CN117820486A - 一种抗hla-g抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗HLA‑G抗体及其应用。本申请公开的抗HLA‑G抗体。不与HLA‑A/B/C交叉结合，且能阻断HLA‑G与LILRB1/2的相互作用，对功能细胞的恢复能力优于对标抗体或相当。这个抗体有希望用于HLA‑G表达的肿瘤的治疗。
Description
技术领域
本说明书涉及生物技术领域，特别涉及一种抗HLA-G抗体及其应用。
背景技术
肿瘤通过建立免疫抑制肿瘤微环境来逃避免疫系统。涉及NK细胞的免疫逃避包括几个机制。肿瘤细胞或肿瘤微环境的其他组分如转化生长因子-β(TGF-β)、IL-6、IL-10、色氨酸分解代谢产物、前列腺素E2(PGE2)、dickkopf相关蛋白2(DKK2)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、可溶性HLA-G、可溶性NKG2D配体。据报道，半乳糖-3(NKp30可溶性抑制性受体)可降低NK细胞的活化、细胞毒性、IFNγ的产生及其激活性受体的表达和激活。此外，肿瘤细胞还发现激活性受体的配体脱落和抑制性受体配体的上调。因此，人们开发了多种策略来恢复NK细胞的功能。
HLA-G(human leucocyte antigen-G)即人类白细胞抗原系统-G是一种非经典的HLA-Ⅰb类抗原，它定位于6号染色体短臂HLA远端300bp以内，并选择性的在胎盘表达，参与保护胚胎免受母体淋巴系统的攻击。它最早于1987年被Geraghty DE克隆，1990年Kovats S发现它在胎盘绒毛远端的细胞滋养层特异表达。HLA-G在多种肿瘤中表达(如黑素瘤，肉瘤和淋巴瘤)，近年来被视为是一种新兴的免疫检查点。这些HLA-G分子使肿瘤细胞能逃避NK细胞和CTL细胞的杀伤，溶解作用，这是一种新的肿瘤细胞逃脱免疫监视的机制。非实体肿瘤，绒毛膜癌的发生也可能与HLA-G分子抑制NK细胞的杀伤作用有关。
发明内容
鉴于上述现有技术，本申请采用HLA-G高表达细胞进行免疫，并在初筛阶段对抗体与HLA-G在细胞水平的结合进行考察并作为筛选依据，筛选出特异性结合HLA-G的抗体，在后续筛选验证中，使用抗HLA-G抗体Tizona-38373/38426作为对标抗体，体外活性检测显示本发明抗体不与HLA-A/B/C交叉结合，且能阻断HLA-G与LILRB1/2的相互作用，对功能细胞的恢复能力优于对标抗体。这个抗体有希望用于HLA-G表达的肿瘤的治疗。
本申请提供一种抗HLA-G抗体，所述抗HLA-G抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述抗HLA-G抗体的重链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的VHCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示的VHCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的VHCDR3，或包括氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的VHCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的VHCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的VHCDR3；和/或，所述抗HLA-G抗体的轻链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的VLCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的VLCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的VLCDR3，或包括氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的VLCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的VLCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的VLCDR3。
本申请还提供一种分离的多核苷酸，编码上述的抗HLA-G抗体。
本申请还提供一种表达载体，含有上述的分离的多核苷酸。
本申请还提供一种抗体的表达系统，所述表达系统含有上述的表达载体或基因组中整合有外源的上述的多核苷酸。
本申请还提供上述的抗HLA-G抗体的制备方法，包括如下步骤：在适合表达所述抗体的条件下，培养上述的抗体的表达系统，从而表达出所述的抗体，纯化分离出所述的抗体。
本申请还提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括上述的抗HLA-G抗体。
本申请还提供一种药物组合物包括上述的抗HLA-G抗体及药学上可接受的载体。
本申请还提供上述的抗HLA-G抗体、多核苷酸、表达载体、表达系统、检测试剂盒或如药物组合物在制备用于诊断、治疗或预防肿瘤的药物中的用途。
本说明书实施例提供的抗HLA-G抗体带来的有益效果包括但不限于：(1)本申请提供的抗HLA-G抗体阻断HLA-G与LILRB2受体结合的效果，优于对标抗体38426和38373；(2)本申请提供的抗HLA-G抗体恢复功能细胞的活性能力，优于对标抗体38373。
附图说明
本申请将以示例性实施例的方式进一步说明，这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。这些实施例并非限制性的，其中：
图1A为根据本申请一些实施例所示的鼠源抗体在JEG3细胞上的结合曲线图；
图1B为根据本申请一些实施例所示的鼠源抗体在SU86.86细胞上的结合曲线图；
图1C为根据本申请一些实施例所示的鼠源抗体在COS7-HLA-G1细胞上的结合曲线图；
图2A为根据本申请一些实施例所示的嵌合抗HLA-G抗体在HLA-G5蛋白上的结合曲线图；
图2B为根据本申请一些实施例所示的嵌合抗HLA-G抗体在JEG3细胞上的结合曲线图；
图2C为根据本申请一些实施例所示的嵌合抗HLA-G抗体在SU86.86细胞上的结合曲线图；
图2D为根据本申请一些实施例所示的嵌合抗HLA-G抗体在COS7-HLA-G1细胞上的结合曲线图；
图3为根据本申请一些实施例所示的人源化抗HLA-G抗体在JEG3细胞上的结合曲线图；
图4A为根据本申请一些实施例所示的抗体阻断HLA-G与LILRB1受体结合的柱状图；
图4B为根据本申请一些实施例所示的抗体阻断HLA-G与LILRB2受体结合的柱状图；
图5为根据本申请一些实施例所示的抗体恢复功能细胞的活性能力曲线图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本说明书实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本说明书的一些示例或实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图将本说明书应用于其它类似情景。除非从语言环境中显而易见或另做说明，图中相同标号代表相同结构或操作。
如本说明书和权利要求书中所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。
本说明书中使用了流程图用来说明根据本说明书的实施例的系统所执行的操作。应当理解的是，前面或后面操作不一定按照顺序来精确地执行。相反，可以按照倒序或同时处理各个步骤。同时，也可以将其他操作添加到这些过程中，或从这些过程移除某一步或数步操作。
2020年7月，吉利德宣布将对Tizona Therapeutics公司进行3亿美元的股权投资，获得后者49.9％的股权。吉利德同时拥有收购后者剩余50.1％股权的独家选择权，未来的行权费用和潜在里程金合计12.5亿美元。吉利德可以在抗体药物TTX-080的Ib期数据公布之后或更早的时间点决定是否收购Tizona公司的剩余股权。本次吉利德收购该公司股权，意在其肿瘤免疫治疗候选药物TTX-080。TTX-080是一款由Tizona研发的靶向人白细胞抗原-G(HLA-G)的单抗药物，也是第一个进入临床研究阶段的HLA-G抑制剂。TTX-080通过阻断HLA-G与其受体相互作用，从而激活人体先天性免疫和适应性免疫，具有强大的抗肿瘤潜力。HLA-G的表达模式与PD-1/PD-L1不同，这一点也暗示出HLA-G抑制剂具有治疗对PD-1/PD-L1抑制剂无效或者对PD-1/PD-L1抑制剂产生耐药性肿瘤患者的潜力。FDA已经批准了对TTX-080的IND申请，现阶段，Tizona正在启动TTX-080的I期临床试验，以评估TTX-080是否可用于晚期癌症的单一疗法和联合疗法。
以下是对本申请中一些术语的定义。
术语“特异性结合”意指此结合对于抗原是选择性的，并且能与不想要的或非特异性的相互作用区别开来。
术语“药物组合物”指其形式使得其中含有的活性成分的生物学活性有效，且不含对会接受该组合物施用的受试者有不可接受的毒性的别的成分的制剂。
“药学上可接受的载体”是指药物组合物或制剂中的成分，而不是活性成分，其对个体是无毒的。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。所述药学上可接受的载体可以是无菌液体，例如水、盐水溶液、葡萄糖水溶液、甘油水溶液和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。
本文中的“序列”一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述氨基酸序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本文需要更限定的解释。
本文中的“载体”是指能携带至少一个多核苷酸片段的多核苷酸。载体可以将核酸的片段、各个多核苷酸递送到宿主细胞中。它可以包含至少一种包含调节序列的表达盒，用于正确地表达掺入其中的多核苷酸。待引入到细胞中的多核苷酸(例如编码目的产物或选择标记的多核苷酸)可以插入到载体的表达盒中以从其表达。根据本申请的载体可以以环状或线性(线性化)形式存在，并且也包括载体片段。术语“载体”也包含允许转移外源核酸片段的人工染色体或类似的各个多核苷酸。
术语“治疗或预防”(及其语法变体)指试图改变治疗个体中疾病的自然进程，并且可以是为了预防或在临床病理学的过程期间实施的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、降低疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。
术语“多核苷酸”是指通常从一个脱氧核糖或核糖连接至另一个脱氧核糖或核糖的核苷酸的聚合物，且取决于上下文，其指DNA以及RNA。本申请中的多核苷酸并不包含任一大小限制，并且也包括包含修饰，特别是包含修饰的核苷酸的多核苷酸。
本申请提供一种抗HLA-G抗体，所述抗HLA-G抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述抗HLA-G抗体的重链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的VHCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示的VHCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的VHCDR3，或包括氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的VHCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的VHCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的VHCDR3；和/或，所述抗HLA-G抗体的轻链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的VLCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的VLCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的VLCDR3，或包括氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的VLCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的VLCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的VLCDR3。
CDR(互补决定区，complementarity determining region)通常指抗体中在空间结构上可以与抗原决定簇形成互补的区域。抗体中的可变性通常并不均匀地分布在整个抗体的可变区中，单克隆抗体的重链可变区通常具有3个超变区(hypervariable region，HVR)，这些区域在空间结构上通常可以与抗原决定簇形成互补，所以超变区也被称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)，即重链可变区通常包括三个互补决定区，即HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些实施例中，所述抗HLA-G抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述抗HLA-G抗体的重链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的VHCDR1、氨基酸序列如SEQID NO:13所示的VHCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的VHCDR3；和所述抗HLA-G抗体的轻链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的VLCDR1、氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示的VLCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的VLCDR3。
在一些实施例中，所述抗HLA-G抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述抗HLA-G抗体的重链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的VHCDR1、氨基酸序列如SEQID NO:4所示的VHCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的VHCDR3；和所述抗HLA-G抗体的轻链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的VLCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的VLCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的VLCDR3。
在一些实施例中，所述抗HLA-G抗体的重链可变区的氨基酸序列可以如SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:11所示。在一些实施例中，所述抗HLA-G抗体的轻链可变区的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12所示。
在一些实施例中，所述抗HLA-G抗体包括氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的轻链可变区。
在一些实施例中，所述抗HLA-G抗体包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的轻链可变区。
在一些实施例中，所述抗HLA-G抗体还可以包括重链恒定区和轻链恒定区。
在一些实施例中，优选的，所述抗HLA-G抗体的重链恒定区的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:9所示。在一些实施例中，优选的，所述抗HLA-G抗体的轻链恒定区的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:10所示。
在一些实施例中，所述抗HLA-G抗体可以与人源HLA-G1特异性结合。
在一些实施例中，所述抗HLA-G抗体可以为鼠源抗体和人源化抗体。在一些实施例中，优选的，所述人源化抗体可以选自全人源化抗体或嵌合抗体。
人源化抗体是指抗体的恒定区部分(即CH和CL区)或抗体所有全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。
嵌合抗体是利用DNA重组技术，将异源单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达出嵌合抗体，这样表达的抗体分子中轻重链的V区是异源的，而C区是人源的，这样整个抗体分子的近2/3部分都是人源的。这样产生的抗体，减少了异源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。
全人源化抗体是指将人类抗体基因通过转基因或转染色体技术，将人类编码抗体的基因全部转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达人类抗体，达到抗体全人源化的目的。
本领域知晓，并非完整的四聚体才能发挥抗体的功效，包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')或F(ab')2、纳米抗体(VHH)、单链抗体(scFv)等形式的抗体均可发挥特异性结合抗原的功效。
本申请还提供一种分离的多核苷酸，编码上述的抗HLA-G抗体。
在一些实施例中，多核苷酸可以是RNA、DNA或cDNA等。提供所述分离的多核苷酸的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以通过自动DNA合成和/或重组DNA技术等制备获得，也可以从适合的天然来源加以分离。
本申请还提供一种表达载体，含有上述的分离的多核苷酸。
本申请还提供一种抗体的表达系统，所述表达系统含有上述的表达载体或基因组中整合有外源的上述的多核苷酸。
所述表达系统可以是宿主细胞，所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞、丝状真菌细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、丝状真菌、植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。将构建体导入宿主细胞的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以显微注射法、基因枪法、电穿孔法、病毒介导的转化法、电子轰击法、磷酸钙沉淀法等方法。表达系统的选择取决于多种因素，包括细胞生长特性、表达水平、胞内和胞外表达、目的蛋白质的翻译后修饰和生物学洁性，以及在生产治疗性蛋白质中的监管问题和经济考虑。
本申请还提供上述的抗HLA-G抗体的制备方法，包括如下步骤：在适合表达所述抗体的条件下，培养上述的抗体的表达系统，从而表达出所述的抗体，纯化分离出所述的抗体。
本申请还提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括上述的抗HLA-G抗体。
本申请还提供一种药物组合物包括上述的抗HLA-G抗体及药学上可接受的载体。
在一些实施例中，本申请的药物组合物可以在单一疗法中施用(例如，没有伴随施用任何另外的治疗剂，或没有伴随施用任何另外的治疗剂对抗要用本申请的药物组合物治疗或预防的相同疾病)。在一些实施例中，本申请的药物组合物也可与一种或多种其它治疗剂联合施用或同时施用。
药学上可接受的载体，可以是常用的药物载体，例如可以是聚乙二醇，包括分子量在约200到约5,000Da范围内的聚乙二醇(例如PEG 200、PEG 300、PEG 400或PEG 600)，乙二醇，丙二醇，甘油，非离子表面活性剂，泰洛沙泊，聚山梨酯80，聚乙二醇-15-羟基，硬脂酸酯，磷脂，卵磷脂，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱，环糊精，α-环糊精，β-环糊精，γ-环糊精，羟乙基-β-环糊精，羟丙基-β-环糊精，羟乙基-γ-环糊精，羟丙基-γ-环糊精，二羟丙基-β-环糊精，磺丁醚-β-环糊精，磺丁醚-γ-环糊精，葡糖基-α-环糊精，葡糖基-β-环糊精，二葡萄糖基-β-环糊精，麦芽糖基-α-环糊精，麦芽糖基-β-环糊精，麦芽糖基-γ-环糊精，麦芽三糖基-β-环糊精，麦芽三糖基-γ-环糊精，二麦芽糖基-β-环糊精，甲基-β-环糊精，羧基烷基硫醚，羟丙基甲基纤维素，羟丙基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，乙酸乙烯酯共聚物、乙烯基吡咯烷酮、月桂基硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠或其任何组合。本领域的技术人员通常可基于剂型要求确定药物组合物的配方。
本申请还提供上述的抗HLA-G抗体、多核苷酸、表达载体、表达系统、检测试剂盒或药物组合物在制备用于诊断、治疗或预防肿瘤的药物中的用途。
在一些实施例中，所述肿瘤可以选自肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈内腺癌、胆管癌、结肠腺癌、淋巴样肿瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、食管癌、多形性成胶质细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、急性髓性白血病、脑低度胶质瘤、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、间皮细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺癌、直肠癌、恶性肉瘤、黑色素瘤、胃癌、睾丸生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤、多发性骨髓瘤、急性淋系白血病、慢性淋系白血病、慢性髓性白血病、淋巴瘤、肺癌、肉瘤、肛门癌、黑色素瘤、视网膜母细胞瘤中的一种或多种。在一些实施例中，优选的，所述肿瘤可以选自黑色素瘤、肉瘤或淋巴瘤。
在一些实施方案中，本申请的抗体可以用于延迟疾病的形成或延缓病症的进展。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1--鼠抗HLA-G抗体的产生
通过慢病毒感染的方法(MOI＝3-10，5μg/mL polybrene)在CHOS细胞(Invitrogen)和COS7细胞(ATCC)上分别过表达人源HLA-G1(hHLA-G1，NCBI ReferenceSequence:NM_001384290.1)，并在COS7细胞上过表达HLA-A/B/C(共15个)。慢病毒由上海吉凯基因医学科技股份有限公司提供，细胞感染72小时后加相应抗生素继续培养2-4周，扩增并冻存，得到CHOS-hHLA-G1和COS7-hHLA-G1这2株HLA-G过表达细胞系，和15株用于反筛的COS7-HLA-A/B/C，以用于后续实验。
为了获得人源化抗HLA-G抗体，使用构建的过表达人源HLA-G1的CHOS-hHLA-G1细胞免疫Balb/c小鼠，(北京维通利华实验动物技术有限公司，品系代码216)；初免佐剂使用完全弗氏佐剂CFA(InvivoGen公司，货号vac-cfa-60)，之后免疫佐剂都使用IFA(InvivoGen公司，货号vac-ifa-60)；免疫途径为皮下多点。多次免疫后将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0使用电融合法进行融合，得到既能表达抗体又能在体外无限增殖的B细胞融合，并且在HAT选择培养基中培养。将融合后的杂交瘤细胞铺在96孔细胞培养板中，并且通过对上清中抗体在细胞水平结合HLA-G能力的检测，筛选出目的阳性克隆并进行2-3轮亚克隆。
鼠抗结合细胞水平高通量筛选：在筛选中通过使用人源HLA-G表达的细胞(COS7-hHLA-G1)分别进行铺板。将6000个细胞稀释于100μL完全培养基中，使用平底96孔板，过夜使细胞贴壁或沉于孔底，第二天去掉上清。将100μL待筛选杂交瘤上清加入细胞板中，室温孵育1小时。去掉上清后，每孔加入100μL第二抗体(DyLight488山羊抗鼠IgG，Abcam目录编号ab97015)，浓度为3μg/mL，室温孵育0.5小时。染色完成后去掉上清，每孔加入100μLDPBS，上机器进行读数。使用全视野细胞扫描分析仪(Nexcelom，型号ImageCytometer)对实验板进行测定读数。测定时选择第二抗体对应荧光通道和明场通道同时对孔内细胞进行高速扫描成像。荧光通道得到的成像根据有荧光标记的细胞形态和荧光强度设定参数对抗体结合的细胞进行计数，明场通道得到的成像根据细胞形态设定参数对贴壁细胞进行计数，然后两组数据相除得到和抗体结合的显示荧光的细胞占细胞总数的百分比。根据该比例判定融合瘤上清中抗体与表达HLA-G的细胞的结合效果。
鼠抗与HLA-G结合的流式评价：将200,000个HLA-G表达细胞JEG3(ATCC)，SU86.86(ATCC)，COS7-HLAG1和HLA-G不表达细胞COS7-HLA-A/B/C(共15个)置于FACS buffer(PBS+2％ FBS)/孔中，加入待测鼠源抗体后4摄氏度孵育1小时。离心去掉上清，使用FACS buffer清洗两遍，加入第二抗体(DyLight488山羊抗鼠IgG，Abcam目录编号ab97015)4摄氏度孵育0.5小时。染色完成后离心去掉上清，用FACS buffer清洗两次后使用FACS buffer重悬细胞，然后上机器进行读数。使用流式细胞分析仪(BD公司，型号CantoII)对实验细胞进行测定读数。测定时先根据FSC和SSC圈定细胞位置，然后选择第二抗体对应荧光通道和SSC对细胞进行分析。鼠源抗体27G8与JEG3(ATCC)，SU86.86(ATCC)，COS7-HLAG1结合情况如图1A-1C和表1所示，与COS7-HLA-A/B/C的结合情况如表2所示。
表1鼠源抗体对HLA-G阳性细胞的结合
表2鼠源抗体对HLA-A/B/C细胞的结合
实施例2--鼠抗HLA-G抗体的可变区序列测定
离心收集杂交瘤细胞，每5-10×106细胞加入1mL TRIzol和0.2mL氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟，离心取水相加入0.5mL异丙醇，室温放置10分钟后收集沉淀，乙醇洗涤后干燥得到RNA。在提前预冷的离心管里面加入模板RNA和引物，使引物和模板正确配对后进行反转录过程，再进行PCR扩增。微量离心管中各加入dNTP/ddNTP混合物2.5μL，混合物37℃孵育5分钟，备用。在一个空的微量离心管中加入1pmol的PCR扩增双链DNA，10pmol测序引物，2μL 5×测序缓冲液，加双蒸水至总体积10μL，96℃加热8分钟，置于冰上冷却1分钟，4℃10000g离心10秒。加入2μL预冷的标记混合物(dCTP、dGTP、dTTP各0.75μmol/L)，α-32P-dATP 5μCi，1μL 0.1mol/L DDT，测序酶2U，加水至15μL，混匀后置冰上2分钟，标记新合成的DNA链。3.5μL标记反应混合物加入到准备好微量离心管中，37℃孵育5分钟。每管加入4μL终止液。样品在80℃的水浴中热变性5分钟，每一泳道加2μL加到测序胶上,电泳分离这些片段，收集序列信息。
27G8鼠源抗体的VH和VL序列如表3所示。进一步，还使用Kabat等人描述的方法(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，Public HealthService，美国国立卫生研究院，贝塞斯达、马里兰州(1991)，第647-669页)，确定了鼠源单抗的CDR序列。
表3：鼠源抗体的序列信息
27G8 VH(SEQ ID NO:1)：
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKTSRSSFTEYTMQWVKQRHGKSLEWIGGIIPNNGAPTYNQKFKGKATLTVDKSSSMAFMELRSLTSEDSAVYFCARGGREEFGPYYFDFWGQGTTLTVSS
27G8 VL(SEQ ID NO:2)：
DVVLTQIPLSLPVSLGDRASISCRSSQRLVHSNGYTHLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTFVPWTFGGGTKLEFK
27G8 VHCDR1(SEQ ID NO:3)：EYTMQ
27G8 VHCDR2(SEQ ID NO:4)：GIIPNNGAPTYNQKFKG
27G8 VHCDR3(SEQ ID NO:5)：GGREEFGPYYFDF
27G8 VLCDR1(SEQ ID NO:6)：RSSQRLVHSNGYTHLH
27G8 VLCDR2(SEQ ID NO:7)：KVSNRFS
27G8 VLCDR3(SEQ ID NO:8)：SQSTFVPWT
实施例3--嵌合抗HLA-G抗体的重组表达
在抗体基因序列验证后，鼠源抗体的可变区连接人源抗体的恒定区(人源IgG1)，将含有抗体基因的表达载体pTT5转染至哺乳动物细胞HEK293。收获培养瓶生长的含有抗体克隆的哺乳动物细胞上清液，使用protein A柱纯化，并且使用100mM醋酸pH3.0洗脱抗体蛋白。然后将纯化的抗体蛋白上样到分子排阻层析柱上进一步分离纯化。将对应于单体的抗体蛋白配制于PBS缓冲液中，配制品缓冲液补充有20％甘油。
实施例4--嵌合抗HLA-G抗体的抗原结合活性评价
在筛选中通过使用人源HLA-G5蛋白进行铺板。将0.1μg蛋白稀释于100μL DPBS中，使用平底96孔高吸附板，4℃过夜，第二天去掉上清。将100μL待测嵌合抗体加入平板中，室温孵育1小时。去掉上清后，每孔加入100μL第二抗体(山羊抗人IgG Fc(HRP)，Abcam目录编号ab97225)，浓度为0.1μg/mL，室温孵育0.5小时。去掉上清后每孔加入100μL双组份TMB显色液(Biopanda Diagnostics目录编号TMB-S-003)，显色完成后加入100μL 0.5M H2SO4终止显色，上机器进行读数。使用多功能酶标仪(TECAN，型号SPARK)对实验板进行测定读数。测定时选择96孔透明平底板，OD值选择450nm。根据OD值判定嵌合抗体与人源HLA-G5的结合效果。数据分析使用GraphPad，横坐标使用抗体浓度的对数，纵坐标使用OD450nm数值，根据曲线拟合出抗HLA-G5抗体的EC50。
将200,000个HLA-G表达细胞JEG3(ATCC)，SU86.86(ATCC)，COS7-HLAG1和HLA-G不表达细胞COS7-HLA-A/B/C(A/B/C各选1个)置于FACS buffer中待用，使用圆底低吸附96孔板。抗体样本使用FACS buffer进行梯度稀释。细胞板中加入经稀释的抗体，相应阴性对照孔加入FACS buffer，4摄氏度孵育1小时。离心去掉上清后，使用FACS buffer清洗两遍，每孔加入第二抗体(DyLight488山羊抗人IgG，Abcam目录编号ab97003)4摄氏度再孵育0.5小时。染色完成后离心去掉上清，用FACS buffer清洗两次后每孔加入FACS buffer重悬细胞，然后上机器进行读数。使用流式细胞分析仪(BD公司，型号Canto II)对实验板中细胞进行测定读数。测定时先根据FSC和SSC圈定细胞位置，然后选择第二抗体对应荧光通道和SSC对细胞进行分析，数据分析使用GraphPad，横坐标使用抗体摩尔浓度的对数，纵坐标使用平均荧光强度数值，根据曲线拟合出抗HLA-G抗体的EC50。
27G8和对标抗体38426对HLA-G5蛋白的结合情况如图2A所示，表4列出了两个抗体在HLA-G5蛋白上结合的EC50和最大结合值(Top OD450nm)；与3种HLA-G表达细胞(JEG3/SU86.86/COS7-HLAG1)的结合情况分别如图2B-2D所示，表5列出了两个抗体在3种细胞上结合的EC50和最大结合值(Top FC MFI)；表6列出了两个抗体在HLA-G不表达细胞上结合情况。结果表明，27G8在蛋白和细胞水平上的结合能力与38426相当，且不与HLA-A/B/C结合。
表4嵌合抗体对HLA-G5蛋白的结合
表5嵌合抗体对HLA-G阳性细胞的结合
表6嵌合抗体对HLA-A/B/C细胞的结合
实施例5--鼠抗HLA-G抗体的人源化
为提高候选抗体与人源抗体的序列的同源性，减少抗体对人的免疫原性，可以对以上实施例提供的鼠源抗体进行人源化设计和制备，使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人源框架序列(参见Winter的美国专利No.5,225,539；Queen等人的美国专利Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370；以及Lo,Benny,K.C.,editor,in AntibodyEngineering:Methods and Protocols,volume 248,Humana Press,New Jersey,2004)。
具体而言，将鼠源抗体27G8的重链和轻链CDR区分别移到对应的人源化模板的FR框架上，并对人源化模板的FR区氨基酸残基进行了一系列的回复突变，以使人源化抗体尽可能保留鼠源抗体的抗原结合能力。根据以上方法，本发明人制备获得了鼠源抗体27G8的人源化抗体hu27G8-01，hu27G8-01重链可变区和轻链可变区分别如SEQ ID NO:11和12所示，抗体的重链恒定区为SEQ ID NO:9，轻链恒定区为SEQ ID NO:10。
重链恒定区(SEQ ID NO:9)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
轻链恒定区(SEQ ID NO:10)：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
人源化抗体hu27G8-01 VH(SEQ ID NO:11)：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKTSRSSFTEYTMQWVRQAPGQGLEWMGGIIPNNAAPTYNQKFKGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGREEFGPYYFDFWGQGTLVTVSS
人源化抗体hu27G8-01 VL(SEQ ID NO:12)：
DVVLTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQRLVHSNAYTHLHWYQQKPGQPPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDLAVYFCSQSTFVPWTFGGGTKVEIK
人源化抗体hu27G8-01 VH CDR2(SEQ ID NO:13)：GIIPNNAAPTYNQKFKG
人源化抗体hu27G8-01 VL CDR1(SEQ ID NO:14)：RSSQRLVHSNAYTHLH
实施例6--人源化抗HLA-G抗体的抗原结合活性评价
将200，000个HLA-G表达细胞JEG3置于FACS buffer中待用，使用圆底低吸附96孔板。抗体样本使用FACS buffer进行梯度稀释。细胞板中加入经稀释的抗体，相应阴性对照孔加入FACS buffer，4摄氏度孵育1小时。离心去掉上清后，使用FACS buffer清洗两遍，每孔加入第二抗体(DyLight488山羊抗人IgG，Abcam目录编号ab97003)4摄氏度再孵育0.5小时。染色完成后离心去掉上清，用FACS buffer清洗两次后每孔加入FACS buffer重悬细胞，然后上机器进行读数。使用流式细胞分析仪(BD公司，型号Canto II)对实验板中细胞进行测定读数。测定时先根据FSC和SSC圈定细胞位置，然后选择第二抗体对应荧光通道和SSC对细胞进行分析，数据分析使用GraphPad，横坐标使用抗体摩尔浓度的对数，纵坐标使用平均荧光强度数值，根据曲线拟合出抗HLA-G抗体的EC50。
hu27G8-01和对标抗体38426对HLA-G表达细胞JEG3的结合情况分别如图3所示。表7列出了两个抗体在肿瘤细胞上结合的EC50和最大结合值(Top FC MFI)。结果表明，hu27G8-01对JEG3细胞的结合能力与对标抗体38426相当。
表7人源化抗体对HLA-G阳性细胞的结合
实施例7--抗体阻断HLA-G与LILRB1/2受体的结合活性
将200，000个HLA-G表达细胞K562-HLAG1(内部自建，构建方法同实施例1)置于FACS buffer中待用，使用圆底低吸附96孔板。抗体样本使用FACS buffer进行稀释，细胞板中加入经稀释的抗体，相应阴性对照孔加入FACS buffer，4℃孵育30分钟，然后加入生物素化LILRB1/2(Kactus)受体，4℃孵育1小时，孵育完成后，离心去掉上清后，使用FACS buffer清洗两遍，每孔加入第二抗体(APC抗his抗体，Biolegend目录编号362605)，4℃再孵育0.5小时。染色完成后离心去掉上清，用FACS buffer清洗两次后每孔加入FACS buffer重悬细胞，然后上机器进行读数。使用流式细胞分析仪(BD公司，型号Canto II)对实验板中细胞进行测定读数。测定时先根据FSC和SSC圈定细胞位置，然后选择第二抗体对应荧光通道和SSC对细胞进行分析，数据分析使用GraphPad，横坐标使用抗体名称，纵坐标使用阻断率(％)。其中阻断率(％)＝100％-(平均荧光强度值-最小荧光强度值)/(最大荧光强度值-最小荧光强度值)*100％。
结果如图4A-4B所示，对于LILRB1，候选抗体对其与HLA-G结合的阻断效果达到99％以上；对于LILRB2，候选抗体对其与HLA-G结合的阻断效果在86％，优于对标抗体38426和38373。
实施例8--抗体恢复功能细胞的活性能力
靶细胞使用HLA-G表达细胞K562-HLAG1-OKT3(内部自建，构建方法同实施例1)，实验在96孔平底细胞板中(Corning 3903)进行。每孔加入5000个靶细胞，将梯度稀释的抗体加入平底板中，37℃条件下孵育30分钟。效应细胞使用Jurkat-LILRB1-NAFT-luc(内部自建，构建方法同实施例1)，37℃条件下进行反应6小时，反应结束加入One-Glo LuciferaseAssay System试剂(Promega，E6110)进行荧光显色，细胞板使用Tecan Spark10酶标仪测定发光读数。数据分析使用GraphPad，横坐标使用抗体摩尔浓度的对数，纵坐标使用发光读值，根据曲线拟合出抗HLA-G抗体恢复功能细胞活性的EC50。
结果如图5所示，对于LILRB1，候选抗体可恢复功能细胞的活性能力，优于对标抗体38373。
上文已对基本概念做了描述，显然，对于本领域技术人员来说，上述详细披露仅仅作为示例，而并不构成对本说明书的限定。虽然此处并没有明确说明，本领域技术人员可能会对本说明书进行各种修改、改进和修正。该类修改、改进和修正在本说明书中被建议，所以该类修改、改进、修正仍属于本说明书示范实施例的精神和范围。
同时，本说明书使用了特定词语来描述本说明书的实施例。如“一个实施例”、“一实施例”、和/或“一些实施例”意指与本说明书至少一个实施例相关的某一特征、结构或特点。因此，应强调并注意的是，本说明书中在不同位置两次或多次提及的“一实施例”或“一个实施例”或“一个替代性实施例”并不一定是指同一实施例。此外，本说明书的一个或多个实施例中的某些特征、结构或特点可以进行适当的组合。
一些实施例中使用了描述成分、属性数量的数字，应当理解的是，此类用于实施例描述的数字，在一些示例中使用了修饰词“大约”、“近似”或“大体上”来修饰。除非另外说明，“大约”、“近似”或“大体上”表明所述数字允许有±20％的变化。相应地，在一些实施例中，说明书和权利要求中使用的数值参数均为近似值，该近似值根据个别实施例所需特点可以发生改变。在一些实施例中，数值参数应考虑规定的有效数位并采用一般位数保留的方法。尽管本说明书一些实施例中用于确认其范围广度的数值域和参数为近似值，在具体实施例中，此类数值的设定在可行范围内尽可能精确。
最后，应当理解的是，本说明书中所述实施例仅用以说明本说明书实施例的原则。其他的变形也可能属于本说明书的范围。因此，作为示例而非限制，本说明书实施例的替代配置可视为与本说明书的教导一致。相应地，本说明书的实施例不仅限于本说明书明确介绍和描述的实施例。
Claims (11)
1.一种抗HLA-G抗体，所述抗HLA-G抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述抗HLA-G抗体的重链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的VHCDR1、氨基酸序列如SEQ IDNO:13所示的VHCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的VHCDR3，或包括氨基酸序列如SEQID NO:3所示的VHCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的VHCDR2和氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示的VHCDR3；
和/或，所述抗HLA-G抗体的轻链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的VLCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的VLCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的VLCDR3，或包括氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的VLCDR1、氨基酸序列如SEQID NO:7所示的VLCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的VLCDR3。
2.如权利要求1所述的抗HLA-G抗体，其特征在于，所述抗HLA-G抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:11所示；
和/或，所述抗HLA-G抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12所示。
3.如权利要求1所述的抗HLA-G抗体，其特征在于，还包括重链恒定区和轻链恒定区，优选的，所述抗HLA-G抗体的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；所述抗HLA-G抗体的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；
和/或，所述抗HLA-G抗体与人源HLA-G1特异性结合；
和/或，所述抗HLA-G抗体为鼠源抗体或人源化抗体，优选的，所述人源化抗体选自全人源化抗体或嵌合抗体。
4.一种分离的多核苷酸，编码如权利要求1～3任一项所述的抗HLA-G抗体。
5.一种表达载体，含有如权利要求4所述的分离的多核苷酸。
6.一种抗体的表达系统，所述表达系统含有如权利要求5所述的表达载体或基因组中整合有外源的如权利要求4所述的多核苷酸。
7.如权利要求1～3任一项所述的抗HLA-G抗体的制备方法，包括如下步骤：在适合表达所述抗体的条件下，培养如权利要求6所述的抗体的表达系统，从而表达出所述的抗体，纯化分离出所述的抗体。
8.一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括如权利要求1～3任一项所述的抗HLA-G抗体。
9.一种药物组合物包括如权利要求1～3任一项所述的抗HLA-G抗体及药学上可接受的载体。
10.如权利要求1～3任一项所述的抗HLA-G抗体、权利要求4所述的多核苷酸、权利要求5所述的表达载体、权利要求6所述的表达系统、权利要求8所述的检测试剂盒或如权利要求9所述的药物组合物在制备用于诊断、治疗或预防肿瘤的药物中的用途。
11.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈内腺癌、胆管癌、结肠腺癌、淋巴样肿瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、食管癌、多形性成胶质细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、急性髓性白血病、脑低度胶质瘤、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、间皮细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺癌、直肠癌、恶性肉瘤、黑色素瘤、胃癌、睾丸生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤、多发性骨髓瘤、急性淋系白血病、慢性淋系白血病、慢性髓性白血病、淋巴瘤、肺癌、肉瘤、肛门癌、黑色素瘤、视网膜母细胞瘤中的一种或多种，优选的，所述肿瘤选自黑色素瘤、肉瘤或淋巴瘤。
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