CN117843717A - 一种以多肽为底物的颗粒酶b响应型组装体及其制备方法和应用 - Google Patents
一种以多肽为底物的颗粒酶b响应型组装体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明公开了一种以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体及其制备方法和应用。该探针是基于Gd(III)的核磁共振弛豫成像造影剂，合成方法如下：首先将亲水性的化合物1和颗粒酶B的底物肽(pep)连接，然后将可螯合Gd(III)的疏水性螯合剂化合物2连接到底物肽的另一端，产物与GdCl3·6H2O搅拌，使Gd(III)充分螯合。使用两相搅拌法将产物通过亲疏水作用组装，得到最终的组装体。本发明中的组装体可以在肿瘤免疫产生的部位响应，产生核磁共振弛豫成像信号改变，而在未产生肿瘤免疫的部位则没有信号变化，该探针可以区分肿瘤免疫是否产生，为肿瘤的免疫治疗提供指导。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学工程材料领域，尤其涉及一种以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体及其制备方法和应用。
背景技术
传统的免疫学评估方法主要包括活检的组织学诊断和血液(或尿液)样本的生化分析。然而这些体外方法是侵入性的，且没有时空信息。而体内成像无论是在临床检测还是作为研究工具来说，对于实时观察体内情况都带来了巨大的便利。其中，核磁共振弛豫成像(MRI)展现出较大的优势，主要包括：该成像方式是非入侵式的；对人体没有电离辐射损伤；可获得多方位的图像，提供更丰富的影像信息且易于临床转化。为了提高成像对比度，呈现更好的成像效果，通常需要引入造影剂。
钆相关造影剂作为一种T1造影剂，可以提供较为明亮的阳性信号，但其生物安全性较低。大量证据表明，钆相关造影剂具有较强的肾毒性，可导致肾原性系统纤维化，FDA对钆相关造影剂提出了“黑框警告”。因此，对Gd(III)进行螯合及组装，减少其肾代谢，成为一个新的研究方向。
此外，传统非响应型组装体作为MRI造影剂无论是否到达目标组装，均会产生信号，可能出现假阳，其在体内的成像效果受到极大的限制。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体，主要引入酶响应型的多肽，使其组装成具有颗粒酶B响应的纳米组装体，使其具有较好的生物安全性及较好的成像效果；本发明的另一目的是提供一种以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体的制备方法；本发明的另一目的是提供一种以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体的应用。
技术方案：本发明的一种以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体，所述颗粒酶B响应型组装体通过具有两亲性的化合物自组装而成；两亲性的化合物以酶响应的底物多肽为连接，该多肽的一端连接有亲水性化合物，多肽的另一端连接有疏水性化合物，疏水性化合物内螯合有Gd(III)；其中，亲水性化合物为含有羧基的亲水聚合物，该羧基用于与上述多肽连接；疏水性化合物为螯合剂，富含O、N且可提供配位电子，配位电子用于与Gd(III)形成配位键，该疏水性化合物含有羧基或酯键用于与上述多肽连接；上述多肽为包含颗粒酶B底物在内的一段多肽序列，其羧基端或两端含有多余的氨基酸作为反应位点。
作为优选，亲水性化合物为末端修饰羧基的聚乙二醇，聚丙烯酸中的一种或几种，
疏水性化合物可与氨基或巯基反应，同时富N、O等含有孤对电子可与Gd(III)形成配位键的原子。作为优选，疏水性化合物为原卟啉，次卟啉，血卟啉，间卟啉，粪卟啉，尿卟啉，酚卟啉，二氢卟吩e6，脱镁叶绿素a及其衍生物中的一种或几种。
作为优选，多肽为包含颗粒酶B底物(包括但不限于IEFD，IEPD)在内的一段多肽序列，其羧基端或两端含有多余的氨基酸以提供氨基(赖氨酸，精氨酸)或巯基(半胱氨酸)作为反应位点。
作为优选，亲水性化合物为末端修饰羧基的聚乙二醇，疏水性化合物为原卟啉，多肽为pep，具有如下化学结构：
本发明中，以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体通过化学反应将亲水端与疏水螯合剂连接到pep两端，该pep是组装体具有酶响应性的关键。其中，反应产生的两亲性的化合物具有两亲性，在剧烈搅拌或超声的作用下，可通过亲疏水作用力自组装，形成纳米组装体。
优选地，两亲性的化合物具有如下化学结构：
本发明中亲疏水作用力组装的以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体具有较好的亲水性及稳定性。首先，该组装体具有纳米级尺寸，可以通过高通透性和滞留效应(EPR效应)长期聚集在肿瘤部位，产生on的信号。当肿瘤部位免疫被激起时，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)产生颗粒酶B，颗粒酶B识别并剪切底物pep，组装体部分解组装且亲水性减弱，产生off的信号；相比于肿瘤免疫产生的部位，未激起肿瘤免疫的部位在一定时间内则不会产生明显的信号减弱，从而达到肿瘤免疫成像的目的，在一定程度上增强了成像的对比度及灵敏度。
优选地，以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体的粒径为100±10nm
另一方面，本发明提供一种上述的以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将亲水性的化合物1与底物多肽pep连接，得到化合物3；化合物1为含有羧基的亲水聚合物；底物多肽的一端含有氨基或巯基；
2)将化合物3与化合物2连接，得到化合物4；化合物2为疏水性化合物，可作为螯合剂且含有羧基或酯键基团，羧基或酯键基团用于与底物多肽连接；
3)将化合物4溶于与GdCl3·6H2O搅拌，使Gd(III)与螯合剂充分螯合，得到化合物5；
4)化合物5通过亲疏水作用自组装，形成以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体。
进一步地，步骤1)中，合成化合物3的反应为酰胺反应，或，巯基和羧基的加成反应。
进一步地，化合物3合成方法为：将亲水性化合物1与催化剂溶于N,N-二甲基甲酰胺中，充分活化后，缓慢滴加至溶于N,N-二甲基甲酰胺的pep中，在室温下进行反应，待反应完全后，进行分离提纯，得到化合物3。
作为优选，催化剂为2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，1-羟基苯并三唑，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺/N-羟基丁二酰亚胺，2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉中的任意一种。
进一步地，步骤2)中，合成化合物4的反应为羧基和氨基的酰胺反应、巯基和羧基的加成反应、酯基和氨基的氨解反应、卤素和巯基的亲核取代反应、卤素和氨基的亲核取代反应中任意一种反应。
进一步地，化合物4合成方法为：将化合物2与催化剂溶于N,N-二甲基甲酰胺中，充分活化后，将溶于N,N-二甲基甲酰胺的化合物3缓慢滴加至反应体系，在室温下进行反应，待反应完全后，进行分离提纯，得到化合物4。
进一步地，步骤3)中，将化合物4溶于良溶剂中，再与溶于水的GdCl3·6H2O在室温下搅拌，待反应完全后，进行分离提纯，得到化合物5。
作为优选，步骤3)中，良溶剂为水，甲醇，N,N-二甲基甲酰胺，二甲亚砜，乙醇等中的一种或几种。
步骤4)中，自组装方法为两相混合法，将化合物5溶于除水之外的良溶剂中，滴加入水中，超声或超声破碎或剧烈搅拌进行组装，减压蒸馏或透析除去良溶剂。
作为优选，良溶剂包括甲醇，N,N-二甲基甲酰胺，二甲亚砜，乙醇，二氯甲烷，三氯甲烷等。
另一方面，本发明提供一种上述的以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体在制备造影剂中的应用。
具体的，本发明提供一种如上述的以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体在制备肿瘤及肿瘤免疫核磁共振弛豫成像造影剂中的应用。
本发明以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体具备良好的生物相容性和成像效果，在肿瘤免疫响应的部位产生显著核磁共振弛豫成像信号变化。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)本发明中的以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体具有纳米级粒径，可以长期滞留在肿瘤部位产生on的信号，而当肿瘤部位产生免疫响应后，细胞毒性T淋巴细胞成熟产生颗粒酶B，颗粒酶B识别并剪切底物肽，使该组装体结构改变，信号减弱。本发明中以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体可以实现由on到off的信号变化，大大减少了假阳性发生的概率。
(2)本发明中的反应条件温和，步骤简单，所制备的以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体具有较好的稳定性。
(3)本发明中，使用含螯合剂的化合物4将Gd(III)螯合，并形成纳米组装体，利用其较好的成像效果的同时，大大降低了Gd(III)导致的肾毒性的可能，具有较好的生物相容性，因此有潜在临床转化的可能性。
附图说明
图1为本发明的以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体的制备过程示意图
图2为实施例1中合成的化合物4的核磁共振氢谱图。
图3为实施例2中合成的化合物5的T1加权核磁共振弛豫成像信号图。
图4为实施例3中组装体形成的图片。
图5为实施例3中组装体的动态光散射粒度分布图。
图6为实施例3中组装体的透射电子显微镜图。
图7为实施例4中组装体与颗粒酶B共孵育后的透射电子显微镜图。
图8为实施例4中组装体与颗粒酶B共孵育前后T1加权核磁共振弛豫成像信号变化图。
图9为实施例5中正常细胞与组装体共孵育后的存活率示意图。
图10为实施例6中小鼠乳腺癌细胞与组装体共孵育后的存活率示意图。
图11为实施例7中细胞毒性T淋巴细胞与组装体共孵育后的存活率示意图。
图12为实施例8中小鼠乳腺癌细胞对组装体内吞情况的荧光显微镜图。
图13为实施例9中细胞毒性T淋巴细胞对组装体内吞情况的荧光显微镜图。
图14为实施例10中小鼠乳腺癌细胞及细胞毒性T淋巴细胞与组装体共孵育后，T1加权核磁共振弛豫成像信号图。
具体实施方式
如图1所示，在一实施例中，提供一种以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体，该响应为颗粒酶B响应；所述纳米组装体通过在响应pep两端分别修饰亲水化合物1和疏水化合物2，进而通过亲疏水作用组装获得。化合物1为含有羧基的亲水性高分子化合物，该化合物的羧基可在催化剂存在的条件下与pep一端的氨基或巯基进行反应；化合物2为含有羧基、酯键、卤素等可与氨基或巯基进行反应的疏水性化合物，且该化合物可与Gd(III)螯合；pep为包含可被颗粒酶B识别并剪切片段的一段多肽，其羧基端或两端修饰有含氨基或巯基的氨基酸以提供反应位点。
下面以各优选方案中的较优实施例进行举例说明。
实施例1：化合物4的合成
合成路线如下：
将化合物1(PEG5000-COOH)(50mg，10mmol)和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(7.6mg，20mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，充分活化后，加入N,N-二异丙基乙胺(3.3μl，20mmol)将反应体系调至弱碱性，得到活化的聚乙二醇。将pep(26.4mg，30mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，边剧烈搅拌或超声边缓慢滴加活化的聚乙二醇，室温反应过夜。反应结束后，透析得化合物3。将已获得的化合物3的水溶液使用冷冻干燥法除去溶剂。取40mg化合物3(6.8mmol)重悬于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中备用。将化合物2(原卟啉)(11.6mg，20.4mmol)和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(7.8mg，20.4mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，充分活化后，加入N,N-二异丙基乙胺(6.8μl，40.8mmol)将反应体系调至弱碱性，边剧烈搅拌或超声边缓慢将溶于N,N-二甲基甲酰胺的化合物3滴加入活化后的反应体系。反应结束后，先使用DMF透析，除去没有反应的反应物，再使用水透析，得到化合物4的水溶液，通过冷冻干燥法除去溶剂，并通过核磁进行验证其合成。
化合物4的核磁数据如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.41(s,1H),10.33(s,1H),10.25(s,1H),8.41(d,J＝80.5Hz,9H),7.95(s,1H),7.22(s,5H),6.46(d,J＝17.9Hz,2H),6.23(d,J＝11.5Hz,2H),5.98(s,1H),5.52(s,1H),5.32(s,1H),4.33(s,3H),4.03(d,J＝7.1Hz,8H),3.51(s,475H),1.23(s,6H),1.17(d,J＝7.8Hz,4H),0.84(d,J＝6.8Hz,3H).
化合物4的核磁共振氢谱图如图2所示，表明以pep为连接的一端亲水、一端疏水的聚合物成功合成。
实施例2：化合物5的合成
化合物5的合成即为Gd(III)的螯合。将化合物4(32mg，5mmol)与GdCl3·6H2O(9.3mg，25mmol)溶于去离子水中(5ml)，室温下搅拌48h，透析除去过量的Gd(III)，得到化合物5。
将相同摩尔量的化合物4和化合物5溶于等体积的去离子水，进行核磁共振弛豫成像信号检测，结果如图3所示，化合物5的水溶液表现出显著增强的T1加权成像信号，表明Gd(III)的成功螯合。
实施例3：以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体的合成
称取20mg化合物5，溶于100μl二甲亚砜，充分溶解后，边超声或剧烈搅拌边滴加入1ml去离子水中，室温搅拌至有明显乳光产生，透析除去未组装的化合物5，得到以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体。
组装前后水溶液乳光变化如图4所示，化合物5分散在去离子水中表现为为均一、澄清、透亮的水溶液；组装体分散在去离子水中表现出较为均一的乳浊液，长时间静置无明显沉淀生成。
用动态光散射仪对所得组装体进行粒度表征，结果如图5所示。
对所制备得到的组装体通过透射电子显微镜进行形貌大小表征，如图6所示，组装体大小约为100nm。
实施例4：以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体的体外酶响应考察
使用pH 7.4的PBS将组装体稀释至适宜浓度，并加入溶解在pH 7.4的PBS中的颗粒酶B，对照组加入同样体积的pH 7.4的PBS，放置于37℃恒温水浴锅保温一段时间。
对与颗粒酶B共孵育后的组装体通过透射电子显微镜进行形貌大小表征，如图7所示，组装体解体，疏水端以类似纳米纤维的状态存在。
采用倍半稀释的方法，对样品进行浓度梯度的稀释，测量该浓度梯度样品的T1加权图像，结果如图8所示。随着样品浓度增加，T1加权成像显示出更为明亮的信号，即核磁共振弛豫成像信号在一定范围内与样品浓度呈正相关。进一步的，与颗粒酶B共孵育后，T1信号减弱，表明组装体解组装，与动态光散射仪和透射电子显微镜所测结果一致。
实施例5：评价以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体对正常细胞的毒性
此处选用人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)。于96孔板上接种适量HUVEC细胞，当细胞生长至70～80％汇合度时换用不同浓度(0，0.038，0.075，0.15mmol/L)的颗粒酶B响应型组装体的空白培养基稀释液进行孵育，每组选用三个复孔，对照组选用空白培养基进行孵育。孵育24h后弃去药液，用PBS冲洗三次，去除残留药液，按照CCK-8试剂盒的操作说明进行操作，加入CCK-8工作液1-3h后，用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度值(OD值)，按照如下公式计算细胞的存活率：
细胞存活率＝OD Sample/OD Control×100％
结果如图9所示，细胞存活率均在100％左右，表明以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体对HUVEC细胞基本无显著毒性，即该组装体具有较好的生物相容性。
实施例6：评价以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体对癌细胞的毒性
参照实施例5的细胞毒性评价方法，差异之处在于，此处选用小鼠乳腺癌细胞(4T1细胞)。
结果如图10所示，细胞存活率均在100％左右，表明以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体对4T1细胞基本无显著毒性。
实施例7：评价以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体对细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的毒性
参照实施例5的细胞毒性评价方法，差异之处在于，此处选用小鼠细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。CTL细胞取自健康雌性小鼠，小鼠颈椎脱臼处死后，在75％乙醇中浸泡5分钟，取出小鼠置于无菌操作台上。暴露腹部后纵向切割皮肤，暴露脾脏。小心分离脾脏周围的结缔组织，取出脾脏，放入盛有5ml PBS的培养皿中冲洗并剥去周围的结缔组织。将脾脏用镊子夹碎至于尼龙网上，取注射器活塞，轻轻研磨组织，将组织磨碎。上下吹打悬液将剩余的一些细胞团块打散。取新的尼龙网，过滤悬液以除去残留的碎屑用尼龙网过滤，得到单细胞悬液。采用阴选法，参考T细胞分离试剂盒说明书利用磁珠提取T细胞。参考T细胞激活/扩增试剂盒说明书进行操作，将T细胞活化为细胞毒性T淋巴细胞，以备后续使用。
结果如图11所示，细胞存活率均在100％左右，表明以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体对CTL细胞基本无显著毒性。
实施例8：评价肿瘤细胞对以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体的内吞效果
此处选用小鼠乳腺癌细胞(4T1细胞)。于12孔板上接种适量4T1细胞，当细胞生长至70～80％汇合度时换用0.15mmol/L的颗粒酶B响应型组装体的空白培养基稀释液进行孵育，对照组选用空白培养基进行孵育，分别孵育1h，2h，4h，8h，在荧光显微镜下进行观察。
其摄取结果如图12所示，前4h内，随着时间的增加，荧光亮度逐渐增加，4-8h荧光强度只有轻度增加。即前4h内，细胞对组装体的摄取逐渐增加，4-8h细胞对组装体的摄取到达平台期。
实施例9：评价细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体的内吞效果
参照实施例5的细胞内吞评价方法，差异之处在于，此处选用小鼠细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
其摄取结果如图13所示，前4h内，随着时间的增加，荧光亮度逐渐增加，4-8h荧光强度只有轻度增加。即前4h内，细胞对组装体的摄取逐渐增加，4-8h细胞对组装体的摄取到达平台期。
实施例10：以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体在细胞层面的免疫响应性考察
于6孔板上接种适量4T1细胞或CTL细胞，当细胞生长至70～80％汇合度时换用0.15mmol/L的颗粒酶B响应型组装体的空白培养基稀释液进行孵育，分别孵育2h，4h，8h。使用胰酶将4T1细胞从6孔板上充分消化，后加入空白培养基，转移至1.5ml EP管中。将CTL细胞吹匀后，转移至1.5ml EP管中。离心得细胞团，使用0.5％的琼脂糖将其重悬，并转移至核磁共振弛豫成像皿中，静置待其完全凝固。
对细胞进行核磁共振弛豫成像，结果如图14所示，4T1细胞中，T1加权成像信号先随摄取的组装体增多而增强，到达摄取平台期后信号维持不变，表明进入平台期后，4T1细胞中组装体无明显变化。而在CTL细胞中，细胞对组装体的摄取逐渐增加，而T1加权信号逐渐减弱，表明其在CTL细胞中可以响应并产生信号变化。这一结果与已知的4T1细胞中不产生颗粒酶B，而活化的CTL细胞中产生大量颗粒酶B相同，表明本发明中以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体在细胞层面可以有效区分肿瘤细胞及免疫细胞，具有较好的免疫响应性。
以上所述实施例对本发明的制备工艺以及部分体外应用进行了详细说明，但以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡以本发明为基础，在本发明的原则范围内所做的任何修改，补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体，其特征在于，所述颗粒酶B响应型组装体通过具有两亲性的化合物自组装而成；两亲性的化合物以酶识别的底物多肽为连接，该多肽的一端连接有亲水性化合物，多肽的另一端连接有疏水性化合物，疏水性化合物内螯合有Gd(III)；其中，亲水性化合物为含有羧基的亲水聚合物，该羧基用于与上述多肽连接；疏水性化合物为螯合剂，富含O、N且可提供配位电子，配位电子用于与Gd(III)形成配位键；该疏水性化合物含有羧基或酯键用于与上述多肽连接；上述多肽为包含颗粒酶B底物在内的一段多肽序列，其羧基端或两端含有多余的氨基酸作为反应位点。
2.根据权利要求1所述的以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体的制备方法，其特征在于，亲水性化合物为末端修饰羧基的聚乙二醇，聚丙烯酸中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体的制备方法，其特征在于，疏水性化合物为原卟啉，次卟啉，血卟啉，间卟啉，粪卟啉，尿卟啉，酚卟啉，二氢卟吩e6，脱镁叶绿素a及其衍生物中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体的制备方法，其特征在于，亲水性化合物为末端修饰羧基的聚乙二醇；疏水性化合物为原卟啉；多肽为pep，具有如下化学结构：
5.一种根据权利要求1-4中任一所述的以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将亲水性的化合物1与多肽pep连接，得到化合物3；化合物1为含有羧基的亲水聚合物；多肽pep的一端含有氨基或巯基；
2)将化合物3与化合物2连接，得到化合物4；化合物2为疏水性化合物，可作为螯合剂且含有羧基或酯键基团，羧基或酯键基团用于与底物多肽连接；
3)将化合物4溶于与GdCl3·6H2O搅拌，使Gd(III)与螯合剂充分螯合，得到化合物5；
4)化合物5通过亲疏水作用自组装，形成以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体。
6.根据权利要求5所述的以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体的制备方法，其特征在于，步骤1)中，合成化合物3的反应为酰胺反应，或，巯基和羧基的加成反应。
7.根据权利要求5所述的以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体的制备方法，其特征在于，步骤2)中，合成化合物4的反应为羧基和氨基的酰胺反应、巯基和羧基的加成反应、酯基和氨基的氨解反应、卤素和巯基的亲核取代反应、卤素和氨基的亲核取代反应中任意一种反应。
8.根据权利要求5所述的以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体的制备方法，其特征在于，步骤3)中，将化合物4溶于良溶剂中，再与溶于水的GdCl3·6H2O在室温下搅拌，待反应完全后，进行分离提纯，得到化合物5。
9.根据权利要求5所述的以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体的制备方法，其特征在于，步骤4)中，自组装方法为两相混合法，将化合物5溶于除水之外的良溶剂中，滴加入水中，超声或超声破碎或剧烈搅拌进行组装，减压蒸馏或透析除去良溶剂。
10.一种根据权利要求1-4中任一所述的以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体在制备造影剂中的应用。
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| CN202410028089.6A Pending CN117843717A (zh) | 2024-01-08 | 2024-01-08 | 一种以多肽为底物的颗粒酶b响应型组装体及其制备方法和应用 |
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2024
- 2024-01-08 CN CN202410028089.6A patent/CN117843717A/zh active Pending
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