Fu的质粒图谱。

图4为本发明实施例2中SDS-PAGE检测重组杆状病毒表达产物；其中，1为rBac-Fu；2为对照组。

图5为本发明实施例2中Western Blot检测重组杆状病毒表达产物；其中，1为rBac-Fu；2为对照组。

图6为本发明实施例4中SDS-PAGE检测PCV2-Fu蛋白。

图7为本发明实施例4中PCV2-Fu蛋白的电镜照片。

具体实施方式

使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

本发明提供一种猪圆环病毒2型的重组抗原蛋白，包括由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

或，由如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过替换、增加或截短得到的、且具有与猪圆环病毒2型抗体结合能力的衍生蛋白质。

本发明还提供了编码上述重组抗原蛋白的基因序列，所述基因序列具有如SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列；或

编码如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或

编码具有与PCV2抗体结合能力的衍生蛋白质的核苷酸序列，所述衍生蛋白质由如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过替换、增加或截短得到的。

作为作为优选的实施方式，本发明提供了携带上述核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的基因的表达载体。

具体地，所述重组表达载体的制备包括将核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的PCV2-Fu基因克隆至PUC载体上，得到pUC-Fu质粒载体；以所述pUC-Fu质粒载体为模板、Fu-F、Fu-R分别作为上游引物和下游引物，进行PCR扩增后纯化得到PCV2-Fu基因片段；利用酶切连接法进行酶切、纯化后PCV2-Fu基因片段和消化质粒通过连接酶进行连接得到连接产物；将所述连接产物利用微生物细胞进行转化、筛选和扩增，构建含有PCV2-Fu基因的转移载体，即得到所述重组表达载体。

本发明还提供了一种重组抗原蛋白的制备方法，具体步骤包括：将上述的重组表达载体同源重组到杆状病毒基因组中并转染昆虫细胞，构建得到重组杆状病毒。

具体地，所述重组表达载体同源重组到杆状病毒基因组中，得到重组杆状病毒基因组；用所述重组杆状病毒基因组转染昆虫细胞后，培养被感染的昆虫细胞，分离和纯化后产生的外源蛋白，即为所述重组抗原蛋白；其中，所述昆虫细胞包括Sf9昆虫细胞。

作为优选的实施方式，本发明还提供了PCV2 ELISA抗体检测试剂盒，包括猪圆环病毒2型阳性血清、抗原包被板、酶标二抗、底物显色液、样品稀释液、洗涤液和终止液；其中，抗原包被板中包被有重组抗原蛋白(PCV2-Fu)。

作为优选地实施方式，抗原包被板的制备方法，具体步骤包括：将重组抗原蛋白PCV2-Fu加入至酶标板中，孵育过夜后加入封闭液，孵育后洗涤得到包被好的反应板，密封包装后即为抗原包被板，0～4℃保存。

作为一个典型的实施方式，抗原包被板的制备的方法包括：取96孔酶标板，每孔加入纯化后的PCV2-Fu蛋白(1mg/L)，100μL/孔，2～8℃孵育过夜；弃去液体，每孔加入250μLPBST(0.01mol/L，pH值7.2)，静置1分钟洗涤5次；每孔加入200μL 1％BSA封闭，37℃孵育1小时，弃去封闭液；每孔加入250μL PBST，静置1分钟，洗涤5次。

将包被好的反应板密封包装，4℃保存。

作为一个典型的实施方式，酶标二抗为HRP辣根过氧化物酶标记的二抗。

作为一个典型的实施方式，底物显色液的制备包括将0.2g四甲基联苯胺(TMB)溶液溶于100mL无水乙醇中，定容至1L，即为显色A液；将9.33g柠檬酸和14.6g磷酸氢二钠加入到6.4mL 0.75％的过氧化氢尿素中，调至pH 5.0，定容至1L，即为显色B液；将显色A液与B液等体积混合，量取111.2mL的18mol/L浓硫酸，用混合显色液将其定容至1000mL。

作为一个典型的实施方式，样品稀释液的制备包括配置pH7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)。

作为一个典型的实施方式，洗涤液的制备包括20×PBST溶液，氯化钠(NaCl)160g，氯化钾(KCl)4g，十二水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)57.8g，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)4g，加超纯水800mL溶解后加入10mL吐温-20，1000mL容量瓶定容。

作为一个典型的实施方式，终止液包括2mol/L硫酸溶液。

作为一个典型的实施方式，PCV2型阳性血清的制备包括使用PCV2-Fu蛋白免疫试验动物，获得PCV2型抗体阳性血清。

转染培养基T1购自Mirus公司，Cellfectin转染试剂购自Thermo公司，SF-SFM新鲜培养基购买自Thermo公司，

商业化质粒pFastBac 1、大肠杆菌DH10Bac感受态细胞均购买于thermo公司。

实施例1转移载体pF-Fu构建与鉴定

1.PCV2-Fu基因扩增与纯化：本实施例采用南京金斯瑞生物科技有限公司合成的密码子优化后的PCV2-Fu基因(SEQ ID NO:1)并克隆到pUC17载体上，得到pUC-Fu质粒载体。

以pUC-Fu质粒作为模板，Fu-F、Fu-R作为上下游引物进行PCR扩增(Fu-F、Fu-R的基因序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示)，扩增体系见表1。

表1PCV2-Fu基因扩增体系

反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性45秒，54℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。

将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图1所示，在0.9kbp的位置出现目的条带，PCV2-Fu基因片段扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。

2.酶切与纯化：将pFastBac 1质粒和步骤1中纯化的PCV2-Fu基因片段使用BamHⅠ、HindⅢ37℃双酶切3小时，具体酶切反应体系见表2、表3。

将酶切产物进行凝胶电泳，分别使用凝胶回收纯化试剂盒纯化酶切的pFastBac 1质粒以及PCV2-Fu基因片段。

表2PCV2-Fu基因酶切反应体系

表3pFastBac 1质粒酶切反应体系

3.连接：将步骤2酶切过的pFastBac 1质粒和PCV2-Fu基因片段使用T4 DNA连接酶16℃水浴连接过夜获得连接产物，连接体系见表4。

表4PCV2-Fu基因与pFastBac 1质粒连接体系

4.转化：取10μL连接产物加入100μL的DH5α感受态细胞，混匀，42℃热休克90秒，冰浴2分钟，加入900μL不含Amp的LB培养基，37℃培养1小时。取1.0mL菌液离心浓缩成100μL涂布于含有Amp(100ug/ml浓度)的LB固体培养基上，37℃培养16小时。

5.菌落PCR和测序鉴定：挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，Fu-F和Fu-R作为引物进行菌落PCR。

将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图2所示，出现0.9kbp附近条带的样品为阳性样品。将菌落PCR鉴定阳性的菌液进行测序，选择测序正确的菌液进行保存。

采用上述步骤构建得到的含有目的基因的转移载体pF-Fu，其示意图如图3。

实施例2构建重组杆状病毒基因组Bac-Fu并转染重组杆状病毒

本实施例构建重组杆状病毒基因组Bac-Fu并转染重组杆状病毒，具体步骤包括：

1.DH10Bac菌转化：取1μL实施例1所获转移载体pF-Fu加入100μL的DH10Bac感受态细胞中混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，再冰浴2分钟，加入900μL不含Amp的LB液体培养基，37℃培养5小时后，取100μL菌液稀释81倍，再取100μL稀释的菌液涂布到含有含卡那霉素50μg/mL，庆大霉素7μg/mL，四环素10μg/mL，X-gal 100μg/mL，IPTG 40μg/mL的LB固体培养基上，37℃培养48小时。

2.挑选单克隆：使用接种针挑取大的白色菌落，然后在含卡那霉素50μg/mL，庆大霉素7μg/mL，四环素10μg/mL，X-gal 100μg/mL，IPTG 40μg/mL的LB固体培养基上划线，37℃培养48小时，然后挑取单菌落接种含卡那霉素50μg/mL，庆大霉素7μg/mL，四环素10μg/mL，X-gal 100μg/mL，IPTG 40μg/mL的LB液体培养基培养，保存菌种，抽提质粒，获得重组质粒Bacmid-Fu。

3.制备重组杆状病毒rBac-Fu：

1)在六孔板中每个孔接种0.8×10⁶个Sf9细胞，细胞汇合度为50～70％。

2)对于每一个孔制备以下的复合物：用100μL转染培养基T1稀释4μL的Cellfectin转染试剂，短暂的漩涡震荡；用100μL转染培养基T1稀释3μg步骤2中的重组质粒Bacmid-Fu，将稀释的转染试剂和质粒混合，轻轻吹匀，制备转染混合物。

3)待细胞贴壁后加入步骤2)的转染复合物，27℃孵育5小时，移除上清，添加2mLSF-SFM新鲜培养基，27℃培养4～5日收获上清，获得重组杆状病毒rBac-Fu。

对收获的F1代重组杆状病毒使用间接免疫荧光法检测病毒含量，rBac-Fu代种毒病毒含量为1.81×10⁸TCID₅₀。

扩增重组杆状病毒rBac-Fu作为种毒备用。

4)SDS-PAGE检测及Western Blot检测：将步骤3中收获的上清进行SDS-PAGE检测。以兔源抗PCV2阳性血清作为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗进行Western Blot鉴定。

如图4所示为SDS-PAGE检测结果，由图可见，rBac-Fu在分子量约35kDa处出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带，电泳结果条带大小均与目标蛋白理论分子量大小一致，证明蛋白表达成功。

如图5所示为Western Blot鉴定结果，由图可见，重组杆状病毒表达样品都有目的条带，阴性对照没有目的条带，说明目的蛋白在Sf9细胞中得到正确表达。

实施例3昆虫细胞的生物反应器无血清悬浮培养

本实施例采用昆虫细胞的生物反应器无血清悬浮培养实施例2获得的rBac-Fu得到rBac-Fu培养物。

在含有300mL SF-SFM培养基的1000mL摇瓶中无菌培养Sf9昆虫细胞3-4天，待浓度长到3-5×10⁶cell/mL，活力大于95％时，将细胞接种到含有3000mL SF-SFM培养基的5L的生物反应器中，接种浓度为3-8×10⁵cell/mL。当细胞浓度达到3-5×10⁶cell/mL时，将细胞接种到含有30000mL SF-SFM培养基的50L生物反应器中，待细胞长至浓度为3-5.5×10⁶cell/mL，接种到含有300000mL SF-SFM培养基的500L生物反应器中，待细胞浓度达到2-8.5×10⁶cell/mL时，以1％接种量接种实施例2获得的rBac-Fu，反应器培养条件为pH值6.0-6.5、温度25-27℃、溶氧30-80％、搅拌速度100-180rpm。在感染之后继续培养5-9天后，加入千分之一终浓度灭活剂二乙烯亚胺(BEI)，37℃作用48h后，加千分之二终浓度Na₂S₂O₃终止灭活，收获rBac-Fu细胞培养物。

实施例4蛋白纯化及电镜检测

制备重组抗原蛋白(PCV2-Fu蛋白)，包括对实施例3的rBac-Fu细胞培养物进行蛋白纯化和电镜检测，具体包括：

1.蔗糖密度梯度离心：将实施例3收获的rBac-Fu细胞培养物超声破碎后，12000r/min离心30分钟，取上清，0.22μm滤膜过滤，去除杂质，使用截留分子量为10kDa的超滤管浓缩10倍。每个离心管加入浓度为40％的蔗糖溶液10mL，然后加入2.0mL超滤浓缩样品，29000r/min超速离心2小时，弃上清，沉淀用2.0mLPBS重悬。然后将悬液经过浓度分别为50％、60％、70％、80％的梯度浓度蔗糖离心加入悬液2.0mL，38000r/min离心2小时。离心结束后在50％～60％浓度交界处出现一个白色条带，小心吸取白色的条带，即得到纯化的PCV2-Fu蛋白。将收获的纯化的PCV2-Fu蛋白使用BCA总蛋白定量法进行蛋白含量测定，用SDS-PAGE电泳的方法再结合灰度扫描确定其浓度，结果如图6所示，PCV2-Fu蛋白浓度为2.2g/L，纯度为98.4％。

2.电镜观察：将步骤1收集的PCV2-Fu蛋白滴加到有碳膜的铜网上，自然风干后，滴加2％磷钨酸钠溶液进行负染，负染后进行电镜观察。电镜下观察到与PCV2病毒粒子大小相当、形态学相近的病毒样颗粒，具体结果见图7。

实施例5制备PCV2 ELISA抗体检测试剂盒

1.抗原包被板的制备：取96孔酶标板，每孔加入实施例4中纯化的PCV2-Fu蛋白(1mg/L)，100μL/孔，2～8℃孵育过夜。弃去液体，每孔加入250μLPBST(0.01mol/L，pH值7.2)，静置1分钟洗涤5次；每孔加入200μL 1％BSA封闭，37℃孵育1小时，弃去封闭液；每孔加入250μLPBST，静置1分钟，洗涤5次。将包被好的反应板密封包装，4℃保存。

2.酶标二抗的制备：HRP标记的酶标二抗(羊抗猪IgG)购自于Bioworld公司。

3.底物显色液的制备：将0.2g四甲基联苯胺(TMB)溶液溶于100mL无水乙醇中，定容至1L，即为显色A液；将9.33g柠檬酸和14.6g磷酸氢二钠加入到6.4mL 0.75％的过氧化氢尿素中，调至pH 5.0，定容至1L，即为显色B液。将显色A液与B液等体积混合，量取111.2mL的18mol/L浓硫酸，用混合显色液将其定容至1000mL。

4.样品稀释液的制备：配置pH7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)。

5.洗涤液的制备：20×PBST溶液：氯化钠(NaCl)160g，氯化钾(KCl)4g，磷酸氢二钠·12水(Na₂HPO4·12H₂O)57.8g，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)4g，加超纯水800mL溶解后加入10mL吐温-20，1000mL容量瓶定容。

6.终止液的制备：配制2mol/L硫酸溶液。

7.阳性血清的制备：使用PCV2-Fu蛋白免疫试验动物，获得PCV2型抗体阳性血清。

实施例6 PCV2 ELISA抗体检测试剂盒的初始程序设置

1.操作方法：将待检测的样品分别进行系列倍比稀释，加入抗原包被板，50μL/孔，每样品2个重复。同时加入阴性对照和阳性对照。37℃孵育0.5小时，弃去血清孵育物，每孔加入250μL PBST，静置1分钟，弃去洗涤液，洗涤5次；每孔加入1:2000倍稀释的酶标二抗100μL，37℃孵育0.5小时；每孔加入250μL PBST，静置1分钟，洗涤5次；每孔加入TMB显色液100μL，置37℃避光显色15分钟；每孔加入2mol/L硫酸溶液100μL终止反应。使用酶标仪检测OD_450nm值。

2.结果判定：阴性对照血清OD_450nm＜0.2时，试验结果判定有效。待测血清OD_450nm＞2.1×阴性对照血清OD_450nm时，判定为阳性。待测样品为阳性的最高稀释倍数即为抗体效价。

实施例7 PCV2 ELISA抗体检测试剂盒的反应条件的确定

1.抗原包被板中包被抗原浓度确定：通过碳酸盐缓冲液将实施例4中获得的纯化的PCV2-Fu蛋白分别稀释至不同浓度(0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L、1.2mg/L)，用各个稀释浓度的PCV2-Fu蛋白包被96孔板，按照实施例6的方法检测待检样品的抗体效价，以确定最佳抗原包被浓度为1mg/L。

2.抗原包被板中包被温度与时间确定：将实施例4中获得的纯化的PCV2-Fu蛋白稀释至1mg/L后，包被96孔酶标板，分别设置不同孵育温度及时间(2～8℃孵育8h、2～8℃孵育16h、2～8℃孵育24h、2～8℃孵育32h)。按照实施例6的方法检测待检样品的抗体效价，以确定抗原包被温度及时间为2～8℃孵育过夜。

3.抗原包被板中封闭物质浓度确定：将实施例4中获得的纯化的PCV2-Fu蛋白稀释至1mg/L后，包被96孔酶标板，2～8℃孵育过夜。分别使用不同浓度的BSA封闭(0.5％、0.8％、1％、1.2％、1.5％)，200μL/孔。之后按照实施例6的方法检测待检样品的抗体效价，以确定封闭物质浓度为1％BSA。

4.抗原包被板中封闭时间确定：将纯化的PCV2-Fu蛋白稀释至1mg/L后，包被96孔酶标板，2～8℃孵育过夜。使用1％BSA封闭，200μL/孔，37℃条件下分别设置不同的反应时间(20min、30min、40min、50min、60min)，之后按照实施例6的方法检测待检样品抗体效价，以确定封闭时间为50min。

5.二抗稀释倍数确定：分别用PBST以不同倍数稀释酶标二抗(1:200、1:400、1:800、1:1600、1：3200、1：6400、1：12800、1：25600)，按照已经优化好的检测条件及实施例6的方法检测待检样品的抗体效价，以确定二抗稀释倍数为1：12800。

6.显色液作用时间确定：TMB室温恢复温度30分钟。加入TMB后，分别于37℃或室温作用15、30分钟显色，按照已经优化好的条件检测待检样品的抗体效价，以确定显色液作用时间为15min。

实施例8特异性及灵敏度检测

1.特异性检测：利用本发明制备的PCV2 ELISA抗体检测试剂盒分别检测猪瘟病毒(CFSV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRSV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)的阳性血清，同时用PCV2阳性血清和阴性血清作为对照，100μL/孔加入反应板，根据实施例7确定的检测条件进行检测，结果如表5所示，除PCV2阳性血清为阳性外，其余检测结果均为阴性，说明本发明的ELISA抗体检测试剂盒与其它病原的抗体之间并无交叉反应，具有良好的特异性。

表5ELISA试剂盒检测结果

注：“+”为阳性，“-”为阴性。

2.灵敏度检测：对PCV2抗体阳性血清分别按照1:100、1:300、1:1000、1:3000、1:10000、1:30000、1:50000、1:100000倍进行稀释，利用本发明ELISA抗体检测试剂盒对其进行检测，同时设置使用PCV2 Cap蛋白全长(NCBI Reference Sequence:YP_010774700.1)铺板的对照组，结果显示，本发明试剂盒其最高能够检测到阳性结果的血清稀释倍数为100000倍，而对照组最高能够检测到阳性结果的血清稀释倍数为1：10000，说明本发明ELISA抗体检测试剂盒灵敏度明显高于CAP全长制备的检测抗原。

表6ELISA试剂盒检测结果OD_450nm

综上，根据本发明提供的技术方案，提供的PCV2试剂盒，具有明显的特异性，钱呢挂钩检测试剂盒最高能够检测到阳性结果的血清稀释倍数低至100000倍，与现有技术中的PCV2 Cap蛋白全长抗原制备的试剂盒相比，具有更高的检测灵敏性。

显然，基于上述技术方案，本发明提供了一种无需以现有技术中CAP蛋白作为抗原的ELISA抗体检测试剂盒或胶体金试纸条，能够更加快速、准确地进行PCV2的检测，且具有良好的特异性和检测灵敏性，解决了现有技术中存在的对以衣壳蛋白为检测抗原，灵敏度不足以进行低浓度样本检测的技术问题。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种用于检测PCV2的重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白包括由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

或，由如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过替换、增加或截短得到的、且具有与PCV2抗体结合能力的衍生蛋白质。

2.编码如权利要求1所述的重组抗原蛋白的基因。

3.一种重组表达载体，其特征在于，包含如权利要求2所述的基因。

4.携带权利要求2所述基因，或权利要求3所述重组表达载体的宿主细胞。

5.一种重组抗原蛋白的构建方法，其特征在于，将权利要求3所述的重组表达载体同源重组到杆状病毒基因组中并转染昆虫细胞，构建得到重组杆状病毒；

所述重组表达载体同源重组到杆状病毒基因组中，得到重组杆状病毒基因组；

用所述重组杆状病毒基因组转染昆虫细胞后，培养被感染的昆虫细胞，分离和纯化后产生的外源蛋白，即为所述重组抗原蛋白；

可选的，所述昆虫细胞包括Sf9昆虫细胞。

6.一种非疾病诊断目的检测PCV2的方法，其特征在于，以权利要求1所述的重组抗原蛋白为抗原，通过抗原-抗体反应检测出猪圆环病毒2型的抗体来诊断猪圆环病毒2型。

7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，具体步骤包括：将权利要求1所述的重组抗原蛋白包被于酶标板中，经第一次孵育后加入酶标二抗，进行第二次孵育，避光进行显色反应，最后，加入终止液终止反应，进行OD_450nm值的检测；

8.权利要求1所述的重组抗原蛋白，或者权利要求2所述的基因，或者权利要求3所述的重组表达载体，或权利要求4所述的宿主细胞在制备检测猪圆环病毒2型的分子检测制品中的应用；可选的，所述分子检测制品包括抗体检测试剂盒和/或胶体金试纸条。

9.一种猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，包括包被有如权利要求1所述的重组抗原蛋白的抗原包被板；

进一步的，所述试剂盒中含有猪圆环病毒2型阳性血清、酶标二抗、底物显色液、样品稀释液、洗涤液和终止液。

10.一种猪圆环病毒2型胶体金试纸条，其特征在于，所述胶体金试纸条的诊断抗原为权利要求1所述的重组抗原蛋白。