CN117815364A - 用于治疗特发性膀胱过度活动综合征和逼尿肌过度活动的组合物和方法 - Google Patents
用于治疗特发性膀胱过度活动综合征和逼尿肌过度活动的组合物和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了缓解平滑肌疾病的一种或多种病征或症状的方法。本披露的组合物可以包含含有编码Maxi‑K通道肽的核酸的质粒载体。本披露的组合物能以单一单位剂量向至少两个或更多个部位逼尿肌内给予。
Description
本申请是申请日为2018年5月14日，申请号为201880036929.6，发明名称为“用于治疗特发性膀胱过度活动综合征和逼尿肌过度活动的组合物和方法”的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年5月12日提交的临时申请USSN 62/505,382的权益，将其内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及用于改善与平滑肌功能异常相关的一种或多种症状的医学疗法领域。具体而言，膀胱的平滑肌功能异常。
序列表的并入
将在2018年5月11日创建的大小为30KB的命名为IONC-002-001WO_SeqList.txt的文本文件的内容通过引用以其整体特此并入。
背景技术
膀胱功能异常是一个普遍的问题，其在美国显著影响着数百万男性和女性的生活质量。许多常见的疾病(例如，BHP、糖尿病、多发性硬化症和中风)改变正常的膀胱功能。膀胱功能的显著不良变化也是年龄增长的正常结果。改变的膀胱生理有两种主要的临床表现：弛缓性膀胱和反射亢进型膀胱。由于逼尿肌平滑肌(膀胱壁的外部平滑肌)的无效收缩性，弛缓性膀胱或逼尿肌活动低下降低了排空尿液内容物的能力。在弛缓或活动低下的状态下，降低的平滑肌收缩性与膀胱功能异常的病因有关。因此，不足为奇的是，平滑肌张力的药理调节不足以纠正潜在问题。实际上，用于治疗这种疾病的流行方法是使用清洁间歇导尿；这是预防慢性尿路感染、肾盂肾炎和最终肾衰竭的成功手段。因此，弛缓性膀胱的治疗改善疾病症状，但是无法纠正潜在病因。
相反，反射亢进型、不受抑制型或表现出逼尿肌过度活动的膀胱在膀胱充盈过程中自发收缩；在个体无法控制尿液通过的情况下，这可能会导致尿频、尿急和急迫性尿失禁。反射亢进型膀胱是一个更难治疗的问题。用于治疗这种病症的药物通常仅部分有效，并且具有严重的副作用，这限制了患者的使用和积极性。当前接受的治疗选择(例如，奥昔布宁和托特罗定)在很大程度上是非特异性的，并且最常见地涉及毒蕈碱受体途径和/或膀胱肌细胞上的钙通道的阻断。考虑到这两个途径在体内许多器官系统的细胞功能中极其重要，因此，此类治疗策略不仅是调节膀胱平滑肌张力的粗略方法；相反，由于它们的一种或多种作用机理，实际上也保证了它们具有显著的不良全身作用。因此，非常需要用于膀胱功能异常的改善的治疗选择。
尽管为了开发治愈或治疗由改变的平滑肌张力引起的疾病进行了多种尝试，但是目前的疗法仍然是不足的，因为它们提供了有限的功效和/或显著的副作用。因此，在本领域中长期需要用于通过提高功效来解决改变的平滑肌张力的潜在病因同时副作用最小的药物和/或医学干预。
发明内容
本发明提供了治疗或缓解人类受试者的膀胱过度活动综合征或逼尿肌过度活动的病征或症状的方法，这些方法通过向至少两个或更多个部位逼尿肌内给予单位剂量的组合物来进行，该组合物包含具有启动子和编码Maxi-K通道肽的核酸的载体。该启动子是例如平滑肌启动子或巨细胞病毒中早期启动子。该单位剂量是单一单位剂量。可替代地，在不同时间给予两个或更多个单位剂量。
该单位剂量在约5,000-50,000mcg之间。例如，该单位剂量是至少10,000mcg。优选地，该单位剂量是16,000mcg或24,000mcg。
在5、10、15、20个或更多个部位给予该组合物。
该病征或症状是例如排尿频繁或尿急。
在一些方面，该载体含有按以下顺序的核酸元件：人巨细胞病毒中早期启动子序列，如SEQ ID NO:1；T7引发位点序列，如SEQ ID NO:2；hSlo开放阅读框序列，如SEQ ID NO:7；BGH聚腺苷酸化信号序列，如SEQ ID NO:3；卡那霉素抗性序列，如SEQ ID NO:5；以及pUC复制起点序列，如SEQ ID NO:4。在某些方面，该hSlo开放阅读框序列在SEQ ID NO:7的位置1054处包含单点突变，从而在SEQ ID NO:8的位置352处产生丝氨酸。
本发明提供了一种载体，该载体包含按以下顺序的核酸元件：人巨细胞病毒中早期启动子序列，如SEQ ID NO:1；T7引发位点序列，如SEQ ID NO:2；hSlo开放阅读框序列，如SEQ ID NO:7；BGH聚腺苷酸化信号序列，如SEQ ID NO:3；卡那霉素抗性序列，如SEQ ID NO:5；以及pUC复制起点序列，如SEQ ID NO:4。在该载体的一些方面，该hSlo开放阅读框序列在SEQ ID NO:7的核苷酸位置1054处具有单点突变，并且所述点突变在SEQ ID NO:8的位置352处产生丝氨酸。在一些方面，该载体包含质粒、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体或脂质体。在一些方面，该质粒是pVAX。
本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本披露的多种载体和药学上可接受的稀释剂或载体。在一些方面，将该药物组合物配制用于注射进平滑肌。在一些方面，将该多种载体与盐水溶液中的20％-25％蔗糖合并。
在本披露的药物组合物的一些方面，该单位剂量是单一单位剂量。在一些方面，该单位剂量在约5,000-50,000mcg之间。在一些方面，该单位剂量是至少10,000mcg。在一些方面，该单位剂量是16,000mcg或24,000mcg。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。尽管类似或等同于本文所述的那些的方法和材料可以用于本发明的实践，但是以下描述了合适的方法和材料。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献清楚地通过引用以其整体而并入。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，本文所述的材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨在是限制性的。
根据以下具体实施方式和权利要求书，本发明的其他特征和优点将是清楚的并且涵盖在内。
附图说明
图1中A-D是一系列四个条形图，其示出了两个治疗组中梗阻2周后的排尿参数。相对于假手术、年龄匹配的对照大鼠，在两个治疗组中2周梗阻对相关的排尿参数的影响的图形描绘。A-D代表表3中总结的数据。
图2A-图2C是一系列三个图表，其示出了对照组(图2A)、仅载体(pVAX)组(图2B)和用hSlo治疗组(图2C)中梗阻2周后的膀胱测压记录。在每个治疗组中独特大鼠的大约1小时的膀胱测压记录的代表性实例。
图3示出了给予仅载体(pVAX)以及300和1000μg的pVAX/hSLO的大鼠中膀胱测压记录的三个图表。在给予仅载体(pVAX)以及300和1000μg的pVAX/hSLO的大鼠中膀胱测压记录的代表性追踪。注意在治疗的动物中规律的周期性排空和排尿间压力波动的实际不存在。
图4是示出了两次注射1000μg后雌性大鼠组织中pVAX/hSLO载体的拷贝平均数的条形图。hMaxi-k的生物分布。生物分布：第24h和1周时，注射1000μg的pVAX-hSLO后，雌性大鼠组织中的质粒平均拷贝/μg总DNA(N＝4只动物/时间点/一式两份地测量)。注意对照组织(未注射pVAX-hSLO的动物，平均39个组织)的背景值是8.9x 10-3ng质粒/μg总DNA，上限值8x 10-2ng/μg总DNA。因此，仅大于9.6x 105拷贝/μg总DNA的值被认为高于对照动物值(由红线示出)。
图5是示出了pVAX/hSLO载体在人类受试者中的注射部位的图解。
图6是示出了通过治疗人类受试者的每天平均排泄次数随时间的变化的条形图。误差条表示均值标准误差(SEM)。通过治疗每天平均排泄次数随时间的变化(人群：功效)。
图7是示出了通过治疗人类受试者的平均尿急发作随时间的变化的条形图。误差条表示均值标准误差(SEM)。通过治疗平均尿急发作随时间的变化(人群：功效)。
图8是pVAX/hSLO的质粒图谱。
具体实施方式
本发明提供了用于治疗膀胱生理功能异常的基因疗法的方法。具体而言，本发明是基于以下发现：将含有表达人Maxi-K通道(hMaxi-K)的基因的载体直接注射进膀胱壁的平滑肌显著地缓解了女性的膀胱过度活动和尿失禁的症状。具体而言，参与者接受了总剂量为16,000mcg或24,000mcg的hMaxi-K，以20-30次肌内注射给予进膀胱。在24周内拜访了参与者8次，并且在18个月进行了随访。在每次访视前7天收集的平均日记数据揭示，与安慰剂相比，接受hMaxi-K的那些参与者的每天排泄以及每天尿急发作平均次数显著减少。
MaxiK通道(也称为BK通道)提供了钾离子从细胞流出的途径，通过抑制电压敏感性Ca2+通道允许平滑肌松弛，并且由此通过降低病理性升高的平滑肌张力实现器官功能的正常化。术语“MaxiK通道”和“BK通道”在本文中可互换使用。
在结构上，MaxiK通道由α和β亚基构成。四个α亚基形成通道的孔，并且这些α亚基由单个Slo1基因编码(也称为Slo、hSlo和钾钙激活通道亚家族Mα1或KCNMA1)。有四个β亚基可以调节MaxiK通道功能。每个β亚基具有独特的组织特异性表达和调节功能，其中β-1亚基(钾钙激活通道亚家族M调节剂β亚基1或KCNMB1)主要在平滑肌细胞中表达。
MaxiK通道的关键簇非常接近底层肌浆网的兰尼碱敏感性钙储存，为在多种平滑肌(包括膀胱)中钙信号(即，火花)和膜电位的局部调节提供了重要的机制。细胞内钙水平的提高增加了MaxiK通道的开放可能性，从而增加了K+通过钙敏感性MaxiK通道的向外运动。K+的流出导致正电荷净移动出细胞，使细胞内部相对于外部带更多负电荷。这有两个主要影响。第一，增加的膜电位保证钙通道关闭时花费的时间比打开时长。第二，由于钙通道更可能关闭，因此Ca2+进入细胞的净通量降低，并且游离细胞内钙水平相应降低。减少的细胞内钙促进平滑肌松弛。因此，在细胞膜上具有更多MaxiK通道的主要影响在于对于任何给定的松弛刺激，应该导致平滑肌细胞松弛增强。
在部分尿道梗阻(PUO)的动物模型和逼尿肌过度活动(DO)的人模型中，发生逼尿肌肌细胞之间的细胞间通讯增加。关于增加的细胞间通讯，当与具有潜在地较低水平的细胞间偶联的正常膀胱相比时，增加的钙信号传导的影响可能会增加。这种增加的钙信号传导至少部分有助于PUO大鼠模型中观察到的“非排泄性收缩”。然而，如果MaxiK通道表达平行增加(例如，由于本披露的组合物或方法的MaxiK通道编码转基因的过表达)，则推测起来由这些转染细胞表达的所得重组的和/或转基因的MaxiK通道可能会“短路”异常增加的钙信号。这防止通过间隙连接的进一步传播，并且因此防止异常的和增加的钙信号传导的充分增加(通过例如未转染的肌细胞招募)以减轻异常的收缩反应。通过本披露的组合物或方法的MaxiK通道编码转基因的过表达，在单独细胞或细胞组中异常收缩反应的减少消除或改善DO(尿急的临床相关因素)的非排泄性收缩特征。相反，由于排尿反应中脊髓反射的参与导致协同的逼尿肌收缩远远超过异常增加的与DO相关的钙信号传导，MaxiK转基因的过表达可能有效地减少或抑制有助于DO(如在动物模型中测量为IMP(排尿间压力)的降低)或SA(与对照水平相比自发活动)的较弱异常增加的钙信号，而不显著地或可检测地影响更强劲的排尿收缩反应。
衰老和疾病可能导致hSlo基因的最终产物的表达发生变化，hSlo基因是表达大电导Ca2+激活电压敏感性钾通道的α-亚基(BKα)的基因。那些变化导致组成器官的平滑肌的张力的器官特异性生理变化减少。影响是引起人类疾病的器官中平滑肌细胞的张力增强，这些疾病是如阴茎的勃起功能障碍(ED)、膀胱的尿急、尿频、夜尿和尿失禁(例如，膀胱过度活动(OAB)综合征)、肺的哮喘、结肠的肠易激、眼的青光眼和前列腺的膀胱出口梗阻。
本发明的方法
本发明提供了用于治疗平滑肌生理功能异常的基因疗法的方法。具体而言，本发明的方法用于治疗或缓解膀胱过度活动(OAB)综合征或逼尿肌过度活动的症状。
OAB综合征的特征在于包括但不限于尿急、尿频、夜尿和尿失禁的一组症状。OAB被细分为特发性OAB和神经源性OAB。
逼尿肌过度活动被定义为特征在于可能是自发性的或诱发性的在充盈期过程中不随意的逼尿肌收缩的尿动力学观察。逼尿肌过度活动被细分为特发性逼尿肌过度活动和神经源性逼尿肌过度活动。
本披露的组合物和方法提供了将编码hMaxi-K的核酸递送至有需要的人类受试者或患者的细胞中。在一些情况下，核酸的递送可以称为基因疗法。
本披露的组合物和方法提供了用于递送hMaxi-K核酸或其突变体的任何合适的方法。在一些情况下，可以使用任何合适的“载体”(有时也称为“基因递送”或“基因转移”媒介物)进行核酸的递送。载体、递送媒介物、基因递送媒介物或基因转移媒介物可以指代包含待递送至靶细胞的多核苷酸的分子的任何合适的大分子或复合物。在一些情况下，靶细胞可以是核酸或基因被递送至的任何细胞。待递送的多核苷酸可以包含基因疗法中感兴趣的编码序列，如hSlo基因。
通过直接注射进逼尿肌肌肉，将hSlo基因引入膀胱的平滑肌细胞中。
例如，合适的载体可以包括但不限于病毒载体(如腺病毒、腺相关病毒(AAV)和逆转录病毒)、脂质体、其他含脂质的复合物和其他能够介导多核苷酸递送至靶细胞的大分子复合物。
可替代地，使用哺乳动物载体通过裸DNA转移将hSlo基因转移到平滑肌细胞中。本文中的“裸DNA”被定义为包含在非病毒载体中的DNA。可以将该DNA序列与无菌水溶液合并，该无菌水溶液优选地与受者的血液等渗。这样一种溶液可以通过以下方式来制备：将DNA悬浮在含有生理相容性物质(如氯化钠、甘氨酸等)的水中，维持与生理条件相容的缓冲pH，并且使溶液无菌。在本发明的一个优选实施例中，将该DNA与20％-25％蔗糖盐水溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)合并，以准备引入平滑肌细胞中。
如本文所述，核酸可以指代多核苷酸。核酸和多核苷酸可以互换使用。在一些情况下，核酸可以包含DNA或RNA。在一些方面，核酸可以包括用于表达Maxi-K的DNA或RNA。在一些方面，RNA核酸可以包括但不限于感兴趣的基因(例如Slo)、内含子、非翻译区、终止序列等的转录物。在其他情况下，DNA核酸可以包括但不限于诸如杂合启动子基因序列、强组成型启动子序列、感兴趣的基因(例如Slo)、非翻译区、终止序列等序列。在一些情况下，可以使用DNA和RNA的组合。
如本文的披露中所述，术语“表达构建体”意在包括任何类型含有编码基因产物的核酸或多核苷酸的基因构建体，在其中部分或全部核酸编码序列能够被转录。转录物可以被翻译成蛋白质。在一些方面，转录物可以被部分翻译或不被翻译。在某些方面，表达包括基因转录和mRNA翻译成基因产物二者。在其他方面，表达仅包括编码感兴趣的基因的核酸的转录。
该核酸可以作为核酸的数量来测量。通常，任何合适量的核酸可以与本披露的组合物和方法一起使用。在一些情况下，核酸可以是至少约1pg、10pg、100pg、1pg、10pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1μg、10μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1ng、10ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1mg、10mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、2g、3g、4g或5g。在一些情况下，核酸可以是至多约1pg、10pg、100pg、1pg、10pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1μg、10μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1ng、10ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1mg、10mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、2g、3g、4g或5g。
在一些情况下，核酸可以是至少约5000mcg、7500mcg、10,000mcg、12,500mcg、15,000mcg、16,000mcg、17,500mcg、20,000mcg、22,500mcg、24,000mcg、25,000mcg、30,000mcg、35,000mcg、40,000mcg、45,000mcg或50,000mcg。
如本文所用，mcg和μg可互换使用。
本发明具体地提供了基因治疗的方法，其中参与平滑肌张力调节的MaxiK通道蛋白调节平滑肌的松弛。这些蛋白质将促进或增强平滑肌的松弛，并且将从而降低平滑肌张力。具体而言，在膀胱平滑肌张力降低的情况下，膀胱容量将增加。
此外，本发明具体地提供了调节受试者的膀胱平滑肌张力的方法，该方法包括将编码参与平滑肌张力调节的蛋白质的DNA序列引入该受试者的膀胱平滑肌细胞中，以及在该受试者的足够数量的膀胱平滑肌细胞中表达，以增强该受试者的膀胱松弛。在这个实施例中，本发明的方法用于缓解反射亢进型膀胱。反射亢进型膀胱可能由多种障碍引起，包括神经源性和动脉源性功能异常、以及其他导致膀胱平滑肌松弛不完全或收缩性增强的病症。该受试者可以是动物或人，并且优选是人。
本发明的重组载体和质粒还可以含有编码合适的调节元件的核苷酸序列，以实现载体构建体在合适的宿主细胞中的表达。如本文所用，“表达”是指载体将插入的DNA序列转录成mRNA的能力，使得可以发生由插入的核酸编码的蛋白质的合成。本领域技术人员将理解以下内容：(1)多种增强子和启动子适用于本发明的构建体；以及(2)这些构建体将含有必需的起始、终止和控制序列，以便在将重组载体构建体引入宿主细胞中后，适当地转录和加工编码参与平滑肌张力调节的蛋白质的DNA序列。
本发明提供的用于在平滑肌细胞中表达编码参与平滑肌张力调节的蛋白质的DNA序列的非病毒载体可以包含全部或部分以下本领域技术人员已知的载体：pVax(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))、pCMVβ(英杰公司(Invitrogen))、pcDNA3(英杰公司)、pET-3d(诺瓦根公司(Novagen))、pProEx-1(生命技术公司(Life Technologies))、pFastBac1(生命技术公司)、pSFV(生命技术公司)、pcDNA2(英杰公司)、pSL301(英杰公司)、pSE280(英杰公司)、pSE380(英杰公司)、pSE420(英杰公司)、pTrcHis A,B,C(英杰公司)、pRSET A,B,C(英杰公司)、pYES2(英杰公司)、pAC360(英杰公司)、pVL1392和pVl1392(英杰公司)、pCDM8(英杰公司)、pcDNA I(英杰公司)、pcDNA I(amp)(英杰公司)、pZeoSV(英杰公司)、pRc/CMV(英杰公司)、pRc/RSV(英杰公司)、pREP4(英杰公司)、pREP7(英杰公司)、pREP8(英杰公司)、pREP9(英杰公司)、pREP10(英杰公司)、pCEP4(英杰公司)、pEBVHis(英杰公司)和λPop6。其他载体对于本领域技术人员将是清楚的。优选地，该载体是pVax。
在一些实施例中，该pVax载体序列包含以下的序列：
在一些实施例中，该pVAX序列包含与SEQ ID NO:10具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，该pVAX序列包含在SEQ ID NO:10的位置2处G对A的取代、在SEQ ID NO:10的位置5处另外的G、在SEQ ID NO:10的位置1158处T对C的取代、在SEQ ID NO:10的位置2092处A的缺失、在SEQ ID NO:10的位置2493处T对C的取代或其组合。
适用于本发明的启动子包括但不限于组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子。在一些实施例中，该启动子是平滑肌启动子。在其他实施例中，该启动子是肌肉细胞启动子。优选地，该启动子不是尿路上皮特异性表达启动子。
在本发明的一个实施例中，编码参与平滑肌张力调节的蛋白质的DNA序列的表达受该DNA序列所引入的具体载体的控制和影响。一些真核载体已经被工程化，使得它们能够在宿主细胞内高水平表达插入的核酸。此类载体利用许多强大的启动子之一来指导高水平表达。真核载体使用病毒基因、特别是肿瘤病毒的基因的启动子-增强子序列。本发明的这个具体实施例通过使用诱导型启动子提供了编码该蛋白质的DNA序列的表达的调节。诱导型启动子的非限制性实例包括金属硫蛋白启动子和小鼠乳腺瘤病毒启动子。取决于载体，DNA序列在平滑肌细胞中的表达可通过在细胞的生长周期的某个点添加特定的化合物来诱导。有效用于本发明的重组载体的启动子和增强子的其他实例包括但不限于CMV(巨细胞病毒)、SV40(猿猴病毒40)、HSV(单纯疱疹病毒)、EBV(爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barrvirus))、逆转录病毒、腺病毒启动子和增强子、以及平滑肌特异性启动子和增强子。平滑肌特异性启动子的实例是SM22α。示例性平滑肌启动子描述于美国专利号7,169,764中，将其内容通过引用以其整体并入本文。
在优选实施例中，该启动子是SM22α启动子序列，并且可以包括但不限于诸如以下等序列：
在优选实施例中，该启动子是人巨细胞病毒中早期启动子序列，并且可以包括但不限于诸如以下等序列：
CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT(SEQ ID NO:1)。
在一些方面，T7引发位点可以包括例如但不限于诸如TAATACGACTCACTATAGGG SEQID NO:2等序列。
在一些方面，用于表达本披露的DNA序列或蛋白质的重组病毒和/或质粒包含polyA(聚腺苷酸化)序列，如本文提供的那些(例如，BGH polyA序列)。通常，任何合适的polyA序列均可以用于该转基因的所需表达。例如，在一些情况下，本披露提供了包含BGHpolyA序列或BGH polyA序列的一部分的序列。在一些情况下，本披露提供了包含一个或多个polyA序列或序列元件的组合的polyA序列。在一些情况下，不使用polyA序列。在一些情况下，一个或多个polyA序列可以称为非翻译区(UTR)、3'UTR或终止序列。
polyA序列在长度上可以包含1-10bp、10-20bp、20-50bp、50-100bp、100-500bp、500bp-1Kb、1Kb-2 Kb、2Kb-3 Kb、3Kb-4 Kb、4Kb-5 Kb、5Kb-6 Kb、6Kb-7 Kb、7Kb-8 Kb、8Kb-9 Kb和9Kb-10 Kb的长度。polyA序列在长度上可以包含至少1bp、2bp、3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1Kb、2Kb、3Kb、4Kb、5Kb、6Kb、7Kb、8Kb、9Kb和10Kb的长度。polyA序列在长度上可以包含至多1bp、2bp、3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1Kb、2Kb、3Kb、4Kb、5Kb、6Kb、7Kb、8Kb、9Kb和10Kb的长度。
在一些情况下，BGH polyA可以包括但不限于诸如以下等序列：
在一些情况下，可以针对影响蛋白质表达的各种参数优化polyA序列，这些参数包括但不限于转基因在细胞中的mRNA半衰期、转基因的mRNA的稳定性或转录调节。例如，可以改变polyA序列以增加转基因的mRNA转录，这可以导致蛋白质表达增加。在一些情况下，可以改变polyA序列以降低转基因的mRNA转录物的半衰期，这可以导致蛋白质表达减少。
在一些方面，该载体包含编码复制起点序列的序列，如本文提供的那些。复制起点序列通常提供用于繁殖质粒/载体的序列。
在一些情况下，pUC复制起点序列可以包括但不限于诸如以下等序列：
该载体还可以包含选择性标记。选择性标记可以是阳性的、阴性的或双功能的。阳性选择性标记允许选择携带该标记的细胞，然而阴性选择性标记允许选择性消除携带该标记的细胞。已经描述了多种此类标记基因，包括双功能(即，阳性/阴性)标记(参见例如，Lupton,S.,WO 92/08796,1992年5月29日公开；和Lupton,S.,WO 94/28143,1994年12月8日公开)。阴性选择性标记的实例可以包括包含对抗生素(如氨苄青霉素或卡那霉素)的抗性基因。此类标记基因可以提供另外的控制措施，这在基因疗法的背景下可能是有利的。各种各样的此类载体在本领域中是已知的，并且通常是可得的。
在一些情况下，编码卡那霉素抗性的核酸可以包括但不限于诸如以下等序列：
该重组载体/质粒包含编码人Maxi-K蛋白、突变体Maxi-K蛋白或其功能片段的多核苷酸。适用于本发明的编码Maxi-K蛋白的示例性核酸包括SEQ ID NO:6的核酸序列。
hSlo
ATGGCAAACGGTGGCGGCGGCGGCGGCGGCAGCAGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGAGGCAGCGGTCTTAGAATGAGCAGCAATATCCACGCGAACCATCTCAGCCTAGACGCGTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCTTCCTCTTCTTCTTCTTCCTCCTCCTCTTCCTCCTCGTCCTCGGTCCACGAGCCCAAGATGGATGCGCTCATCATCCCGGTGACCATGGAGGTGCCGTGCGACAGCCGGGGCCAACGCATGTGGTGGGCTTTCCTGGCCTCCTCCATGGTGACTTTCTTCGGGGGCCTCTTCATCATCTTGCTCTGGCGGACGCTCAAGTACCTGTGGACCGTGTGCTGCCACTGCGGGGGCAAGACGAAGGAGGCCCAGAAGATTAACAATGGCTCAAGCCAGGCGGATGGCACTCTCAAACCAGTGGATGAAAAAGAGGAGGCAGTGGCCGCCGAGGTCGGCTGGATGACCTCCGTGAAGGACTGGGCGGGGGTGATGATATCCGCCCAGACACTGACTGGCAGAGTCCTGGTTGTCTTAGTCTTTGCTCTCAGCATCGGTGCACTTGTAATATACTTCATAGATTCATCAAACCCAATAGAATCCTGCCAGAATTTCTACAAAGATTTCACATTACAGATCGACATGGCTTTCAACGTGTTCTTCCTTCTCTACTTTGGCTTGCGGTTTATTGCAGCCAACGATAAATTGTGGTTCTGGCTGGAAGTGAACTCTGTAGTGGATTTCTTCACGGTGCCCCCCGTGTTTGTGTCTGTGTACTTAAACAGAAGTTGGCTTGGTTTGAGATTTTTAAGAGCTCTGAGACTGATACAGTTTTCAGAAATTTTGCAGTTTCTGAATATTCTTAAAACAAGTAATTCCATCAAGCTGGTGAATCTGCTCTCCATATTTATCAGCACGTGGCTGACTGCAGCTGGGTTCATCCATTTGGTGGAGAATTCAGGGGACCCATGGGAAAATTTCCAAAACAACCAGGCTCTCACCTACTGGGAATGTGTCATTTACTCATGGTCACAATGTCCACCGTTGGTTATGGGGATGTTTATGCAAAAACCACACTTCGGCGCCTCTTCATGGTCTTCTTCATCCTCGGGGGACTGGCCATGTTTGCCAGCTACGTCCCTGAAATCATAGAGTTAATAGGAAACCGCAAGAAATACGGGGGCTCCTATAGTGCGGTTAGTGGAAGAAAGCACATTGTGGTCTGCGGACACATCACTCTGGAGAGTGTTTCCAACTTCCTGAAGGACTTTCTGCACAAGGACCGGGATGACGTCAATGTGGAGATCGTTTTTCTTCACAACATCTCCCCCAACCTGGAGCTTGAAGCTCTGTTCAAACGACATTTTACTCAGGTGGAATTTTATCAGGGTTCCGTCCTCAATCCACATGATCTTGCAAGAGTCAAGATAGAGTCAGCAGATGCATGCCTGATCCTTGCCAACAAGTACTGCGCTGACCCGGATGCGGAGGATGCCTCGAATATCATGAGAGTAATCTCCATAAAGAACTACCATCCGAAGATAAGAATCATCACTCAAATGCTGCAGTATCACAACAAGGCCCATCTGCTAAACATCCGAGCTGGAATTGGAAAGAAGGTGATGACGCAATCTGCCTCGCAGAGTTGAAGTTGGGCTTCATAGCCCAGAGCTGCCTGGCTCAAGGCCTCTCCACCATGCTTGCCAACCTTCTCCATGAGGTCATTCATAAAGATTGAGGAAGACACATGGCAGAAATACTACTTGGAAGGAGTCTCAAATCAAATGTACACAGAATATCTCTCCAGTGCCTTCGTGGGTCTGTCCTTCCCTACTGTTTGTGAGCTGTGTTTTGTGAAGCTCAAGCTCCTAATGATAGCCATTGAGTACAAGTCTGCCAACCGAGAGAGCCGTATATTAATTAATCCTGGAAACCATTTTAAGATCCAAGAAGGTACTTTAGGATTTTTCATCGCAAGTGATGCCAAAGAAGTTAAAAGGGCATTTTTTTACTGCAAGGCCTGTCATGATGACATCACAGATCCCAAAAGAATAAAAAAATGTGGCTGCAAACGGCTTGAAGATGAGCAGCCGTCAACACTATCACCAAAAAAAAAGCAACGGAATGGAGGCATGCGGAACTCACCCAACACCTCGCCTAAGCTGATGAGGCATGACCCCTTGTTAATTCCTGGCAATGATCAGATTGACAACATGGACTCCAATGTGAAGAAGTACGACTCTACTGGGATGTTTCACTGGTGTGCACCCAAGGAGATAGAGAAAGTCATCCTGACTCGAAGTGAAGCTGCCATGACCGTCCTGAGTGGCCATGTCGTGGTCTGCATCTTTGGCGACGTCAGCTCAGCCCTGATCGGCCTCCGGAACCTGGTGATGCCGCTCCGTGCCAGCAACTTTCATTACCATGAGCTCAAGCACATTGTGTTTGTGGGCTCTATTGAGTACCTCAAGCGGGAATGGGAGACGCTTCATAACTTCCCCAAAGTGTCCATATTGCCTGGTACGCCATTAAGTCGGGCTGATTTAAGGGCTGTCAACATCAACCTCTGTGACATGTGCGTTATCCTGTCAGCCAATCAGAATAATATTGATGATACTTCGCTGCAGGACAAGGAATGCATCTTGGCGTCACTCAACATCAAATCTATGCAGTTTGATGACAGCATCGGAGTCTTGCAGGCTAATTCCCAAGGGTTCACACCTCCAGGAATGGATAGATCCTCTCCAGATAACAGCCCAGTGCACGGGATGTTACGTCAACCATCCATCACAACTGGGGTCAACATCCCCATCATCACTGAACTAGTGAACGATACTAATGTTCAGTTTTTGGACCAAGACGATGATGATGACCCTGATACAGAACTGTACCTCACGCAGCCCTTTGCCTGTGGGACAGCATTTGCCGTCAGTGTCCTGGACTCACTCATGAGCGCGACGTACTTCAATGACAATATCCTCACCCTGATACGGACCCTGGTGACCGGAGGAGCCACGCCGGAGCTGGAGGCTCTGATTGCTGAGGAAAACGCCCTTAGAGGTGGCTACAGCACCCCGCAGACACTGGCCAATAGGGACCGCTGCCGCGTGGCCCAGTTAGCTCTGCTCGATGGGCCATTTGCGGACTTAGGGGATGGTGGTTGTTATGGTGATCTGTTCTGCAAAGCTCTGAAAACATATAATATGCTTTGTTTTGGAATTTACCGGCTGAGAGATGCTCACCTCAGCACCCCCAGTCAGTGCACAAAGAGGTATGTCATCACCAACCCGCCCTATGAGTTTGAGCTCGTGCCGACGGACCTGATCTTCTGCTTAATGCAGTTTGACCACAATGCCGGCCAGTCCCGGGCCAGCCTGTCCCATTCCTCCCACTCGTCGCAGTCCTCCAGCAAGAAGAGCTCCTCTGTTCACTCCATCCCATCCACAGCAAACCGACAGAACCGGCCCAAGTCCAGGGAGTCCCGGGACAAACAGAAGTACGTGCAGGAAGAGCGGCTTTGATATGTGTATCCACCGCCACTGTGTGAAACTGTATCTGCCACTCATTTCCCCAGTTGGTGTTTCCAACAAAGTAACTTTCCCTGTTTTCCCCTGTAGTCCCCCCCTTTTTTTTTACACATATTTGCATATGTATGATAGTGTGCATGTGGTTGTCATTTTTATTTCACCACCATAAAACCCTTGAGCACAACAGCAAATAAGCAGACGGGCTCCGGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAG(SEQ ID NO:6)
hSlo基因的修饰可以用于有效治疗人类疾病，该人类疾病例如由BK通道表达、活性、上游信号传导事件和/或下游信号传导事件的改变引起。对hSlo的野生型核苷酸或肽序列的修饰可以包括但不限于缺失、插入、移码、取代和倒位。例如，对hSlo的野生型序列的预期修饰包括在编码hSlo的DNA、cDNA或RNA序列中单个核苷酸的取代和/或在编码hSlo的肽或多肽序列中单个氨基酸的取代。在编码hSlo的DNA、cDNA或RNA序列中单个核苷酸和/或在编码hSlo的肽或多肽序列中单个氨基酸的取代也称为点突变。编码hSlo的DNA、cDNA或RNA序列和/或编码hSlo的肽或多肽序列内的取代可以是保守的或不保守的。
当根据SEQ ID NO:7编号时，在hSlo基因中优选的修饰包括在核酸位置1054处的点突变。当根据SEQ ID NO:7编号时，此点突变导致MaxiK通道蛋白的位置352处的氨基酸取代。例如，该点突变是丝氨酸(S)对苏氨酸(T)的取代(例如，T352S)。任选地，hSlo基因中的另外的修饰包括点突变，当根据SEQ ID NO:8编号时，这些点突变导致在氨基酸位置496、602、681、778、805或977处的一个或多个氨基酸取代。
氨基酸序列(SEQ ID NO:8)中的另外的突变也用黑色背景上的白色字母高亮显示，并且带有突变的名称(例如C977A(C1)、C496A(C2)、C681A(C3)、M602L(M1)、M778L(M2)和M805L(M3))。
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本发明还提供了平滑肌细胞，该平滑肌细胞表达编码参与平滑肌张力调节的蛋白质的外源DNA序列。如本文所用，“外源”意指引入生物体或细胞中的任何DNA。在一些实施例中，该外源DNA序列编码hSlo。
药物组合物
药物组合物是含有一种或多种活性成分以及一种或多种赋形剂、载体、稳定剂或填充剂的配制品，其适于向人类患者给予以实现所需的诊断结果或者治疗或预防效果。为了储存稳定性和处理便利性，可以将药物组合物配制成冻干(即冷冻干燥)或真空干燥的粉末，其可以在给予患者前用盐水或水重构。可替代地，可以将药物组合物配制成水溶液。药物组合物可以含有蛋白质活性成分。已经不同程度成功地使用多种赋形剂(如白蛋白和明胶)，以尝试和稳定药物组合物中存在的蛋白质活性成分。此外，在冻干的冷冻条件下，冷冻保护剂(如醇)已经用于减少蛋白质变性。
适于内服的药物组合物包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内给予，合适的载体包括生理盐水、抑菌水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，该组合物必须是无菌的并且应该是流动的至具有容易注射的程度。它在制造和储存条件下必须是稳定的并且必须防止微生物(如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可以例如通过以下方式维持合适的流动性：通过使用包衣(如卵磷脂)，在分散液的情况下通过维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂(如聚山梨醇酯(Tween.TM.)、十二烷基硫酸钠(月桂基硫酸钠)、月桂基二甲基氧化胺、鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)、聚乙氧基化醇、聚氧乙烯山梨醇酐、辛苯聚醇(octoxynol)(TritonX100.TM.)、N,N-二甲基十二烷基胺-N-氧化物、十六烷基三甲基溴化铵(HTAB)、聚乙二醇(polyoxyl)10月桂基醚、Brij 721.TM.、胆汁盐(脱氧胆酸钠、胆酸钠)、普朗尼克酸(pluronic acid)(F-68、F-127)、聚乙二醇蓖麻油(Cremophor.TM.)、壬基酚乙氧基化物(Tergitol.TM.)、环糊精和乙基苄索氯铵(Hyamine.TM.)。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，将优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)、氯化钠。可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现内服组合物的延长吸收。
无菌溶液可以通过以下方式来制备：将所需量的活性化合物根据需要与以上列举的成分中的一种或其组合一起掺入适当溶剂中，随后过滤灭菌。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散液，该无菌媒介物含有基础分散介质和来自以上列举的那些的其他所需成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法为真空干燥和冷冻干燥，这些干燥产生活性成分加来自其先前经无菌过滤溶液的任何另外的所需成分的粉末。
药物组合物可以与给予说明书一起被包括在容器、包装或分配器中。
本披露的某些组合物还在配制品中掺入了载体化合物。如本文所用，“载体化合物”或“载体”可以指代如下核酸或其类似物，其是惰性的(即，本身不具有生物活性)，但是却被体内过程被认为是核酸，这些体内过程通过例如降解生物活性的核酸或促进其从循环中的除去而降低具有生物活性的核酸的生物利用度。核酸和载体化合物的共同给予(通常是后一种物质过量)可能引起肝脏、肾脏或其他额外的循环储器中回收的核酸的量大幅度减少，推测起来是由于载体化合物和核酸之间竞争共有受体。例如，当与聚肌苷酸、硫酸葡聚糖、聚胞苷酸(polycytidic acid)或4-乙酰胺基-4’异氰硫基-芪-2,2'二磺酸共同给予时，部分硫代磷酸寡核苷酸在肝组织中的回收可能减少(Miyao等人,Antisense Res.Dev.[反义研究与开发],1995,5,115-121；Takakura等人,Antisense&Nucl.Acid Drug Dev.[反义和核酸药物开发],1996,6,177-183)。
可以将载体掺入向哺乳动物患者、特别是人给予的药物组合物中。载体或病毒体可以在无毒的、惰性的、药学上可接受的水性载体中配制，优选在3至8的范围内、更优选在6至8的范围内、最优选在6.8至7.2的范围内的pH下。在重构时，此类无菌组合物将包含溶解在具有可接受的pH的水性缓冲液中的含有编码治疗性分子的核酸的载体。
在一些方面，本文提供的药物组合物包含与药学上可接受的载体和/或赋形剂混合的治疗有效量的载体，该载体和/或赋形剂是例如盐水、磷酸盐缓冲盐水、磷酸盐和氨基酸、聚合物、多元醇、糖、缓冲液、防腐剂和其他蛋白质。示例性氨基酸、聚合物和糖等是辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物、聚乙二醇单硬脂酸酯化合物、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、蔗糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露醇、葡聚糖、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、木糖醇、乳糖、海藻糖、牛或人血清白蛋白、柠檬酸酯、乙酸酯、林格氏和汉克氏溶液、半胱氨酸、精氨酸、肉碱、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯和二醇。
在一些方面，本文提供的药物组合物包含缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或磷酸钠/硫酸钠、tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、无菌水和普通熟练技术人员已知的其他缓冲液，如Good等人(1966)Biochemistry[生物化学]5:467描述的那些。优选的药物组合物含有磷酸钠、氯化钠和蔗糖。
在一些方面，本文提供的药物组合物以约1％-30％(如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％)(v/v)的量包含增加悬浮液的粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇、蔗糖或葡聚糖。优选地，蔗糖是约10％-30％(v/v)，最优选地，蔗糖是约20％(v/v)。
在给予之前，该药物组合物不含生产过程中使用的组分，例如培养基组分、宿主细胞蛋白质、宿主细胞DNA、质粒DNA，并且基本上不含支原体、内毒素和微生物污染。优选地，该药物组合物具有小于10、5、3、2或1个CFU/拭子。最优选地，组合物具有0个CFU/拭子。该药物组合物中的内毒素水平小于20EU/mL、小于10EU/mL或小于5EU/mL。
试剂盒
可以将可用于本披露的组合物和试剂包装在试剂盒中以促进本披露的应用。在一些方面，本发明的方法提供了包含本披露的重组核酸的试剂盒。在一些方面，本发明的方法提供了包含本披露的重组病毒的试剂盒。说明书可以是呈任何所需形式，包括但不限于印在试剂盒插页上、印在一个或多个容器上、以及在电子存储介质(如计算机可读储存介质)上提供的电子存储的说明书。还任选地包括在计算机可读储存介质上的软件包，该软件包允许用户整合信息并且计算控制剂量。
在另一方面，本披露提供了包含本文提供的药物组合物的试剂盒。在又另一方面，本披露提供了用于治疗疾病的试剂盒。
在一方面，试剂盒包含：(a)本文提供的重组病毒，和(b)向细胞或个体给予治疗有效量的重组病毒的说明书。在一些方面，该试剂盒可以包含用于给予重组病毒的药学上可接受的盐或溶液。任选地，该试剂盒还可以包含呈标签或单独插页形式的用于合适的操作参数的说明书。例如，该试剂盒可以具有告知医师或实验室技术人员制备一定剂量的重组病毒的标准说明书。
任选地，该试剂盒还可以包含标准或对照信息，使得可以将患者样品与对照信息标准品进行比较，以确定重组病毒的测试量是否是治疗量。任选地，该试剂盒还可以包含用于给予的装置，如注射器、过滤器针头、伸长管和套管。
定义
除非另有说明，否则如本文所述的本披露的组合物和方法可以采用分子生物学的常规技术和描述(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学、免疫化学和眼科技术，这些技术在本领域的技术人员的技术范围内。此类常规技术包括用于观察和分析受试者的视网膜或视觉、克隆和繁殖重组病毒、配制药物组合物以及生化纯化和免疫化学的方法。合适的技术的具体说明可以参考本文的实例。然而，当然也可以使用等效的常规程序。此类常规技术和描述可以在标准实验室手册中找到，这些标准实验室手册是如Green等人编辑,GenomeAnalysis:A Laboratory Manual Series[基因组分析：实验室手册系列](第I-IV卷)(1999)；Weiner等人编辑,Genetic Variation:A Laboratory Manual[遗传变异：实验室手册](2007)；Dieffenbach,Dveksler编辑,PCR Primer:A Laboratory Manual[PCR引物：实验室手册](2003)；Bowtell和Sambrook,DNA Microarrays:A Molecular Cloning Manual[DNA微阵列：分子克隆手册](2003)；Mount,Bioinformatics:Sequence and GenomeAnalysis[生物信息学：序列和基因组分析](2004)；Sambrook和Russell,CondensedProtocols from Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆的浓缩方案：实验室手册](2006)；以及Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册](2002)(全部来自冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press))；Stryer,L.,Biochemistry[生物化学](第4版)W.H.Freeman,纽约(1995)；Gait,“Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach”[“寡核苷酸合成：实用方法”]IRL出版社(IRL Press),伦敦(1984)；Nelson和Cox,Lehninger,Principles ofBiochemistry[生物化学原理],第3版,W.H.弗里曼出版社(W.H.Freeman Pub.),纽约(2000)；以及Berg等人,Biochemistry[生物化学],第5版,W.H.弗里曼出版社,纽约(2002)，出于所有目的将所有参考文献通过引用以其整体并入本文。
除非上下文另外清楚地说明，否则如本文所用，单数形式“一个/一种(a、an)”和“该(the)”旨在包括复数形式。此外，就在具体实施方式和/或权利要求书中使用的术语“包括(including)”、“包括(includes)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“具有(with)”或其变体来说，此类术语旨在以与术语“包含(comprising)”类似的方式包括在内。
范围可以在本文中表示为从“约”一个特定值和/或到“约”另一个特定值。当表达这样一个范围时，另一种情况包括从一个特定值和/或到另一特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，将理解该特定值构成另一种情况。还将理解，每个范围的端点相对于另一端点，以及独立于另一端点都是显著的。如本文所用的术语“约”是指在特定用途的上下文中相对于所述数值为正负15％的范围。例如，约10将包括8.5至11.5的范围。术语“约”还解释了值测量中的典型误差或不精确性。
在本发明的上下文中，如本文所用，术语“治疗”(“treating”或“treatment”)意指逆转此术语应用的障碍或病症或者这种障碍或病症(例如，特发性膀胱过度活动综合征)的一种或多种症状、缓解此术语应用的障碍或病症或者这种障碍或病症(例如，特发性膀胱过度活动综合征)的一种或多种症状、抑制此术语应用的障碍或病症或者这种障碍或病症(例如，特发性膀胱过度活动综合征)的一种或多种症状的发展或预防此术语应用的障碍或病症或者这种障碍或病症(例如，特发性膀胱过度活动综合征)的一种或多种症状。
根据本发明，术语“患者”或“有需要的患者”旨在用于特发性膀胱过度活动综合征影响或可能影响的人或非人哺乳动物。
如本文所用，术语“逼尿肌”或“逼尿肌肌肉”意指膀胱的肌肉。“逼尿肌内”意指进入逼尿肌肌肉。
如本文所预期，表述“分离的核酸”是指任何类型的分离的核酸，其可以特别地是天然的或合成的、DNA或RNA、单链的或双链的。具体而言，在核酸是合成的情况下，其可以包含对碱基或键的非天然修饰，特别是用于增加对核酸降解的抗性。在核酸是RNA的情况下，修饰特别地涵盖将其末端加帽或修饰核糖主链的2'位置，从而降低羟基部分的反应性，例如通过抑制羟基部分(以产生2'-脱氧核糖或2'-脱氧核糖-2'-氟核糖)、或用烷基(如甲基)取代羟基部分(以产生2'-O-甲基-核糖)。
当大于80％、优选大于85％、优选大于90％的氨基酸或核酸序列是相同的，或者大于约90％、优选大于95％的氨基酸或核酸序列是相似的(功能上相同的)，两个氨基酸序列或核酸序列是“基本上同源的”或“基本上相似的”。为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的百分比同一性，出于最佳比较目的将序列进行比对(例如，可以在第一氨基酸或核酸序列的序列中引入空位以与第二氨基酸或核酸序列进行最佳比对)。然后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与在第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则这些分子在那个位置是相同的。两个序列之间的百分比同一性是序列共享的相同位置数的函数。在一个实施例中，两个序列的长度相同。两个序列之间的百分比同一性的确定可以使用数学算法完成。优选地，通过使用例如GCG(遗传学计算机组(Genetics Computer Group)，GCG包的程序手册，版本7，麦迪逊，威斯康星州)堆积程序或任何序列比较算法(如BLAST、FASTA等)通过比对来鉴定相似或同源序列。
如本文所用，术语“载体”是指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指可以将另外的DNA区段连接到其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中可以将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体以及附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞中时被整合到该宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体表达载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达。
其他实施例
虽然已经结合其具体实施方式对本发明进行了描述，但前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点以及修改都在以下权利要求的范围内。
实例实例1：hMaxi-K基因转移的非临床研究
大鼠
在大鼠模型中部分尿出口梗阻的病理生理重演了在人中观察到的相应的下尿路症状的许多相关方面。使得注意的生理和病理生理相似性合理地假设，对大鼠膀胱的研究将提供至少对人膀胱生理和功能异常的一些方面的了解。
因为大鼠膀胱的生理与人膀胱的许多方面相似，所以研究检查了用hSlo cDNA(即，maxi-K通道)的膀胱滴注K通道基因疗法的潜在实用性，以改善部分尿出口梗阻的大鼠模型中的膀胱过度活动。
在一项研究中，22只雌性Sprague-Dawley大鼠经受了部分尿道(即出口，PUO)梗阻，并且与17只假手术的对照大鼠平行运行。在梗阻6周后，经手术将耻骨上导管置入所有大鼠的膀胱圆顶中。12只梗阻的大鼠在导尿过程中接受了膀胱滴注在1ml PBS-20％蔗糖中的100μg的hSlo/pcDNA，并且另外10只梗阻的大鼠接受1ml PBS-20％蔗糖(7只大鼠)或1ml仅含有pcDNA的PBS-20％蔗糖(3只大鼠)。手术后两天，对所有动物进行膀胱测压，以检查在有意识且不受约束的大鼠中排尿反射的特征。梗阻与膀胱重量增加三到四倍以及几乎每个排尿参数估计值的改变相关(参见表1)。
注射PBS-20％蔗糖的梗阻的大鼠通常在排尿之间表现自发膀胱收缩。相比之下，hSlo注射消除了梗阻相关膀胱活动亢进，而不可检测地影响任何其他膀胱测压参数。推测起来，hSlo在大鼠膀胱中的表达在功能上拮抗了通常在梗阻的动物中观察到的增加的收缩性，并且由此改善了膀胱过度活动。
另一项研究检查了hSlo基因转移改变和/或改善在梗阻的雄性大鼠模型中观察到的排尿间压力波动的能力。对于这些研究，使用会阴途径使大鼠梗阻2周。梗阻2周后，为大鼠导尿以进行膀胱测压检查，并且置于2个治疗组中的1个中。年龄匹配的对照大鼠经受了假梗阻并且平行运行。
表2总结了所有实验动物排尿参数的均值，并且这些发现的突出特征在图1和图2A-图2C中以图形方式描绘。重要的是，与在6周梗阻的雌性大鼠中进行的研究一样，单次膀胱内滴注100μg hSlo/pVAX与若干具有重大生理相关性的排尿参数的统计学上显著的变化相关。
第三项研究评估了在雌性大鼠中在部分尿道出口梗阻2周后hSlo基因转移的效果。如上所述，为了产生部分尿道出口梗阻(PUO)，将结扎线置于体重200-250g的雌性Sprague-Dawley大鼠的尿道上(Christ等人,2001)。结扎线放置后两周，大鼠经受了手术以放置耻骨上导管。两天后，在代谢笼中对有意识的不受约束的大鼠进行膀胱功能研究(即，膀胱测压)。如表3和图3所示，部分尿道出口梗阻2周后，雌性大鼠表现出膀胱功能的显著变化，如通过膀胱容量增加了2倍以上并且出现了显著的自发膀胱收缩所证明的。随着排尿之间压力的波动，观察到增加的自发膀胱收缩(参见图3)，并且可以通过在SA和IMP值中观察到的相应的增加来量化，如表3所示。单次腔内膀胱注射300μg和1000μg的pVAX/hSlo(在1mlPBS-20％蔗糖中)导致逼尿肌过度活动几乎完全消融。此效果通过当与仅用pVAX载体治疗的大鼠相比时在hSlo治疗的梗阻的大鼠中IMP和SA的显著降低反映(参见表3)。尽管在这个模型中未显示出DO效应与hSlo基因转移的真正关系，但是此项研究确实证明，由于DO的1-log单位变化(从100至1000μg)，在对膀胱排空能力没有任何可检测的影响的情况下，DO具有统计学上显著的、此外生理学上相关的减少。也就是说，在这个动物模型中，pVAX/hSlo能够改善出口梗阻相关DO的病理生理效应，而对膀胱功能没有任何不利影响。在6周梗阻的雌性Sprague Dawley大鼠中滴注100μg pVAX/hSlo后，观察到了如下所示的类似效果。
对患有OAB的女性开始临床试验之前，使用直接囊内注射进行了兔研究，以评估注射进膀胱壁的不同体积的基因转移的分布(表4)。使用9只平均体重为6磅的雌性成年新西兰白兔。将动物麻醉，并且将pVAX-lacz以0.05、0.1和0.15ml等分试样注射进膀胱壁的4、8和10个部位的逼尿肌中。另外一组3只动物仅以最大体积的载体单独注射载体(4、8或10个部位x 0.15ml)。质粒以4000μg/ml的浓度在溶液中。一周后，对动物实施安乐死并且切除膀胱并且称重。将蓝色区域准备用于组织学检查和分子分析。通过RNA提取和实时PCR进行hSlo表达组织的分子分析。此外，对多种兔组织进行了组织病理学检查。
由于在这个动物模型中直接膀胱注射有困难，因此仅给1只兔注射了0.05ml。6只兔在4、8和10个部位注射了0.1ml(3只来自膀胱内部；3只来自膀胱外部)。3只兔在4、8和10个部位注射了0.15ml。结果表明，与一些注射次数最少(4次注射)的动物相比，注射次数更多(8-10次注射)的那些兔具有更少的表达。总的结论是，直接注射进膀胱壁导致该基因的表达，然而，似乎最有效的是使注射分散地更宽，也许是相距1cm。直到治疗后30分钟为止，一直在血液中检测到该基因。由于缝合线(兔模型中常见的伪影)，观察到肉芽肿病变。
毒理学
对于OAB适应症，在技术上不可能像在人体试验中使用的那样在大鼠中模拟相同的膀胱内给予pVAX/hSlo的经尿道途径。因此，在评估pVAX/hSlo膀胱内注射的毒理学和生物分布研究中，对动物进行了膀胱手术暴露，并且使用针头将研究材料直接注射进膀胱。
在15只275-300gm正常雌性Sprague-Dawley大鼠中评估了pVAX/hSlo对血液学和化学参数的影响。手术暴露后，将1000μg的pVAX/hSlo(8只动物)或pVAX载体(7只动物)直接注射进膀胱腔。在注射测试材料后第4、8和24小时以及第1周，通过CO2麻醉对动物实施安乐死后，立即经由心脏穿刺收集血样。分析样品的葡萄糖、尿素氮、肌酸酐、总蛋白质、总胆红素、碱性磷酸酶、ALT、AST、胆固醇、钠、钾、氯、A/G比、BUN/肌酸酐比、球蛋白、脂肪酶、淀粉酶、甘油三酯、CPK、GTP、镁和渗透压。在4个时间点，pVAX/hSlo和对照之间的实验室参数相似。
在两项研究中评估了pVAX/hSlo对雌性Sprague-Dawley大鼠(275至300gm)的组织病理学的影响。在第一项研究中，对4只大鼠进行了部分膀胱梗阻手术，并且2周后，将在1000μL PBS-20％蔗糖中的100μg pVAX/hSlo直接给予到进行膀胱手术暴露的膀胱腔中。在注射pVAX/hSlo后第1、8和24小时以及第1周对单只动物实施安乐死。立即将47个器官的组织固定在10％福尔马林中并且进行常规组织病理学检查。仅在膀胱中发现组织病理学变化，并且包括浆膜炎、水肿、出血和纤维化。这些变化与部分尿道梗阻所预期的那些一致，并且不认为与pVAX/hSlo的注射相关。
由于给予pVAX/hSlo的患有PUO的大鼠的膀胱中的组织病理学变化，在正常大鼠中评估了与载体(pVAX)和PBS-20％蔗糖相比pVAX/hSlo对膀胱组织学的影响。手术暴露后，将以下测试材料直接注射进膀胱腔：1)0.6ml PBS-20％蔗糖，2)在0.6ml PBS-20％蔗糖中的1000μg pVAX，或3)在0.6ml PBS-20％蔗糖中的1000μg pVAX/hSlo。滴注后72小时，用CO2对动物实施安乐死，并且取出膀胱并且立即固定在10％福尔马林溶液中。选择72小时的时间点以限制针刺对膀胱壁的机械作用，并且最小化可能由pVAX/hSlo、载体或稀释剂引起的炎症的任何潜在的影响。
膀胱检查无明显发现。总体而言，pVAX/hSlo和媒介物或pVAX之间没有治疗相关差异。注意到尿路上皮中没有治疗相关改变。在组织学检查中观察到的病变与用于注射的针头造成的创伤一致，因为它们在分布上是局灶性的而不是弥慢性或多灶性的。
在生物分布研究中，将测试材料直接注射进275-300g正常雌性Sprague-Dawley大鼠的暴露的膀胱腔中。向12只动物给予在0.6ml PBS-20％蔗糖中的1000μg pVAX/hSlo，并且向5只动物给予0.6ml PBS-20％蔗糖(图4)。在注射测试材料后第24小时、第1周和第1个月各处死四只动物。按如下指定顺序收集组织样品：心脏、肝脏、脑、肾脏、脾脏、肺、主动脉、气管、淋巴结、眼、二头肌、结肠、阴道和子宫。
用经验证的QPCR方法分析基因组DNA样品的卡那霉素基因。结果表明，注射1000μgpVAX/hSlo后，可以在24小时后在主动脉、子宫、膀胱和尿道中检测到该质粒。在第1周，在膀胱中测量到大1300万个拷贝/μg总DNA，并且在二头肌中也可以略微检测到pVAX/hSlo。结果以图形格式显示在图4(下文)中。
尽管这些结果与海绵窦内注射后的发现不同，但是在对这些疫苗的临床试验性新药(IND)试验中，60天后，1300万个拷贝/μg总DNA的检测仍然低于在DNA疫苗注射部位持续存在的<30个拷贝质粒/105个宿主细胞。这些DNA疫苗研究证明，肌内、皮下、皮内或颗粒介导的递送不会导致质粒在异位部位长期存在。此外，将pVAX/hSlo直接注射进动物的手术暴露膀胱的程序可能解释了在膀胱以外的组织中检测质粒的能力。在人中，将使用经尿道导管将hMaxi-K直接滴注进膀胱，并且由于组织损伤或创伤引起的质粒分布风险明显显著降低。
实例2：hMaxi-K基因转移的人临床试验
试验设计
这是一项1B期、多中心研究，其评估在患有特发性(非神经源性)膀胱过度活动综合征(OAB)和逼尿肌过度活动(DO)的女性患者中，作为直接注射给予进膀胱壁的两个递增剂量的hMaxi-K基因的安全性和潜在的活性。
研究人群是患有膀胱过度活动(OAB)和逼尿肌过度活动而在其他方面健康的≥18岁的无生育能力(例如，子宫切除、输卵管结扎或绝经后(定义为加入研究前最后一次月经周期>12个月、或血清FSH>40mIU/L))的女性。
入选标准包括持续时间≥6个月的膀胱过度活动的临床症状，包括以下至少一项：
1.排尿频繁(≥8次/24h)
2.尿急(很难推迟的突然令人迫不及待地想要排尿的抱怨)或夜尿(晚上醒来两次或更多次排泄的抱怨)的症状
3.急迫性尿失禁(每周平均5次-急迫性尿失禁被定义为：伴随尿急或紧接在尿急之前的无意识漏尿的抱怨)
参与者在筛选时还进行了膀胱扫描，发现残留体积≤200ml，并且在基线尿动力学测试过程中记录的逼尿肌过度活动为至少5cm/H20的逼尿肌≥1次不受控制的收缩。
表6示出了依据访视的治疗计划和程序的概览。
这项研究的主要目的是评估与安慰剂(PBS-20％蔗糖)相比不良事件的发生及其与hMaxi-K的大约20至30次膀胱壁肌内注射的单次治疗的关系。这是双盲、不平衡的安慰剂对照的连续剂量试验。参与者为18岁或以上、无生育能力、患有中度OAB/DO持续时间≥6个月、具有以下至少一项的健康女性：排尿频繁≥每天8次，尿急或夜尿(晚上醒来两次或更多次排泄的抱怨)的症状，急迫性尿失禁(每周5次或更多次尿失禁发作)和逼尿肌过度活动(在CMG上记录的至少5cm/H20压力的逼尿肌≥1次不受控制的位相性收缩)。所有参与者在之前用抗胆碱能药治疗都失败了。4名参与者用肉毒毒素A治疗失败了。
参与者被随机分配至两个剂量(16,000μg或24,000μg)之一的hMaxi-K或安慰剂。膀胱镜检查过程中以20-30IM注射进膀胱壁来给予治疗。在24周内拜访了参与者8次，并且进行了18个月的研究随访。记录研究药物给药后发生的所有报告的不良事件。在筛选访视1A(第-1周)以及注射后第4周(访视5)和第24周(访视8)进行复杂CMG。每次访视时使用测量排泄后残留体积(PVR)。
评估功效的数据使用依据治疗组的总结描述性统计(组合安慰剂与2个活性治疗组以及组合安慰剂与组合治疗组)进行评估。将线性混合效应模型用于估计安慰剂和活性治疗之间偏离基线的变化差异，并且用于测试对于不同结果是否存在剂量反应。将使用广义估计方程(GEE)模型来估计二进制端点的影响。
6名参与者接受了16000μg，3名参与者接受了24000μg，并且4名参与者接受了安慰剂。在两个活性治疗组中，大多数不良事件(AE)的严重程度为轻度，并且均被认为与研究药物无关。2名女性在用hMaxi-K治疗后患有轻度无关的UTI：一名在给药后当月接受24000μg，并且另一名在给药后6个月接受16000μg。在16000μg组中报告有一例无关的严重AE。由于天气寒冷，先前存在的哮喘恶化，这需要进行ER访视，并且在给予哮喘治疗后得以解决。没有受试者由于AE而中断，并且所有入组受试者都完成了6个月的试验。此外，在18个月的长期研究后安全性随访过程中，迄今受试者没有报告任何问题(13名中的9名完成了18个月的随访；13名中的13名完成12个月的随访)。
每次访视前7天收集的日记数据的平均值揭示了在6个月的试验期间，与安慰剂和基线相比的统计学上显著的(p<0.05)改善，以及每天平均排泄次数和每天尿急发作平均次数的持续减少。在下表7和8中显示的变化是与安慰剂相比偏离基线的平均变化(+/-SE)。
生活质量参数(King健康问卷)在生活影响、角色局限性、身体局限性、社会局限性和睡眠能量的领域中示出了单独活性治疗和组合活性治疗组(所有剂量)的与安慰剂相比和与基线相比的统计学上显著的持续平均变化。
这项IB期临床试验的结果示出了在单次给予hMaxi-K后持续试验的6个月持续时间排泄和尿急发作次数的显著减少。在没有PVR变化和治疗相关严重不良事件的情况下观察到了那些结果。此项新颖的临床试验的结果首次表明人Maxi-K基因的单次逼尿肌内给予是安全的。
尽管入组人数少，但是参与者日记的总体发现示出了所有活性治疗的与安慰剂相比和与基线相比的平均排泄次数和尿急发作平均次数的显著减少(p<0.05)，以及所有剂量的研究药物的与基线相比的急迫性尿失禁发作的显著减少(p<0.05)。在访视3和5时，参与者对治疗的反应示出了所有活性剂量的与安慰剂相比的一些正p值(参见表9)。为了减少排泄和尿急发作的次数，在除了最终访视8(第24周)的所有访视中均观察到了与安慰剂相比和与基线相比的这些显著变化。在2个活性治疗(16000μg和24000μg)之间没有观察到显著差异，可能是由于在24000μg组中入组的参与者人数较少(N＝3)。
生活质量参数(King健康问卷)在许多领域中示出了单独活性治疗和组合活性治疗组(所有剂量)的与安慰剂相比和与基线相比的统计学上显著的平均改善。这包括以下内容：
·领域2：生活影响
·在访视5时，与基线相比，所有活性剂量的P＝0.014，并且24000μg的p＝0.007，
·在访视5时，与安慰剂相比，24000μg的P＝0.016；
·在访视5时，与16000μg组相比，24000μg组的P＝0.016
·在访视6时，与基线相比，所有活性剂量的P＝0.043
·在访视7时，与基线相比，16000μg的P＝0.010，并且所有活性剂量的p＝0.005
·在访视8时，与基线相比，所有活性剂量的P＝0.026
·领域3：角色局限性
·在访视5时，与基线相比，16000μg、24000μg和所有活性剂量分别为P＝0.004、P＝0.015、P<0.001
·在访视5时，与安慰剂相比，16000μg、24000μg和所有活性剂量分别为P＝0.030、P＝0.035和P＝0.015
·在访视6时，与基线相比，16000μg、24000μg和所有活性剂量分别为P＝0-023、P＝0.014和P＝0.001
·在访视6时，与安慰剂相比，16000μg、24000μg和所有活性剂量分别为P＝0.047、P＝0.020和P＝0.014
·在访视7时，与安慰剂相比，16000μg、24000μg和所有活性剂量分别为P＝0.012、P＝0.014和P<0.001
·在访视7时，与安慰剂相比，24000μg和所有活性剂量分别为P＝0.032和P＝0.021
·在访视8时，与基线相比，24000μg和所有活性剂量分别为P＝0.014和P＝0.005
·在访视8时，与安慰剂相比，16000μg、24000μg和所有活性剂量分别为P＝0.047、P＝0.007和P＝0.007
·领域4身体局限性
·在访视6时，与基线相比，24000μg和所有活性剂量分别为P＝0.018和P＝0.005
·在访视7时，与基线相比，16000μg、24000μg和所有活性剂量分别为P＝0.012、P＝0.018和P＝0.001
·在访视8时，与基线相比，16000μg、24000μg和所有活性剂量分别为P＝0.012、P＝0.047和P＝0.003
·领域5：社会局限性
·在访视6时，分别与基线和安慰剂相比，24000μg的P＝0.032和P＝0.22
·在访视7时，与基线相比，24000μg和所有活性剂量分别为P＝0.002和P＝0.004
·在访视7时，与安慰剂相比，24000μg和所有活性剂量分别为P＝0.008和P＝0.043
·在访视8时，与基线相比，24000μg和所有活性剂量分别为P＝0.002和P＝0.014
·在访视8时，与安慰剂相比，24000μg的P＝0.006
·领域8：睡眠能量
·在访视5时，与基线相比，16000μg、24000μg和所有活性剂量分别为P＝0.047、P＝0.007和P＝0.001
·在访视5时，与安慰剂相比，24000μg和所有活性剂量分别为P＝0.020和P＝0.015
·在访视6时，与基线相比，24000μg和所有活性剂量分别为P＝0.005和P＝0.006
·在访视7时，与基线相比，24000μg和所有活性剂量分别为P＝0.001和P＝0.006
·在访视7时，与安慰剂相比，24000μg的P＝0.012
72小时护垫测试(表12)示出了在访视3-6和访视8时hMaxi-K活性剂量与基线相比的一些统计学上显著的变化，然而，在访视3-5和访视8时安慰剂也有统计学上显著的变化。总体而言，与活性治疗组相比，安慰剂组似乎具有更不严重的疾病，并且活性治疗的基线(V2)垫重几乎是安慰剂组的基线垫重的2倍。此外，安慰剂的V1A平均垫重仅为29克，然而此组在V2时的重量为259克(几乎是V1A的9倍)。这是由于以下事实：参与者002-001在V1A之前就扔掉了护垫(因此她未包括在V1A均值中)，而且她似乎比其他3名安慰剂参与者患有更严重的疾病(在V2时，她第3天的平均垫重为295克，而其他3名参与者为3.3至36克)。
表1.治疗对6周梗阻的雌性大鼠和假手术对照的平均排尿参数的影响的总结
a在200μl PBS-20％蔗糖中的100μg pVAX/hSlo
b这些大鼠中有3只接受了在PBS-20％蔗糖中的1000μg pcDNA。对照：假手术的未梗阻的年龄匹配的对照动物，WT：膀胱重量(mg)，MP：排尿压力(cm H2O)，THP：阈值压力(cmH2O)，BP：基础压力(cm H2O)，BC：膀胱容量(ml)，MV：排尿体积(ml)，RV：残留体积(ml)，MIP：平均排尿间压力(cm H2O；在整个排尿间间隔期间的平均压力减去同一只动物的基础压力)。
*与假手术显著不同；p<0.05。
**与对照(梗阻但未治疗)显著不同；p<0.05，单向方差分析和Newman Keuls事后成对比较。
表2.治疗对2周梗阻的雄性大鼠和假手术对照的平均排尿参数的影响的总结。
Bcap，膀胱容量(ml)；MV，排尿体积(ml)；RV，残留体积(ml)；BP，基础压力(cmH2O)；TP，阈值压力(cm H2O)；MP，排尿压力(cm H2O)；IMP，平均排尿间压力(cm H2O；在整个排尿间间隔期间的平均压力减去同一只动物的基础压力)；SA，自发活动(cm H2O)；Bcom，膀胱顺应性(ml/cm H2O)；BW，膀胱重量(mg)。
a这些动物中有5只是2周假性对照，其他5只是1个月大(或6周假性对照)。然而，统计分析揭示到，任何排尿参数均无显著差异，并且因此，出于此分析的目的，将这2个种群视为同质。
b给所有治疗的大鼠单独给予1000μg pVAX或给予在1ml含20％蔗糖的PBS中的100μg hSlo/pVAX。所有数据都表示均值±S.E.M.，并且使用单向方差分析进行了分析，并且对所有成对(多重)比较进行了事后Tukey检验。
c与相应假对照值显著不同。
d与相应pVAX值显著不同。
表3.治疗对2周梗阻的雌性大鼠的平均排尿参数的影响的总结
a在200μl PBS-20％蔗糖中的10、30、300、1000μg pVAX/hSlo
b对照：仅接受了1000μg的pVAX的梗阻的年龄匹配的对照动物，WT：膀胱重量(mg)，MP：排尿压力(cm H2O)，
TP：阈值压力(cm H2O)，BP：基础压力(cm H2O)，BC：膀胱容量(ml)，MV：排尿体积(ml)，RV：残留体积(ml)，
MIP：平均排尿间压力(cm H2O；在整个排尿间间隔期间的平均压力减去同一只动物的基础压力)；
SA自发活动(MIP-BP)；BCOM膀胱顺应性(膀胱容量/TP-BP)
*与对照显著不同；p<0.05。所有成对多重比较程序(Holm-Sidak法)
与对照显著不同；P<0.05，单向方差分析。
表4.兔膀胱内注射方案
表5.最终剂量-hMaxi-k
注意：在每个剂量群组中，6名参与者将接受hMaxi-K，并且3名将接受PBS-20％蔗糖(安慰剂)。
表6.依据实验室访视的测试总结
a在给予研究药物之前以及在给药后2小时将进行ECG。
b膀胱测压包括：第一次想要排泄时的体积、逼尿肌压力、腹腔压力、排泄开始时的逼尿肌压力、最大流量时的逼尿肌压力、最大逼尿肌压力、强烈排泄冲动的体积、排泄时的峰值流速、排泄体积、DO时的体积、排泄后残留体积、膀胱总体积(排泄体积+残留体积)、过程期间逼尿肌收缩的次数和DO的持续时间。
c入选标准规定残留体积≤200ml。导尿之前，应在V1和V8时进行膀胱扫描。
d用微量RBC和WBC、蛋白质、葡萄糖、亚硝酸盐、pH和比重在V1、V3-5以及V7和V8时进行尿液分析。在V1A和V2时，将通过Dipstick进行尿液分析。在V1(通过尿动力学导管导尿)、V3(排泄干净)时进行尿液培养；在V1A、V2、V5和V8时，在膀胱测压或膀胱镜检查(通过尿动力学导管导尿)之前和通过排泄干净排放(在V2时使用药物给予后第一次排泄的尿液)之前进行尿液培养。在给药之前将通过Dipstick进行访视2的尿液分析，并且在研究药物给予之前和排放之前均将进行尿液培养。
e将在V1、V2-5、V7和V8时进行的实验室测试包括：血液学-CBC和分类、血小板计数、沉降速率、PTT、PT(在V2和V4时不测试PT和PTT)、CRP、抗核抗体；化学-BUN、肌酸酐、Na+、K+、Mg++、Ca++、CO2、Cl-、白蛋白、碱性磷酸酶、ALT、AST、GGT、总胆红素、总蛋白质、CPK、LDH、葡萄糖；需要对在筛选V1时并且视需要而定未进行子宫切除的育龄妇女进行β-HCG的血清妊娠检查。此外，如果在加入研究之前，最后一次月经周期不>12个月，则FSH>40IU/L。仅在筛选访视1时测试HbA1c。在2(第0周)不进行化学测试。在V4时，化学测试将仅包括BUN、肌酸酐、电解质(Na+、K+)、CRP、葡萄糖和ANA。在访视1A或V6时不进行实验室测试。在所有研究访视时，实验室测试应该在一天的同一时间进行。
f在访视2时，在给予研究药物之前将进行测试或程序。
g在V2时预给药。如果标本在第24周仍呈阳性，则参与者必须每月返回一次，直到连续两次标本对hSlo DNA呈阴性。
h生命体征在V1时将仅包括身高；在V1和V8时包括体重；在所有访视(V1A除外)时包括口腔体温。所有BP测量都应该使用同一条手臂并且指定。
iV1A之前(以测试顺应性和入选标准)、访视2前7天和其后每次访视前7天完成日记。
j在研究的第1天和第3天(在访视2时给予药物后的第1天和第3±1天)将通过电话与参与者联系，以评估不良事件。
k主观评估基于附件C中的以下问题：“您对您的膀胱问题有多烦恼？”和“这种治疗对您有益吗？”
l给予研究药物后，将每15分钟测量BP，持续2小时。
m参与者将携带在访视1A和2之前(如果V1A在筛选V1之后)穿着3天以及所有后续访视(访视3至访视8)之前穿着3天的护垫/尿布；还携带干净的护垫/尿布作为基线使用。
n访视1A可以与V1在同一天发生。在这种情况下，应该完成在V1时尚未完成的所有V1A程序。膀胱镜检查应该在所有其他V1程序之后进行，并且在膀胱镜检查后使用干净的排泄获得尿液培养。如果V1A与V1同时发生，则由于在V1之前将无法完成护垫的收集和日记，因此必须在V2时检查这些的顺应性。
oECG将在给予研究之前进行
表7：平均排泄次数/24小时和随时间的减少-功效人群
/>
/>
/>
[1]：用于测试在某个时间点测量的值与某种治疗的基线测量值之间是否存在统计学上显著的差异的p-值。
[2]：用于测试与安慰剂相比偏离基线的变化之间是否存在统计学上显著的差异的p-值。
所有p-值和估计值都源自使用排泄次数作为因变量、治疗(安慰剂、16000μg、24000μg和总hMaxi-K)、时间点以及时间与治疗的相互作用的线性混合效应模型。所有剂量＝所有hMaxi-K剂量
SD＝标准偏差；SEM＝均值的标准误差
表8：尿急发作平均次数/24小时和随时间的减少-功效人群
2318107-FI-IP-STERNE
/>
/>
[1]：用于测试在某个时间点测量的值与某种治疗的基线测量值之间是否存在统计学上显著的差异的p-值。
[2]：用于测试与安慰剂相比偏离基线的变化之间是否存在统计学上显著的差异的p-值。
所有p-值和估计值都源自使用排泄次数作为因变量、治疗(安慰剂、16000μg、24000μg和总hMaxi-K)、时间点以及时间与治疗的相互作用的线性混合效应模型。
所有剂量＝所有hMaxi-K剂量
SD＝标准偏差；SEM＝均值的标准误差
表9：急迫性尿失禁发作次数和随时间的减少-功效人群
2318107-FI-IP-STERNE
2318107-FI-IP-STERNE
/>
[1]：用于测试在某个时间点测量的值与某种治疗的基线测量值之间是否存在统计学上显著的差异的P-值。
[2]：用于测试与安慰剂相比偏离基线的变化之间是否存在统计学上显著的差异的P-值。
所有P-值和估计值都源自使用排泄次数作为因变量、治疗(安慰剂、16000μg、24000μg和总hMaxi-K)、时间点以及时间与治疗的相互作用的线性混合效应模型。
所有剂量＝所有hMaxi-K剂量
SD＝标准偏差；SEM＝均值的标准误差
表10：参与者对治疗反应的看法-功效人群
注意：p-值是标称值，并且用于卡方检验以查看接受治疗的患者和接受安慰剂的患者对治疗反应的看法是否不同。
所有剂量＝所有hMaxi-K剂量
表11：每24小时急迫性尿失禁发作平均次数的变化-功效人群
/>
/>
/>
[1]：用于测试在某个时间点测量的值与某种治疗的基线测量值之间是否存在统计学上显著的差异的p-值。
[2]：用于测试与安慰剂相比偏离基线的变化之间是否存在统计学上显著的差异的p-值。
[3]：用于测试24000μg组与16000μg组之间是否存在差异的p-值。
所有p-值和估计值都源自使用每24小时急迫性尿失禁发作的次数作为因变量、治疗(安慰剂、16000μg、24000μg和总hMaxi-K)、时间点以及时间与治疗的相互作用的线性混合效应模型。
表12：72小时护垫测试的重量(gm)变化-安全性人群
/>
/>
[1]：用于测试在某个时间点测量的值与某种治疗的基线测量值之间是否存在统计学上显著的差异的P-值。
[2]：用于测试与安慰剂相比偏离基线的变化之间是否存在统计学上显著的差异的P-值。
[3]：结果包括受试者002019的值为0，其结果未正确输入数据库。结果已经通过网站和CRA验证。
所有P-值和估计值都源自使用72小时护垫测试的重量作为因变量、治疗(安慰剂、16000μg、24000μg和总hMaxi-K)、时间点以及时间与治疗的相互作用的线性混合效应模型。
所有剂量＝所有hMaxi-K剂量SD＝标准偏差。
Claims (31)
1.一种治疗或缓解人类受试者的膀胱过度活动综合征或逼尿肌过度活动的病征或症状的方法，该方法包括向至少两个或更多个部位逼尿肌内给予单位剂量的组合物，该组合物包含具有启动子和编码Maxi-K通道肽的核酸的载体。
2.如权利要求1所述的方法，其中该启动子是平滑肌启动子。
3.如权利要求1所述的方法，其中该启动子是巨细胞病毒中早期启动子。
4.如权利要求1所述的方法，其中该单位剂量是单一单位剂量。
5.如权利要求1所述的方法，其中该单位剂量在约5,000-50,000mcg之间。
6.如权利要求1所述的方法，其中该单位剂量是至少10,000mcg。
7.如权利要求1所述的方法，其中该单位剂量是16,000mcg或24,000mcg。
8.如权利要求1所述的方法，其中在5个或更多个部位给予该组合物。
9.如权利要求1所述的方法，其中在10个或更多个部位给予该组合物。
10.如权利要求1所述的方法，其中在15个或更多个部位给予该组合物。
11.如权利要求1所述的方法，其中在20个或更多个部位给予该组合物。
12.如权利要求1所述的方法，其中该病征或症状是排尿频繁或尿急。
13.如权利要求1所述的方法，其中该载体包含按以下顺序的核酸元件：
a.人巨细胞病毒中早期启动子序列；
b.T7引发位点序列；
c.hSlo开放阅读框序列；
d.BGH聚腺苷酸化信号序列；
e.卡那霉素抗性序列；以及
f.pUC复制起点序列。
14.如权利要求13所述的方法，其中该人巨细胞病毒中早期启动子序列是SEQ ID NO:1。
15.如权利要求13所述的方法，其中T7引发位点序列是SEQ ID NO:2。
16.如权利要求13所述的方法，其中该BGH聚腺苷酸化信号序列是SEQ ID NO:3。
17.如权利要求13所述的方法，其中该卡那霉素抗性序列是SEQ ID NO:5。
18.如权利要求13所述的方法，其中该pUC复制起点序列是SEQ ID NO:4。
19.如权利要求13所述的方法，其中该hSlo开放阅读框序列是SEQ ID NO:7。
20.如权利要求19所述的方法，其中该hSlo开放阅读框序列在SEQ ID NO:7的核苷酸位置1054处具有单点突变，并且其中所述点突变在SEQ ID NO:8的位置352处产生丝氨酸。
21.一种载体，该载体包含按以下顺序的核酸元件：
g.包含SEQ ID NO:1的人巨细胞病毒中早期启动子序列；
h.包含SEQ ID NO:2的T7引发位点序列；
i.包含SEQ ID NO:7的hSlo开放阅读框序列；
j.包含SEQ ID NO:3的BGH聚腺苷酸化信号序列；
k.包含SEQ ID NO:5的卡那霉素抗性序列；以及
l.包含SEQ ID NO:4的pUC复制起点序列。
22.如权利要求21所述的载体，其中该hSlo开放阅读框序列在SEQ ID NO:7的核苷酸位置1054处具有单点突变，并且其中所述点突变在SEQ ID NO:8的位置352处产生丝氨酸。
23.如权利要求21或22所述的载体，其中该载体包含质粒、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体或脂质体。
24.如权利要求23所述的载体，其中该质粒是pVAX。
25.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求23所述的多种载体和药学上可接受的稀释剂或载体。
26.如权利要求25所述的药物组合物，其中将该药物组合物配制用于注射进平滑肌。
27.如权利要求25所述的药物组合物，其中将该多种载体与盐水溶液中的20％-25％蔗糖合并。
28.如权利要求25所述的药物组合物，其中该单位剂量是单一单位剂量。
29.如权利要求25所述的药物组合物，其中该单位剂量在约5,000-50,000mcg之间。
30.如权利要求25所述的药物组合物，其中该单位剂量是至少10,000mcg。
31.如权利要求25所述的药物组合物，其中该单位剂量是16,000mcg或24,000mcg。
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