CN116355863A - 适应传代细胞培养的猪非典型瘟病毒分离株及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了适应传代细胞培养的猪非典型瘟病毒分离株及其用途。本发明从确定为APPV感染的死亡仔猪中分离到一株适应传代细胞培养的APPV分离株，其微生物保藏编号是：CGMCC No.45417。该分离株可以在PK‑15细胞中连续稳定传代和增殖，且传代过程中病毒滴度逐渐增高。病毒中和试验(VNT)表明基于该分离株进行的VNT能够有效区分APPV抗体阳性血清和阴性血清。本发明提供的APPV分离株为APPV的生物学和致病性研究以及疫苗和诊断试剂的开发提供关键材料，对APPV引起的疾病诊断、感染监测体系的完善和所致疾病流行的控制等具有重要应用前景，同时还可用于制备诊断或防治APPV感染的检测试剂或疫苗。

Description

适应传代细胞培养的猪非典型瘟病毒分离株及其用途
技术领域
本发明涉及猪非典型瘟病毒分离株，尤其涉及适应传代细胞培养的猪非典型瘟病毒分离株及其用途，属于猪非典型瘟病毒分离株及其用途领域。
背景技术
瘟病毒是一类有囊膜且基因组高度变异的单股正链RNA病毒，属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)，可感染猪、反刍动物和野生动物等。猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)、牛病毒性腹泻病毒1型(bovine viral diarrheavirus 1，BVDV-1)、牛病毒性腹泻病毒2型(bovine viral diarrhea virus 2，BVDV-2)和边界病病毒(border disease virus，BDV)是目前主要的瘟病毒成员。近年来，多种新型瘟病毒相继在家畜和野生动物中被发现。国际病毒分类委员会于2017年发布新的瘟病毒分类指南，将瘟病毒属成员划分为A～K 11个种(Smith,D.B.,Meyers,G.,Bukh,J.,Gould,E.A.,Monath,T.,Muerhoff A.S.,Pletnev,A.,Rico-Hesse,R.,Stapleton,J.T.,Simmonds,P.,&Becher,P.(2017).Proposed revision to the taxonomy of the genus Pestivirus,family Flaviviridae.Journal of General Virology,98(8),2106–2112.https://doi.org/10.1099/jgv.0.000873)。
2015年，美国科研人员通过宏基因组测序在1份猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)阳性猪血清样本中发现一种新型瘟病毒，被称为猪非典型瘟病毒(atypical porcine pestivirus，APPV)(Hause,B.M.,Collin,E.A.,Peddireddi,L.,Yuan,F.,Chen,Z.,Hesse,R.A.,Gauger,P.C.,Clement,T.,Fang,Y.,&Anderson,G.(2015).Discovery of a novel putative atypicalporcine pestivirus in pigs in the USA.Journal of General Virology,96,2994–2998.https://doi.org/10.1099/jgv.0.000251)。随后，科研人员将APPV感染动物血清接种于怀孕母猪，发现所产仔猪头部和四肢肌肉发生阵发性震颤，影响仔猪正常吮乳，增加仔猪断奶前死亡率(Arruda,B.L.,Arruda,P.H.,Magstadt,D.R.,Schwartz,K.J.,Dohlman,T.,Schleining,J.A.,Patterson,A.R.,Visek,C.A.,&Victoria,J.G.(2016).Identification of a divergent lineage porcine pestivirus in nursing pigletswith congenital tremors and reproduction of disease following experimentalinoculation.PLoS One,11,e0150104.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0150104)。APPV属于黄病毒科瘟病毒属，被分类为Pestivirus K，其基因组是11～12kb的单股正链RNA，由5′非翻译区(UTR)、一个大的开放阅读框(ORF)和3′UTR组成。ORF编码3 635个氨基酸组成的多聚蛋白，在自身及宿主蛋白酶的作用下加工水解产生4种结构蛋白(C、Erns、E1和E2)和8种非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)(Hause et al.,2015)。瘟病毒的E2糖蛋白能够引起高水平的中和抗体，是诊断试剂和疫苗研发的主要靶标。值得注意的是，与CSFV和BVDV相比，APPV E2糖蛋白缺失了两个较完整的N末端结构域，这导致其(241aa)明显小于其他瘟病毒的E2蛋白(373～378aa)(Riedel,C.,Aitkenhead,H.,El Omari,K.,&Rümenapf,T.(2021).Atypical porcine pestiviruses:relationships and conserved structural features.Viruses,13(5),760.https://doi.org/10.3390/v13050760)。由于E2蛋白也介导瘟病毒的细胞入侵，这段缺失可能导致APPV进入宿主细胞的能力与其它瘟病毒有所差别(Cagatay,G.N.,Antos,A.,Suckstorff,O.,Isken,O.,Tautz,N.,Becher,P.,&Postel,A.(2021).Porcine complement regulatoryprotein CD46 is a major receptor for atypical porcine pestivirus but not forclassical swine fever virus.Journal of Virology,95(9),e02186-20.https://doi.org/10.1128/JVI.02186-20)。
到目前为止，APPV引起的仔猪先天性震颤在欧洲、美洲和亚洲见诸报道。基于不同的基因遗传分析，APPV可以划分为三个主要基因型，基因2型和3型毒株仅在亚洲地区发现，而基因1型毒株在世界范围内普遍存在，并显示出高度的变异(Yuan,F.,Feng,Y.,Bai,J.,Liu,X.,Arruda,B.,Anbalagan,S.,&Peddireddi,L.(2022).Genetic diversity andprevalence of atypical porcine pestivirus in the Midwest of US swine herdsduring 2016-2018.Transboundary and Emerging Diseases,69(2),753–763.https://doi.org/10.1111/tbed.14046)。APPV体外分离较为困难，Hause和Arruda等尝试在原代猪肾细胞和传代猪肾细胞系(PK-15、IBRS-2和SK6)分离病毒，但并未成功(Hause,B.M.,Collin,E.A.,Peddireddi,L.,Yuan,F.,Chen,Z.,Hesse,R.A.,Gauger,P.C.,Clement,T.,Fang,Y.,&Anderson,G.(2015).Discovery of a novel putative atypical porcinepestivirus in pigs in the USA.Journal of General Virology,96,2994–2998.https://doi.org/10.1099/jgv.0.000251；Arruda,B.L.,Arruda,P.H.,Magstadt,D.R.,Schwartz,K.J.,Dohlman,T.,Schleining,J.A.,Patterson,A.R.,Visek,C.A.,&Victoria,J.G.(2016).Identification of a divergent lineage porcine pestivirusin nursing piglets with congenital tremors and reproduction of diseasefollowing experimental inoculation.PLoS One,11,e0150104.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0150104)。迄今，APPV对猪的致病性研究都是通过将感染动物组织匀浆或者血清无菌处理后接种怀孕母猪进行的，而细胞分离株对猪只的致病性目前尚无报道。
目前的研究表明，APPV毒株的遗传多样性很高，即使在一个国家内，APPV毒株的遗传差异也是非常大的(吴伟鑫,黄金,周磊,杨汉春.2015—2017年我国部分地区猪非典型瘟病毒的遗传变异分析[J].畜牧兽医学报,2020,51(08):1939-1948.)。迄今为止，我们对APPV的来源以及如何传播到猪群仍不清楚，但鉴于APPV广泛分布于三大洲的许多国家，表现出大流行潜力，因此未来有必要进行更多地区的流行病学调查及病毒分离鉴定，以监测APPV的遗传演变，并评估APPV单独感染或与其他猪病原体混合感染对猪群的影响。
由于APPV在适合猪瘟病毒等其它瘟病毒增殖的细胞系中复制非常有限，体外分离非常困难，这极大地限制了对该病原的致病机制研究、疫苗开发和诊断试剂研制，导致APPV疫苗和诊断试剂研发以及对病毒感染和致病性的研究受到阻碍。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株可稳定传代的适应传代细胞培养的APPV分离株；
本发明的目的之二是将所述的可稳定传代的适应传代细胞培养的APPV分离株应用于制备诊断APPV感染的检测试剂或用于制备防治APPV疫苗等。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明首先提供了一株可稳定传代的适应传代细胞培养的APPV分离株，其分类命名是：猪非典型瘟病毒；微生物保藏编号是：CGMCCNo.45417；保藏时间是：2023年2月8日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明对黑龙江省某猪场发病死亡仔猪进行RT-PCR检测和测序，确定为APPV感染，进一步将APPV阳性样品接种于PK-15细胞并盲传多代进行病毒分离，RT-PCR结果显示，每代次细胞培养物检测均为APPV阳性；随后通过间接免疫荧光试验(IFA)证实，该分离株可以在PK-15细胞上稳定传代，随着代次增加，病毒滴度呈上升趋势，目前已稳定传代至30代；进一步通过透射电子显微镜观察到有囊膜的球形病毒粒子，直径约为40-50nm，与瘟病毒形态和大小一致。以上结果表明，本发明成功分离获得一株可稳定传代的APPV毒株，将其命名为分离株China/HLJ491/2017。
本发明进一步对分离株China/HLJ491/2017进行了体外增殖特性分析，结果显示，该毒株感染PK-15细胞72h后，病毒滴度可达105.5TCID50/mL。
为了进一步鉴定分离株China/HLJ491/2017，本发明确定了China/HLJ491/2017株的全基因组序列，基于APPV分离株全基因组序列构建进化树，并与NCBI公布的APPV参考毒株核苷酸和氨基酸序列进行同源性比对分析，发现China/HLJ491/2017株属于APPV基因2型，与相同基因型毒株同源性在93.3～97.6％，与不同基因型毒株核苷酸同源性在80.9～83.5％。另外，本发明所分离的分离株China/HLJ491/2017(基因2型)与德国分离株(Ger-NRW_L277株，基因1型)基因型不同，基因2型毒株目前仅在亚洲(主要是中国)被发现。另外，上述两个分离株的核苷酸序列差异较大，同源性仅为83.4％，这些差异可能会导致毒株的复制能力和致病力等生物学特性存在不同。
本发明进一步利用分离的APPV China/HLJ491/2017株进行了病毒中和试验(VNT)，表明基于该分离株进行的VNT能够有效区分APPV抗体阳性血清和阴性血清。鉴于VNT是瘟病毒的金标准方法，因此本发明提供的APPV分离株能够为APPV诊断试剂研发提供金标准参考方法。
综上，本发明成功分离到一株可以在PK-15细胞上连续传代的APPV分离株，该分离株可以在PK-15细胞中连续稳定传代和增殖，且传代过程中病毒滴度逐渐增高；该APPV分离株将为该病毒的生物学和致病性研究以及疫苗和诊断试剂的开发提供关键材料，对APPV引起的疾病诊断、感染监测体系的完善和所致疾病流行的控制等具有重要应用价值，同时还可用于制备诊断APPV感染的快速检测试剂和疫苗研究。
附图说明
图1为不同代次的APPV分离株China/HLJ491/2017在PK-15细胞中的感染情况。
图2为电子显微镜观察APPV分离株China/HLJ491/2017病毒粒子形态；(A)APPVChina/HLJ491/2017株感染细胞培养上清中的病毒颗粒；(B)APPV China/HLJ491/2017株感染的细胞中的病毒颗粒。
图3为APPV分离株China/HLJ491/2017在PK-15细胞上的多步生长曲线。
图4为APPV分离株China/HLJ491/2017全基因组扩增片段；M：DL2000 DNA Marker；1：APPV-1F/1R；2：APPV-2F/2R；3：APPV-3F/3R；4：APPV-4F/4R；5：APPV-5F/5R；6：APPV-6F/6R；7：APPV-7F/7R；8：APPV-8F/8R；9：APPV-9F/9R；10：APPV-10F/10R。
图5为APPV分离株China/HLJ491/2017全基因组进化树分析。
图6为临床APPV感染场猪血清对APPV China/HLJ491/2017株的中和情况；(A)将APPV China/HLJ491/2017株以200TCID50/100μL的剂量感染PK-15细胞，未感染病毒的PK-15细胞作为阴性对照；(B)临床APPV感染场猪血清从1：4开始连续2倍稀释进行VNT，血清中APPV中和抗体滴度最高为128。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
试验例1适应传代细胞培养的猪非典型瘟病毒毒株的分离、鉴定以及APPV病毒中和试验
1试验材料和方法
1.1临床样品、抗体和细胞
2017年7～8月，黑龙江省某猪场60头断奶仔猪发病，死亡率为10％。猪只均免疫过常规疫苗，包括猪瘟疫苗、蓝耳病疫苗、猪圆环病毒2型(PCV2)疫苗、伪狂犬病疫苗。患病仔猪临床表现为渐进式消瘦、生长缓慢，出现咳喘、腹式呼吸等呼吸道症状以及眼睑肿胀或皮炎等。病死猪的组织样品被当地兽医送往中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪烈性传染病创新团队实验室(以下简称“本发明人实验室”)进行诊断，本发明人实验室通过PCR/RT-PCR或荧光定量PCR(qPCR)/RT-qPCR对CSFV、PRRSV、伪狂犬病病毒(PRV)、PCV2、猪细小病毒(PPV)、猪流感病毒(SIV)和APPV病原进行了检测，确定为APPV和PCV2阳性，其它病原均为阴性。
PK-15细胞由本发明人实验室保存，并用含有10％胎牛血清(FBS)、100μg/mL链霉素和100IU/mL青霉素的DMEM培养基在37℃和5％ CO2条件下培养；针对APPV E2蛋白的单克隆抗体(MAb)6E2由本发明人实验室制备并保存；PCV2抗血清由哈尔滨国生生物科技股份有限公司提供。
1.2病料处理、RNA提取和cDNA合成
将组织样品剪碎置于研钵中，加入适量无菌石英砂充分研磨，然后加入1mL DMEM培养基制成悬液并转移至1.5mL离心管中，反复冻融3次，4℃、2 000×g离心10min，吸取上清200μL按照Simply P总RNA提取试剂盒(BioFlux，中国)说明书提取病毒RNA，最后加入40μL无RNA酶的DEPC处理水洗脱，进行反转录，体系为RNA模板6μL、AMV 0.5μL、RRI 0.5μL、dNTP4μL、AMV Buffer 4μL、随机引物9N 1μL、DEPC水5μL，混匀后，置于42℃水浴锅孵育1h后备用。
1.3RT-PCR和测序
RT-PCR按照Postel等(Postel,A.,Meyer,D.,Petrov,A.,&Becher,P.(2017).Recent emergence of a novel porcine pestivirus:interference with classicalswine fever diagnosis？Emerging Microbes&Infections,6,1-2.https://doi.org/10.1038/emi.2017.5)发表的引物进行，正向引物APPV_5030-fw(5′-CCCCAGGCAATACCTCACAAC-3′)和反向引物APPV_5469-rev(5′-CCCCCTTTTTGGTTCCTCCC-3′)，使用Ex Taq聚合酶(TaKaRa，中国)扩增APPV的部分NS3基因(440bp)。PCR反应程序为：95℃预变性5min，35个扩增循环(56℃30s和72℃45s)，72℃延伸10min。PCR产物用Omega胶回收试剂盒(Omega，美国)纯化后进行测序。
1.4病毒分离
将RT-PCR鉴定为APPV核酸阳性的猪组织制成匀浆并冻融后，4℃条件下2000×g离心10min，将上清液经0.45μm滤膜(Millipore，美国)过滤除菌，然后接种培养密度为80％左右的PK-15细胞，在37℃和5％ CO2下培养72h。随后将培养物反复冻融3次，4℃条件下2000×g离心10min收获上清。然后，将上清再次接种PK-15细胞，盲传5代。每一代收获的培养上清液均使用RT-qPCR和qPCR分别进行APPV和PCV2检测(Liu,H.,Shi,K.,Zhao,J.,Yin,Y.,Chen,Y.,Si,H.,Qu,S.,Long,F.,&Lu,W.(2022).Development of a one-step multiplexqRT-PCR assay for the detection of African swine fever virus,classical swinefever virus and atypical porcine pestivirus.BMC Veterinary Research,18(1),43.https://doi.org/10.1186/s12917-022-03144-4；Olvera,A.,Sibila,M.,Calsamiglia,M.,Segalés,J.,&Domingo,M.(2004).Comparison of porcine circovirustype 2load in serum quantified by a real time PCR in postweaningmultisystemic wasting syndrome and porcine dermatitis and nephropathysyndrome naturally affected pigs.Journal of Virological Methods,117(1),75–80.https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2003.12.007)。
为了保证分离的APPV分离株的纯净性，将第11代的病毒培养物与等体积的抗PCV2血清(用DMEM进行1:10稀释)混合，37℃孵育2h以中和培养物中可能存在的PCV2。然后，将中和后的病毒培养物接种PK-15细胞，37℃培养72h。将培养物反复冻融三次后收获上清，并在PK-15细胞中继续传代，用RT-qPCR和qPCR分别对第12代到20代的病毒培养物进行APPV和PCV2检测。
1.5间接免疫荧光试验(IFA)和透射电子显微镜(TEM)观察
将PK-15细胞铺于96孔板中，12h后接种RT-PCR鉴定为APPV阳性的病毒液，同时设置未接种病毒液的正常细胞对照，在37℃和5％ CO2条件下培养72h。取出96孔板弃去培养液，每孔加入100μL预冷的无水乙醇于4℃固定30min；然后加入用含5％牛血清白蛋白的PBS进行1:200稀释的抗APPV E2蛋白的MAb 6E2，置于37℃温箱孵育2h；用PBST洗5次后加入1:300倍稀释的FITC标记的山羊抗鼠IgG(Invitrogen，美国)，37℃孵育1h；用PBST洗5次后加入50μL甘油-PBS缓冲液(1:1)，使用倒置荧光显微镜(Nikon TE200，日本)进行荧光观察。利用Reed和Muench法计算病毒滴度(Reed,L.J.,Muench,H.(1983).Asimple method ofestimating fifty percent endpoints.American Journal of Hygiene,27,493–4973)。
将病毒培养物冻融三次后，在4℃下8000×g离心30min除去细胞碎片。然后25,000×g离心3h，弃去上清液，将沉淀物重悬于100μL PBS中。然后用2％磷钨酸进行负染并使用透射电子显微镜(Hitachi,Tokyo,日本)观察病毒形态。将APPV感染的PK-15细胞固定于2.5％戊二醛中，然后参考已发表的文献(Zhao,C.,Chen,C.,Li,Y.,Dong,S.,Tan,K.,Tian,Y.,Zhang,L.,Huang,J.,&Zhang,L.(2019).Genomic characterization of a novelrecombinant porcine astrovirus isolated in northeastern China.Archives ofVirology,164(5),1469–1473.https://doi.org/10.1007/s00705-019-04162-8)制成超薄切片，并用透射电子显微镜进行观察。
1.6多步生长曲线
将PK-15细胞铺于24孔板，待细胞汇合度达到80％，将传代至第18代的病毒液以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.1的剂量接种细胞，在37℃和5％ CO2下孵育2h，以允许病毒吸附。然后弃去上清，用无血清的DMEM洗涤3次，加入500μL含10％ FBS的DMEM，在37℃、5％CO2条件下继续培养，在不同时间点(12、24、36、48、60、72和84h)分别收取细胞培养物置于-80℃冰箱，反复冻融3次后，离心收取上清。利用IFA测定不同时间点的病毒滴度(TCID50)，绘制多步生长曲线。
1.7全基因组扩增
参考APPV_VIRES_NM01_C1毒株(GenBank登录号为MK378658)的全基因组序列，用软件SnapGene 4.1.9设计10对扩增区域相互重叠的特异性引物，用于扩增APPV的完整基因组，序列信息详见表1。
PCR反应程序为：95℃预变性5min，扩增35个循环(56℃30s和72℃1min 45s)，72℃延伸10min。PCR扩增产物用Omega胶回收试剂盒(Omega，美国)纯化，并克隆到pMD18-T载体(TaKaRa，中国)中，将连接产物转化到大肠杆菌(DH5α)感受态细胞。挑取阳性菌落，并将其测序。使用DNASTAR 7.1软件中的SeqMan程序进行拼接和组装，生成完整的APPV全长基因组序列。
表1APPV全基因组引物序列
Figure BDA0004137456140000101
Figure BDA0004137456140000111
1.8序列分析
将获得的APPV全基因组序列与GenBank数据库中公布的24株APPV毒株序列进行比对，分析其同源性，并绘制系统发育进化树。使用DNASTAR 7.1软件进行多序列比对和序列相似性计算，利用MEGA7软件中的Neighbor-Joining算法进行进化树分析，Bootstrap为1000次重复。
1.9病毒中和实验(VNT)
VNT被认为是瘟病毒的金标准方法，本试验利用所分离的APPV China/HLJ491/2017株进行VNT，对现地某猪场(该场曾经发生过APPV感染，病猪利用2.2中RT-PCR方法及测序确定为APPV阳性)的猪血清4份进行APPV抗体检测，同时以SPF猪血清(2份)作为对照，具体步骤参考Cagatay et al.(Cagatay,G.N.,Meyer,D.,Wendt,M.,Becher,P.,&Postel,A.(2019).Characterization of the humoral immune response induced afterinfection with atypical porcine pestivirus(APPV).Viruses,11(10),880.https://doi.org/10.3390/v11100880)公布的方法进行。
2试验结果
2.1适应传代细胞培养的APPV分离株的体外分离与鉴定
将鉴定为APPV核酸阳性的猪组织匀浆(PCV2也为阳性)接种于PK-15细胞并盲传5代，通过RT-qPCR和qPCR检测，发现1-5代次细胞培养物APPV和PCV2均为阳性。为了获得纯净的APPV分离株，将第11代病毒培养物用抗PCV2血清处理，然后继续接种PK-15细胞进行传代，RT-qPCR和qPCR检测结果显示，随着代次增加，PCV2的Ct值逐渐上升，从第17代起未检测到PCV2，而只检测到APPV，表明PCV2被完全清除(表2)。值得注意的是，发现未用抗PCV2血清处理组(未处理组)后续各个代次的病毒培养物PCV2的Ct值也逐渐升高，从第17代起也未检测到PCV2，表明不用PCV2抗血清处理，PCV2也会随着传代次数增加逐渐消失。
为了进一步对APPV分离株进行鉴定，将第10、20和30代的病毒培养物接种于PK-15细胞，然后利用本发明人实验室制备的针对APPV E2蛋白的特异性单克隆抗体进行IFA检测，结果发现，不同代次的病毒培养物可见特异性荧光灶，并且随着传代次数增加，荧光灶逐渐增多，表明该毒株可以在PK-15细胞中连续稳定传代，且传代过程中病毒滴度逐渐增高，以上结果表明，本实验成功分离到一株适应传代细胞培养的APPV分离株，将其命名为China/HLJ491/2017株(图1)，其微生物保藏编号为CGMCC No.45417。
为了确认所分离的APPV China/HLJ491/2017株的病毒粒子形态，对该病毒分离株细胞培养上清和病毒感染细胞中的病毒粒子进行电子显微镜观察，结果显示，所分离的APPV分离株为有囊膜的球形粒子，直径约为50nm，与瘟病毒的形态和大小相近(图2)。
表2不同代次病毒培养物APPV和PCV2核酸检测情况
Figure BDA0004137456140000121
2.2APPV分离株的体外复制动力学
将第18代APPV China/HLJ491/2017株以MOI＝0.1的剂量接种PK-15细胞，并分别在不同时间点(12、24、36、48、60、72和84h)收获病毒上清，通过IFA测定病毒滴度，结果表明，APPV China/HLJ491/2017分离株可在PK-15细胞中有效增殖，并在感染后72h病毒滴度达到峰值，为105.5TCID50/mL(图3)。
2.3APPV分离株的全基因组特征及序列分析
提取APPV China/HLJ491/2017株第10代病毒液的RNA，用全基因组测序引物进行RT-PCR扩增，成功扩增到10个目的片段，条带大小与预期一致(图4)。用DNASTAR 7.1软件将10个特异性扩增片段的测序结果进行拼接，获得China/HLJ491/2017分离株的全基因组序列。基于病毒的全基因组序列进行进化树分析结果显示，目前APPV分离株主要分为3个基因型，而China/HLJ491/2017分离株属于基因2型(图5)。应用MegAlign Clustal W算法分析China/HLJ491/2107与NCBI上的参考毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性。结果表明，China/HLJ491/2107分离株与同一基因型毒株的同源性在93.3～97.6％，与其中APPV_VIRES_NM01_C1株的核苷酸同源性最高，达97.6％；与不同基因型毒株的核苷酸同源性在80.9～83.5％(表3)。
Figure BDA0004137456140000141
Figure BDA0004137456140000151
2.4APPV分离株中和抗体的检测
病毒中和试验(VNT)是瘟病毒的金标准方法，本实验利用所分离的APPV China/HLJ491/2017分离株进行了VNT，以检测猪血清中针对APPV的抗体。对现地曾发生APPV感染的某猪场(该场曾出现APPV感染，病猪利用1.2中RT-PCR方法及测序确定为APPV阳性)猪血清4份，以及SPF猪血清2份进行APPV抗体检测。
VNT检测结果显示，采用APPV分离株检测的APPV感染场猪血清APPV中和抗体滴度最高为128(图6)，而SPF猪血清则检测不到APPV抗体。

Claims (6)

1.一株适应传代细胞培养的猪非典型瘟病毒(atypicalporcine pestivirus)分离株，其特征在于，其微生物保藏编号是：CGMCC No.45417。
2.根据权利要求1所述的猪非典型瘟病毒分离株，其特征在于，所述的传代细胞是PK-15细胞。
3.权利要求1或2所述的猪非典型瘟病毒分离株在制备诊断猪非典型瘟病毒感染的试剂中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的诊断猪非典型瘟病毒感染的试剂是检测猪非典型瘟病毒的抗原或抗体。
5.一种检测猪非典型瘟病毒检测试剂盒，包括检测猪非典型瘟病毒抗原或抗体，其特征在于，所述的检测猪非典型瘟病毒抗原或抗体是权利要求1或2所述的猪非典型瘟病毒分离株。
6.权利要求1或2所述的猪非典型瘟病毒分离株在制备防治猪非典型瘟病毒感染的疫苗中的用途。
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