BR112019023726A2 - método de tratamento ou alívio de um sinal ou sintoma de síndrome da bexiga hiperativa ou hiperatividade do detrusor em um sujeito humano, vetor e composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

a presente invenção proporciona métodos de alívio de um ou mais sinais ou sintomas de doenças do músculo liso. as composições da divulgação podem incluir um vetor de plasmídeo contendo um ácido nucleico que codifica um peptídeo de canal maxi-k. as composições da divulgação podem ser administradas por via intradetrusoral a pelo menos dois ou mais locais em uma dose unitária única.

Description

MÉTODO DE TRATAMENTO OU ALÍVIO DE UM SINAL OU SINTOMA DE SÍNDROME DA BEXIGA HIPERATIVA OU HIPERATIVIDADE DO DETRUSOR EM UM SUJEITO HUMANO, VETOR E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o beneficio do pedido provisório USSN 62/505,382, depositado em 12 de maio, 2017, os conteúdos do qual são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

ÁREA DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção se relaciona geralmente com a área de terapias médicas para melhorar um ou mais sintomas relacionados com disfunção do músculo liso. Em particular, disfunção do músculo liso da bexiga.

INCORPORAÇÃO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[003] Os conteúdos do ficheiro de texto chamado IONC-002-001WO_SeqList.txt, que foi criado em 11, maio, 2018 e tem 30 KB em tamanho, são deste modo incorporados por referência nas suas totalidades.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] A função anormal da bexiga é um problema comum que afeta significativamente a qualidade de vida de milhões de homens e mulheres nos Estados Unidos. Muitas doenças comuns (p.ex., BHP, diabetes mellitus, esclerose múltipla e acidente vascular cerebral) alteram a função normal da bexiga. Mudanças indesejadas significativas na função da bexiga são também um resultado normal de idade avançada. Existem duas manifestações clinicas principais de fisiologia alterada da bexiga: a bexiga

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2/99 atônica e a bexiga hiperrefléxica. A bexiga atônica ou subatividade do detrusor tem capacidade diminuída de esvaziar seus conteúdos de urina devido a contratilidade ineficaz do músculo liso detrusor (o músculo liso exterior da parede da bexiga). No estado atônico ou subativo, a contratilidade diminuída do músculo liso está implicada na etiologia da disfunção da bexiga. Assim, não é surpreendente que a modulação farmacológica do tônus muscular liso seja insuficiente para corrigir o problema subjacente. De fato, o método prevalente para tratamento desta condição usa cateterização intermitente limpa; isto é um meio bem-sucedido de prevenir infeção crônica do trato urinário, pielonefrite e eventual insuficiência renal. Como tal, o tratamento da bexiga atônica melhora os sintomas de doença, mas não corrige a causa subjacente.

[005] Reciprocamente, a bexiga hiperrefléxica, desabitada ou que exibe hiperatividade do detrusor se contrai espontaneamente durante o enchimento da bexiga; isto pode resultar em frequência urinária, urgência urinária e incontinência de urgência, onde o indivíduo é incapaz de controlar a passagem de urina. A bexiga hiperrefléxica é um problema mais difícil de tratar. As medicações que têm sido usadas para tratar esta condição são usualmente somente parcialmente eficazes e têm efeitos secundários graves que limitam o uso e entusiamos do paciente. As opções de tratamento correntemente aceites (p.ex., oxibutinina e tolteradina) são largamente inespecíficas e, o mais frequentemente, envolvem bloqueio das vias de receptores muscarínicos e/ou dos canais de cálcio nos miócitos da bexiga. Dada a importância central destas

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3/99 duas vias no funcionamento celular de muitos sistemas de órgãos no corpo, tais estratégias terapêuticas são não só métodos grosseiros para modulação do tônus muscular liso da bexiga; ao invés, devido ao(s) seu(s) próprio(s) mecanismo(s) de ação, têm também virtualmente garantia de terem efeitos sistêmicos significativos e indesejáveis. Conformemente, existe uma grande necessidade de opções de tratamento melhoradas para disfunção da bexiga.

[006] Apesar de múltiplas tentativas de se desenvolver uma cura ou tratamento para doenças causadas por tônus muscular liso alterado, as terapias correntes são inadequadas porque proporcionam eficácia limitada e/ou efeitos secundários significativos. Assim existe uma necessidade há muito sentida na técnica de uma intervenção farmacêutica e/ou médica para atender à causa subjacente de tônus muscular liso alterado por aumento da eficácia com efeitos secundários minimos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] A invenção proporciona métodos de tratamento ou alivio de um sinal ou sintoma de síndrome da bexiga hiperativa ou hiperatividade do detrusor em um sujeito humano por administração intradetrusoral a pelo menos dois ou mais locais de uma dose unitária de uma composição compreendendo um vetor tendo um promotor e um ácido nucleico codificando um peptideo de canal Maxi-K. O promotor é, por exemplo, um promotor do músculo liso ou um promotor intermédio-inicial do citomegalovirus. A dose unitária é uma dose unitária única. Alternativamente, duas ou mais doses unitárias são administradas em momentos diferentes.

[008] A dose unitária é entre cerca de 5.000-50.000

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4/99 mcg. Por exemplo, a dose unitária é, pelo menos, 10.000 mcg. Preferencialmente, a dose unitária é 16.000 mcg ou 24.000 mcg.

[009] A composição é administrada em 5, 10, 15, 20 ou mais locais.

[010] 0 sinal ou sintoma é, por exemplo, frequência de micção ou urgência.

[011] Em alguns aspectos, o vetor contém elementos de ácidos nucleicos na seguinte ordem: uma sequência de promotor intermédio-inicial do citomegalovirus humano, tal como SEQ ID NO:1; uma sequência de local de iniciação T7, tal como SEQ ID NO: 2; uma sequência de grelha de leitura aberta hSlo, tal como SEQ ID NO: 7; uma sequência de sinal de poliadenilação BGH, tal como SEQ ID NO: 3; uma sequência de resistência à canamicina, tal como SEQ ID NO: 5 e uma sequência de origem de replicação pUC, tal como SEQ ID NO: 4. Em certos aspectos, a sequência de grelha de leitura aberta hSlo compreende uma mutação pontual na posição 1054 de SEQ ID NO: 7 resultando em serina na posição 352 de SEQ ID NO: 8.

[012] A invenção proporciona um vetor, compreendendo o vetor elementos de ácidos nucleicos na seguinte ordem: uma sequência de promotor intermédio-inicial do citomegalovirus humano tal como SEQ ID NO: 1; uma sequência de local de iniciação T7 tal como SEQ ID NO: 2; uma sequência de grelha de leitura aberta hSlo tal como SEQ ID NO: 7; uma sequência de sinal de poliadenilação BGH, tal como SEQ ID NO: 3; uma sequência de resistência à canamicina tal como SEQ ID NO: 5; e uma sequência de origem de replicação pUC tal como SEQ ID NO: 4. Em alguns aspectos do vetor, a sequência de grelha de leitura

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5/99 aberta hSlo tem uma mutação pontual única na posição de nucleotídeo 1054 de SEQ ID NO: 7 e a referida mutação pontual resulta em serina na posição 352 de SEQ ID NO: 8. Em alguns aspetos, o vetor compreende um plasmídeo, um vetor adenoviral, um vetor de vírus adenoassociado (AAV), um vetor retroviral ou um lipossomo. Em alguns aspectos, o plasmídeo é pVAX.

[013] A invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma pluralidade do vetor da divulgação e um diluente ou transportador farmaceuticamente aceitável. Em alguns aspectos, a composição farmacêutica é formulada para injeção em músculo liso. Em alguns aspectos, a pluralidade do vetor é combinada com sacarose a 20-25% em solução salina.

[014] Em alguns aspectos da composição farmacêutica da divulgação, a dose unitária é uma dose unitária única. Em alguns aspectos, a dose unitária é entre cerca de 5.000-50.000 mcg. Em alguns aspectos, a dose unitária é pelo menos 10.000 mcg. Em alguns aspectos, a dose unitária é 16.000 mcg ou 24.000 mcg.

[015] A não ser que de outro modo definidos, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por um perito na técnica à qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos em baixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionados aqui são expressamente incorporados por referência na sua totalidade. Em casos de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições,

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6/99 imperará. Adicionalmente, os materiais, métodos e exemplos descritos aqui são somente ilustrativos e não se destinam a ser limitantes.

[016] Outras características e vantagens da invenção serão aparentes a partir da e englobadas pela seguinte descrição detalhada e reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[017] As FIG. 1 A-D são uma série de quatro gráficos de barras que mostram parâmetros de micção após 2 semanas de obstrução nos dois grupos de tratamento.

[018] As FIG. 2 A-C são uma série de três gráficos que mostram registros cistométricos após 2 semanas de obstrução em um grupo de controle (Fig. 2A) , um grupo somente com vetor (pVAX) (Fig. 2B) e um grupo tratado com hSlo (Fig. 2C).

[019] A FIG. 3 mostra três gráficos de registros cistométricos em um rato dado somente vetor (pVAX) e 300 e 1000 pg de pVAX/hSLO.

[020] A FIG. 4 é um gráfico de barras que mostra número médio de cópias de vetor pVAX/hSLO em tecidos de ratos fêmeas após duas injeções de 1000 pg.

[021] A FIG. 5 é um diagrama que mostra locais de injeção do vetor pVAX/hSLO em sujeitos humanos.

[022] A FIG. 6 é um gráfico de barras mostrando a mudança no número médio de vazios por dia ao longo do tempo por tratamento em sujeitos humanos. As barras de erro representam erro padrão das médias (SEM).

[023] A FIG. 7 é um gráfico de barras mostrando a mudança nos episódios de urgência médios ao longo do tempo por

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1/99 tratamento em sujeitos humanos. As barras de erro representam erro padrão das médias (SEM).

[024] A FIG. 8 é um mapa de plasmideo de pVAX/hSLO.

[025] DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[026] A presente invenção proporciona métodos de terapia gênica para tratamento de disfunções fisiológicas da bexiga. Especificamente, a invenção é baseada na descoberta de que a injeção direta de um vetor que contém o gene que expressa o canal Maxi-K humano (hMaxi-K) no músculo liso da parede da bexiga aliviou significativamente os sintomas de bexiga hiperativa e incontinência urinária em mulheres. Especificamente, os participantes receberam uma dose total de 16.000 mcg ou 24.000 mcg de hMaxi-K administrada como 20-30 injeções intramusculares na bexiga. Os participantes foram vistos 8 vezes no espaço de um periodo de 24 semanas e um acompanhamento até 18 meses. Os dados diários médios coletados 7 dias antes de cada visita revelaram redução estatisticamente significativa de vazios por dia bem como no número médio de episódios de urgência para aqueles participantes recebendo hMaxi-K em comparação com placebo.

[027] O canal MaxiK (também conhecido como um canal BK) proporciona uma via de efluxo para ions de potássio a partir da célula, permitindo relaxação de músculo liso por inibição do canal de Ca²⁺ sensivel à voltagem e, deste modo, efetuando normalização da função do órgão por redução do tônus muscular liso aumentado patológico. Os termos canal MaxiK e canal BK são usados indistintamente aqui.

[028] Estruturalmente, os canais MaxiK são

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8/99 compostos por subunidades alfa e beta. Quatro subunidades alfa formam o poro do canal, e estas subunidades alfa são codificadas por um gene Slol único (também chamado Slo, hSlo e subfamllia M alfa 1 de canal ativado por potássio e cálcio ou KCNMA1) . Existem quatro subunidades beta que podem modular a função de canais MaxiK. Cada subunidade beta tem expressão e funções moduladoras especificas de tecidos distintas, com a subunidade beta-1 {subfamília M subunidade beta reguladora 1 de canal ativado por potássio e cálcio ou KCNMB1) expressa maioritariamente em células musculares lisas.

[029] Agrupamentos estratégicos de canais MaxiK próximos dos armazenamentos de cálcio sensíveis à rianodina do retículo sarcoplasmático subjacente proporcionam um mecanismo importante para a modulação local de sinais de cálcio (i.e., faíscas) e potencial de membrana em diversos músculos lisos, incluindo bexiga urinária. O aumento no nível de cálcio intracelular aumenta a probabilidade aberta do canal MaxiK, aumentando assim o movimento para fora de K⁺ através do canal MaxiK sensível ao cálcio. O efluxo de K⁺ causa um movimento liquido de carga positiva para fora da célula, tornando o interior da célula mais negativamente carregado no que diz respeito ao exterior. Isto tem dois efeitos principais. Em primeiro lugar, o potencial de membrana aumentado assegura que o canal de cálcio passa mais tempo fechado do que aberto. Em segundo lugar, como é mais provável que o canal de cálcio esteja fechado, existe um fluxo líquido diminuído de Ca²⁺ para a célula e uma redução correspondente nos níveis de cálcio intracelular livre. O cálcio intracelular reduzido promove relaxação do músculo liso.

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A principal implicação de se terem mais canais MaxiK na membrana da célula, portanto, é que deve levar a relaxação de células do músculo liso intensificada a qualquer dado estimulo para relaxação.

[030] A comunicação intercelular aumentada entre miócitos do detrusor ocorre tanto em modelos animais de obstrução uretral parcial (PUO) como em humanos com hiperatividade do detrusor (DO) . No que diz respeito à comunicação intercelular aumentada, o impacto de sinalização de cálcio aumentada pode ser aumentado quando comparado com uma bexiga normal com niveis potencialmente mais baixos de acoplamento intercelular. Esta sinalização de cálcio aumentada contribui, pelo menos em parte, para as contrações sem micção observadas no modelo de rato de PUO. No entanto, se existisse um aumento paralelo na expressão de canais MaxiK (por exemplo, como resultado de sobre-expressão de um transgene codificando canal MaxiK de uma composição ou método da divulgação), então presumivelmente os canais MaxiK recombinantes e/ou transgênicos resultantes expressos por estas células transfectadas podem atenuar sinais de cálcio anormalmente aumentados. Isto previne disseminação adicional através de junções de lacunas e, assim, previne aumento suficiente de sinalização de cálcio anormal e aumentado (por, por exemplo, recrutamento de miócitos não transfectados) para mitigar respostas contráteis anormais. A redução de respostas contráteis anormais em células individuais ou grupos de células, por sobre-expressão de um transgene codificando canal MaxiK de uma composição ou método da divulgação, elimina ou melhora as contrações sem micção características de DO, o correlato clínico

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10/99 de urgência. Reciprocamente, como o envolvimento de reflexos espinhais na resposta de micção produz contrações coordenadas do detrusor muito além da sinalização de cálcio anormalmente aumentada associada à DO, a sobre-expressão do transgene de MaxiK pode efetivamente reduzir ou inibir o sinal de cálcio anormalmente aumentado mais fraco que contribui para a DO (como medido em um modelo animal como uma diminuição na IMP (pressão intermicções) ou SA (atividade espontânea em comparação com níveis de controle), sem afetar significativamente ou detectavelmente a resposta de contrações de micção mais robusta.

[031] O envelhecimento e a doença podem resultar em mudanças na expressão do produto final do gene hSlo, o gene que expressa a subunidade α do canal de potássio sensível à voltagem, ativado por Ca²⁺ de grande condutância (BKa). Essas mudanças resultam em modificação fisiológica específica de órgãos reduzida do tônus do músculo liso que compreende o órgão. O efeito é tônus aumentado das células musculares lisas nos órgãos que causam doenças humanas tais como disfunção erétil (ED) no pênis, urgência urinária, frequência, noctúria e incontinência na bexiga (p.ex., síndrome da bexiga hiperativa (OAB)), asma nos pulmões, intestino irritável no cólon, glaucoma nos olhos e obstrução da saída da bexiga na próstata.

Métodos da Invenção

[032] A presente invenção proporciona um método de terapia gênica para tratamento de disfunções fisiológicas do músculo liso. Especificamente, os métodos da invenção são usados para tratar ou aliviar um sintoma da síndrome da bexiga hiperativa (OAB) ou hiperatividade do detrusor.

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[033] A síndrome OAB é caracterizada por um grupo de sintomas que incluem, mas não estão limitados a, urgência urinária, frequência, noctúria e incontinência. A OAB é subdividida em OAB idiopática e OAB neurogênica.

[034] A hiperatividade do detrusor é definida como uma observação urodinâmica caracterizada por contrações involuntárias do detrusor durante a fase de enchimento que podem ser espontâneas ou provocadas. A hiperatividade do detrusor é subdividida em hiperatividade idiopática do detrusor e hiperatividade neurogênica do detrusor.

[035] As composições e métodos da divulgação proporcionam a administração de um ácido nucleico codificando hMaxi-K a células em um sujeito humano ou paciente com sua necessidade. Em alguns casos, a administração do ácido nucleico pode ser referida como terapia gênica.

[036] A composição e métodos da divulgação proporcionam qualquer método adequado para administração do ácido nucleico de hMaxi-K ou seu mutante. Em alguns casos, a administração do ácido nucleico pode ser realizada usando qualquer vetor adequado (por vezes também referido como veículo de administração gênica ou transferência gênica). Vetor, veículo de administração, veículo de administração gênica ou veículo de transferência gênica pode se referir a qualquer macromolécula ou complexo de macromoléculas adequado compreendendo um polinucleotídeo a ser administrado a uma célula alvo. Em alguns casos, uma célula alvo pode ser qualquer célula à qual o ácido nucleico ou gene é administrado. O polinucleotídeo a ser administrado pode compreender uma sequência codificante de

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12/99 interesse em terapia gênica, tal como o gene hSlo.

[037] O gene hSlo é introduzido em uma célula muscular lisa da bexiga por injeção direta no músculo detrusor.

[038] Por exemplo, vetores adequados podem incluir, mas não limitados a, vetores virais tais como adenovírus, vírus adenoassociados (AAV) e retrovírus, lipossomos, outros complexos contendo lipídeos e outros complexos macromoleculares capazes de mediarem a administração de um polinucleotídeo a uma célula alvo.

[039] Alternativamente, o gene hSlo é transferido nas células musculares lisas por transferência de DNA nu, usando um vetor de mamífero. DNA nu é aqui definido como DNA contido em um vetor não viral. A sequência de DNA pode ser combinada com uma solução aquosa estéril, que é preferencialmente isotônica com o sangue do receptor. Uma tal solução pode ser preparada por suspensão do DNA em água contendo substâncias fisiologicamente compatíveis (tais como cloreto de sódio, glicina e similares), mantendo um pH tamponada compatível com condições fisiológicas, e tornando a solução estéril. Em uma modalidade preferencial da invenção, o DNA é combinado com sacarose a 20-25% em solução salina (p.ex., solução salina tamponada com fosfato) em preparação para introdução em uma célula muscular lisa.

[040] Como descrito aqui, os ácidos nucléicos podem se referir a polinucleotídeos. Acido nucleico e polinucleotídeo podem ser usados indistintamente. Em alguns casos, os ácidos nucléicos podem compreender DNA ou RNA. Em alguns aspectos, os ácidos nucléicos podem incluir DNA ou RNA para a expressão de Maxi-K. Em alguns aspectos, os ácidos nucléicos de RNA podem

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13/99 incluir, mas não estão limitados a um gene de interesse (p.ex., Slo), introns, regiões não traduzidas, sequências de terminação e similares. Em outros casos, os ácidos nucleicos de DNA podem incluir, mas não estão limitados a sequências tais como sequências de gene promotor híbrido, sequências de promotor constitutivo forte, o gene de interesse (p.ex., Slo), regiões não traduzidas, sequências de terminação e similares. Em alguns casos, uma combinação de DNA e RNA pode ser usada.

[041] Como descrito na divulgação aqui, o termo construto de expressão se entende como incluindo qualquer tipo de construto genético contendo um ácido nucleico ou polinucleotídeo codificando produtos gênicos nos quais parte da ou toda a sequência codificante de ácidos nucleicos é capaz de ser transcrita. O transcrito pode ser traduzido em uma proteína. Em alguns aspectos pode ser parcialmente traduzido ou não traduzido. Em certos aspectos, a expressão inclui tanto transcrição de um gene como tradução de mRNA em um produto gênico. Em outros aspectos, a expressão inclui somente transcrição do gene codificando ácidos nucleicos de interesse.

[042] O ácido nucleico pode ser medido como a quantidade de ácido nucleico. Geralmente, qualquer quantidade adequada de ácido nucleico pode ser usada com as composições e métodos desta divulgação. Em alguns casos, o ácido nucleico pode ser pelo menos cerca de 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, 1 mg, 10 mg, 100 mg,

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200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg 1 g, 2 g, 3 g, 4 g ou 5 g. Em alguns casos, o ácido nucleico pode ser no máximo cerca de 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, 1 mg, 10 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, 1 g, 2 g, 3 g, 4 g ou 5 g.

[043] Em alguns casos, o ácido nucleico pode ser pelo menos cerca de 5000 mcg, 7500 mcg, 10.000 mcg, 12.500 mcg, 15.000 mcg, 16.000 mcg, 17.500 mcg, 20.000 mcg, 22.500 mcg, 24.000 mcg, 25.000 mcg, 30.000 mcg, 35.000 mcg, 40.000 mcg, 45.000 mcg ou 50.000 mcg.

[044] Como usados aqui, mcg e pg são usados indistintamente.

[045] A presente invenção proporciona especificamente um método de terapia gênica em que a proteína de canal MaxiK envolvida na regulação de tônus muscular liso modula a relaxação de músculo liso. Estas proteínas promoverão ou intensificarão a relaxação de músculo liso e diminuirão assim o tônus muscular liso. Em particular, onde o tônus muscular liso é diminuído na bexiga, a capacidade da bexiga será aumentada.

[046] Além disso, a presente invenção proporciona especificamente um método de regulação do tônus muscular liso da bexiga em um sujeito, compreendendo a introdução, em células musculares lisas da bexiga do sujeito, de uma sequência de DNA codificando uma proteína envolvida na regulação do tônus muscular

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15/99 liso e expressão em um número suficiente de células musculares lisas da bexiga do sujeito para intensificar a relaxação da bexiga no sujeito. Em esta modalidade, o método da presente invenção é usado para aliviar uma bexiga hiperrefléxica. Uma bexiga hiperrefléxica pode resultar de uma variedade de disfunções, incluindo disfunções neurogênicas e arteriogênicas, bem como outras condições que causam relaxação incompleta ou contratilidade aumentada do músculo liso da bexiga. 0 sujeito pode ser animal ou humano e é preferencialmente humano.

[047] Os vetores e plasmideos recombinantes da presente invenção podem também conter uma sequência de nucleotídeos codificando elementos reguladores adequados, de modo a efetuar expressão do construto de vetor em uma célula hospedeira adequada. Como usada aqui, expressão se refere à capacidade do vetor de transcrever a sequência de DNA inserida em mRNA tal que a síntese da proteína codificada pelo ácido nucleico inserido possa ocorrer. Os peritos na técnica apreciarão o seguinte: (1) que uma variedade de intensificadores e promotores é adequada para uso nos construtos da invenção; e (2) que os construtos conterão as sequências necessárias de inicio, terminação e controle para transcrição e processamento apropriados da sequência de DNA codificando uma proteína envolvida na regulação do tônus muscular liso, após introdução do construto de vetor recombinante em uma célula hospedeira.

[048] Os vetores não virais proporcionados pela presente invenção, para a expressão em uma célula muscular lisa da sequência de DNA codificando uma proteína envolvida na regulação do tônus muscular liso, podem compreender todo o ou

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16/99 uma parte de qualquer um dos seguintes vetores conhecidos de um perito na técnica: pVax (Thermo Fisher Scientific), pCMVp (Invitrogen), pcDNA3 (Invitrogen), pET-3d (Novagen), pProEx-1 (Life Technologies), pFastBac 1 (Life Technologies), pSFV (Life Technologies), pcDNA2 (Invitrogen), pSL301 (Invitrogen), pSE280 (Invitrogen), pSE380 (Invitrogen), pSE420 (Invitrogen), plrcHis A,B,C (Invitrogen), pRSET A,B,C (Invitrogen), pYES2 (Invitrogen), pAC360 (Invitrogen), pVL1392 e pV11392 (Invitrogen), pCDM8 (Invitrogen), pcDNA I (Invitrogen), pcDNA I(amp) (Invitrogen), pZeoSV (Invitrogen), pRc/CMV (Invitrogen), pRc/RSV (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pREPT (Invitrogen), pREP8 (Invitrogen), pREP9 (Invitrogen), pREPlO (Invitrogen), pCEP4 (Invitrogen), pEBVHis (Invitrogen) e ÀPop6. Outros vetores seriam aparentes a um perito na técnica. Preferencialmente, o vetor é pVax.

[049] Em algumas modalidades, a sequência do vetor pVax compreende uma sequência de:

GACTCTTCGC GATGTACGGG CCAGATATAC GCGTTGACAT TGATTATTGA CTAGTTATTA

ATAGTAATCA ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT ATGGAGTTCC GCGTTACATA

121 ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTGGCTGACC GCCCAACGAC CCCCGCCCAT TGACGTCAAT

181 AATGACGTAT GTTCCCATAG TAACGCCAAT AGGGACTTTC CATTGACGTC AATGGGTGGA

241 CTATTTACGG TAAACTGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC

301 CCCTATTGAC GTCAATGACG GTAAATGGCC CGCCTGGCAT

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TATGCCCAGT ACATGACCTT

361 ATGGGACTTT CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC ATCGCTATTA CCATGGTGAT

421 GCGGTTTTGG CAGTACATCA ATGGGCGTGG ATAGCGGTTT GACTCACGGG GATTTCCAAG

481 TCTCCACCCC ATTGACGTCA ATGGGAGTTT GTTTTGGCAC CAAAATCAAC GGGACTTTCC

541 AAAATGTCGT AACAACTCCG CCCCATTGAC GCAAATGGGC GGTAGGCGTG TACGGTGGGA

601 GGTCTATATA AGCAGAGCTC TCTGGCTAAC TAGAGAACCC ACTGCTTACT GGCTTATCGA

661 AATTAATACG ACTCACTATA GGGAGACCCA AGCTGGCTAG CGTTTAAACT TAAGCTTGGT

721 ACCGAGCTCG GATCCACTAG TCCAGTGTGG TGGAATTCTG CAGATATCCA GCACAGTGGC

781 GGCCGCTCGA GTCTAGAGGG CCCGTTTAAA CCCGCTGATC AGCCTCGACT GTGCCTTCTA

841 GTTGCCAGCC ATCTGTTGTT TGCCCCTCCC CCGTGCCTTC CTTGACCCTG GAAGGTGCCA

901 CTCCCACTGT CCTTTCCTAA TAAAATGAGG AAATTGCATC GCATTGTCTG AGTAGGTGTC

961 ATTCTATTCT GGGGGGTGGG GTGGGGCAGG ACAGCAAGGG GGAGGATTGG GAAGACAATA

1021 GCAGGCATGC TGGGGATGCG GTGGGCTCTA TGGCTTCTAC TGGGCGGTTT TATGGACAGC

1081 AAGCGAACCG GAATTGCCAG CTGGGGCGCC CTCTGGTAAG GTTGGGAAGC CCTGCAAAGT

1141 AAACTGGATG GCTTTCTCGC CGCCAAGGAT CTGATGGCGC

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18/99

AGGGGATCAA GCTCTGATCA

1201 AGAGACAGGA TGAGGATCGT TTCGCATGAT TGAACAAGAT GGATTGCACG CAGGTTCTCC

1261 GGCCGCTTGG GTGGAGAGGC TATTCGGCTA TGACTGGGCA CAACAGACAA TCGGCTGCTC

1321 TGATGCCGCC GTGTTCCGGC TGTCAGCGCA GGGGCGCCCG GTTCTTTTTG TCAAGACCGA

1381 CCTGTCCGGT GCCCTGAATG AACTGCAAGA CGAGGCAGCG CGGCTATCGT GGCTGGCCAC

1441 GACGGGCGTT CCTTGCGCAG CTGTGCTCGA CGTTGTCACT GAAGCGGGAA GGGACTGGCT

1501 GCTATTGGGC GAAGTGCCGG GGCAGGATCT CCTGTCATCT CACCTTGCTC CTGCCGAGAA

1561 AGTATCCATC ATGGCTGATG CAATGCGGCG GCTGCATACG CTTGATCCGG CTACCTGCCC

1621 ATTCGACCAC CAAGCGAAAC ATCGCATCGA GCGAGCACGT ACTCGGATGG AAGCCGGTCT

1681 TGTCGATCAG GATGATCTGG ACGAAGAGCA TCAGGGGCTC GCGCCAGCCG AACTGTTCGC

1741 CAGGCTCAAG GCGAGCATGC CCGACGGCGA GGATCTCGTC GTGACCCATG GCGATGCCTG

1801 CTTGCCGAAT ATCATGGTGG AAAATGGCCG CTTTTCTGGA TTCATCGACT GTGGCCGGCT

1861 GGGTGTGGCG GACCGCTATC AGGACATAGC GTTGGCTACC CGTGATATTG CTGAAGAGCT

1921 TGGCGGCGAA TGGGCTGACC GCTTCCTCGT GCTTTACGGT ATCGCCGCTC CCGATTCGCA

1981 GCGCATCGCC TTCTATCGCC TTCTTGACGA GTTCTTCTGA

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ATTATTAACG

CTTACAATTT

2041 CCTGATGCGG

TATTTTCTCC

TTACGCATCT

GTGCGGTATT

TCACACCGCA

TACAGGTGGC

2101 ACTTTTCGGG

GAAATGTGCG

CGGAACCCCT

ATTTGTTTAT

TTTTCTAAAT

ACATTCAAAT

2161 ATGTATCCGC

TCATGAGACA

ATAACCCTGA

TAAATGCTTC

AATAATAGCA

CGTGCTAAAA

2221 CTTCATTTTT

AATTTAAAAG

GATCTAGGTG

AAGATCCTTT

TTGATAATCT

CATGACCAAA

2281 ATCCCTTAAC

GTGAGTTTTC

GTTCCACTGA

GCGTCAGACC

CCGTAGAAAA

GATCAAAGGA

2341 TCTTCTTGAG

ATCCTTTTTT

TCTGCGCGTA

ATCTGCTGCT

TGCAAACAAA

AAAACCACCG

2401 CTACCAGCGG

TGGTTTGTTT

GCCGGATCAA

GAGCTACCAA

CTCTTTTTCC

GAAGGTAACT

2461 GGCTTCAGCA

GAGCGCAGAT

ACCAAATACT

GTCCTTCTAG

TGTAGCCGTA

GTTAGGCCAC

2521 CACTTCAAGA

ACTCTGTAGC

ACCGCCTACA

TACCTCGCTC

TGCTAATCCT

GTTACCAGTG

2581 GCTGCTGCCA

GTGGCGATAA

GTCGTGTCTT

ACCGGGTTGG

ACTCAAGACG

ATAGTTACCG

2641 GATAAGGCGC

AGCGGTCGGG

CTGAACGGGG

GGTTCGTGCA

CACAGCCCAG

CTTGGAGCGA

2701 ACGACCTACA

CCGAACTGAG

ATACCTACAG

CGTGAGCTAT

GAGAAAGCGC

CACGCTTCCC

2761 GAAGGGAGAA

AGGCGGACAG

GTATCCGGTA

AGCGGCAGGG

TCGGAACAGG

AGAGCGCACG

2821 AGGGAGCTTC

CAGGGGGAAA

CGCCTGGTAT

CTTTATAGTC

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20/99

CTGTCGGGTT

GGAGCCTATG

CTTTTGCTCA

TCGCCACCTC

2881 TGACTTGAGC GTCGATTTTT GTGATGCTCG TCAGGGGGGC GAAAAACGCC

2941 AGCAACGCGG CCTTTTTACG GTTCCTGGGC TTTTGCTGGC CATGTTCTT (SEQ ID NO: 10).

[050] Em algumas modalidades, a sequência de pVAX compreende uma sequência com pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, a sequência de pVAX compreende uma substituição de G por A na posição 2 de SEQ ID NO: 10, uma G adicional na posição 5 de SEQ ID NO: 10, uma substituição de T por C na posição 1158 de SEQ ID NO: 10, uma A em falta na posição 2092 de SEQ ID NO: 10, uma substituição de T por C na posição 2493 de SEQ ID NO: 10 ou uma sua combinação.

[051] Promotores adequados para a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, promotores constitutivos, promotores específicos de tecidos e promotores indutíveis. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor de músculo liso. Em outras modalidades, o promotor é um promotor de células musculares. Preferencialmente, o promotor não é um promotor de expressão específico do urotélio.

[052] Em uma modalidade da invenção, a expressão da sequência de DNA codificando uma proteína envolvida na regulação do tônus muscular liso é controlada e afetada pelo vetor particular no qual a sequência de DNA foi introduzida. Alguns vetores eucarióticos foram manipulados tal que sejam capazes de expressar ácidos nucleicos inseridos até elevados níveis dentro da célula hospedeira. Tais vetores utilizam um de

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21/99 um número de promotores poderosos para dirigir o elevado nível de expressão. Os vetores eucarióticos usam sequências de promotor-intensificador de genes virais, especialmente aquelas de vírus tumorais. Esta modalidade particular da invenção proporciona regulação da expressão da sequência de DNA codificando a proteína, através do uso de promotores indutíveis. Exemplos não limitantes de promotores indutíveis incluem promotores de metalotionina e promotores de vírus tumoral mamário de camundongo. Dependendo do vetor, a expressão da sequência de DNA na célula muscular lisa seria induzida pela adição de um composto específico em um certo ponto no ciclo de crescimento da célula. Outros exemplos de promotores e intensificadores eficazes para uso nos vetores recombinantes da presente invenção incluem, mas não estão limitados a promotores e intensificadores de CMV (citomegalovirus), SV40 (vírus símio 40), HSV (vírus do herpes simples), EBV (vírus de Epstein-Barr), retrovírus, adenovirais, e promotores e intensificadores específicos do músculo liso. Um exemplo de um promotor específico do músculo liso é SM22a. Promotores de músculo liso exemplificativos são descritos na Patente dos EUA No. 7,169, 764, os conteúdos da qual são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

[053] Em modalidades preferenciais, o promotor é uma sequência de promotor de SM22a e pode incluir mas não está limitado a sequências tais como:

gaattcagga cgtaatcagt ggctggaaag caagagctct agaggagctc tgacccttcc ttcagatgcc acaaggaggt gctggagttc tatgcaccaa cagccaggct ggctgtagtg gattgagcgt ctgaggctgc acctctctgg gttctgggtg agactgaccc tgcctgaggg ttctctcctt ccctctctct

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22/99 ccctctccct ctccctctct ctgtttcctg aggtttccag gattggggat gacaccacta aagccttacc ttttaagaag ttgcattcag tgagtgtgtg cagatagggg cagaggagag ctggttctgt ctccactgtg tttggtcttg tcagaccatc aggtgtgata gcagttgtct ttaaccctaa ccctgagcct tcccttccca agaccactga agctaggtgc aagataagtg gggacccttt aggatctttc acgataagga ctattttgaa gggagggagg gtgacactgt ttaccctagt gtctccagcc ttgccaggcc ttaaacatcc gcccattgtc aaggggccag ggttgacttg ctgctaaaca aggcactccc tagagaagca gcataccata cctgtgggca ggatgaccca tgttctgcca cgcacttggt aggccacttt gaacctcaat tttctcaact gttaaatggg gtggtaactg ataaagggga acgtgaaagg aaggcgtttg catagtgcct ggttgtgcag gtcaagacta gttcccacca actcgatttt aaagccttgc aagaaggtgg ccttgcaggt tcctttgtcg ggccaaactc tagaatgcct ccccctttct agagcagacc caagtccggg taacaaggaa gggtttcagg gtcctgccca ttcccggccg ccctcagcac cgccccgccc cgacccccgc agcatctcca cagcttatta tagcttaaac cctgcagcca actcctttct gggactcaga agacatagca ggtactgaac gtctcacctg ctgaggtggt cctagtcctc acccgctcta gcccgctaga agccttggaa ctatctcata ccaggctgca cttgtttgtc ttctcattga taaaaggttt aagcatgcag agaatgtctc cggctgcccc cgacagactg ctccaacttg gtgtctttcc ccaaatatgg agcctgtgtg gagtgagtgg ggcggcccgg ggtggtgagc caagcagact tccatgggca gggaggggcg ccagcggacg gcagaggggt gacatcactg cctaggcggc ctttaaaccc ctcacccagc cggcgcccca gcccgtctgc cccagcccag acaccgaagc tactctcctt ccagtccaca aacgaccaag ccttgtaagt gcaagtcat (SEQ ID NO: 9).

[054] Em modalidades preferenciais, o promotor é uma sequência de promotor intermédio-inicial do citomegalovirus humano e pode incluir mas não está limitado a sequências tais

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23/99 como:

CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCC G000AT T GAC G T CAATAAT GAC GTATGTTCCCATAG TAAC G C CAATAG G GAC T T T C CAT T GAC GTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGC CAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACA TGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGG TGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAA GTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAA AATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCT ATATAAGCAGAGCT (SEQ ID NO: 1).

[055] Em alguns aspectos, um local de iniciação T7 pode ser incluído tal como, mas não limitado a, sequências tais como TAATACGACTCACTATAGGG SEQ ID NO: 2.

[056] Em alguns aspectos, o vírus e/ou plasmídeo recombinante usado para expressar uma sequência de DNA ou proteína da divulgação compreende uma sequência de poliA (poliadenilação), tal como aqueles proporcionadas aqui (p.ex., sequência de poliA BGH.). Geralmente, qualquer sequência de poliA adequada pode ser usada para a expressão desejada do transgene. Por exemplo, em alguns casos, a presente divulgação proporciona uma sequência compreendendo sequência de poliA BGH ou porção de uma sequência de poliA BGH. Em alguns casos, a presente divulgação proporciona sequências de poliA compreendendo uma combinação de uma ou mais sequências ou elementos de sequências de poliA. Em alguns casos, nenhuma sequência de poliA é usada. Em alguns casos, uma ou mais sequências de poliA podem ser referidas como regiões não traduzidas (UTRs), 3' UTRs ou sequências de terminação.

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[057] Uma sequência de poliA pode compreender um comprimento de 1-10 pb, 10-20 pb, 20-50 pb, 50-100 pb, 100-500 pb, 500 pb-1 Kb, 1 Kb-2 Kb, 2 Kb-3 Kb, 3 Kb-4 Kb, 4 Kb-5 Kb, 5 Kb-6 Kb, 6 Kb-7 Kb, 7 Kb-8 Kb, 8 Kb-9 Kb e 9 Kb-10 Kb em comprimento. Uma sequência de poliA pode compreender um comprimento de pelo menos 1 pb, 2 pb, 3 pb, 4 pb, 5 pb, 6 pb, 7 pb, 8 pb, 9 pb, 10 pb, 20 pb, 30 pb, 40 pb, 50 pb, 60 pb, 70 pb, 80 pb, 90 pb, 100 pb, 200 pb, 300 pb, 400 pb, 500 pb, 600 pb, 7 0 0 pb, 8 0 0 pb, 9 0 0 pb, 1 Kb, 2 Kb, 3 Kb, 4 Kb, 5 Kb, 6 Kb, 7 Kb, 8 Kb, 9 Kb e 10 Kb em comprimento. Uma sequência de poliA pode compreender um comprimento de no máximo 1 pb, 2 pb, 3 pb, 4 pb, 5 pb, 6 pb, 7 pb, 8 pb, 9 pb, 10 pb, 20 pb, 30 pb, 40 pb, 50 pb, 6 0 pb, 7 0 pb, 8 0 pb, 9 0 pb, 10 0 pb, 2 0 0 pb, 3 0 0 pb, 4 0 0 pb, 500 pb, 600 pb, 700 pb, 800 pb, 900 pb, 1 Kb, 2 Kb, 3 Kb, 4 Kb, 5 Kb, 6 Kb, 7 Kb, 8 Kb, 9 Kb e 10 Kb em comprimento.

[058] Em alguns casos, uma poliA BGH pode incluir mas não está limitada a sequências tais como:

agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta gtgggctct (SEQ ID NO: 3) .

[059] Em alguns casos, as sequências de poliA podem ser otimizadas quanto a vários parâmetros afetando a expressão de proteínas, incluindo mas não se limitando a meia-vida do mRNA do transgene na célula, estabilidade do mRNA do transgene ou regulação transcricional. Por exemplo, as sequências de poliA

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25/99 podem ser alteradas para aumentar a transcrição de mRNA do transgene, o que pode resultar em expressão de proteínas aumentada. Em alguns casos, as sequências de poliA podem ser alteradas para diminuir a meia-vida do transcrito de mRNA do transgene, o que pode resultar em expressão de proteínas diminuída.

[060] Em alguns aspectos, o vetor compreende uma sequência codificando uma sequência de origem de replicação, tal como aquelas proporcionadas aqui. As sequências de origem de replicação proporcionam geralmente sequência útil para propagação de um plasmideo/vetor.

[061] Em alguns casos, uma sequência de origem de replicação pUC pode incluir mas não está limitada a sequências tais como:

ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctqctgcca gtggcgataa gtcgtqtctt accgggttgg actcaagacg ataqttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtqagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctgggc ttttgctggc cttttgctca catgttctt (SEQ ID NO: 4).

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[062] O vetor pode também compreender um marcador selecionável. Os marcadores selecionáveis podem ser positivos, negativos ou bifuncionais. Os marcadores selecionáveis positivos permitem seleção para células transportando o marcador, ao passo que os marcadores selecionáveis negativos permitem que as células transportando o marcador sejas seletivamente eliminadas. Uma variedade de tais genes marcadores foi descrita, incluindo marcadores bifuncionais (i.e., positivos/negativos) (ver, p.ex., Lupton, S., WO 92/08796, publicada a 29 de maio, 1992; e Lupton, S., WO 94/28143, publicado a 8 de dez., 1994). Exemplos de marcadores selecionáveis negativos podem incluir a inclusão de genes de resistência a antibióticos, tais como ampicilina ou canamicina. Tais genes marcadores podem proporcionar medida de controle que pode ser vantajosa em contextos de terapia gênica. Uma grande variedade de tais vetores é conhecida na técnica e está geralmente disponível.

[063] Em alguns casos, um ácido nucleico codificando resistência à canamicina pode incluir mas não está limitada a sequências tais como:

ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc

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27/99 attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga (SEQ ID NO: 5).

[064] O vetor/plasmideo recombinante compreende um polinucleotídeo codificando uma proteína Maxi-K humana, uma proteína Maxi-K mutante ou um seu fragmento funcional. Um Ácido nucleico exemplificativo codificando a proteína Maxi-K adequado para uso na presente invenção inclui a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 6.

hSlo

ATGGCAAACGGTGGCGGCGGCGGCGGCGGCAGCAGCGGCGGCGGCGGCGGCGG

CGGCGGAGGCAGCGGTCTTAGAATGAGCAGCAATATCCACGCGAACCATCTCAGCCTAGACGC GTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCTTCCTCTTCTTCTTCTTCCTCCTCCTCTTCCTCCTCGTC

CTCGGTCCACGAGCCCAAGATGGATGCGCTCATCATCCCGGTGACCATGGAGGTGCCGTGCGA CAGCCGGGGCCAACGCATGTGGTGGGCTTTCCTGGCCTCCTCCATGGTGACTTTCTTCGGGGG CCTCTTCATCATCTTGCTCTGGCGGACGCTCAAGTACCTGTGGACCGTGTGCTGCCACTGCGG GGGCAAGACGAAGGAGGCCCAGAAGATTAACAATGGCTCAAGCCAGGCGGATGGCACTCTCAA ACCAGTGGATGAAAAAGAGGAGGCAGTGGCCGCCGAGGTCGGCTGGATGACCTCCGTGAAGGA CTGGGCGGGGGTGATGATATCCGCCCAGACACTGACTGGCAGAGTCCTGGTTGTCTTAGTCTT T G C T C T CAG CAT C G G T G CAC TTGTAATATACTT CATAGAT T CAT CAAAC C CAATAGAAT C C T G CCAGAATTTCTACAAAGATTTCACATTACAGATCGACATGGCTTTCAACGTGTTCTTCCTTCT CTACTTTGGCTTGCGGTTTATTGCAGCCAACGATAAATTGTGGTTCTGGCTGGAAGTGAACTC

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TGTAGTGGATTTCTTCACGGTGCCCCCCGTGTTTGTGTCTGTGTACTTAAACAGAAGTTGGCT TGGTTTGAGATTTTTAAGAGCTCTGAGACTGATACAGTTTTCAGAAATTTTGCAGTTTCTGAA TAT T C T TAAAACAAG TAAT T C CAT CAAG C T G G T GAAT CTGCTCTCCATATTTAT CAG CAC G T G GCTGACTGCAGCTGGGTTCATCCATTTGGTGGAGAATTCAGGGGACCCATGGGAAAATTTCCA AAACAACCAGGCTCTCACCTACTGGGAATGTGTCATTTACTCATGGTCACAATGTCCACCGTT GGTTATGGGGATGTTTATGCAAAAACCACACTTCGGCGCCTCTTCATGGTCTTCTTCATCCTC GGGGGACTGGCCATGTTTGCCAGCTACGTCCCTGAAATCATAGAGTTAATAGGAAACCGCAAG AAATACGGGGGCTCCTATAGTGCGGTTAGTGGAAGAAAGCACATTGTGGTCTGCGGACACATC ACTCTGGAGAGTGTTTCCAACTTCCTGAAGGACTTTCTGCACAAGGACCGGGATGACGTCAAT GTGGAGATCGTTTTTCTTCACAACATCTCCCCCAACCTGGAGCTTGAAGCTCTGTTCAAACGA CATTTTACTCAGGTGGAATTTTATCAGGGTTCCGTCCTCAATCCACATGATCTTGCAAGAGTC AAGATAGAGTCAGCAGATGCATGCCTGATCCTTGCCAACAAGTACTGCGCTGACCCGGATGCG GAG GAT G C C T C GAATAT CAT GAGAG TAAT C T C CATAAAGAAC TAC CAT C C GAAGATAAGAAT C ATCACTCAAATGCTGCAGTATCACAACAAGGCCCATCTGCTAAACATCCGAGCTGGAATTGGA AAGAAGGTGATGACGCAATCTGCCTCGCAGAGTTGAAGTTGGGCTTCATAGCCCAGAGCTGCC TGGCTCAAGGCCTCTCCACCATGCTTGCCAACCTTCTCCATGAGGTCATTCATAAAGATTGAG GAAGACACAT GGCAGAAATAC TAC T T GGAAGGAGT C T CAAAT CAAAT GTACACAGAATAT C T C TCCAGTGCCTTCGTGGGTCTGTCCTTCCCTACTGTTTGTGAGCTGTGTTTTGTGAAGCTCAAG C T C C TAAT GATAG C CAT TGAGTACAAGT C T GCCAAGCGAGAGAGCCGTATAT TAAT TAAT CC T GGAAACCATTTTAAGATCCAAGAAGGTACTTTAGGATTTTTCATCGCAAGTGATGCCAAAGAA GTTAAAAGGGCATTTTTTTACTGCAAGGCCTGTCATGATGACATCACAGATCCCAAAAGAATA AAAAAATGTGGCTGCAAACGGCTTGAAGATGAGCAGCCGTCAACACTATCACCAAAAAAAAAG CAACGGAATGGAGGCATGCGGAACTCACCCAACACCTCGCCTAAGCTGATGAGGCATGACCCC T T G T TAAT T C C T G GCAAT GAT CAGAT T GACAACATGGAC T CCAAT GT GAAGAAGTACGAC T C T ACTGGGATGTTTCACTGGTGTGCACCCAAGGAGATAGAGAAAGTCATCCTGACTCGAAGTGAA GCTGCCATGACCGTCCTGAGTGGCCATGTCGTGGTCTGCATCTTTGGCGACGTCAGCTCAGCC CTGATCGGCCTCCGGAACCTGGTGATGCCGCTCCGTGCCAGCAACTTTCATTACCATGAGCTC AAGCACATTGTGTTTGTGGGCTCTATTGAGTACCTCAAGCGGGAATGGGAGACGCTTCATAAC

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TTCCCCAAAGTGTCCATATTGCCTGGTACGCCATTAAGTCGGGCTGATTTAAGGGCTGTCAAC ATCAACCTCTGTGACATGTGCGΤTATCCTGTCAGCCAATCAGAATAATATTGATGATACΤTCG CTGCAGGACAAGGAATGCATCTTGGCGTCACTCAACATCAAATCTATGCAGTTTGATGACAGC ATCGGAGTCTTGCAGGCTAATTCCCAAGGGTTCACACCTCCAGGAATGGATAGATCCTCTCCA GATAACAGCCCAGTGCACGGGATGTTACGTCAACCATCCATCACAACTGGGGTCAACATCCCC AT CAT CAC T GAAC TAG T GAAC GATAC TAAT G Τ TCAGΤ Τ Τ Τ T GGACCAAGACGAT GAT GAT GAC CCTGATACAGAACTGTACCTCACGCAGCCCTTTGCCTGTGGGACAGCATTTGCCGTCAGTGTC CTGGACTCACTCATGAGCGCGACGTACTTCAATGACAATATCCTCACCCTGATACGGACCCTG GTGACCGGAGGAGCCACGCCGGAGCTGGAGGCTCTGATTGCTGAGGAAAACGCCCTTAGAGGT GGCTACAGCACCCCGCAGACACTGGCCAATAGGGACCGCTGCCGCGTGGCCCAGTTAGCTCTG CTCGATGGGCCATTTGCGGACTTAGGGGATGGTGGTTGTTATGGTGATCTGTTCTGCAAAGCT CTGAAAACATATAATATGCTTTGTTTTGGAATTTACCGGCTGAGAGATGCTCACCTCAGCACC CCCAGTCAGTGCACAAAGAGGTATGTCATCACCAACCCGCCCTATGAGTTTGAGCTCGTGCCG ACGGACCTGATCTTCTGCTTAATGCAGTTTGACCACAATGCCGGCCAGTCCCGGGCCAGCCTG TCCCATTCCTCCCACTCGTCGCAGTCCTCCAGCAAGAAGAGCTCCTCTGTTCACTCCATCCCA TCCACAGCAAACCGACAGAACCGGCCCAAGTCCAGGGAGTCCCGGGACAAACAGAAGTACGTG CAGGAAGAGCGGCTTTGATATGTGTATCCACCGCCACTGTGTGAAACTGTATCTGCCACTCAT TTCCCCAGTTGGTGTTTCCAACAAAGTAACTTTCCCTGTTTTCCCCTGTAGTCCCCCCCTTTT Τ Τ Τ Τ TACACATAT TTGCATATGTATGATAGTGTGCATGTGGTTGTCATTTTTATTT CAC CAC C ATAAAACCCTTGAGCACAACAGCAAATAAGCAGACGGGCTCCGGAATTCCTGCAGCCCGGGGG ATCCACTAG (SEQ ID NO: 6)

[065] Modificações do gene hSlo podem ser usadas para tratar efetivamente doença humana que seja causada, por exemplo, por alterações da expressão, ativação, eventos de sinalização a montante e/ou eventos de sinalização a jusante de canais BK. As modificações a uma sequência de nucleotídeos ou peptídeos de tipo selvagem de hSlo podem incluir, mas não estão limitadas a, deleções, inserções, desvios de grelha,

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30/99 substituições e inversões. Por exemplo, modificações contempladas à sequência de tipo selvagem de hSlo incluem substituições de um nucleotídeo único em uma sequência de DNA, cDNA ou RNA codificando hSlo e/ou substituições de um aminoácido único em uma sequência de peptídeos ou polipeptídeos codificando hSlo. A substituição de um nucleotídeo único em uma sequência de DNA, cDNA ou RNA codificando hSlo e/ou um aminoácido único em uma sequência de peptídeos ou polipeptídeos codificando hSlo é também referida como uma mutação pontual. As substituições dentro de uma sequência de DNA, cDNA ou RNA codificando hSlo e/ou uma sequência de peptídeos ou polipeptídeos codificando hSlo podem ser conservadas ou não conservadas.

[066] A modificação preferencial no gene hSlo inclui uma mutação pontual na posição de ácido nucleico 1054 quando numerada de acordo com SEQ ID NO: 7. Esta mutação pontual resulta em uma substituição de aminoácido na posição 352 da proteína de Canal MaxiK quando numerada de acordo com SEQ ID NO: 7. Por exemplo, a mutação pontual é uma substituição de uma Serina (S) por uma Treonina (T) (p.ex., T352S). Opcionaímente, modificações adicionais no gene hSlo incluem mutações pontuais que resultam em uma ou mais substituições de aminoácidos nas posições de aminoácidos 496, 602, 681, 778, 805 ou 977 quando numeradas de acordo com SEQ ID NO: 8.

[067] Mutações adicionais na sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) são também destacadas por letras brancas em um fundo preto e acompanhadas pelo nome da mutação (p.ex., C977A (Cl), C496A (C2), C681A (C3), M602L (Ml), M778L (M2) e M805L (M3)).

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31/99

ATGGCAAATGGTGGCGGCGGCGGCGGCGGCAGCAGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGAGGC 6Ο

1MANGGGGGGGSSGGGGG

G G G

AGCAGTCTTAGAATGAGTAGCAATATCCACGCGAACCATCTCAGCCTAGACGTGTCCTCC 120

21SSLRMSSNIHANHLSLD

V S S

121

TCCTCCTCCTCCTCCTCTTCCTCTTCTTCTTCTTCCTCCTCCTCTTCCTCCTCGTCCTCG 180

41SSSSSSSSSSSSSSSSS s s s

181

GTCCACGAGCCCAAGATGGATGCGCTCATCATCCCGGTGACCATGGAGGTGCCGTGCGAC 240

61VHEPKMDALI IPVTMEV

PCD

241

AGCCGGGGCCAACGCATGTGGTGGGCTTTCCTGGCCTCCTCCATGGTGACTTTCTTCGGG 300

81SRGQRMWWAFLASSMVT

F F G

301

GGCCTCTTCATCATCTTGCTCTGGCGGACGCTCAAGTACCTGTGGACCGTGTGCTGCCAC 360

101GLFI ILLWRTLKYLWTV

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32/99

C C Η

361

TGCGGGGGCAAGACGAAGGAGGCCCAGAAGATTAACAATGGCTCAAGCCAGGCGGATGGC 420

121CGGKTKEAQKINNGSSQ A D G

421

ACTCTCAAACCAGTGGATGAAAAAGAGGAGGCAGTGGCCGCCGAGGTCGGCTGGATGACC 480

141TLKPVDEKEEAVAAEVG W Μ T

481

TCCGTGAAGGACTGGGCGGGGGTGATGATATCCGCCCAGACACTGACTGGCAGAGTCCTG 540

161SVKDWAGVMI SAQTLTG R V L

541

GTTGTCTTAGTCTTTGCTCTCAGCATCGGTGCACTTGTAATATACTTCATAGATTCATCA 600

181 VVLVFALS IGALVIYFI D S S

601

AAC C CAATAGAAT C C T G C CAGAAT T T C TACAAAGAT T T CACAT TACAGAT C GACAT G G C T 660

201NPIESCQNFYKDFTLQI DMA

661

TTCAACGTGTTCTTCCTTCTCTACTTCGGCTTGCGGTTTATTGCAGCCAACGATAAATTG

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33/99

720

221FNVFFLLYFGLRFIAAN

D K L

721

TGGTTCTGGCTGGAAGTGAACTCTGTAGTGGATTTCTTCACGGTGCCCCCCGTGTTTGTG 780

241 WFWLEVNSVVDFFTVPP

V F V

781

TCTGTGTACTTAAACAGAAGTTGGCTTGGTTTGAGATTTTTAAGAGCTCTGAGACTGATA 840

261SVYLNRSWLGLRFLRAL

R L I

841

CAGTTTTCAGAAATTTTGCAGTTTCTGAATATTCTTAAAACAAGTAATTCCATCAAGCTG 900

281QFSEILQFLNILKTSNS

I K L

901

GTGAATCTGCTCTCCATATTTATCAGCACGTGGCTGACTGCAGCCGGGTTCATCCATTTG 960

301 VNLLSIFISTWLTAAGF

I H L

961

GTGGAGAATTCAGGGGACCCATGGGAAAATTTCCAAAACAACCAGGCTCTCACCTACTGG 1020

321VENSGDPWENFQNNQAL

T Y W

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1021

GAATGTGTCTATTTACTCATGGTCACAATGTCCACCGTTGGTTATGGGGATGTTTATGCA 1080

ATGGTCACAATGTCCTCCGTTGGTTATGGGGAT (SEQ ID NO:11)

341ECVYLLMVTMSTVGYGD

V Y A

1081

AAAACCACACTTGGGCGCCTCTTCATGGTCTTCTTCATCCTCGGGGGACTGGCCATGTTT 1140

361KTTLGRLFMVFFILGGL

AMF

1141

GCCAGCTACGTCCCTGAAATCATAGAGTTAATAGGAAACCGCAAGAAATACGGGGGCTCC 1200

381ASYVPEI IELIGNRKKY

G G S

1201

TATAGTGCGGTTAGTGGAAGAAAGCACATTGTGGTCTGCGGACACATCACTCTGGAGAGT 1260

401 YSAVSGRKHIVVCGHI T

L E S

1261

GTTTCCAACTTCCTGAAGGACTTTCTGCACAAGGACCGGGATGACGTCAATGTGGAGATC 1320

421VSNFLKDFLHKDRDDVN

V E I

1321

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35/99

GTTTTTCTTCACAACATCTCCCCCAACCTGGAGCTTGAAGCTCTGTTCAAACGACATTTT 1380

441VFLHNISPNLELEALFK

R Η F

1381

ACTCAGGTGGAATTTTATCAGGGTTCCGTCCTCAATCCACATGATCTTGCAAGAGTCAAG 1440

461 TQVEFYQGSVLNPHDLA

R V K

1441

ATAGAGTCAGCAGATGCATGCCTGATCCTTGCCAACAAGTACTGCGCTGACCCGGATGCG 1500

481 IESADACLILANKYCAD

PDA

1501

GAG GAT G C C T C GAATAT CAT GAGAG ΤAAT C T C CATAAAGAAC TAC CAT C C GAAGATAAGA 1560

501EDASNIMRVISIKNYHP

K I R

1561

ATCATCACTCAAATGCTGCAGTATCACAACAAGGCCCATCTGCTAAACATCCCGAGCTGG 1620

521 I ITQMLQYHNKAHLLNI

P S W

1621

AATTGGAAAGAAGGTGATGACGCAATCTGCCTCGCAGAGTTGAAGTTGGGCTTCATAGCC 1680

541NWKEGDDAICLAELKLG

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36/99

FIA

1681

CAGAGCTGCCTGGCTCAAGGCCTCTCCACCATGCTTGCCAACCTCTTCTCCATGAGGTCA 1740

561QSCLAQGLSTMLANLFS

M R S

1741

T T CATAAAGATT GAGGAAGACACAT GGCAGAAATACTAC T T GGAAGGAGTCT CAAAT GAA 1800

581FIKIEEDTWQKYYLEGV

S N E

1801

ATGTACACAGAATATCTCTCCAGTGCCTTCGTGGGTCTGTCCTTCCCTACTGTTTGTGAG 1860

601MYTEYLSSAFVGLSFPT

V C E

1861

CTGTGTTTTGTGAAGCTCAAGCTCCTAATGATAGCCATTGAGTACAAGTCTGCCAACCGA 1920

621LCFVKLKLLMIAIEYKS

A N R

1921

GAGAG C C G T AT AT T AAT T AAT C C T G G AAAC C AT C T T AAGAT C C AAGAAG G T AC T T T AG GA 1980

641ESRILINPGNHLKIQEG

T L G

1981

TTTTTCATCGCAAGTGATGCCAAAGAAGTTAAAAGGGCATTTTTTTACTGCAAGGCCTGT

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37/99

2040

661 FFIASDAKEVKRAFFYC

K A C

2041

CAT GAT GACAT CACAGAT CCCAAAAGAATAAAAAAAT GT GGC T GCAAACGGC T T GAAGAT 2100

681HDDITDPKRIKKCGCKR

L E D

2101

GAGCAGCCGTCAACACTATCACCAAAAAAAAAGCAACGGAATGGAGGCATGCGGAACTCA 2160

701EQPSTLSPKKKQRNGGM

R N S

2161

CCCAACACCTCGCCTAAGCTGATGAGGCATGACCCCTTGTTAATTCCTGGCAATGATCAG 2220

721PNTSPKLMRHDPLLIPG

N D Q

2221

ATTGACAACATGGACTCCAATGTGAAGAAGTACGACTCTACTGGGATGTTTCACTGGTGT 2280

741 IDNMDSNVKKYDSTGMF

H W C

2281

GCACCCAAGGAGATAGAGAAAGTCATCCTGACTCGAAGTGAAGCTGCCATGACCGTCCTG 2340

761APKE IEKVILTRSEAAM

T V L

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2341

AGTGGCCATGTCGTGGTCTGCATCTTTGGCGACGTCAGCTCAGCCCTGATCGGCCTCCGG 2400

781 S G Η V V V C I F G D V S S A L I

G L R

2401

AACCTGGTGATGCCGCTCCGTGCCAGCAACTTTCATTACCATGAGCTCAAGCACATTGTG 2460

801 NLVMPLRASNFHYHELK

Η I V

2461

TTTGTGGGCTCTATTGAGTACCTCAAGCGGGAATGGGAGACGCTTCATAACTTCCCCAAA 2520

821FVGSIEYLKREWETLHN

F P K

2521

GTGTCCATATTGCCTGGTACGCCATTAAGTCGGGCTGATTTAAGGGCTGTCAACATCAAC 2580

841 VS ILPGTPLSRADLRAV

N I N

2581

CTCTGTGACATGTGCGTTATCCTGTCAGCCAATCAGAATAATATTGATGATACTTCGCTG 2640

861LCDMCVILSANQNNIDD

T S L

2641

CAGGACAAGGAATGCATCTTGGCGTCACTCAACATCAAATCTATGCAGTTTGATGACAGC 2700

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881QDKECILASLNIKSMQF

D D S

2701

ATCGGAGTCTTGCAGGCTAATTCCCAAGGGTTCACACCTCCAGGAATGGATAGATCCTCT 2760

901 IGVLQANSQGFTPPGMD

R S S

2761

CCAGATAACAGCCCAGTGCACGGGATGTTACGTCAACCATCCATCACAACTGGGGTCAAC 2820

921PDNSPVHGMLRQPSITT

G V N

2821

ATCCCCATCAT CAC T GAAC TAG T GAAC GATACTAATGTT CAG T T T T T G GAC CAAGAC GAT 2880

941 IPI I TELVNDTNVQFLD Q D D

2881

GATGATGACCCTGATACAGAACTGTACCTCACGCAGCCCTTTGCCTGTGGGACAGCATTT 2940

961 DDDPDTELYLTQPFACG

T A F

2941

GCCGTCAGTGTCCTGGACTCACTCATGAGCGCGACGTACTTCAATGACAATATCCTCACC 3000

981AVSVLDSLMSATYFNDN

I L T

3001

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40/99

CTGATACGGACCCTGGTGACCGGAGGAGCCACGCCGGAGCTGGAGGCTCTGATTGCTGAG 3060

1001 LIRTLVTGGATPELEAL

I A E

3061

GAAAACGCCCTTAGAGGTGGCTACAGCACCCCGCAGACACTGGCCAATAGGGACCGCTGC 3120

1021 ENALRGGYSTPQTLANR

D R C

3121

CGCGTGGCCCAGTTAGCTCTGCTCGATGGGCCATTTGCGGACTTAGGGGATGGTGGTTGT 3180

1041 RVAQLALLDGPFADLGD

G G C

3181

TATGGTGATCTGTTCTGCAAAGCTCTGAAAACATATAATATGCTTTGTTTTGGAATTTAC 3240

1061 YGDLFCKALKTYNMLCF

G I Y

3241

CGGCTGAGAGATGCTCACCTCAGCACCCCCAGTCAGTGCACAAAGAGGTATGTCATCACC 3300

1081 RLRDAHLSTPSQCTKRY

V I T

3301

AACCCGCCCTATGAGTTTGAGCTCGTGCCGACGGACCTGATCTTCTGCTTAATGCAGTTT 3360

1101 NPPYEFELVPTDLIFCL

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M Q F

3361

GACCACAATGCCGGCCAGTCCCGGGCCAGCCTGTCCCATTCCTCCCACTCGTCGCAGTCC 3420

1121 DHNAGQSRASLSHSSHS S Q S

3421

T C CAG CAAGAAGAG CTCCTCTGTT CAC TCCATCCCATC GACAG CAAAC C GACAGAAC C G G 3480

1141 SSKKSSSVHSIPSTANR Q N R

3481

CCCAAGTCCAGGGAGTCCCGGGACAAACAGAAGTACGTGCAGGAAGAGCGGCTT 3538 (SEQ ID NO: 7)

1161 PKSRESRDKQKYVQEER L (SEQ ID NO: 8)

[068] A presente invenção proporciona adicionalmente uma célula muscular lisa que expressa uma sequência de DNA exógeno codificando uma proteína envolvida na regulação do tônus muscular liso. Como usado aqui, exógeno significa qualquer DNA que é introduzido em um organismo ou célula. Em algumas modalidades, a sequência de DNA exógeno codifica hSlo.

Composições Farmacêuticas

[069] Uma composição farmacêutica é uma formulação contendo um ou mais ingredientes ativos bem como um ou mais excipientes, transportadores, estabilizantes ou agentes de volume, o que foi adequado para administração a um paciente

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42/99 humano para se alcançar um resultado de diagnóstico ou efeito terapêutico ou profilático desejado. Para estabilidade no armazenamento e conveniência de manuseamento, uma composição farmacêutica pode ser formulada como um pó liofilizado (i.e., criodessecado) ou seco em vácuo que pode ser reconstituído com solução salina ou água antes da administração a um paciente. Alternativamente, a composição farmacêutica pode ser formulada como uma solução aquosa. Uma composição farmacêutica pode conter um ingrediente ativo proteináceo. Vários excipientes, tais como albumina e gelatina, têm sido usados com diferentes graus de sucesso para tentar estabilizar um ingrediente ativo de proteina presente em uma composição farmacêutica. Adicionalmente, crioprotetores tais como álcoois têm sido usados para reduzir a desnaturação de proteínas sob as condições de congelamento de liofilização.

[070] As composições farmacêuticas adequadas para uso interno incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersão injetáveis estéreis. Para administração intravenosa, transportadores adequados incluem solução salina fisiológica, água bacteriostática ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em todos os casos, a composição tem de ser estéril e deve ser fluída na medida em que exista seringabilidade fácil. Tem de ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e tem de ser preservada contra a ação contaminante de mlcrorganismos tais como bactérias e fungos. O transportador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e

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43/99 polietilenoglicol liquido e similares) e suas misturas adequadas. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partículas requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos tais como polissorbatos (Tween™) , dodecil sulfato de sódio (lauril sulfato de sódio), óxido de amina de lauril dimetila, brometo de cetiltrimetilammônio (CTAB), álcoois polietoxilados, sorbitana de polioxietileno, octoxinol (Triton X100™) , N,N-dimetildodecilamina-N-óxido, brometo de hexadeciltrimetilamônio (HTAB), éter de laurila de polioxila 10, Brij 721™, sais biliares (desoxicolato de sódio, cloreto de sódio), ácidos plurônicos (F—68, F-127), óleo de rícino de polioxila (Cremophor™) , etoxilato de nonilfenol (Tergitol™) , ciclodextrinas e cloreto de etilbenzetônio (Hyamine™) . A prevenção da ação de microrganismos pode ser alcançada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e similares. Em muitos casos será preferencial incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol, cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições internas pode ser provocada por inclusão na composição de um agente que retarde a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

[071] As soluções estéreis podem ser preparadas por incorporação do composto ativo na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido por esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas por

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44/99 incorporação do composto ativo em um veiculo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daqueles numerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, métodos de preparação são secagem em vácuo ou criodessecação que originam um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma sua solução previamente esterilizada por filtração.

[072] As composições farmacêuticas podem ser incluidas em um recipiente, pacote ou distribuídas em conjunto com instruções para administração.

[073] Certas composições da presente divulgação incorporam também compostos transportadores na formulação. Como usado aqui, composto transportador ou transportador pode se referir a um ácido nucleico, ou seu análogo, que é inerte (i.e., não possui atividade biológica per se) mas é reconhecido como um ácido nucleico por processos in vivo que reduzem a biodisponibilidade de um ácido nucleico tendo atividade biológico por, por exemplo, degradação do ácido nucleico biologicamente ativo ou promoção da sua remoção da circulação. A coadministração de um ácido nucleico e um composto transportador, geralmente com um excesso desta última substância, pode resultar em uma redução substancial da quantidade de ácido nucleico recuperada no fígado, rim ou outros reservatórios extracirculatórios, presumivelmente devido à competição entre o composto transportador e o ácido nucleico para um receptor comum. Por exemplo, a recuperação de um oiigonucleotídeo parcialmente de fosforotioato em tecido hepático pode ser reduzida quando é coadministrado com ácido poli-inosínico, sulfato de dextrana, ácido policitídico ou ácido

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4-acetamido-4'-isotiociano-estilbeno-2,2'-dissulfônico (Miyao et al., Antisense Res. Dev._f 1995, 5, 115-121; Takakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183) .

[074] O vetor pode ser incorporado em composições farmacêuticas para administração a pacientes mamíferos, particularmente humanos. O vetor ou virions podem ser formulados em transportadores aquosos farmaceuticamente aceitáveis, inertes, não tóxicos, preferencialmente a um pH variando de 3 a 8, mais preferencialmente variando de 6 a 8, o mais preferencialmente variando de 6,8 a 7,2. Tais composições estéreis compreenderão o vetor contendo o ácido nucleico codificando a molécula terapêutica dissolvida em um tampão aquoso tendo um pH aceitável após reconstituição.

[075] Em alguns aspectos, as composições farmacêuticas proporcionadas aqui compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor em mistura com adição com um transportador e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável, por exemplo solução salina, solução salina tamponada com fosfato, fosfato e aminoácidos, polímeros, polióis, açúcar, tampões, conservantes e outras proteínas. Aminoácidos, polímeros e açúcares e similares exemplificativos são compostos de octilfenoxi polietóxi etanol, compostos de monoestearato de polietilenoglicol, ésteres de ácidos graxos de polioxietileno sorbitana, sacarose, frutose, dextrose, maltose, glucose, manitol, dextrana, sorbitol, inositol, galactitol, xilitol, lactose, tre-halose, albumina de soro bovino ou humano, citrato, acetato, soluções de Ringer e Hank, cisteína, arginina, carnitina, alanina, glicina, lisina, valina, leucina,

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46/99 polivinilpirrolidona, polietileno e glicol.

[076] Em alguns aspectos, a composição farmacêutica proporcionada aqui compreende um tampão, tal como solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou fosfato de sódio/sulfato de sódio, tampão de tris, tampão de glicina, água estéril e outros tampões conhecidos do especialista perito tais como aqueles descritos por Good et al. (1966) Biochemistry 5: 467. A composição farmacêutica preferencial contém fosfato de sódio, cloreto de sódio e sacarose.

[077] Em alguns aspectos, a composição farmacêutica proporcionada aqui compreende substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tal como celulose de carboximetila sódica, sorbitol, sacarose ou dextrana, na quantidade de cerca de 1-30 por cento, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 por cento (v/v). Preferencialmente, a sacarose é cerca de 10-30% (v/v), o mais preferencialmente a sacarose é cerca de 20% (v/v).

[078] Antes da administração, a composição farmacêutica está isenta de componentes usados durante a produção, p.ex., componentes de cultura, proteina de célula hospedeira, DNA de célula hospedeira, DNA de plasmideo e substancialmente isenta de micoplasma, endotoxina e contaminação microbiana. Preferencialmente, a composição farmacêutica tem menos do que 10, 5, 3, 2 ou 1 CFU/zaragatoa. O mais preferencialmente, a composição tem 0 CFU/zaragatoa. O nível de endotoxinas na composição farmacêutica é menor do que 20 EU/mL, menor do que 10 EU/mL ou menor do que 5 EU/mL.

Estojos

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[079] As composições e reagentes úteis para a presente divulgação podem ser empacotados em estojos para facilitar aplicação da presente divulgação. Em alguns aspectos, o presente método proporciona um estojo compreendendo um ácido nucleico recombinante da divulgação. Em alguns aspectos, o presente método proporciona um estojo compreendendo um virus recombinante da divulgação. As instruções podem estar em qualquer forma desejada, incluindo, mas não se limitando a, impressas em um folheto informativo, impressas em um ou mais recipientes, bem como instruções eletronicamente armazenadas proporcionadas em um meio de armazenamento eletrônico, tal como um meio de armazenamento legível por computador. É também incluído um pacote de software em um meio de armazenamento legível por computador que permite que o usuário integre a informação e calcule uma dose de controle.

[080] Em outros aspectos, a presente divulgação proporciona um estojo compreendendo as composições farmacêuticas proporcionadas aqui. Ainda em outro aspecto, a divulgação proporciona estojos no tratamento de doenças.

[081] Em um aspecto, um estojo compreende: (a) um vírus recombinante proporcionado aqui e (b) instruções para administrar a células ou um indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do vírus recombinante. Em alguns aspectos, o estojo pode compreender sais ou soluções farmaceuticamente aceitáveis para administração do vírus recombinante. Opcionalmente, o estojo pode compreender adicionalmente instruções para parâmetros operacionais adequados na forma de um rótulo ou um folheto informativo separado. Por

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48/99 exemplo, o estojo pode ser instruções padrão informando um médico ou técnico laboratorial para preparar uma dose de virus recombinante.

[082] Opcionalmente, o estojo pode compreender adicionalmente uma informação padrão ou de controle tal que uma amostra do paciente possa ser comparada com o padrão de informação de controle para determinar se a quantidade de teste de virus recombinante é uma quantidade terapêutica. Opcionalmente, o estojo podería compreender adicionalmente dispositivos para administração, tais como como uma seringa, agulha de filtro, tubo de extensão e cânula.

Definições

[083] As composições e métodos desta divulgação como descritos aqui podem empregar, a não ser que de outro modo indicado, técnicas e descrições convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), biologia celular, bioquímica, imunoquímica e técnicas oftálmicas, que estão dentro da perícia dos praticantes da técnica. Tais técnicas convencionais incluem métodos para observação e análise da retina ou visão em um sujeito, clonagem e propagação de vírus recombinantes, formulação de uma composição farmacêutica e purificação bioquímica e imunoquímica. Ilustrações específicas de técnicas adequadas podem ser tidas por referência aos exemplos aqui. No entanto, procedimentos convencionais equivalentes podem, obviamente, ser também usados. Tais técnicas e descrições convencionais podem ser encontradas em manuais laboratoriais padrão tais como Green, et al., Eds., Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV) (1999); Weiner, et al.,

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Eds., Genetic Variation: A Laboratory Manual (2007); Dieffenbach, Dveksler, Eds., PCR Primer: A Laboratory Manual (2003); Bowtell e Sambrook, DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual (2003); Mount, Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis (2004); Sambrook e Russell, Condensed Protocola from Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2006); e Sambrook e Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2002) (todos da Cold Spring Harbor Laboratory Press); Stryer, L., Biochemistry (4^a Ed.) W.H. Freeman, N.Y. (1995); Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach IRL Press, Londres (1984) ; Nelson e Cox, Lehninger, Principies of Biochemistry, 3^a Ed., W.H. Freeman Pub., Nova Iorque (2000); ed Berg et al., Biochemistry, 5^a Ed., W.H. Freeman Pub., Nova Iorque (2002), todos os quais são aqui incorporados por referência na sua totalidade para todos os propósitos.

[084] Como usadas aqui, as formas singulares um, uma e o/a se destinam a incluir as formas plurais também, a não ser que o contexto indique claramente de outro modo. Além disso, na medida em que os termos incluindo, inclui, tendo, tem, com ou suas variantes são usados na descrição detalhada e/ou nas reivindicações, tais termos se destinam a ser inclusivos de uma maneira similar ao termo compreendendo.

[085] As gamas podem ser expressas aqui como de cerca de um valor particular e/ou a cerca de outro valor particular. Quando uma tal gama é expressa, outro caso inclui de um valor particular e/ou ao outro valor particular. Similarmente, quando os valores são expressos como aproximações, por uso do antecedente cerca de, será entendido que o valor particular

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50/99 forma outro caso. Será adicionalmente entendido que os pontos finais de cada uma das gamas são significativos tanto em relação ao outro ponto final como independentemente do outro ponto final. O termo cerca de como usado aqui se refere a uma gama que é 15% mais ou menos de um valor numérico apresentado dentro do contexto do uso particular. Por exemplo, cerca de 10 incluiría uma gama de 8,5 a 11,5. O termo cerca de inclui também erro ou imprecisão típica na medição de valores.

[086] No contexto da invenção, o termo tratar ou tratamento, como usado aqui, significa reverter, aliviar, inibir o progresso de ou prevenir a disfunção ou condição à qual tal termo se aplica ou um ou mais sintomas de tal disfunção ou condição (p.ex., síndrome da bexiga hiperativa idiopática).

[087] De acordo com a invenção, o termo paciente ou paciente com sua necessidade se destina para um mamífero humano ou não humano afetado ou provável de ser afetado pela síndrome da bexiga hiperativa idiopática.

[088] Como usado aqui, o termo detrusor ou músculo detrusor se entende o músculo da bexiga. Por intradetrusoralmente se entende no músculo detrusor.

[089] Como pretendido aqui, a expressão ácido nucleico isolado se refere a qualquer tipo de ácido nucleico isolado, pode ser notavelmente natural ou sintético, DNA ou RNA, de fita única ou dupla. Em particular, onde o ácido nucleico é sintético, pode compreender modificações não naturais das bases ou ligações, em particular para aumentar a resistência à degradação do ácido nucleico. Onde o ácido nucleico é RNA, as modificações englobam notavelmente capeamento das suas

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51/99 extremidades ou modificação da posição 2' do esqueleto de ribose de modo a diminuir a reatividade da fração de hidroxila, por exemplo por supressão da fração de hidroxila (para originar uma 2'-desoxirribose ou uma 2'-desoxirribose-2'-fluororribose) ou substituição da fração de hidroxila por um grupo alquila, tal como um grupo alquila (para originar uma 2'-O-metil-ribose).

[090] Duas sequências de aminoácidos ou sequências de ácidos nucleicos são substancialmente homólogas ou substancialmente similares quando mais do que 80%, preferencialmente mais do que 85%, preferencialmente mais do que 90% das sequências de aminoácidos ou ácidos nucleicos são idênticas ou mais do que cerca de 90%, preferencialmente mais do que 95%, são similares (funcionalmente idênticas). Para se determinar a percentagem de identidade de duas sequências de aminoácidos ou de dois ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para propósitos de comparação ótima (p.ex., podem ser introduzidas lacunas na sequência de uma primeira sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos para alinhamento ótimo com uma segunda sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos). Os resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos em posições de aminoácidos ou posições de nucleotídeos são depois comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo residuo de aminoácido ou nucleotideo que a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas em essa posição. A percentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências. Em uma modalidade, as duas sequências têm o mesmo comprimento. A determinação da percentagem de identidade entre

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52/99 duas sequências pode ser alcançada usando um algoritmo matemático. Preferencialmente, as sequências similares ou homólogas são identificadas por alinhamento usando, por exemplo, o programa pileup GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Versão 7, Madison, Wis.) ou qualquer um dos algoritmos de comparação de sequências tais como BLAST, FASTA, etc.

[091] Como usado aqui, o termo vetor se refere a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligada. Um tipo de vetor é um plasmídeo, que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (p.ex., vetores bacterianos tendo uma origem de replicação bacteriana e vetores de mamífero epissomais) . Outros vetores (p.ex., vetores de mamífero não epissomais) são integrados no genoma de uma célula hospedeira após introdução na célula hospedeira e, deste modo, são replicados em conjunto com o genoma hospedeiro. Além do mais, certos vetores, vetores de expressão, são capazes de dirigir a expressão de genes aos quais estão operacionalmente ligados.

OUTRAS MODALIDADES

[092] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunção com a sua descrição detalhada, a descrição anterior se destina a ilustrar e não limitar o escopo da invenção, que é definido pelo escopo das reivindicações anexas. Outros aspectos,

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53/99 vantagens e modificações estão dentro do escopo das seguintes reivindicações.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: ESTUDOS NÃO CLÍNICOS COM TRANSFERÊNCIA GÊNICA DE hMaxi-K

Ratos

[093] A patofisiologia da obstrução parcial da salda urinária no modelo de rato recapitula muitos aspectos relevantes dos sintomas correspondentes do trato urinário inferior observados em humanos. As notáveis similaridades fisiológicas e patofisiológicas tornam razoável assumir que estudos sobre a bexiga do rato proporcionarão informação sobre pelo menos alguns aspectos da fisiologia e disfunção da bexiga humana.

[094] Como a fisiologia da bexiga do rato tem paralelos com muitos aspectos da bexiga humana, estudos examinaram a potencial utilidade de terapia gênica de canal K instilado na bexiga com cDNA de hSlo (i.e., o canal maxi-K) para melhorar a hiperatividade da bexiga em um modelo de rato de obstrução parcial da salda urinária.

[095] Em um estudo, vinte e dois ratos SpragueDawley fêmeas foram sujeitos a obstrução uretral parcial (i.e., saida, PUO), com 17 ratos de controle com simulação da operação operados em paralelo. Após 6 semanas de obstrução, cateteres suprapúbicos foram cirurgicamente colocados na cúpula da bexiga em todos os ratos. Doze ratos obstruídos receberam instilação na bexiga de 100 pg de hSlo/pcDNA em 1 mL de PBS-sacarose a 20% durante a cateterização e outros 10 ratos obstruídos receberam 1

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54/99 mL de PBS-sacarose a 20% (7 ratos) ou 1 mL de PBS-sacarose a 20% contendo somente pcDNA (3 ratos) . Dois dias após cirurgia foi realizada cistometria em todos os animais para examinar as características do reflexo de micção em ratos conscientes e irrestritos. A obstrução foi associada a um aumento de três a quatro vezes no peso da bexiga e alterações em virtualmente todas as estimativas de parâmetros de micção (ver Tabela 1).

[096] Os ratos obstruídos injetados com PBSsacarose a 20% exibiram rotineiramente contrações espontâneas da bexiga entre micções. Em contraste, a injeção de hSlo eliminou a hiperatividade da bexiga associada à obstrução, sem afetar detectavelmente qualquer outro parâmetro cistométrico. Presumivelmente, a expressão de hSlo na bexiga dos ratos antagoniza funcionalmente a contratilidade aumentada normalmente observada em animais obstruídos e deste modo melhora a hiperatividade da bexiga.

[097] Outro gene examinou a capacidade da transferência gênica de hSlo de alterar e/ou melhorar as flutuações da pressão intermicções observadas em um modelo de ratos machos obstruídos. Para estes estudos, os ratos foram obstruídos durante 2 semanas usando uma abordagem perineal. Após 2 semanas de obstrução, os ratos foram cateterizados para investigações cistométricas e colocados em 1 de 2 grupos de tratamento. Ratos de Controle com Correspondência de Idade foram sujeitos a uma obstrução simulada e operados em paralelo.

[098] Os valores médios para os parâmetros de micção em todos os animais experimentais são resumidos na Tabela 2, e as características salientes destas descobertas são

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55/99 graficamente ilustradas nas Figuras 1 e 2. Importantemente, como com o estudo no rato fêmea obstruído durante 6 semanas, uma única instilação intravesical de 100 pg de hSlo/pVAX foi associada a mudanças estatisticamente significativas em vários parâmetros de micção de grande relevância fisiológica.

[099] Um terceiro estudo avaliou os efeitos da transferência gênica de hSlo após 2 semanas de obstrução parcial da saída uretral em ratos fêmeas. De modo a criar uma obstrução parcial da saída uretral (PUO), uma ligadura foi colocada na uretra de ratos Sprague-Dawley fêmeas pesando 200-250 g (Christ et al., 2001) como descrito acima. Duas semanas após colocação da ligadura, os ratos foram sujeitos a cirurgia para colocação de um cateter suprapúbico. Dois dias mais tarde, estudos da função da bexiga (i.e., cistometria) foram realizados em ratos conscientes, irrestritos em gaiolas metabólicas. Como ilustrado na Tabela 3 e Figura 3, após as 2 semanas de obstrução parcial da saída uretral, os ratos fêmeas exibem mudanças significativas na função da bexiga, como evidenciado pelo aumentado de mais do que 2 vezes na capacidade da bexiga e pelo aparecimento de contrações espontâneas da bexiga significativas. As contrações espontâneas da bexiga aumentadas foram observadas como flutuações de pressão entre micções (ver Figura 3) e podem ser quantificadas como mostrado na Tabela 3 pelos aumentos correspondentes nos valores de SA e IMP. Uma única injeção intraluminal na bexiga de 300 pg e 1000 pg de pVAX/hSlo (em 1 mL de PBS-sacarose a 20%) resultou em uma ablação quase completa da hiperatividade do detrusor. Este efeito é refletido pela diminuição significativa em IMP e SA nos ratos obstruídos, tratados com hSlo, quando

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56/99 comparados com os ratos tratados somente com vetor pVAX (ver Tabela 3) . Embora uma verdadeira relação de efeito DO para a transferência gênica de hSlo não tenha sido mostrada em este modelo, este estudo demonstrou de fato que, ao longo de uma variação unitária de 1-log em DO (de 100 a 1000 pg), existe uma diminuição estatisticamente significativa e, além do mais, fisiologicamente relevante em DO, na ausência de qualquer efeito detectável na capacidade da bexiga de se esvaziar. Isto é, em este modelo animal, pVAX/hSlo é capaz de melhorar os efeitos patofisiológicos de DO relacionada com obstrução do fluxo de saída, sem ter qualquer efeito prejudicial na função da bexiga. Foram observados efeitos similares após instilação de 100 pg de pVAX/hSlo nos ratos Sprague Dawley fêmeas obstruídos durante 6 semanas, que são mostrados em baixo.

[100] Um estudo em coelhos para avaliar a distribuição de diferentes volumes de transferência gênica injetados na parede da bexiga foi realizada antes da iniciação do ensaio clinico em mulheres com OAB usando injeções intravesiclares diretas (Tabela 4). Foram usados nove coelhos brancos New Zealand Adultos fêmeas pesando uma média de 2,72 kg (6 libras). Os animais foram anestesiados e pVAX-lacz era para ser injetado no detrusor em alíquotas de 0,05, 0,1 e 0,15 mL em 4, 8 e 10 locais na parede da bexiga. Um conjunto adicional de 3 animais era para ser injetado com transportador sozinho somente ao volume mais elevado de transportador (4, 8 ou 10 locais x 0,15 mL). Os plasmídeos estavam em solução a uma concentração de 4000 pg/ml. Uma semana mais tarde, os animais foram eutanasiados e as bexigas excisadas e pesadas. As áreas com cor azul foram

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57/99 preparadas para examinação histológica e análise molecular. A análise molecular de tecido com expressão de hSlo foi feita com extração de RNA e PCR em tempo real. Adicionalmente foi realizada histopatologia nos vários tecidos de coelhos.

[101] Devido à dificuldade com injeções diretas na bexiga em este modelo animal, a injeção de 0,05 mL foi somente dada a um coelho. Seis coelhos tiveram 0,1 mL em 4, 8 e 10 locais (3 do interior da bexiga; 3 do exterior da bexiga). Três coelhos tiveram 0,15 mL em 4, 8 e 10 locais. Os resultados indicaram que aqueles coelhos com um número maior de injeções (8-10 injeções) tiveram menos expressão do que alguns animais com o menor número de injeções (4 injeções) . A conclusão global é que a injeção direta na parede da bexiga resulta na expressão do gene, no entanto, parece funcionar melhor com dispersão mais ampla das injeções talvez com uma distância de 1 cm. O gene foi detectado no sangue até 30 minutos pós-tratamento. Existiram lesões granulomatosas observadas devido às suturas (um artefato comum no modelo de coelhos).

Toxicologia

[102] Para a indicação de OAB, não é tecnicamente possivel simular a mesma via transuretral de administração intravesical de pVAX/hSlo em ratos como será usado nos ensaios humanos. Portanto, nos estudos de toxicologia e biodistribuição avaliando a injeção intravesical de pVAX/hSlo, os animais foram submetidos a exposição cirúrgica da bexiga e material de estudo foi injetado diretamente na bexiga usando uma agulha.

[103] O efeito de pVAX/hSlo em parâmetros hematológicos e químicos foi avaliado em quinze ratos Sprague

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Dawley fêmeas normais com 275-300 gm. 1000 pg de pVAX/hSlo (8 animais) ou vetor pVAX (7 animais) foram injetados diretamente no lúmen da bexiga após exposição cirúrgica. Amostras de sangue foram coletadas através de um bastão cardíaco após os animais terem sido eutanasiados por anestesia com CO2 às 4, 8 e 24 horas e à 1 semana após injeção de material de teste. As amostras foram analisadas quanto à glucose, nitrogênio de ureia, creatinina, proteína total, bilirrubina total, fosfatase alcalina, ALT, AST, colesterol, sódio, potássio, cloreto, razão A/G, razão BUN/creatinina, globulina, lipase, amilase, triglicerideos, CPK, GTP, magnésio e osmolalidade. Os parâmetros laboratoriais foram similares entre pVAX/hSlo e controles nos quatro pontos temporais.

[104] O efeito de pVAX/hSlo na histopatologia em ratos Sprague-Dawley fêmeas (275 a 300 gm) foi avaliado em dois estudos. No primeiro estudo, quatro ratos foram submetidos a cirurgia de obstrução parcial da bexiga e 2 semanas mais tarde 100 pg de pVAX/hSlo em 1000 pL de PBS-sacarose a 20% foram administrados diretamente no lúmen da bexiga com exposição cirúrgica da bexiga. Um animal único foi eutanasiado às 1, 8 e 24 horas e à uma semana após injeção de pVAX/hSlo. Os tecidos de 47 órgãos foram imediatamente fixos em formalina a 10% e processados para examinação histopatológica de rotina. Mudanças histopatológicas foram notadas somente na bexiga e consistiram em serosite, edema, hemorragia e fibrose. Estas mudanças foram consistentes com aquelas esperadas com obstrução uretral parcial e não foram consideradas relacionadas com injeção de pVAX/hSlo.

[105] Devido às mudanças histopatológicas na

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59/99 bexiga de ratos com PUO aos quais foi administrado pVAX/hSlo, o efeito de pVAX/hSlo comparado com vetor (pVAX) e PBS-sacarose a 20% na histologia da bexiga foi avaliado em ratos normais. Após exposição cirúrgica, o seguinte material de teste foi injetado diretamente no lúmen da bexiga: 1) 0,6 mL de PBS-sacarose a 20%, 2) 1000 pg de pVAX em 0,6 mL de PBS-sacarose a 20% ou 3) 1000 pg de pVAX/hSlo em 0,6 mL de PBS-sacarose a 20%. Os animais foram eutanasiados com CO2 72 horas após instilação e as bexigas removidas e imediatamente fixadas em solução de formalina a 10%. O ponto temporal de 72 horas foi escolhido para limitar os efeitos mecânicos da punção com agulha na parede da bexiga e minimizar quaisquer efeitos potenciais de inflamação que pudessem ser causados pelo pVAX/hSlo, vetor ou diluente.

[106] Não existiram descobertas grosseiras na examinação da bexiga. Globalmente, não existiram diferenças relacionadas com o tratamento entre pVAX/hSlo e o veículo ou pVAX. Nenhumas alterações relacionadas com o tratamento no urotélio foram notadas. As lesões vistas na examinação histológica foram consistentes com trauma da agulha usada para injeção uma vez que eram focais em vez de difusas ou multifocais na distribuição.

[107] No estudo de biodistribuição, material de teste foi injetado diretamente no lúmen de bexigas expostas em ratos Sprague-Dawley fêmeas normais com 275-300 g. 1000 pg de pVAX/hSlo em 0,6 mL de PBS-sacarose a 20% foram administrados a 12 animais e 0,6 mL de PBS-sacarose a 20% administrados a 5 animais (Figura 4). Quatro animais foram cada um sacrificados às 24 horas, 1 semana e 1 mês após injeção de material de teste.

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Amostras de tecido foram coletadas na ordem especificada como se segue: coração, fígado, cérebro, rim, baço, pulmão, aorta, traqueia, linfonodo, olho, bíceps, cólon, vagina e útero.

[108] Amostras de DNA genômico foram analisadas quanto ao gene da canamicina com um método de QPCR validado. Os resultados indicam que, após injeção de 1000 pg de pVAX/hSlo, o plasmídeo pôde ser detectado após 24 horas na aorta, útero, bexiga e uretra. À 1 semana, aproximadamente 13 milhões de cópias/pg de DNA total foram medidas na bexiga e pVAX/hSlo pôde ser também detectado ligeiramente no bíceps. Os resultados são exibidos em formato gráfico na Figura 4 (em baixo).

[109] Embora estes resultados difiram de descobertas após injeção intracavernosa, a detecção de 13 milhões de cópias/pg de DNA total é ainda menor do que as <30 cópias de plasmídeo/10⁵ células hospedeiras que persistem no local de injeções de vacinas de DNA após 60 dias em ensaios clínicos de Novo Fármaco em Investigação (IND) para estas vacinas. Estes estudos de vacinas de DNA demonstraram que a administração intramuscular, subcutânea, intradérmica ou mediada por partículas não resultou em persistência a longo prazo do plasmídeo nos locais ectópicos. Adicionalmente, o procedimento para injetar pVAX/hSlo diretamente na bexiga cirurgicamente exposta em animais pode explicar a capacidade de detectar plasmídeo em tecido sem ser a bexiga. Em humanos, hMaxi-K será instilado diretamente na bexiga usando um cateter transuretral e o risco de distribuição de plasmídeos devido a danos ou trauma nos tecidos é obviamente marcadamente reduzida.

EXEMPLO 2: ENSAIO CLÍNICO HUMANO COM TRANSFERÊNCIA

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GÊNICA DE hMaxi-K

Desenho de Ensaio

[110] Este é um estudo multicêntrico, de Fase 1B avaliando a segurança e atividade potencial de duas doses crescentes de gene hMaxi-K administradas como uma Injeção direta na parede da bexiga em pacientes fêmeas com Síndrome da Bexiga Hiperativa Idiopática (Não Neurogênica) (OAB) e Hiperatividade do Detrusor (DO).

[111] A população do estudo é mulheres > 18 anos de idade sem potencial para engravidar (p.ex., histerectomia, ligação tubária ou pós-menopáusicas definidas como último ciclo menstruai >12 meses antes da inscrição no estudo ou FSH no soro >40 mUI/L) com bexiga hiperativa (OAB) e hiperatividade do detrusor que estão de outro modo de boa saúde.

[112] Os critérios de inclusão incluem sintomas clínicos de bexiga hiperativa com duração > 6 meses incluindo pelo menos um dos seguintes:

1. Micção frequente (> 8/24 hrs)

2. Sintomas de urgência urinária (a queixa de desejo compulsivo repentino de urinar, que é difícil de diferir) ou noctúria (a queixa de acordar à noite duas ou mais vezes para mictar)

3. Incontinência urinária de urgência (média de 5 por semana - A incontinência urinária de urgência é definida como: a queixa de vazamento involuntário acompanhada por ou imediatamente precedida por urgência)

[113] Os participantes tiveram também um

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62/99 rastreamento de bexiga no rastreamento demonstrando um volume residual de < 200 mL e hiperatividade do detrusor documentada durante teste urodinâmico da linha de base >1 contração(ões) descontrolada(s) do detrusor de pelo menos 5 cm/LUO.

[114] A Tabela 6 mostra uma visão global do programa de tratamento e procedimentos por visita.

[115] O objetivo principal deste estudo é avaliar a ocorrência de eventos adversos e sua relação com um único tratamento de aproximadamente 20 a 30 injeções intramusculares de hMaxi-K na parede da bexiga em comparação com placebo (PBSsacarose a 20%). Este foi um ensaio de dose sequencial controlado por placebo desequilibrado, duplo cego. Os participantes foram mulheres saudáveis de 18 anos de idade ou mais velhas, sem potencial para engravidar, com OAB/DO moderada com duração > seis meses com pelo menos um dos seguintes: micção frequente > 8 vezes por dia, sintomas de urgência urinária ou noctúria (a queixa de acordar à noite duas ou mais vezes para mictar), incontinência urinária de urgência (cinco ou mais episódios de incontinência por semana) e hiperatividade do detrusor com >1 contração(ões) fásica(s) descontrolada (s) de pelo menos 5 cm/IRO de pressão documentado em CMG. Todos os participantes falharam tratamento prévio com anticolinérgicos. Quatro falharam em uma terapia com toxina A do botulismo.

[116] Os participantes foram aleatoriamente atribuídos a hMaxi-K a uma de duas doses (16.000 pg ou 24,000 pg) ou placebo. O tratamento foi administrado como 20-30 injeções IM na parede da bexiga durante citoscopia. Os participantes foram vistos 8 vezes no espaço de um período de 24 semanas com um

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63/99 acompanhamento de estudo de 18 meses. Todos os eventos adversos relatados ocorrendo após dosagem de fármaco do estudo foram registrados. CMGs complexos foram feitos na visita de rastreamento IA (semana -1) e na semana 4 (visita 5) e semana 24 (visita 8) pós-injeção. 0 volume residual pós-micção (PVR) foi medido em todas as visitas com um Bladderscan®.

[117] Os dados para avaliar a eficácia foram avaliados usando estatísticas descritivas resumidas por grupo de tratamento (placebo combinado vs. 2 grupos de tratamento ativo e placebo combinado vs. grupos de tratamento combinado). Modelos lineares de efeito misto foram usados para estimar a diferença de mudanças a partir da linha de base entre placebo e tratamento ativo e para testar se existiu resposta à dose para diferentes resultados. Modelos de equações de estimativa generalizada (GEE) foram para ser usados para estimar efeitos para os pontos finais binários.

[118] Existiram 6 participantes que receberam 16000 pg, 3 participantes que receberam 24000 pg e 4 participantes que receberam placebo. Em ambos os grupos de tratamento ativo, a maioria dos eventos adversos (AEs) teve gravidade ligeira e todos foram considerados não relacionados com o fármaco do estudo. Duas mulheres tiveram UTIs não relacionadas ligeiras pós-tratamento com hMaxi-K: uma recebendo 24000 pg no mês após dosagem e a outro recebendo 16000 pg aos 6 meses após dosagem. Existiu um AE grave não relacionado relatado no grupo de 16000 pg; exacerbação de asma pré-existente devido ao tempo frio que requereu uma visita à ER e foi resolvida após ter sido dado tratamento da asma. Nenhum sujeito foi

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64/99 descontinuado devido a um AE e todos os participantes inscritos completaram o ensaio de 6 meses. Adicionaimente, durante o acompanhamento de segurança pós-estudo a longo prazo de 18 meses, nenhuns problemas foram relatados nos sujeitos seguidos até à data (9 de 13 completaram acompanhamentos de 18 meses; 13 de 13 completaram os acompanhamentos de 12 meses).

[119] A média dos dados diários coletados durante 7 dias antes de cada visita revelou melhorias estatisticamente significativas (p<0,05) vs. placebo e linha de base com redução durável no número médio de micções por dia e número médio de episódios de urgência por dia ao longo dos 6 meses do ensaio. As mudanças exibidas nas tabelas 7 e 8 em baixo são mudanças médias (+/- SE) a partir da linha de base em comparação com placebo.

[120] Os parâmetros de Qualidade de vida (Questionário King Health) mostraram mudanças médias sustentadas estatisticamente significativas para os tratamentos ativos individuais e para os grupos de tratamento ativo combinados (todas as doses) vs. placebo e vs. linha de base nos domínios de Impacto na Vida, Limitações de Papéis, Limitações Fisicas, Limitações Sociais e Energia do Sono.

[121] Os resultados deste estudo clinico de fase IB mostraram que uma redução significativa do número de episódios de micção e urgência após uma única administração de hMaxi-K durou durante a duração de 6 meses do ensaio. Esses resultados foram observados na ausência de uma mudança em PVR e eventos adversos graves relacionados com o tratamento. Os resultados deste novo ensaio clinico mostram pela primeira vez que uma única administração intradetrusoral do gene Maxi-K humano era segura.

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[122] Apesar da pequena população inscrita, as descobertas globais dos diários dos participantes mostraram reduções significativas (p<0,05) para o número médio de micções e número médio de episódios de urgência vs. placebo e vs. linha de base para todos os tratamentos ativos e de episódios de incontinência de urgência vs. linha de base para todas as doses do fármaco do estudo. A resposta dos participantes ao tratamento mostrou alguns valores p positivos para todas as doses ativas vs. placebo nas Visitas 3 e 5 (ver Tabela 9). Para a redução no número de micções e episódios de urgência, estas mudanças significativas vs. placebo e vs. linha de base foram vistas em todas as visitas até à Visita 8 final (24 semanas) . Não existiram diferenças significativas vistas entre os 2 tratamentos ativos (16000 pg e 24000 pg) possivelmente devido ao pequeno número de participantes inscritos no grupo de 24000 pg (N = 3) .

[123] Os parâmetros de Qualidade de vida (Questionário King Health) mostraram melhoria média estatisticamente significativa para os tratamentos ativos individuais e para os grupos de tratamento ativo combinados (todas as doses) vs. placebo e vs. linha de base em muitos dos domínios. Isto incluiu o seguinte:

□ Domínio 2: Impacto na Vida □ P = 0,014 para todas doses ativas e p = 0,007 para 24000 pg na Visita 5 vs. linha de base, □ P = 0,016 para 24000 pg na Visita 5 vs. placebo;

□ P = 0,016 para o grupo com 24000 pg vs. grupo com

16000 pg na Visita 5 □ P = 0,043 para todas as doses ativas vs. linha de

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66/99 base na Visita 6 □ P = 0,010 para 16000 pg e p = 0, 005 todas as doses ativas vs. linha de base na Visita 7 □ P = 0,026 para todas as doses ativas vs. linha de base na Visita 8 □ Domínio 3: Limitações de Papéis □ P = 0,004, P = 0,015, P < 0,001 para 16000 pg, 24000 pg e todas as doses ativas, respectívamente, vs. linha de base na Visita 5 □ P = 0,030, P = 0,035 e P = 0,015 para 16000 pg, 24000 pg e todas as doses ativas, respectívamente, vs. placebo na Visita 5 □ P = 0,023, P = 0,014 e P = 0,001 para 16000 pg, 24000 pg e todas as doses ativas, respectívamente, vs. linha de base na Visita 6 □ P = 0,047, P = 0,020 e P = 0,014 para 16000 pg, 24000 pg e todas as doses ativas, respectívamente, vs. placebo na Visita 6 □ P = 0,012, P = 0,014 e P < 0,001 para 16000 pg, 24000 pg e todas as doses ativas, respectívamente, vs. placebo na Visita 7 □ P = 0,032 e P = 0,021 para 24000 pg e todas as doses ativas, respectívamente, vs. placebo na Visita 7 □ P = 0,014 e P = 0,005 para 24000 pg e todas as doses ativas, respectívamente, vs. linha de base na Visita 8 □ P = 0,047. P = 0,007 e P = 0,007 para 16000 pg, 24000 pg e todas as doses ativas, respectívamente, vs. placebo na Visita 8

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67/99 □ Domínio 4: Limitações Físicas □ P = 0,018 e P = 0,005 para 24000 pg e todas as doses ativas, respectivamente, vs. linha de base na Visita 6 □ P = 0,012, P = 0,018 e P = 0,001 para 16000 pg, 24000 pg e todas as doses ativas, respectivamente, vs. linha de base na Visita 7 □ P = 0,012, P = 0,047 e P = 0,003 para 16000 pg, 24000 pg e todas as doses ativas, respectivamente, vs. linha de base na Visita 8 □ Domínio 5: Limitações Sociais □ P = 0,032 e P = 0,22 para 24000 pg vs. linha de base e placebo, respectivamente, na Visita 6 □ P = 0,002 e P = 0,004 para 24000 pg e todas as doses ativas, respectivamente, vs. linha de base na Visita 7 □ P = 0,008 e P = 0,043 para 24000 pg e todas as doses ativas, respectivamente, vs. placebo na Visita 7 □ P = 0,002 e P = 0,014 para 24000 pg e todas as doses ativas, respectivamente, vs. linha de base na Visita 8 □ P = 0,006 para 24000 pg vs. placebo na Visita 8 □ Domínio 8: Energia do Sono □ P = 0,047. P = 0,007 e P = 0,001 para 16000 pg, 24000 pg e todas as doses ativas, respectivamente, vs. linha de base na Visita 5 □ P = 0,020 e P = 0,015 para 24000 pg e todas as doses ativas, respectivamente, vs. placebo na Visita 5 □ P = 0,005 e P = 0,006 para 24000 pg e todas as doses ativas, respectivamente, vs. linha de base na Visita 6 □ P = 0,001 e P = 0,006 para 24000 pg e todas as

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68/99 doses ativas, respectivamente, vs. linha de base na Visita 7 □ P = 0,012 para 24000 pg vs. placebo na Visita 7

[124] 0 Teste de Penso de 72 horas (Tabela 12) mostrou algumas mudanças estatisticamente significativas nas Visitas 3-6 e Visita 8 para doses ativas de hMaxi-K vs. linha de base, no entanto, existiram também mudanças estatisticamente significativas para placebo nas Visitas 3-5 e Visita 8. Globalmente, o grupo com placebo pareceu ter doença menos grave do que os grupos de tratamento ativo com pesos de penso na linha de base (V2) para tratamento ativo sendo quase 2 vezes maiores do que aquele do grupo com placebo. Adicionalmente, o peso médio de penso em VIA para placebo foi somente 29 gramas ao passo o peso em V2 para este grupo foi 259 gramas (quase 9 vezes maior do que VIA). Isto foi devido ao fato de que a participante 002001 ter jogado fora seus pensos antes de VIA (logo, ela não foi incluída nas médias de VIA) e ela parece ter tido doença mais grave do que os outros 3 participantes com placebo (o seu peso médio durante 3 dias de penso em V2 foi 295 gramas vs. 3,3 a 36 gramas para os outros 3 participantes).

Tabela 1. Sumário de efeitos de tratamento em parâmetros de micção médios em ratos fêmeas obstruídos durante 6 semanas e controles com simulação da operação

T mg)

P

HP

P

C

V

V

IP IP- BP)

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69/99

ontrole desobst ruí-do (n = 17)	71 5, 0	3,9 , 99	2,3 ,1	2, 6 , 09	,2 ,1	,13 ,10	, 13+ ,04	,49 ,79
Obstruí do: inj etad	547, 6	128,9	36, 3	22,1	3,44	3,22	'**0,3	*5, 59
o com pVAX/hS lo (n = 12)	5,4	6,1	, 30	3,9	,41	,39	,10	, 05
Obstruí do: não tratado	473, 1	132,7	39, 3	18,8	2,91	2,94	, 09	,37
(n = 10)	6, 6	7,9	r 6	,9	, 62	, 65	, 05	,79
	a 1	00 pg c	le pVAX/hSlo e	sm 2 00	pL de	PBS-sacarose a

20% ^b 3 destes ratos receberam 1000 pg de pcDNA em PBSsacarose a 20%. Controle: Animais de controle com correspondência de idade desobstruídos, com simulação da operação, WT: peso da bexiga (mg), MP: pressão de micção (cm de H2O) , THP: pressão limiar (cm de H2O) , BP: pressão basal (cm de H2O) , BC: capacidade da bexiga (mL), MV: volume de micção (mL), RV: volume residual

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70/99 (mL) , MIP: pressão intermicções média ((cm de H2O; a pressão média ao longo do intervalo intermicções inteiro menos a pressão basal no mesmo animal).

* Significativamente diferente de simulação da operação; p<0,05.

* * Significativamente diferente de controle (obstruído mas não tratado); p<0,05, ANOVA de Uma Via, com comparações par a par post-hoc de Newman Keuls.

Tabela 2. Sumário de efeitos de tratamento em parâmetros de micção médios em ratos machos obstruídos durante 2 semanas e controles com simulação da operação.

	cap	V	V	P	P	P	MP	A	com	W
VAX n = 8)h	,36 ± 0,48	,84 ±0,3 1	,53 ± 0,21	8,65 + 5, 38	7,21 + 8, 61c	1,28 + 18,52 c	2,49 + 7,5C	3, 84 + 2,57c	,12 ± 0, 04	48,3 + 105, 3
Slo n = 16)h	,48 ± 0,30 c	,22 ± 0,26c	,27 ±0, 1 2	, 66 + 1,35d	7,26 + 3,7d	4,05 + 6,28d	8,13 + 2,8d	0, 47 + 1, 89c	,17 ± 0, 03	52,3 + 42,99
imulação	,35 ± 0, 14	,32 ± 0, 12	, 03 ±0, 0 2	0, 6 ±0, 81	8,47 + 0,79	6, 58 + 3,34	3, 96 + 1,09	,39 ± 0, 61	, 18 ± 0, 01 8	74,4 + 24,5

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71/99

	cap	V	V	P	P	P	MP	A	com	W
n = 10) 3

Bcap, capacidade da bexiga (mL); MV, volume de micção (mL) ; RV, volume residual (mL); BP, pressão basal (cm de H2O); TP, pressão limiar (cm de H2O) ; MP, pressão de micção (cm de H2O) ; IMP, pressão intermicções média (cm de H2O; a pressão média ao longo do intervalo intermicções inteiro menos a pressão basal no mesmo animal); SA, atividade espontânea (cm de H2O); Bcom, adesão da bexiga (mL/cm de H2O) ; BW, peso da bexiga (mg) .

^a 5 destes animais são controles simulados de 2 semanas, os outros 5 são 1 mês mais velho (ou controles simulados de 6 semanas). No entanto, a análise estatística revelou que não existiram diferenças significativas em qualquer um dos parâmetros de micção e, assim, estas 2 populações foram consideradas como sendo homogêneas para os propósitos desta análise.

^h Foram dados a todos os ratos 1000 pg de pVAX sozinho ou 100 pg de hSlo/pVAX em 1 mL de PBS com sacarose a 20%. Todos os dados representam a média ± S.E.M. e foram analisados usando uma analise da variância de uma via, com um teste de Tukey post-hoc para todas as comparações par a par (múltiplas) .

^c Diferença significativa a partir do valor de controle simulado correspondente.

^d Diferença significativa a partir do valor de pVAX correspondente.

Tabela 3. Sumário de efeitos de tratamento em

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72/99 parâmetros de micção médios em ratos fêmeas obstruídos durante 2 semanas

	MP	TP	BP	BC	MV	RV	MIP (IPBP)	MF	SA	BCOM
Contro le: pVAX (n = 10)	68,1 + 8,1	34,2 + 4,9	9,1 + 1,9	2,3+ 0,3	2,2+ 0,3	1,1± 0, 0	24,0+ 4, 6	4, 6+ 0,5	14,9+ 3,4	0,1 + 0 , 02
Obstruído inj eta do com 10 pg de pVAX/h Slo (n = 7)	65,3 ± 10,5	30,3 + 3, 6	7,2 + 1,0	2,5 + 0, 3	2,4 + 0, 3	0,2 + 0,1	20,0 + 3, 5	4,4 + 0, 5	12,8 + 3, 0	0,1 + 0, 02
Obstruído inj eta do com 30 pg de pVAX/h Slo (n = 9)	81,1 + 7,3	36, 6 + 4,4	11,8 + 2, 6	3,2 + 1,0	2,7 + 0,4	0,4 + 0,2	27,1 + 3,5	4,3 + 0,4	15,3 + 1,5	0,1 + 0, 02
Obstruído inj eta do com 300 pg de pVAX/h Slo (n = 10)	47,8 + 3,7	17,7* * * ! ± 1,6	6,3 + 1,1	2,3 + 0,4	2,2 + 0, 3	0,3 + 0,2	10,3* * * , ± 1,2	5,3 + 0, 6	4,1*, * * ± 0,4	0,2*, ** ± 0, 02

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•Obstruído inj eta do com 1000 pg de pVAX/h Slo (n = 12)

57,2 ± 6,2

21,4* * * ± 1,8

5,7 ± 1,1

2,1 ± 0,1

2,0 ± 0,1

0,1 ± 0, 04

11, 6* * * ± 1,3

5,2 ± 0,3

5,9*, * * ± 0,5

0,1*, ** ± 0, 01

^a 10, 30, 300, 1000 pg de pVAX/hSlo em 200 pL de

PBS-sacarose a 20% ^b Controle: Animais de controle com correspondência de idade obstruídos que receberam lOOOpg de pVAX somente, WT: peso da bexiga (mg), MP: pressão de micção (cm de Η₂Ο) ,

TP: pressão limiar (cm de H2O), BP: pressão basal (cm de H2O) , BC: capacidade da bexiga (mL) , MV: volume de micção (mL) , RV: volume residual (mL),

MIP: pressão intermicções média (cm de H2O; a pressão média ao longo do intervalo intermicções inteiro menos a pressão basal no mesmo animal);

SA atividade espontânea (MIP-BP); BCOM Adesão da bexiga (capacidade da bexiga/TP-BP) * Significativamente diferente de controle; p<0,05. Todos os procedimentos de comparação múltipla par a par (método de Holm-Sidak)

Significativamente diferente de controle; p<0,05, ANOVA de Uma Via.

Tabela 4. Protocolo de Injeção Intravesicular em Coelhos

N = 12

Mistura 50-50 de p-

locais/

locais/

locais/

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74/99

coelhos	VAXhslo (mL)	coelho	coelho	coelho
	0, 05	4	8	10
	0,1	4	8	10
	0, 15	4	8	10

Tabela 5. Dose Final-hMaxi-k

Dose de hMaxi-K	16.000 pg PBS-sacarose a 20%	24.000 pg PBS-sacarose a 20%
Volume	4 mL	6 mL
Número de Frascos	2	3
Volume Final	4 mL	6 mL
Número de injeções IM	20 injeções de 0,2 mL em locais especificados na parede da bexiga com intervalo de aprox. 1 cm (Figura 5)	30 injeções de 0,2 mL em locais especificados na parede da bexiga com intervalo de aprox. 1 cm (Figura 5)

Nota: Em cada coorte de dose, 6 participantes receberão hMaxi-K e 3 receberão PBS-sacarose a 20% (placebo).

Tabela 6. Resumo de Testes por Visita Laboratorial

Fase	Fase de Rastreamento	Visitas de Acompanhamento Pós-Tratamento
Visita/ Periodo	Visita 1	Visita lAn	Visita 2	Acompanhamento pelo Telefonei	Visit a 3	Visita 4	Visita 5	Visita 6	Visita 7	Visita 8
Dias	-14	-14 a -8	0 (Linha de base)	Dias 1 & 3	8	15	29	57	85	169 (Final)
Semana	-2		0	0	1	2	4	8	12	24
Janela da Visita (dias)		+2	+2	Dia 3 ± 1	+2	+2	±2	±3	±5	±5

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Consentimento Informado Assinado	▲
Avaliação de Critérios de Inclusão/Exclusão	▲	▲	Af
Demografia e Historiai Médico/ Cirúrgico	À
Exame Fisico	▲		▲ f		▲	▲	▲	▲	▲	▲
ECG	▲		▲ a		▲		▲			▲
Avaliação de Medicação Prévia/ Simultânea	▲	▲	▲ f		▲	▲	▲	▲	▲	▲
Sinais Vitais h	▲		▲ V 1		▲	▲	▲	▲	▲	▲
Avaliação Obj etiva de OAB /DO (Cistometria)		Àd					A			Á

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b
Rastreamento da bexiga c	À					À		À		À
Diário de Micção Diária Efetuada /Que s tionário sobre urgência 1	▲	▲	▲ f		▲	▲	▲	▲	▲
Teste de Penso m		▲	▲		▲	▲	▲	▲	▲	▲
QoL (Questionário King's Health) e SF-12			▲ f				▲	▲	▲	▲
Avaliação Subj etiva do Estado de Doença k			▲ f		▲	▲	▲	▲	▲	▲
Avaliação Subj etiva da Resposta ao					▲	▲	▲	▲	▲	▲

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11/99

Tratamento k
ICIQ-SF			▲ f				▲	▲	▲	▲
Urinálise e Culturas de Urina d	▲	▲	▲ f	▲	▲	▲	▲		▲	▲
Testes Laboratoriais de Hematologia e	▲		▲	Á	Á	Á	Á		Á	Á
Testes Laboratoriais de Química e	▲		▲	▲	▲	▲	▲		▲	▲
Avaliação Farmacocinética (cDNA de hSlo na urina e sangue)			Á f, g		Á	Á	Á	Á	Á	Á 9
Avaliação de Eventos Adversos		▲	▲ f	▲ 3	▲	▲	▲	▲	▲	▲

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Fármaco do Estudo administrado

▲

^a o ECG será feito antes da administração de fármaco do estudo e às 2 horas pós-dosagem.

^b A cistometria inclui: volume no primeiro desejo de mictar, pressão do detrusor, pressão abdominal, pressão do detrusor no início da micção, pressão do detrusor no fluxo máximo pressão máxima do detrusor, volume com forte urgência de mictar, caudal de pico durante a micção, volume mictado, volume em DO, volume residual pós-micção, volume total da bexiga (volume mictado + volume residual), número de contrações do detrusor durante o procedimento e duração de DO.

^c Os critérios de inclusão especificam volume residual <200 mL. Rastreamentos da bexiga em VI e V8 a serem feitos antes da cateterização.

^d Urinálise com RBC e WBC microscópicos, proteína, glucose, nitritos, pH e gravidade específica em VI, 3-5 e V7 e V8. Em VIA e V2 será feita urinálise por Dipstick. Culturas de urina em VI (por cateterização com o cateter urodinâmico) , V3 (micção limpa) ; em VIA, V2, V5 e V8 antes da cistometria ou cistoscopia (por cateterização com o cateter urodinâmico) e antes da descarga por micção vazia (em V2 usar primeira urina mictada após administração do fármaco). A urinálise da Visita 2 por Dipstick será feita antes da dosagem e a cultura de urina será realizada tanto antes da administração do fármaco do estudo como

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79/99 antes da alta.

^e Os testes laboratoriais a serem feitos em VI, V2 - 5, V7 e V8 incluem: Hematologia- CBC com diferencial, contagem de plaquetas, taxa de sedimentação, PTT, PT (sem PT e PTT em V2 e V4), CRP, Anticorpo antinuclear; Química- BUN, creatinina, Na⁺, K⁺, Mg⁺⁺, Ca⁺⁺, CO2, Cl~, albumina, fosfatase alcalina, ALT, AST, GGT, bilirrubina total, proteína total, CPK, LDH, glucose; Teste de Gravidez no Soros para beta-HCG requerido para mulheres em idade fértil que não tiveram histerectomia em VI de Rastreamento e conforme a necessidade. Adicionalmente, FSH> 40 IU/L se último ciclo menstruai não > 12 meses antes da inscrição no estudo. HbAlc será feito somente na Visita de rastreamento 1. Nenhumas químicas serão feitas em 2 (Semana 0) . Em V4, as químicas incluirão somente BUN, creatinina, eletrólitos (Na⁺, K⁺) , CRP, glucose e ANA. Nenhuns testes laboratoriais serão feitos na Visita IA ou V6. Os testes laboratoriais devem ser realizados no mesmo momento do dia em todas as visitas do estudo.

^f O teste ou procedimento será feito antes da administração do fármaco do estudo na Visita 2

Pré-dosagem em V2. Se a amostra for ainda positiva na semana 24, o participante tem de regressar mensalmente até que duas amostras sucessivas sejam negativas quanto ao DNA de hSlo.

^h Os sinais vitais incluirão altura somente em VI; peso em VI e V8; temperatura corporal oral em todas as visitas (exceto VIA). O mesmo braço deve ser usado para todas as medições de BP e especificado.

¹ Os diários são para serem completados antes de

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VIA (para testar os critérios de adesão e inclusão), durante 7 dias antes da Visita 2 e 7 dias antes de cada visita, subsequentemente.

Os participantes serão contactados por telefone nos Dias de Estudo 1 e 3 (1 dia e 3 dias ± 1, após administração do fármaco na Visita 2) para avaliação de eventos adversos.

^k As avaliações subjetivas são baseadas nas

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	hMaxi-K
Visita		Placebo	16000 ug	24000 ug	Todas as Doses
Visita IA (Rastreamento)	n	4	6	3	9
No. médio de micções (SD)	10,46 (3,48)	11,99 (3,65)	17,39 (5,22)	13,79 (4,73)
Visita 2 (Linha de base)	n	4	6	3	9
No. médio de micções (SD)	10,18 (4,78)	11,26 (2,70)	17,19 (7,07)	13,24 (5,08)
Visita 3 (Semana 1)	n	4	6	3	9
No. médio de micções (SD)	11,59 (4,98)	9,10 (2,12)	14,46 (3,74)	10,89 (3,67)
Mudança média a partir da linha de base (SD)	1,41 (0,78)	-2,16 (1,80)	-2,73 (7,29)	-2,35 (3,92)
SEM	0,39	0,73	4,21	1,31
Valor p [1]	0,251	0, 052	0, 074	0, 018
Valor p [2]		0, 044	0, 047	0, 027
Diferença de Médias de LS vs. placebo		-3,57	-4,14	-3,86
Cl de 95%		-7,01, 0,13	-8,22, - 0, 07	-7,12, 0,59
Visita 4 (Semana 2)	n	4	6	3	9
No. médio de micções (SD)	10, 68 (4,10)	8,35 (2,65)	13,52 (1,94)	10,07 (3,47)
Mudança média a partir da linha de base (SD)	0,51 (1,22)	-2,92 (2,04)	-3,67 (6,48)	-3,17 (3,64)
SEM	0, 61	0, 83	3,74	1,21
Valor p [1]	0, 667	0, 016	0, 026	0, 004
Valor p [2]		0, 051	0, 046	0, 029
Diferença de Médias de LS vs. placebo		-3,42	-4,17	-3,80

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	Cl de 95%		-6,87, 0, 02	-8,25, 0,10	-7,06, - 0, 53
Visita 5 (Semana 4)	n	4	6	3	9
No. médio de micções (SD)	11,40 (4,42)	8,87 (2,25)	13,48 (1,08)	10,40 (2,96)
Mudança média a partir da linha de base (SD)	1,22 (0,69)	-2,40 (2,11)	-3,71 (7,27)	-2,84 (4,05)
SEM	0,35	0, 86	4,20	1,35
Valor p [1]	0,315	0, 035	0, 025	0, 006
Valor p [2]		0, 042	0, 024	0, 017
Diferença de Médias de LS vs. placebo		-3, 62	-4,93	-4,28
Cl de 95%		-7,06, 0,17	-9,01, - 0, 86	-7,54, - 1, 01
Visita 6 (Semana 8)	n	4	6	3	9
No. médio de micções (SD)	10, 17 (3,89)	9,48 (2,73)	13,52 (2,19)	10, 83 (3,15)
Mudança média a partir da linha de base (SD)	-0, 01 (1,20)	-1,79 (2,15)	-3, 67 (7,75)	-2,41 (4,33)
SEM	0, 60	0, 88	4,47	1,44
Valor p [1]	0,996	0, 094	0, 026	0, 011
Valor p [2]		0,261	0, 071	0, 090
Diferença de Médias de LS vs. placebo		-1,78	-3, 66	-2,72

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	Cl de 95%		-5,22, 1, 66	-7,74, 0,41	-5,99, 0,55
Visita 7 (Semana 12)	n	4	6	3	9
No. médio de micções (SD)	10, 96 (4,30)	10,21 (4,11)	12,90 (2,35)	11,11 (3,71)
	Mudança média a partir da linha de base (SD)	0,79 (1,67)	-1,05 (2,90)	-4,29 (6,97)	-2,13 (4,47)
SEM	0, 84	1,18	4,02	1,49
Valor p [1]	0,509	0,293	0, 013	0, 012
Valor p [2]		0,248	0, 022	0, 041
Diferença de Médias de LS vs. placebo		-1,83	-5, 07	-3,45
Cl de 95%		-5,28, 1, 61	-9,15, - 1, 00	-6,72, - 0, 19
Visita 8 (Visita de Salda - Semana 24)	n	4	6	3	9
No. médio de micções (SD)	11,14 (4,81)	9, 74 (3,04)	13,86 (3,02)	11,11 (3,51)
Mudança média a partir da linha de base (SD)	0, 96 (0,99)	-1,52 (2,55)	-3,33 (7,06)	-2,13 (4,16)
SEM	0,50	1,04	4,08	1,39
Valor p [1]	0,421	0, 142	0, 038	0, 019
Valor p [2]		0, 131	0, 041	0, 044
Diferença de Médias de LS vs. placebo		-2,49	-4,30	-3,39

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GI de 95%

-5,93, 0, 96

-8,37, 0,22

-6,66, - 0, 13

seguintes questões no Apêndice C: Quão incômodo você considera seu problema de bexiga? e 0 tratamento foi benéfico para você?

¹ A BP será tomada a cada 15 minutos durante 2 horas pós-administração do fármaco do estudo.

^m Os participantes trarão pensos/fraldas usados durante 3 dias antes das Visitas 1A & 2 (se VIA após VI de rastreamento) e 3 dias antes de todas as visitas subsequentes (Visita 3 a Visita 8); trazer também penso/fraldas limpos para usar como linha de base.

ⁿ A visita IA pode ocorrer no mesmo dia que VI. Em este caso, todos os procedimentos de VIA ainda não feitos em VI devem ser completados. A cistoscopia deve ser realizada após todos os outros procedimentos em VI e a cultura de urina póscistoscopia obtida usando micção limpa. Se VIA coincidir com VI, então, como a coleta de pensos e os diários não terão sido completados antes de VI, estes terão de ser checados quanto à adesão em V2.

° o ECG será feito antes da administração de estudo Tabela 7: Número Médio de Micções/24 Horas e Redução Ao Longo do Tempo - População de Eficácia

[1] : valor p para testar se existe uma diferença estatisticamente significativa entre valores medidos em certo ponto temporal vs. medição na linha de base para certo tratamento

[2]: valor p para testar se existe uma diferença estatisticamente significativa entre mudanças a partir da linha

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	hMaxi-K
Visita		Placebo	16000 ug	24000 ug	Todas as Doses
Visita IA (Rastreamento)	n	4	6	3	9
No. médio de episódios de urgência (SD)	10, 04 (3, 80)	11,12 (4,08)	17,27 (5,33)	13,17 (5,19)
Visita 2 (Linha de base)	n	4	6	3	9
No. médio de episódios de urgência (SD)	9,82 (5,17)	10,21 (3,55)	17,19 (7,07)	12,53 (5,71)
Visita 3 (Semana 1)	n	4	6	3	9
No. médio de episódios de urgência (SD)	11,27 (5,25)	7,89 (3,11)	14,46 (3,74)	10,08 (4,51)
Mudança média a partir da linha de base (SD)	1, 45 (0,83)	-2,31 (2,17)	-2,73 (7,29)	-2,45 (4,03)
SEM	0,42	0, 88	4,21	1,34
Valor p [1]	0,240	0, 040	0, 074	0, 016
Valor p [2]		0, 036	0, 046	0, 024
Diferença de Médias de LS vs. placebo		-3,76	-4,18	-3, 97
Cl de 95%		-7,20, 0,32	-8,25, -0,11	-7,23, -0,71
Visita 4 (Semana 2)	n	4	6	3	9
No. médio de episódios de urgência (SD)	10,22 (4,49)	7,17 (3,35)	13,52 (1,94)	9,29 (4,25)
Mudança média a partir da linha de base (SD)	0, 40 (1,03)	-3, 04 (2,07)	-3, 67 (6, 48)	-3,25 (3, 64)
SEM	0,51	0, 85	3,74	1,21
Valor p [1]	0,734	0, 013	0, 026	0, 004
Valor p [2]		0, 050	0, 050	0, 030
Diferença de Médias de LS vs. placebo		-3,43	-4,07	-3,75

Petição 870200001942, de 06/01/2020, pág. 88/114

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	Cl de 95%		-6,87, 0,01	-8,14, 0,00	-7,01, -0,49
Visita 5 (Semana 4)	n	4	6	3	9
No. médio de episódios de urgência (SD)	11,04 (4,75)	7,87 (3, 92)	13,48 (1,08)	9, 74 (4,22)
Mudança média a partir da linha de base (SD)	1,22 (0, 69)	-2,34 (2,07)	-3,71 (7,27)	-2,80 (4,04)
SEM	0,35	0, 84	4,20	1,35
Valor p [1]	0,315	0, 038	0, 025	0, 007
Valor p [2]		0, 044	0, 024	0, 018
Diferença de Médias de LS vs. placebo		-3,56	-4,93	-4,25
Cl de 95%		-7,00, 0,12	-9,00, -0,86	-7,51, -0,98
Visita 6 (Semana 8)	n	4	6	3	9
No. médio de episódios de urgência (SD)	9, 60 (4,45)	8,32 (4,40)	13,52 (2,19)	10, 05 (4,48)
Mudança média a partir da linha de base (SD)	-0,22 (0, 89)	-1,89 (2,07)	-3, 67 (7,75)	-2,48 (4,30)
SEM	0,45	0, 85	4,47	1,43
Valor p [1]	0, 851	0, 079	0, 026	0, 010
Valor p [2]		0,289	0, 085	0, 106
Diferença de Médias de LS vs. placebo		-1, 67	-3, 45	-2,56
Cl de 95%		-5,11, 1,77	-7,52, 0,62	-5,82, 0,71
Visita 7 (Semana 12)	n	4	6	3	9
No. médio de episódios de urgência (SD)	10, 86 (4,35)	10, 00 (4,31)	12,86 (2,38)	10, 95 (3, 88)
Mudança média a partir da linha de base (SD)	1,04 (2,15)	-0,21 (2,41)	-4,33 (7,05)	-1,58 (4,51)

Petição 870200001942, de 06/01/2020, pág. 89/114

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	SEM	1,07	0, 99	4,07	1,50
Valor p [1]	0,389	0, 829	0, 013	0, 025
Valor p [2]		0,421	0, 017	0, 048
Diferença de Médias de LS vs. placebo		-1,24	-5, 37	-3,31
Cl de 95%		-4,68, 2,20	-9,44, -1,30	-6,57, -0,04
Visita 8 (Visita de Saida) (Semana 24)	n	4	6	3	9
No. médio de episódios de urgência (SD)	10, 89 (4,99)	9, 29 (3,53)	13, 86 (3, 02)	10,81 (3,91)
Mudança média a partir da linha de base (SD)	1,07 (1,18)	-0, 92 (2,27)	-3,33 (7, 06)	-1,72 (4,14)
SEM	0,59	0, 92	4,08	1,38
Valor p [1]	0,373	0,350	0, 037	0, 032
Valor p [2]		0,213	0, 038	0, 054
Diferença de Médias de LS vs. placebo		-1,99	-4,40	-3,20
Cl de 95%		-5,43, 1,45	-8,47, -0,33	-6,46, 0,06

de base comparando com placebo.

[125] Todos os valores p e estimativas são derivados de um modelo de efeito misto linear com número de micções como variáveis dependentes, tratamentos (placebo, 16000 ug, 24000 ug e hMaxi-K total), ponto temporal e interação de tempo e tratamento. Todas as doses = todas as doses de hMaxi-K

SD = desvio padrão; SEM = erro padrão da média

Tabela 8: Número Médio de Episódios de Urgência/24

Horas e Redução Ao Longo do Tempo - População de Eficácia

Petição 870200001942, de 06/01/2020, pág. 90/114

	hMaxi-K
Visita		Placebo fifi /	16000 ug	24000 ug	Todas as Doses
Visita IA (Rastreamento)	n	4	6	3	9
No. médio de episódios de incontinência de urgência/24 hrs (SD)	1,88 (1,25)	2,08 (0,57)	8,69 (12,02)	4,29 (6,87)
Visita 2 (Linha de base)	n	4	6	3	9
No. médio de episódios de incontinência de urgência/24 hrs (SD)	1,82 (1,52)	1,91 (0,83)	3,81 (3,30)	2,54 (2,01)
Visita 3 (Semana 1)	n	4	6	3	9
No. médio de episódios de incontinência de urgência/24 hrs (SD)	1,43 (1,32)	1,29 (1,08)	2,74 (0,25)	1,77 (1,13)
Mudança média a partir da linha de base (SD)	-0,39 (0,22)	-0,63 (0,74)	-1,07 (3,15)	-0,78 (1,69)
SEM	0, 11	0, 30	1, 82	0,56
Valor p [1]	0,460	0,164	0, 103	0, 045
Valor p [2]		0,718	0, 395	0,470
Diferença de Médias de LS vs. placebo		-0,24	-0,68	-0, 46
Cl de 95%		-1,75, 1,27	-2,47, 1,10	-1,89, 0,97
Visita 4 (Semana 2)	n	4	6	3	9
No. médio de episódios de incontinência de urgência/24 hrs (SD)	1,23 (1,27)	0,86 (1,09)	2,95 (1,35)	1,56 (1,51)
Mudança média a partir da linha de base (SD)	-0,58 (0,81)	-1,05 (1,39)	-0,86 (2,60)	-0,99 (1,70)
SEM	0, 40	0, 57	1,50	0,57
Valor p [1]	0,277	0, 035	0, 177	0, 029
Valor p [2]		0,487	0, 728	0,559
Diferença de Médias de LS vs. placebo		-0, 47	-0,27	-0, 37
Cl de 95%		-1,98, 1,04	-2,06, 1,51	-1,80, 1,06
Visita 5 (Semana 4)	n	4	6	3	9
No. médio de episódios de incontinência de urgência/24 hrs (SD)	1,14 (0,95)	0,66 (0,81)	3,10 (2,08)	1,47 (1,72)
Mudança média a partir da linha de base (SD)	-0,67 (0,98)	-1,25 (1,16)	-0,71 (1,76)	-1,07 (1,30)
SEM	0, 49	0,48	1, 01	0,43
Valor p [1]	0,216	0, 017	0,251	0, 026
Valor p [2]		0,393	0, 958	0, 623
Diferença de Médias de LS vs. placebo		-0,58	-0,04	-0,31
Cl de 95%		-2,09, 0,93	-1,83, 1,74	-1,74, 1,12
Visita 6 (Semana 8)	n	4	6	3	9
No. médio de episódios de incontinência de urgência/24 hrs (SD)	1,02 (1,15)	0,50 (0,92)	2,57 (2,13)	1,19 (1,66)
Mudança média a partir da linha de base (SD)	-0,79 (0,49)	-1,41 (1,21)	-1,24 (1,67)	-1,35 (1,27)
SEM	0,25	0,49	0, 97	0,42
Valor p [1]	0,153	0, 010	0, 067	0, 007
Valor p [2]		0,363	0,573	0, 407
Diferença de Médias de		-0,62	-0,45	-0,53

Petição 870200001942, de 06/01/2020, pág. 91/114

89/99

	LS vs. placebo
Cl de 95%		-2,13, 0,89	-2,23, 1,34	-1,97, 0,90
Visita 7 (Semana 12)	n	4	6	3	9
No. médio de episódios de incontinência de urgência/24 hrs (SD)	1,25 (1, 09)	0,64 (0,75)	3,29 (2,27)	1,52 (1,84)
Mudança média a partir da linha de base (SD)	-0,57 (0,71)	-1,27 (1,17)	-0,52 (1,57)	-1,02 (1,27)
SEM	0, 35	0,48	0, 90	0,42
Valor p [1]	0,290	0,016	0,389	0, 037
Valor p [2]		0,306	0, 958	0, 601
Diferença de Médias de LS vs. placebo		-0,70	0, 04	-0,33
Cl de 95%		-2,21, 0,81	-1,74, 1,83	-1,76, 1,10
Visita 8 (Visita de Saida) (Semana 24)	n	4	6	3	9
No. médio de episódios de incontinência de urgência/24 hrs (SD)	0,86 (0,76)	0,62 (0,84)	1,52 (1,39)	0, 92 (1, 06)
Mudança média a partir da linha de base (SD)	-0,96 (0,94)	-1,29 (1,10)	-2,29 (2,72)	-1,62 (1,69)
SEM	0, 47	0,45	1, 57	0,56
Valor p [1]	0,094	0,015	0,005	0, 001
Valor p [2]		0,616	0,122	0,212
Diferença de Médias de LS vs. placebo		-0,34	-1,33	-0, 83
Cl de 95%		-1,84, 1,17	-3,11, 0,46	-2,26, 0,60

[1]:valor p para testar se existe uma diferença estatisticamente significativa entre valores medidos em certo ponto temporal vs. medição na linha de base para certo tratamento.

[2]: valor p para testar se existe uma diferença estatisticamente significativa entre mudanças a partir da linha de base comparando com placebo.

[126] Todos os valores p e estimativas são derivados de um modelo de efeito misto linear com número de micções como variáveis dependentes, tratamentos (placebo, 16000 ug, 24000 ug e hMaxi-K total), ponto temporal e interação de tempo e tratamento.

[127] Todas as doses = todas as doses de hMaxi-K

[128] SD = desvio padrão; SEM = erro padrão da média

Petição 870200001942, de 06/01/2020, pág. 92/114

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[129] Tabela 9: Número de episódios de Incontinência de Urgência e Redução Ao Longo do Tempo - População de Eficácia

[1]: Valor p para testar se existe uma diferença estatisticamente significativa entre valores medidos em certo ponto temporal vs. medição na linha de base para certo tratamento.

[2]: Valor p para testar se existe uma diferença estatisticamente significativa entre mudanças a partir da linha de base comparando com placebo.

Todos os Valores p e estimativas são derivados de um modelo de efeito misto linear com número de micções como variáveis dependentes, tratamentos (placebo, 16000 ug, 24000 ug e hMaxi-K total), ponto temporal e interação de tempo e tratamento.

Todas as doses = todas as doses de hMaxi-K

SD = desvio padrão; SEM = erro padrão da média Tabela 10: Perceção dos Participantes de Resposta ao

Tratamento - População de Eficácia

	Placebo, n	hMaxi-K, n (%)
	Placebo	16000 ug	24000 ug	Todas as Doses
V3 (N = 13)	Sem beneficio	3 (75, 00)	1 (16,67)	0	1 (11,11)
Sim, algum beneficio	1 (25, 00)	1 (16,67)	3 (100,0)	4 (44,44)
Sim, muito beneficio	0	4 (66, 67)	0	4 (44,44)
Valor p		0,1429	0,1429	0,0190
V4 (N = 13)	Sem benefício	3 (75, 00)	1 (16,67)	0	1 (11,11)
Sim, algum beneficio	1 (25, 00)	1 (16,67)	2 (66, 67)	3 (33, 33)
Sim, muito	0	4 (66, 67)	1 (33, 33)	5 (55, 56)

Petição 870200001942, de 06/01/2020, pág. 93/114

91/99

	beneficio
Valor p		0,1429	0,2286	0,1202
V5 (N = 13)	Sem benefício	3 (75, 00)	1 (16,67)	0	1 (11,11)
Sim, algum benefício	1 (25, 00)	0	2 (66, 67)	2 (22,22)
Sim, muito benefício	0	5 (83, 33)	1 (33, 33)	6 (66, 67)
Valor p		0,0238	0,2286	0,0126
V6 (N = 13)	Sem benefício	3 (75, 00)	1 (16,67)	0	1 (11,11)
Sim, algum benefício	1 (25, 00)	2 (33, 33)	2 (66, 67)	4 (44,44)
Sim, muito benefício	0	3 (50, 00)	1 (33, 33)	4 (44,44)
Valor p		0,2286	0,2286	0,2727
V7 (N = 13)	Sem benefício	3 (75, 00)	2 (33, 33)	0	2 (22,22)
Sim, algum benefício	1 (25, 00)	1 (16,67)	2 (66, 67)	3 (33, 33)
Sim, muito benefício	0	3 (50, 00)	1 (33, 33)	4 (44,44)
Valor p		0,2857	0,2286	0,2727
V8 (N = 13)	Sem benefício	3 (75, 00)	2 (33, 33)	0	2 (22,22)
Sim, algum benefício	1 (25, 00)	1 (16,67)	2 (66, 67)	3 (33, 33)
Sim, muito benefício	0	3 (50, 00)	1 (33, 33)	4 (44,44)
Valor p		0,2857	0,2286	0,2727
Nota: os va)	Lores p são nominais e para teste de qui-

quadrado para ver se a perceção da resposta ao tratamento são diferentes para pacientes que receberam tratamento e aqueles que receberam placebo.

Todas as doses = todas as doses de hMaxi-K

Tabela 11: Mudança no Número Médio de Episódios de

Incontinência de Urgência por 24 Horas - População de Eficácia

	hMaxi-K
Visita		Placebo	16000 ug	24000 ug	Todas as Doses

Petição 870200001942, de 06/01/2020, pág. 94/114

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Episódios de incontinência de urgência por 24 horas
Visita IA	n	4	6	3	9
Média (SD)	1, 88 (1,25)	2,08 (0,57)	8, 69 (12,02)	4,29 (6,87)
Visita 2	n	4	6	3	9
Média (SD)	1, 82 (1,52)	1,91 (0,83)	3, 81 (3,30)	2,54 (2,01)
Visita 3	n	4	6	3	9
Média (SD)	1, 43 (1,32)	1,29 (1,08)	2,74 (0,25)	1, 77 (1,13)
Visita 4	n	4	6	3	9
Média (SD)	1,23 (1,27)	0, 86 (1,09)	2,95 (1,35)	1,56 (1,51)
Visita 5	n	4	6	3	9
Média (SD)	1,14 (0,95)	0, 66 (0,81)	3,10 (2,08)	1,47 (1,72)
Visita 6	n	4	6	3	9
Média (SD)	1, 02 (1,15)	0,50 (0,92)	2,57 (2,13)	1,19 (1,66)
Visita 7	n	4	6	3	9
Média (SD)	1,25 (1,09)	0, 64 (0,75)	3,29 (2,27)	1,52 (1,84)
Visita 8 (Visita de Saida)	n	4	6	3	9
Média (SD)	0, 86 (0,76)	0, 62 (0,84)	1,52 (1,39)	0, 92 (1,06)
Mudança a partir da Linha de base V2
Visita 3	n	4	6	3	9
Média (SD)	-0,39 (0,22)	-0, 63 (0,74)	-1,07 (3,15)	-0,78 (1,69)
Valor p [1]	0,460	0,164	0,103	0, 045
Valor p [2]		0,718	0,395	0,470
Diferença de Médias de LS vs. placebo		-0,24	-0, 68	-0,46

Petição 870200001942, de 06/01/2020, pág. 95/114

93/99

	Cl de 95%		-1,75, 1,27	-2,47, 1,10	-1,89, 0, 97
Valor p [3]			0,545
Diferença de Médias de LS 24000 ug vs. 16000ug			-0,44
Cl de 95%			-2,10, 1,21
Visita 4	n	4	6	3	9
Média (SD)	-0,58 (0,81)	-1,05 (1,39)	-0,86 (2,60)	-0, 99 (1,70)
Valor p [1]	0,277	0, 035	0,177	0, 029
Valor p [2]		0,487	0,728	0,559
Diferença de Médias de LS vs. placebo		-0,47	-0,27	-0,37
Cl de 95%		-1,98, 1,04	-2,06, 1,51	-1,80, 1, 06
Valor p [3]			0,789
Diferença de Médias de LS 24000 ug vs. 16000ug			0,19
Cl de 95%			-1,46, 1,85
Visita 5	n	4	6	3	9
Média (SD)	-0, 67 (0,98)	-1,25 (1,16)	-0,71 (1,76)	-1,07 (1,30)
Valor p [1]	0,216	0, 017	0,251	0, 026
Valor p [2]		0,393	0, 958	0, 623
Diferença de Médias de LS vs. placebo		-0,58	-0, 04	-0,31
Cl de 95%		-2,09, 0, 93	-1,83, 1,74	-1,74, 1,12
Valor p [3]			0,465

Petição 870200001942, de 06/01/2020, pág. 96/114

94/99

	Diferença de Médias de LS 24000 ug vs. 16000ug			0,54
Cl de 95%			-i,ii, 2,19
Visita 6	n	4	6	3	9
Média (SD)	-0,79 (0,49)	-1,41 (1,21)	-1,24 (1,67)	-1,35 (1,27)
Valor p [1]	0,153	0, 010	0, 067	0, 007
Valor p [2]		0,363	0,573	0,407
Diferença de Médias de LS vs. placebo		-0, 62	-0, 45	-0,53
Cl de 95%		-2,13, 0, 89	-2,23, 1,34	-1,97, 0, 90
Valor p [3]			0, 810
Diferença de Médias de LS 24000 ug vs. 16000ug			0,17
Cl de 95%			-1,48, 1,83
Visita 7	n	4	6	3	9
Média (SD)	-0,57 (0,71)	-1,27 (1,17)	-0,52 (1,57)	-1,02 (1,27)
Valor p [1]	0,290	0, 016	0,389	0, 037
Valor p [2]		0,306	0, 958	0, 601
Diferença de Médias de LS vs. placebo		-0,70	0, 04	-0,33
Cl de 95%		-2,21, 0, 81	-1,74, 1,83	-1,76, 1,10
Valor p [3]			0,321
Diferença de Médias de LS 24000 ug vs. 16000ug			0,75
Cl de 95%			-0,91, 2,40

Petição 870200001942, de 06/01/2020, pág. 97/114

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Visita 8 (Visita de Saida)	n	4	6	3	9
Média (SD)	-0, 96 (0,94)	-1,29 (1,10)	-2,29 (2,72)	-1, 62 (1,69)
Valor p [1]	0, 094	0, 015	0, 005	0, 001
Valor p [2]		0, 616	0,122	0,212
Diferença de Médias de LS vs. placebo		-0,34	-1,33	-0,83
Cl de 95%		-1,84, 1,17	-3,11, 0,46	-2,26, 0, 60
Valor p [3]			0,199
Diferença de Médias de LS 24000 ug vs. 16000ug			-0, 99
Cl de 95%			-2,65, 0, 66

[1]: valor p para testar se existe uma diferença estatisticamente significativa entre valores medidos em certo ponto temporal vs. medição na linha de base para certo tratamento.

[2]: valor p para testar se existe uma diferença estatisticamente significativa entre mudanças a partir da linha de base comparando com placebo.

[3] : valor p para testar se existe diferença entre grupo com 24000 ug vs. grupo com 16000 ug.

ss Todos os valores p e estimativas são derivados de um modelo de efeito misto linear com número de episódios de incontinência de urgência por 24 horas como variáveis dependentes, tratamentos (placebo, 16000 ug, 24000 ug e hMaxi-K total), ponto temporal e interação de tempo e tratamento.

Tabela 12: Mudança no Peso (gm) de Teste de Penso de 72 Horas - População de Segurança

Petição 870200001942, de 06/01/2020, pág. 98/114

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	hMaxi-K
Visita		Placebo	16000 ug	24000 ug	Todas as Doses
Rastreamento de Visita IA	n	3	6	3	9
Peso médio (SD) de teste de penso de 72 hr.	29,33 (20,03)	345,00 (726, 50)	611,67 (703, 53)	433,89 (686,58)
Linha de base de Visita 2	n	4	6	3	9
Peso médio (SD) de teste de penso de 72 hr.	259,25 (417,95)	314,00 (663,23)	677,33 (643,96)	435,11 (641,56)
Visita 3 (Semana 1)	n	4	6	3	9
Peso médio (SD) de teste de penso de 72 hr.	133,50 (206, 99)	241,67 (541,39)	518,03 (499, 37)	333,79 (514,42)
Mudança média (SD) a partir da linha de base em peso de penso	-125,75 (211,14)	-72,33 (123,08)	-159,30 (144,90)	-101,32 (128,87)
Valor p [1]	0, 044	0,127	0,024	0, 013
Valor p [2]		0,446	0,598	0, 937
Diferença de Médias de LS vs. placebo		53,42	-43,14	5,14
Cl de 95%		-102,87, 209,70	-228,08, 141,80	-143,13, 153,41
Visita 4 (Semana 2)	n	4	6	3	9
Peso médio (SD) de teste de penso de 72 hr.	119,00 (177,72)	231,83 (509,77)	528,00 (501,86)	330,56 (497,30)
Mudança média (SD) a partir da linha de base em peso de penso	-140,25 (242,66)	-82,17 (155,66)	-149,33 (142,12)	-104,56 (146, 02)

Petição 870200001942, de 06/01/2020, pág. 99/114

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	Valor p [1]	0, 029	0, 090	0,031	0, 013
Valor p [2]		0,409	0,818	0,762
Diferença de Médias de LS vs. placebo		58,08	-18,67	19,71
Cl de 95%		-98,20, 214,37	-203,61, 166,27	-128,57, 167,98
Visita 5 (Semana 4)	n	4	6	3	9
Peso médio (SD) de teste de penso de 72 hr.	100,75 (84,24)	212,00 (485,13)	494,67 (508,22)	306,22 (481,29)
Mudança média (SD) a partir da linha de base em peso de penso	-158,50 (345, 31)	-102,00 (179,22)	-182,67 (153,16)	-128,89 (166, 03)
Valor p [1]	0, 017	0, 045	0,014	0, 005
Valor p [2]		0,421	0, 679	0, 861
Diferença de Médias de LS vs. placebo		56,50	-33,76	11,37
Cl de 95%		-99,79, 212,79	-218,69, 151,18	-136, 90, 159,64
Visita 6 [3] (Semana 8)	n	4	6	3	9
Peso médio (SD) de teste de penso de 72 hr.	164,00 (272,19)	186,33 (427,25)	489, 33 (425, 48)	287,33 (426, 96)
Mudança média (SD) a partir da linha de base em peso de penso	-95,25 (145,96)	-127,67 (236, 90)	-188,00 (361,87)	-147,78 (262,15)
Valor p [1]	0,105	0, 018	0,012	0, 003
Valor p [2]		0, 639	0,232	0,318
Diferença de Médias de LS vs. placebo		-32,42	-102,34	-67,38
Cl de 95%		-188,70,	-287,28,	-215,65,

Petição 870200001942, de 06/01/2020, pág. 100/114

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			123,87	82,60	80, 89
Visita 7 [3] (Semana 12)	n	4	6	3	9
Peso médio (SD) de teste de penso de 72 hr.	177,50 (307,75)	307,50 (709, 54)	545,3 (621,50)	386,78 (652,19)
Mudança média (SD) a partir da linha de base em peso de penso	-81,75 (110,34)	-6,50 (52,31)	-191,00 (159,81)	-52,63 (113,57)
Valor p [1]	0,154	0, 881	0,224	0,256
Valor p [2]		0,292	0,860	0, 671
Diferença de Médias de LS vs. placebo		75,25	-16,46	29,40
Cl de 95%		-81,04, 231,54	-228,54, 195,63	-127,70, 186,49
Visita 8 [3] (Semana 24)	n	4	6	3	9
Peso médio (SD) de teste de penso de 72 hr.	85, 00 (126,10)	225,00 (520,04)	596, 67 (528,52)	348,89 (522,87)
Mudança média (SD) a partir da linha de base em peso de penso	-174,25 (293, 32)	-89,00 (145,01)	-80,67 (189,03)	-86,22 (148,64)
Valor p [1]	0, 011	0, 071	0,171	0, 042
Valor p [2]		0,238	0,318	0,219
Diferença de Médias de LS vs. placebo		85,25	83,99	84, 62
Cl de 95%		-71,04, 241,54	-100,94, 268,93	-63,65, 232,89

[1]: Valor p para testar se existe uma diferença estatisticamente significativa entre valores medidos em certo ponto temporal vs. medição na linha de base para certo tratamento.

Petição 870200001942, de 06/01/2020, pág. 101/114

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[2]: Valor p para testar se existe uma diferença estatisticamente significativa entre mudanças a partir da linha de base comparando com placebo.

[3]: Os resultados incluem um valor de 0 para o sujeito 002019 cujos resultados foram incorretamente introduzidos na base de dados. Resultados verificados por local e CRA.

[130] Todos os Valores p e estimativas são derivados de um modelo de efeito misto linear com peso de teste de penso de 72 horas como variáveis dependentes, tratamentos (placebo, 16000 ug, 24000 ug e hMaxi-K total), ponto temporal e interação de tempo e tratamento.

[131] Todas as doses = todas as doses de hMaxi-K SD = desvio padrão

Claims (31)

1. MÉTODO DE TRATAMENTO OU ALÍVIO DE UM SINAL OU SINTOMA DE SÍNDROME DA BEXIGA HIPERATIVA OU HIPERATIVIDADE DO DETRUSOR EM UM SUJEITO HUMANO, caracterizado por compreender administração intradetrusoral a, pelo menos, dois ou mais locais de uma dose unitária de uma composição compreendendo um vetor tendo um promotor e um ácido nucleico codificando um peptídeo de canal Maxi-K.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo promotor ser um promotor do músculo liso.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo promotor ser um promotor intermédioinicial do citomegalovírus.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela dose unitária ser uma dose unitária única.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela dose unitária ser entre cerca de 5,00050,000 mcg.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela dose unitária ser, pelo menos, 10,000 mcg.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela dose unitária ser 16,000 mcg ou 24,000 mcg.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela composição ser administrada em 5 ou mais locais.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela composição ser administrada em 10 ou mais locais.

Petição 870190116116, de 11/11/2019, pág. 8/27

2/4

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela composição ser administrada em 15 ou mais locais.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela composição ser administrada em 20 ou mais locais.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo sinal ou sintoma ser frequência de micção ou urgência.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo vetor compreender elementos de ácidos nucleicos na seguinte ordem:

a. uma sequência de promotor intermédio-inicial do citomegalovirus humano;

b. uma sequência de local de iniciação T7;

c. uma sequência de grelha de leitura aberta hSlo;

d. uma sequência de sinal de poliadenilação BGH;

e. uma sequência de resistência à canamicina; e

f. uma sequência de origem de replicação pUC.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pela sequência de promotor intermédio-inicial do citomegalovirus humano ser SEQ ID NO: 1.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pela sequência de local de iniciação T7 ser SEQ ID NO: 2.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pela sequência de sinal de poliadenilação BGH ser SEQ ID NO: 3.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13,

Petição 870190116116, de 11/11/2019, pág. 9/27

3/4 caracterizado pela sequência de resistência à canamicina ser SEQ ID NO: 5.

18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pela sequência de origem de replicação pUC ser SEQ ID NO: 4.

19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pela sequência de grelha de leitura aberta hSlo ser SEQ ID NO: 7.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pela sequência de grelha de leitura aberta hSlo ter uma mutação pontual única na posição de nucleotídeo 1054 de SEQ ID NO: 7, e em que a referida mutação pontual resulta em serina na posição 352 de SEQ ID NO: 8.

21. VETOR, caracterizado por compreender elementos de ácidos nucleicos na seguinte ordem:

g. uma sequência de promotor intermédio-inicial do citomegalovírus humano compreendendo SEQ ID NO: 1;

h. uma sequência de local de iniciação T7 compreendendo SEQ ID NO: 2;

i. uma sequência de grelha de leitura aberta hSlo compreendendo SEQ ID NO: 7;

j . uma sequência de sinal de poliadenilação BGH compreendendo SEQ ID NO: 3;

k. uma sequência de resistência à canamicina compreendendo SEQ ID NO: 5; e

1. uma sequência de origem de replicação pUC compreendendo SEQ ID NO: 4.

22. VETOR, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pela sequência de grelha de leitura aberta hSlo ter uma mutação pontual única na posição de nucleotídeo 1054

Petição 870190116116, de 11/11/2019, pág. 10/27

4/4 de SEQ ID NO: 7, e em que a referida mutação pontual resulta em serina na posição 352 de SEQ ID NO: 8.

23. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 ou 22, caracterizado pelo vetor compreender um plasmídeo, um vetor adenoviral, um vetor de vírus adenoassociado (AAV), um vetor retroviral ou um liposomo.

24. VETOR, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo plasmídeo ser pVAX.

25. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender uma pluralidade do vetor, de acordo com a reivindicação 23, e um diluente ou transportador farmaceuticamente aceitável.

26. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pela composição farmacêutica ser formulada para injeção em músculo liso.

27. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pela pluralidade do vetor ser combinada com sacarose a 20-25% em solução salina.

28. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pela dose unitária ser uma dose unitária única.

29. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pela dose unitária ser entre cerca de 5,000-50,000 mcg.

30. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pela dose unitária ser, pelo menos, 10,000 mcg.

31. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pela dose unitária ser 16,000 mcg ou 24,000 mcg.