EA046506B1 - Композиции и способы лечения синдрома идиопатической гиперактивности мочевого пузыря и гиперактивности детрузора - Google Patents

Description

Родственные заявки

Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки USSN 62/505382, поданной 12 мая 2017 года, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение в целом относится к области медицинских средств терапии для улучшения одного или нескольких симптомов, связанных с дисфункцией гладких мышц. В частности, дисфункцией гладких мышц мочевого пузыря.

Включение перечня последовательностей

Полное содержание текстового файла с именем IONC-002-001WO_SeqList.txt, созданного 11 мая 2018 года и имеющего размер 30 Кбайт, включено в данный документ посредством ссылки.

Предпосылки изобретения

Аномальная функция мочевого пузыря является распространенной проблемой, которая значительно влияет на качество жизни миллионов мужчин и женщин в Соединенных Штатах. Многие распространенные заболевания (например, ВНР, сахарный диабет, рассеянный склероз и инсульт) изменяют нормальную функцию мочевого пузыря. Значительные неблагоприятные изменения в функции мочевого пузыря также являются нормальным результатом старения. Существуют два основных клинических проявления измененной физиологии мочевого пузыря: атонический мочевой пузырь и гиперрефлекторный мочевой пузырь. Атонический мочевой пузырь или гипоактивность детрузора приводит к уменьшению способности опорожнять его содержимое из-за неэффективной сократимости гладкой мышцы детрузора (наружной гладкой мышцы стенки мочевого пузыря). При атоническом или гипоактивном состоянии пониженная сократимость гладких мышц причастна к этиологии дисфункции мочевого пузыря. Таким образом, неудивительно, что фармакологическая модуляция тонуса гладких мышц недостаточна для коррекции основной проблемы. Фактически, в преобладающем способе лечения этого состояния используют стерильную периодическую катетеризацию; причем это успешное средство предупреждения хронической инфекции мочевыводящих путей, пиелонефрита и возможной почечной недостаточности. Таким образом, лечение атонического мочевого пузыря уменьшает симптомы заболевания, но не устраняет основную причину.

С другой стороны, гиперрефлекторный, не поддающийся подавлению мочевой пузырь или мочевой пузырь, который проявляет гиперактивность детрузора, самопроизвольно сокращается во время наполнения мочевого пузыря; причем это может привести к частому мочеиспусканию, ургентности и ургентному недержанию, когда человек не может контролировать мочеиспускание. Гиперрефлекторный мочевой пузырь является более сложной проблемой для лечения. Лекарственные препараты, которые использовались для лечения этого состояния, обычно являются лишь частично эффективными и имеют серьезные побочные эффекты, которые ограничивают их прием пациентом и его энтузиазм. Принятые в настоящее время варианты лечения (например, оксибутинин и толтерадин), как правило, являются неспецифическими и чаще всего предусматривают блокаду сигнальных путей мускариновых рецепторов и/или кальциевых каналов на миоцитах мочевого пузыря. Учитывая центральное значение этих двух сигнальных путей в клеточном функционировании многих систем организма, такие терапевтические стратегии являются не только грубыми способами модуляции тонуса гладких мышц мочевого пузыря; а скорее, благодаря самому механизму(ам) их действия, они также практически гарантированно будут характеризоваться значительными и нежелательными системными эффектами. Соответственно, существует большая потребность в улучшенных вариантах лечения дисфункции мочевого пузыря. Несмотря на многочисленные попытки разработать лекарство или средство для лечения заболеваний, вызванных измененным тонусом гладких мышц, современные средства терапии являются неадекватными, поскольку они обеспечивают ограниченную эффективность и/или значительные побочные эффекты. Таким образом, в данной области давно ощущается потребность в фармацевтическом и/или медицинском вмешательстве для борьбы с первопричиной изменения тонуса гладких мышц за счет повышения эффективности с минимальными побочными эффектами.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение предусматривает способы лечения или уменьшения выраженности признака или симптома синдрома гиперактивного мочевого пузыря или гиперактивности детрузора у субъектачеловека путем внутридетрузорного введения в по меньшей мере два или более участков стандартной дозы композиции, содержащей вектор, предусматривающий промотор и нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид канала Maxi-K. Промотором является, например, промотор, специфический для гладкой мышцы, или промежуточный ранний промотор цитомегаловируса. Стандартная доза представляет собой единичную стандартную дозу. Альтернативно, две или более стандартные дозы вводятся в разное время.

Стандартная доза составляет от приблизительно 5000 до 50000 мкг. Например, стандартная доза составляет по меньшей мере 10000 мкг. Предпочтительно стандартная доза составляет 16000 мкг или 24000 мкг.

Композицию вводят в 5, 10, 15, 20 или более участков.

Признаком или симптомом является, например, частое мочеиспускание или ургентность.

В некоторых аспектах вектор содержит элементы нуклеиновой кислоты, расположенные в следующем порядке: последовательность промежуточного раннего промотора цитомегаловируса человека, та

- 1 046506 кая как SEQ ID NO: 1; последовательность сайта праймирования Т7, такая как SEQ ID NO: 2; последовательность открытой рамки считывания hSlo, такая как SEQ ID NO: 7; сигнальная последовательность полиаденилирования BGH, такая как SEQ ID NO: 3; последовательность, обеспечивающая устойчивость к канамицину, такая как SEQ ID NO: 5 и последовательность точки начала репликации pUC, такая как SEQ ID NO: 4. В определенных аспектах последовательность открытой рамки считывания hSlo содержит точечную мутацию в положении 1054 SEQ ID NO: 7, что приводит к замене на серин в положении 352 SEQ ID NO: 8.

Настоящее изобретение предусматривает вектор, при этом вектор содержит элементы нуклеиновой кислоты, расположенные в следующем порядке: последовательность промежуточного раннего промотора цитомегаловируса человека, такая как SEQ ID NO: 1; последовательность сайта праймирования Т7, такая как SEQ ID NO: 2; последовательность открытой рамки считывания hSlo, такая как SEQ ID NO: 7; сигнальная последовательность полиаденилирования BGH, такая как SEQ ID NO: 3; последовательность, обеспечивающая устойчивость к канамицину, такая как SEQ ID NO: 5; и последовательность точки начала репликации pUC, такая как SEQ ID NO: 4. В некоторых аспектах вектора последовательность открытой рамки считывания hSlo содержит одну точечную мутацию в нуклеотидном положении 1054 SEQ ID NO: 7, и указанная точечная мутация приводит к замене на серин в положении 352 SEQ ID NO: 8. В некоторых аспектах вектор предусматривает плазмиду, аденовирусный вектор, вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV), ретровирусный вектор или липосому. В некоторых аспектах плазмида представляет собой pVAX.

Настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую множество векторов по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель. В некоторых аспектах фармацевтическая композиция составлена для инъекции в гладкую мышцу. В некоторых аспектах множество векторов объединено с 20-25% сахарозой в физиологическом растворе. В некоторых аспектах фармацевтической композиции по настоящему изобретению стандартная доза представляет собой единичную стандартную дозу. В некоторых аспектах стандартная доза составляет от приблизительно 5000 до 50000 мкг. В некоторых аспектах стандартная доза составляет по меньшей мере 10000 мкг. В некоторых аспектах стандартная доза составляет 16000 мкг или 24000 мкг. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимают специалисты в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, можно использовать при практическом осуществлении настоящего изобретения, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылки, упомянутые в данном документе, явным образом включены посредством ссылки во всей своей полноте. В случае конфликта настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, материалы, способы и примеры, описанные в данном документе, являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.

Другие отличительные признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из последующего подробного описания и формулы изобретения и охватываются ими.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 A-D представлена серия из четырех столбчатых графиков, которые показывают параметры мочеиспускания после 2 недель обструкции в двух группах лечения.

На фиг. 2 А-С представлена серия из трех графиков, которые демонстрируют цистометрические показания после 2 недель обструкции в контрольной группе (фиг. 2А), группе с обработкой только вектором (pVAX) (фиг. 2В) и группе, получавшей обработку с помощью hSlo (фиг. 2С).

На фиг. 3 показаны три графика цистометрических показаний для крыс, получавших только вектор (pVAX) и 300 и 1000 мкг pVAX/hSLO.

На фиг. 4 представлен столбчатый график, который показывает среднее количество копий вектора pVAX/hSLO в тканях самок крыс после двух инъекций 1000 мкг.

На фиг. 5 представлена схема, которая показывает участки инъекции вектора pVAX/hSLO у субъектов-людей.

На фиг. 6 представлен столбчатый график, показывающий обусловленное лечением изменение среднего числа мочеиспусканий в день с течением времени у субъектов-людей. Планки погрешностей представляют стандартную ошибку среднего (SEM).

На фиг. 7 представлен столбчатый график, показывающий обусловленное лечением изменение среднего числа эпизодов ургентности с течением времени у субъектов-людей. Планки погрешностей представляют стандартную ошибку среднего (SEM).

На фиг. 8 представлена плазмидная карта pVAX/hSLO.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение предусматривает способы генной терапии для лечения физиологических дисфункций мочевого пузыря. В частности, настоящее изобретение основано на открытии того, что прямая инъекция вектора, содержащего ген, который экспрессирует канал Maxi-K человека (hMaxi-K), в гладкую мышцу стенки мочевого пузыря, значительно уменьшает выраженность симптомов гиперактив- 2 046506 ного мочевого пузыря и недержания мочи у женщин. В частности, участники получали общую дозу, составляющую либо 16000 мкг, либо 24000 мкг hMaxi-K, вводимую в виде 20-30 внутримышечных инъекций в мочевой пузырь. Участников осматривали 8 раз в течение 24-недельного периода и последующего наблюдения через 18 месяцев. Средние данные из дневников, собранные за 7 дней до каждого визита, показали статистически достоверное уменьшение количества мочеиспусканий в день, а также среднее количество эпизодов ургентности в день для тех участников, которые получали hMaxi-K, по сравнению с плацебо.

Канал Maxi-K (также известный как канал BK) обеспечивает путь оттока ионов калия из клетки, вызывая расслабление гладкой мышцы путем ингибирования чувствительного к напряжению канала Са²⁺ и, таким образом, осуществляя нормализацию работы органа путем снижения патологически повышенного тонуса гладкой мышцы. Термины канал MaxiK и канал BK в данном документе используются взаимозаменяемо.

В отношении структуры каналы MaxiK состоят из альфа- и бета-субъединиц. Четыре альфасубъединицы образуют пору канала, и эти альфа-субъединицы кодируются одним геном Slo 1 (также называемым Slo, hSlo и подсемейством калъций-активируемых калиевых каналов Мальфа-1 или KCNMA1). Существует четыре бета-субъединицы, которые могут модулировать функцию канала MaxiK. Каждая бета-субъединица характеризуется конкретными тканеспецифической экспрессией и функциями модуляции, при этом субъединица бета-1 (регуляторная субъединица бета-1 калъций-активируемых калиевых каналов подсемейства М или KCNMB1) в основном экспрессируется в клетках гладких мышц.

Стратегические кластеры каналов MaxiK в непосредственной близости от рианодинчувствительных запасов кальция нижележащего саркоплазматического ретикулума обеспечивают важный механизм локальной модуляции сигналов кальция (т. е. искр) и мембранного потенциала в разнообразных гладких мышцах, включая мочевой пузырь. Увеличение внутриклеточного уровня кальция увеличивает вероятность открытия канала MaxiK, увеличивая тем самым движение К наружу через чувствительный к кальцию канал MaxiK. Утечка К вызывает суммарное перемещение положительного заряда за пределы клетки, делая внутреннюю часть клетки более отрицательно заряженной по отношению к внешней стороне. Это обуславливает два основных эффекта. Во-первых, повышенный мембранный потенциал гарантирует, что кальциевый канал проводит больше времени в закрытом состоянии, чем в открытом. Во-вторых, поскольку кальциевый канал с большей вероятностью будет закрыт, наблюдается снижение суммарного притока Са²⁺ в клетку и соответствующее снижение уровней свободного внутриклеточного кальция. Сниженный внутриклеточный уровень кальция способствует расслаблению гладких мышц. Следовательно, основное значение наличия большего количества каналов MaxiK в клеточной мембране состоит в том, что это должно приводить к усилению расслабления клеток гладких мышц в ответ на любой данный стимул для релаксации.

Усиление межклеточной коммуникации между миоцитами детрузора происходит как в животных моделях частичной обструкции уретры (PUO), так и у людей с гиперактивностью детрузора (DO). Что касается усиления межклеточной коммуникации, влияние повышенной передачи сигналов кальция может быть усилено по сравнению с нормальным мочевым пузырем с потенциально более низкими уровнями межклеточной связи. Эта повышенная передача сигналов кальция способствует, по крайней мере частично, сокращениям без мочеиспускания, наблюдаемым в моделях крыс с PUO. Однако, если произошло параллельное увеличение экспрессии канала MaxiK (например, в результате сверхэкспрессии трансгена, кодирующего канал MaxiK, предусматриваемого композицией или способом по настоящему изобретению), то, предположительно, полученные в результате рекомбинантные и/или трансгенные каналы MaxiK, экспрессируемые этими трансфицированными клетками, могут срывать аномально повышенные сигналы кальция. Это предотвращает дальнейшее распространение через щелевые контакты и, таким образом, предотвращает достаточное усиление аномальной и повышенной передачи сигналов кальция (например, за счет рекрутирования не подвергнутых трансфицированию миоцитов) для ослабления аномальных сократительных реакций. Снижение аномальных сократительных реакций в отдельных клетках или группах клеток за счет сверхэкспрессии трансгена, кодирующего канал MaxiK, предусматриваемого композицией или способом по настоящему изобретению, устраняет или уменьшает сокращения без мочеиспускания, характерные для DO, клинического коррелята ургентности. С другой стороны, поскольку участие спинальных рефлексов в реакции мочеиспускания вызывает скоординированные сокращения детрузора, значительно превышающие аномально повышенную передачу сигналов кальция, связанную с DO, сверхэкспрессия трансгена MaxiK может эффективно снижать или подавлять более слабый аномально повышенный сигнал кальция, который способствует DO (что измеряют на модели на животных как уменьшение IMP (давления между мочеиспусканиями) или SA (спонтанной активности) по сравнению с контрольными уровнями), без значительного или заметного влияния на более устойчивую реакцию сокращения при мочеиспускании.

Старение и заболевание могут приводить к изменениям в экспрессии конечного продукта гена hSlo, гена, который экспрессирует α-субъединицу высокопорогового Са²⁺-активируемого, чувствительного к напряжению калиевого (ВКа) канала. Эти изменения приводят к снижению органоспецифической фи

- 3 046506 зиологической модификации тонуса гладкой мышцы, из которой состоит орган. Эффектом является повышенный тонус клеток гладких мышц в органах, что обуславливает такие заболевания человека, как эректильная дисфункция (ЭД) в половом члене, ургентность, частое мочеиспускание, никтурия и недержание мочи в мочевом пузыре (например, синдром гиперактивности мочевого пузыря (ОАВ)), астма в легких, раздражение кишечника в толстой кишке, глаукома в глазах и инфравезикальная обструкция в предстательной железе. Способы согласно настоящему изобретению

Настоящее изобретение предусматривает способ генной терапии для лечения физиологических дисфункций гладкой мышцы. В частности, способы согласно настоящему изобретению используются для лечения или уменьшения выраженности симптомов синдрома гиперактивного мочевого пузыря (ОАВ) или гиперактивности детрузора.

Синдром ОАВ характеризуется группой симптомов, которые включают без ограничения ургентность, частое мочеиспускание, никтурию и недержание мочи. ОАВ подразделяется на идиопатическую ОАВ и нейрогенную ОАВ.

Гиперактивность детрузора определяется как уродинамическое наблюдение, характеризующееся непроизвольными сокращениями детрузора во время фазы наполнения, которые могут быть спонтанными или спровоцированными. Гиперактивность детрузора подразделяется на идиопатическую гиперактивность детрузора и нейрогенную гиперактивность детрузора.

Композиции и способы согласно настоящему изобретению предусматривают доставку нуклеиновой кислоты, кодирующей hMaxi-K, в клетки субъекта-человека или нуждающегося в этом пациента. В некоторых случаях доставка нуклеиновой кислоты может называться генной терапией.

Композиция и способы согласно настоящему изобретению предусматривают любой подходящий способ доставки нуклеиновой кислоты hMaxi-K или ее мутанта. В некоторых случаях доставка нуклеиновой кислоты может осуществляться с использованием любого подходящего вектора (иногда также называемого средством для доставки генов или переноса генов). Вектор, средство для доставки, средство для доставки генов или средство для переноса генов может относиться к любой подходящей макромолекуле или комплексу молекул, содержащих полинуклеотид для доставки в целевую клетку. В некоторых случаях целевой клеткой может быть любая клетка, в которую доставляется нуклеиновая кислота или ген. Доставляемый полинуклеотид может содержать представляющую интерес для генной терапии кодирующую последовательность, такую как ген hSlo.

Ген hSlo вводится в гладкомышечную клетку мочевого пузыря путем прямой инъекции в мышцу детрузора.

Например, подходящие векторы могут включать без ограничения вирусные векторы, такие как аденовирусы, аденоассоциированные вирусы (AAV) и ретровирусы, липосомы, другие липидсодержащие комплексы и другие макромолекулярные комплексы, способные опосредовать доставку полинуклеотида к целевой клетке.

Альтернативно, ген hSlo переносится в клетки гладких мышц путем переноса голой ДНК с использованием вектора для экспрессии в млекопитающих. Голая ДНК в данном документе определяется как ДНК, содержащаяся в невирусном векторе. Последовательность ДНК может быть объединена со стерильным водным раствором, который предпочтительно является изотоничным крови реципиента. Такой раствор может быть получен путем суспендирования ДНК в воде, содержащей физиологически совместимые вещества (такие как хлорид натрия, глицин и тому подобное), поддерживая буферный pH, совместимый с физиологическими условиями, и делая раствор стерильным. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ДНК объединяют с 20-25% раствором сахарозы в физиологическом растворе (например, фосфатно-солевым буфером) при подготовке к введению в клетку гладкой мышцы.

Как описано в данном документе, нуклеиновые кислоты могут относиться к полинуклеотидам. Нуклеиновая кислота и полинуклеотид могут использоваться взаимозаменяемо. В некоторых случаях нуклеиновые кислоты могут предусматривать ДНК или РНК. В некоторых аспектах нуклеиновые кислоты могут включать ДНК или РНК для экспрессии Maxi-K. В некоторых аспектах нуклеиновые кислоты, представляющие собой РНК, могут включать без ограничения транскрипт представляющего интерес гена (например, Slo), интроны, нетранслируемые области, терминирующие последовательности и тому подобное. В других случаях нуклеиновые кислоты, представляющие собой ДНК, могут включать без ограничения такие последовательности, как последовательности гибридного промотора гена, последовательности сильного конститутивного промотора, представляющий интерес ген (например, Slo), нетранслируемые области, терминирующие последовательности и тому подобное. В некоторых случаях может использоваться комбинация ДНК и РНК. Как описано в настоящем изобретении, термин экспрессионная конструкция подразумевает включение любого типа генетической конструкции, содержащей нуклеиновую кислоту или полинуклеотид, кодирующие генные продукты, в которых часть или вся последовательность, кодирующая нуклеиновую кислоту, способна транскрибироваться. Транскрипт может быть транслирован в белок. В некоторых аспектах он может быть частично транслирован или не быть транслирован. В определенных аспектах экспрессия включает как транскрипцию гена, так и трансляцию мРНК в продукт гена. В других аспектах экспрессия включает только транскрипцию нуклеиновых кислот, кодирующих представляющие интерес гены.

- 4 046506

Нуклеиновая кислота может быть измерена как количество нуклеиновой кислоты. Как правило, любое подходящее количество нуклеиновой кислоты может быть использовано с композициями и способами согласно настоящему изобретению. В некоторых случаях количество нуклеиновой кислоты может составлять по меньшей мере приблизительно 1 пг, 10 пг, 100 пг, 1 пг, 10 пг, 100 пг, 200 пг, 300 пг, 400 пг, 500 пг, 600 пг, 700 пг, 800 пг, 900 пг, 1 мкг, 10 мкг, 100 мкг, 200 мкг, 300 мкг, 400 мкг, 500 мкг, 600 мкг, 700 мкг, 800 мкг, 900 мкг, 1 нг, 10 нг, 100 нг, 200 нг, 300 нг 400 нг, 500 нг, 600 нг, 700 нг, 800 нг, 900 нг, 1 мг, 10 мг, 100 мг, 200 мг, 300 мг, 400 мг, 500 мг, 600 мг, 700 мг, 800 мг, 900 мг, 1 г, 2 г, 3 г, 4 г или 5 г. В некоторых случаях количество нуклеиновой кислоты может составлять не более приблизительно 1 пг, 10 пг, 100 пг, 1 пг, 10 пг, 100 пг, 200 пг, 300 пг, 400 пг, 500 пг, 600 пг, 700 пг, 800 пг, 900 пг, 1 мкг, 10 мкг, 100 мкг, 200 мкг, 300 мкг, 400 мкг, 500 мкг, 600 мкг, 700 мкг, 800 мкг, 900 мкг, 1 нг, 10 нг, 100 нг, 200 нг, 300 нг 400 нг, 500 нг, 600 нг, 700 нг, 800 нг, 900 нг, 1 мг, 10 мг, 100 мг, 200 мг, 300 мг, 400 мг, 500 мг, 600 мг, 700 мг, 800 мг, 900 мг, 1 г, 2 г, 3 г, 4 г или 5 г.

В некоторых случаях количество нуклеиновой кислоты может составлять по меньшей мере приблизительно 5000 мкг, 7500 мкг, 10000 мкг, 12500 мкг, 15000 мкг, 16000 мкг, 17500 мкг, 20000 мкг, 22500 мкг, 24000 мкг, 25000 мкг, 30000 мкг, 35000 мкг, 40000 мкг, 45000 мкг или 50000 мкг.

В контексте настоящего документа микрограмм и мкг используют взаимозаменяемо.

Настоящее изобретение, в частности, предусматривает способ генной терапии, где белок канала MaxiK, участвующий в регуляции тонуса гладких мышц, модулирует расслабление гладких мышц. Эти белки будут способствовать или улучшать расслабление гладких мышц и, таким образом, снижать тонус гладких мышц. В частности, если тонус гладких мышц в мочевом пузыре снижается, емкость мочевого пузыря будет увеличиваться.

Кроме того, настоящее изобретение, в частности, предусматривает способ регулирования тонуса гладких мышц мочевого пузыря у субъекта, включающий введение в клетки гладких мышц мочевого пузыря субъекта последовательности ДНК, кодирующей белок, участвующий в регуляции тонуса гладких мышц, и обеспечении экспрессии в достаточном количестве клеток гладких мышц мочевого пузыря субъекта для усиления релаксации мочевого пузыря у субъекта. В данном варианте осуществления способ согласно настоящему изобретению используют для уменьшения выраженности состояния гиперрефлекторного мочевого пузыря. Гиперрефлекторный мочевой пузырь может являться следствием различных нарушений, включая нейрогенные и артериогенные дисфункции, а также другие состояния, которые вызывают неполное расслабление или повышенную сократимость гладкой мышцы мочевого пузыря. Пациент может являться животным или человеком, а предпочтительно является человеком.

Рекомбинантные векторы и плазмиды согласно настоящему изобретению также могут содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую подходящие регуляторные элементы, чтобы влиять на экспрессию векторной конструкции в подходящей клетке-хозяине. Используемый в данном документе термин экспрессия относится к способности вектора обеспечивать транскрипцию вставленной последовательности ДНК в мРНК, чтобы произошел синтез белка, кодируемого вставленной нуклеиновой кислотой. Специалистам в данной области будет понятно следующее: (1) что ряд различных энхансеров и промоторов подходит для использования в конструкциях согласно настоящему изобретению; и (2) что конструкции будут содержать необходимые стартовые, терминирующие и регуляторные последовательности для обеспечения правильной транскрипции и обработки последовательности ДНК, кодирующей белок, участвующий в регуляции тонуса гладких мышц, при введении рекомбинантной векторной конструкции в клетку-хозяина.

Невирусные векторы, предусматриваемые настоящим изобретением, для экспрессии в клетке гладкой мышцы последовательности ДНК, кодирующей белок, участвующий в регуляции тонуса гладкой мышцы, могут включать весь или часть любого из следующих векторов, известных специалистам в данной области техники:

pVax (Thermo Fisher Scientific), pCMVP (Invitrogen), pcDNA3 (Invitrogen), pET-3d (Novagen), pProEx-1 (Life Technologies), pFastBac 1 (Life Technologies), pSFV (Life Technologies), pcDNA2 (Invitrogen), pSL301 (Invitrogen), pSE280 (Invitrogen), pSE380 (Invitrogen), pSE420 (Invitrogen), pTrcHis A,B,C (Invitrogen), pRSET A,B,C (Invitrogen), pYES2 (Invitrogen), pAC360 (Invitrogen), pVL1392 и pV11392 (Invitrogen), pCDM8 (Invitrogen), pcDNA I (Invitrogen), pcDNA I(amp) (Invitrogen), pZeoSV (Invitrogen), pRc/CMV (Invitrogen), pRc/RSV (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pREP7 (Invitrogen), pREP8 (Invitrogen), pREP9 (Invitrogen), pREPIO (Invitrogen), pCEP4 (Invitrogen), pEBVHis (Invitrogen) и λΡορό.

Другие векторы будут очевидны для специалиста в данной области. Предпочтительно вектором является pVax.

- 5 046506

В некоторых вариантах осуществления последовательность вектора pVax содержит последовательность:

GACTCTTCGC GATGTACGGG CCAGATATAC GCGTTGACAT TGATTATTGA CTAGTTATTA

ATAGTAATCA ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT ATGGAGTTCC GCGTTACATA

121 ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTGGCTGACC GCCCAACGAC CCCCGCCCAT TGACGTCAAT

181 AATGACGTAT GTTCCCATAG TAACGCCAAT AGGGACTTTC CATTGACGTC AATGGGTGGA

241 CTATTTACGG TAAACTGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC

301 CCCTATTGAC GTCAATGACG GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT ACATGACCTT

361 ATGGGACTTT CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC ATCGCTATTA CCATGGTGAT

421 GCGGTTTTGG CAGTACATCA ATGGGCGTGG ATAGCGGTTT GACTCACGGG GATTTCCAAG

481 ТСТССАСССС ATTGACGTCA ATGGGAGTTT GTTTTGGCAC СААААТСААС GGGACTTTCC

541 AAAATGTCGT AACAACTCCG CCCCATTGAC GCAAATGGGC GGTAGGCGTG TACGGTGGGA

601 GGTCTATATA AGCAGAGCTC TCTGGCTAAC TAGAGAACCC ACTGCTTACT GGCTTATCGA

661 AATTAATACG АСТСАСТАТА GGGAGACCCA AGCTGGCTAG CGTTTAAACT TAAGCTTGGT

721 ACCGAGCTCG GATCCACTAG TCCAGTGTGG TGGAATTCTG CAGATATCCA GCACAGTGGC

781 GGCCGCTCGA GTCTAGAGGG CCCGTTTAAA CCCGCTGATC AGCCTCGACT GTGCCTTCTA

841 GTTGCCAGCC ATCTGTTGTT TGCCCCTCCC CCGTGCCTTC CTTGACCCTG GAAGGTGCCA

901 CTCCCACTGT ССТТТССТАА TAAAATGAGG AAATTGCATC GCATTGTCTG AGTAGGTGTC

961 АТТСТАТТСТ GGGGGGTGGG GTGGGGCAGG ACAGCAAGGG GGAGGATTGG GAAGACAATA

1021 GCAGGCATGC TGGGGATGCG GTGGGCTCTA TGGCTTCTAC TGGGCGGTTT TATGGACAGC

1081 AAGCGAACCG GAATTGCCAG CTGGGGCGCC CTCTGGTAAG GTTGGGAAGC CCTGCAAAGT

1141 AAACTGGATG GCTTTCTCGC CGCCAAGGAT CTGATGGCGC AGGGGATCAA GCTCTGATCA

1201 AGAGACAGGA TGAGGATCGT TTCGCATGAT TGAACAAGAT GGATTGCACG CAGGTTCTCC

1261 GGCCGCTTGG GTGGAGAGGC TATTCGGCTA TGACTGGGCA CAACAGACAA TCGGCTGCTC

1321 TGATGCCGCC GTGTTCCGGC TGTCAGCGCA GGGGCGCCCG GTTCTTTTTG TCAAGACCGA

1381 CCTGTCCGGT GCCCTGAATG AACTGCAAGA CGAGGCAGCG CGGCTATCGT GGCTGGCCAC

1441 GACGGGCGTT CCTTGCGCAG CTGTGCTCGA CGTTGTCACT GAAGCGGGAA GGGACTGGCT

1501 GCTATTGGGC GAAGTGCCGG GGCAGGATCT CCTGTCATCT CACCTTGCTC CTGCCGAGAA

1561 AGTATCCATC ATGGCTGATG CAATGCGGCG GCTGCATACG CTTGATCCGG CTACCTGCCC

1621 ATTCGACCAC CAAGCGAAAC ATCGCATCGA GCGAGCACGT ACTCGGATGG AAGCCGGTCT

1681 TGTCGATCAG GATGATCTGG ACGAAGAGCA TCAGGGGCTC GCGCCAGCCG AACTGTTCGC

1741 CAGGCTCAAG GCGAGCATGC CCGACGGCGA GGATCTCGTC GTGACCCATG GCGATGCCTG

1801 CTTGCCGAAT ATCATGGTGG AAAATGGCCG CTTTTCTGGA TTCATCGACT GTGGCCGGCT

1861 GGGTGTGGCG GACCGCTATC AGGACATAGC GTTGGCTACC CGTGATATTG CTGAAGAGCT

1921 TGGCGGCGAA TGGGCTGACC GCTTCCTCGT GCTTTACGGT ATCGCCGCTC CCGATTCGCA

1981 GCGCATCGCC TTCTATCGCC TTCTTGACGA GTTCTTCTGA ATTATTAACG СТТАСААТТТ

2041 CCTGATGCGG ТАТТТТСТСС TTACGCATCT GTGCGGTATT TCACACCGCA TACAGGTGGC

2101 ACTTTTCGGG GAAATGTGCG CGGAACCCCT ATTTGTTTAT ТТТТСТАААТ АСАТТСАААТ

2161 ATGTATCCGC TCATGAGACA ATAACCCTGA TAAATGCTTC AATAATAGCA CGTGCTAAAA

2221 СТТСАТТТТТ AATTTAAAAG GATCTAGGTG AAGATCCTTT TTGATAATCT CATGACCAAA

2281 АТСССТТААС GTGAGTTTTC GTTCCACTGA GCGTCAGACC CCGTAGAAAA GATCAAAGGA

2341 TCTTCTTGAG АТССТТТТТТ TCTGCGCGTA ATCTGCTGCT TGCAAACAAA AAAACCACCG

2401 CTACCAGCGG TGGTTTGTTT GCCGGATCAA GAGCTACCAA СТСТТТТТСС GAAGGTAACT

2461 GGCTTCAGCA GAGCGCAGAT АССАААТАСТ GTCCTTCTAG TGTAGCCGTA GTTAGGCCAC

2521 CACTTCAAGA ACTCTGTAGC ACCGCCTACA TACCTCGCTC TGCTAATCCT GTTACCAGTG

2581 GCTGCTGCCA GTGGCGATAA GTCGTGTCTT ACCGGGTTGG ACTCAAGACG ATAGTTACCG

2641 GATAAGGCGC AGCGGTCGGG CTGAACGGGG GGTTCGTGCA CACAGCCCAG CTTGGAGCGA

2701 ACGACCTACA CCGAACTGAG ATACCTACAG CGTGAGCTAT GAGAAAGCGC CACGCTTCCC

2761 GAAGGGAGAA AGGCGGACAG GTATCCGGTA AGCGGCAGGG TCGGAACAGG AGAGCGCACG

2821 AGGGAGCTTC CAGGGGGAAA CGCCTGGTAT CTTTATAGTC CTGTCGGGTT TCGCCACCTC

2881 TGACTTGAGC GTCGATTTTT GTGATGCTCG TCAGGGGGGC GGAGCCTATG GAAAAACGCC

2941 AGCAACGCGG CCTTTTTACG GTTCCTGGGC TTTTGCTGGC CTTTTGCTCA CATGTTCTT (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах осуществления последовательность pVAX содержит последовательность с по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности с SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах осуществления последовательность pVAX предусматривает замену G на А в положении 2 SEQ ID NO: 10, дополнительный G в положении 5 SEQ ID NO: 10, замену Т на С в положении 1158 SEQ ID NO: 10, отсутствие А в положении 2092 SEQ ID NO: 10, замену Т на С в положении 2493 SEQ ID NO: 10 или их комбинацию. Промоторы, подходящие для настоящего изобретения, включают без ограничения конститутивные промоторы, тканеспецифичные промоторы и индуцибельные промоторы. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой промотор, специфичный для гладких мышц. В других вариантах осуществления промотор представляет собой промотор, специфичный для мышечной клетки. Предпочтительно промотор не является специфичным для экспрессии в уротелии промотором.

- 6 046506

В одном варианте осуществления настоящего изобретения экспрессия последовательности ДНК, кодирующей белок, участвующий в регуляции тонуса гладких мышц, контролируется и зависит от конкретного вектора, в который была введена последовательность ДНК. Некоторые эукариотические векторы были сконструированы таким образом, чтобы они могли экспрессировать встроенные нуклеиновые кислоты с достижением высоких уровней в клетке-хозяине. Такие векторы используют один из ряда мощных промоторов для обеспечения высокого уровня экспрессии. В эукариотических векторах используются промоторно-энхансерные последовательности вирусных генов, особенно генов опухолевых вирусов. Данный конкретный вариант осуществления настоящего изобретения предусматривает регуляцию экспрессии последовательности ДНК, кодирующей белок, путем использования индуцибельных промоторов. Неограничивающие примеры индуцибельных промоторов включают металлотиониновые промоторы и промоторы вируса опухоли молочной железы мыши. В зависимости от вектора экспрессия последовательности ДНК в клетке гладкой мышцы будет индуцирована добавлением определенного соединения в определенный момент цикла роста клетки. Другие примеры промоторов и энхансеров, эффективных для использования в рекомбинантных векторах согласно настоящему изобретению, включают без ограничения CMV (цитомегаловирус), SV40 (вирус обезьян 40), HSV (вирус простого герпеса), EBV (вирус Эпштейна-Барра), ретровирус, аденовирусные промоторы и энхансеры и специфические для гладких мышц промоторы и энхансеры. Примером специфического для гладких мышц промотора является SM22a. Иллюстративные промоторы, специфические для гладкой мышцы, описаны в патенте США № 7169764, полное содержание которого включено в данный документ посредством ссылки. В предпочтительных вариантах осуществления промотор представляет собой последовательность промотора SM22a и может включать без ограничения такие последовательности, как gaattcagga cgtaatcagt ggctggaaag caagagctct agaggagctc tgacccttcc ttcagatgcc acaaggaggt gctggagttc tatgcaccaa cagccaggct ggctgtagtg gattgagcgt ctgaggctgc acctctctgg gttctgggtg agactgaccc tgcctgaggg ttctctcctt ccctctctct ccctctccct ctccctctct ctgtttcctg aggtttccag gattggggat gacaccacta aagccttacc ttttaagaag ttgcattcag tgagtgtgtg cagatagggg cagaggagag ctggttctgt ctccactgtg tttggtcttg tcagaccatc aggtgtgata gcagttgtct ttaaccctaa ccctgagcct tcccttccca agaccactga agctaggtgc aagataagtg gggacccttt aggatctttc acgataagga ctattttgaa gggagggagg gtgacactgt ttaccctagt gtctccagcc ttgccaggcc ttaaacatcc gcccattgtc aaggggccag ggttgacttg ctgctaaaca aggcactccc tagagaagca gcataccata cctgtgggca ggatgaccca tgttctgcca cgcacttggt aggccacttt gaacctcaat tttctcaact gttaaatggg gtggtaactg ataaagggga acgtgaaagg aaggcgtttg catagtgcct ggttgtgcag gtcaagacta gttcccacca actcgatttt aaagccttgc aagaaggtgg ccttgcaggt tcctttgtcg ggccaaactc tagaatgcct ccccctttct agagcagacc caagtccggg taacaaggaa gggtttcagg gtcctgccca ttcccggccg ccctcagcac cgccccgccc cgacccccgc agcatctcca cagcttatta tagcttaaac cctgcagcca actcctttct gggactcaga agacatagca ggtactgaac gtctcacctg ctgaggtggt cctagtcctc acccgctcta gcccgctaga agccttggaa ctatctcata ccaggctgca cttgtttgtc ttctcattga taaaaggttt aagcatgcag agaatgtctc cggctgcccc cgacagactg ctccaacttg gtgtctttcc ccaaatatgg agcctgtgtg gagtgagtgg ggcggcccgg ggtggtgagc caagcagact tccatgggca gggaggggcg ccagcggacg gcagaggggt gacatcactg cctaggcggc ctttaaaccc ctcacccagc cggcgcccca gcccgtctgc cccagcccag acaccgaagc tactctcctt ccagtccaca aacgaccaag ccttgtaagt gcaagtcat (SEQ ID NO: 9).

- 7 046506

В предпочтительных вариантах осуществления промотор представляет собой последовательность промежуточного раннего промотора цитомегаловируса человека и может включать без ограничения та кие последовательности, как

CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACG

TCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGG

AGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCC

TATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGAC

TTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGC

AGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGA

CGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCC

GCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT (SEQ

ID NO: 1).

В некоторых аспектах может быть включен сайт праймирования Т7, как например без ограничения такие последовательности, как TAATACGACTCACTATAGGG под SEQ ID NO: 2.

В некоторых аспектах рекомбинантный вирус и/или плазмида, используемые для экспрессии последовательности ДНК или белка согласно настоящему изобретению, содержит последовательность поли А (полиаденилирования), такую как последовательности, представленные в данном документе (например, последовательность поли A BGH). Как правило, любая подходящая последовательность поли А может использоваться для желаемой экспрессии трансгена. Например, в некоторых случаях настоящее изобретение предусматривает последовательность, содержащую последовательность поли А BGH или часть последовательности поли А BGH. В некоторых случаях настоящее раскрытие предусматривает последовательности поли А, содержащие комбинацию одной или нескольких последовательностей или элементов последовательности поли А. В некоторых случаях последовательность поли А не используется. В некоторых случаях одна или несколько последовательностей поли А могут определяться как нетранслируемые области (UTR), 3'-UTR или терминирующие последовательности.

Длина последовательности поли А может предусматривать длину, составляющую 1-10 п.о., 10-20 п.о., 20-50 п.о., 50-100 п.о., 100-500 п.о., 500 п.о. -1 т.п.н., 1 т.п.н. - 2 т.п.н., 2 т.п.н. - 3 т.п.н., 3 т.п.н. - 4 т.п.н., 4 т.п.н. - 5 т.п.н., 5 т.п.н. -6 т.п.н., 6 т.п.н. - 7 т.п.н., 7 т.п.н. - 8 т.п.н., 8 т.п.н. - 9 т.п.н. и 9 т.п.н. 10 т.п.н. Длина последовательности поли А может предусматривать длину, составляющую по меньшей мере 1 п.о., 2 п.о., 3 п.о., 4 п.о., 5 п.о., 6 п.о., 7 п.о., 8 п.о., 9 п.о., 10 п.о., 20 п.о., 30 п.о., 40 п.о., 50 п.о., 60 п.о., 70 п.о., 80 п.о., 90 п.о., 100 п.о., 200 п.о., 300 п.о., 400 п.о., 500 п.о., 600 п.о., 700 п.о., 800 п.о.,

900 п.о., 1 т.п.н., 2 т.п.н., 3 т.п.н., 4 т.п.н., 5 т.п.н., 6 т.п.н., 7 т.п.н., 8 т.п.н., 9 т.п.н. и 10 т.п.н. Длина последовательности поли А может предусматривать длину, составляющую не более 1 п.о., 2 п.о., 3 п.о., 4 п.о., 5 п.о., 6 п.о., 7 п.о., 8 п.о., 9 п.о., 10 п.о., 20 п.о., 30 п.о., 40 п.о., 50 п.о., 60 п.о., 70 п.о., 80 п.о.,

п.о., 100 п.о., 200 п.о., 300 п.о., 400 п.о., 500 п.о., 600 п.о., 700 п.о., 800 п.о., 900 п.о., 1 т.п.н., 2 т.п.н., 3 т.п.н., 4 т.п.н., 5 т.п.н., 6 т.п.н., 7 т.п.н., 8 т.п.н., 9 т.п.н. и 10 т.п.н.

В некоторых случаях поли А BGH может включать без ограничения такие последовательности, как agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta gtgggctct (SEQ Ш NO: 3).

В некоторых случаях последовательности поли А могут быть оптимизированы в отношении различных параметров, влияющих на экспрессию белка, включая без ограничения время полужизни мРНК трансгена в клетке, стабильность мРНК трансгена или регуляцию транскрипции. Например, последовательности поли А могут быть изменены для увеличения транскрипции мРНК трансгена, что может привести к увеличению экспрессии белка. В некоторых случаях последовательности поли А могут быть изменены для уменьшения времени полужизни транскрипта мРНК трансгена, что может привести к снижению экспрессии белка.

В некоторых аспектах вектор содержит последовательность, представляющую собой последова тельность, кодирующую точку начала репликации, как например таковые предусмотренные в данном документе. Последовательности точки начала репликации, как правило, обеспечивает последовательность, полезную для воспроизводства плазмиды/вектора.

В некоторых случаях, последовательность точки начала репликации pUC может включать без ограничения такие последовательности, как

- 8 046506 ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctgggc ttttgctggc cttttgctca catgttctt (SEQ Ш NO: 4).

Вектор также может содержать селектируемый маркер. Селектируемые маркеры могут быть положительными, отрицательными или бифункциональными. Положительные селектируемые маркеры позволяют осуществлять отбор клеток, несущих маркер, тогда как отрицательные селектируемые маркеры позволяют избирательно исключать клетки, несущие маркер. Описано множество таких маркерных генов, включая бифункциональные (то есть положительные/отрицательные) маркеры (см., например, Lupton, S., WO 92/08796, опубликованный 29 мая 1992 г.; и Lupton, S., WO 94/28143, опубликованный 8 декабря 1994 г.). Примеры отрицательных селектируемых маркеров могут предусматривать включение генов устойчивости к антибиотикам, таким как ампициллин или канамицин. Такие маркерные гены могут обеспечить дополнительную меру контроля, которая может обладать преимуществом в контексте генной терапии. Большое разнообразие таких векторов известно в данной области и, как правило, доступно.

В некоторых случаях нуклеиновая кислота, кодирующая устойчивость к канамицину, может включать без ограничения такие последовательности, как ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga (SEQ Ш NO: 5).

Рекомбинантный вектор/плазмида содержит полинуклеотид, кодирующий белок Maxi-K человека, мутантный белок Maxi-K или его функциональный фрагмент. Иллюстративная нуклеиновая кислота, кодирующая белок Maxi-K, подходящий для использования в настоящем изобретении, включает последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 6. hSlo

- 9 046506

ATGGCAAACGGTGGCGGCGGCGGCGGCGGCAGCAGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGAGGCA GCGGTCTTAGAATGAGCAGCAATATCCACGCGAACCATCTCAGCCTAGACGCGTCCTCCTCCTC CTCCTCCTCCTCTTCCTCTTCTTCTTCTTCCTCCTCCTCTTCCTCCTCGTCCTCGGTCCACGAG CCCAAGATGGATGCGCTCATCATCCCGGTGACCATGGAGGTGCCGTGCGACAGCCGGGGCCAAC GCATGTGGTGGGCTTTCCTGGCCTCCTCCATGGTGACTTTCTTCGGGGGCCTCTTCATCATCTT GCTCTGGCGGACGCTCAAGTACCTGTGGACCGTGTGCTGCCACTGCGGGGGCAAGACGAAGGAG GCCCAGAAGATTAACAATGGCTCAAGCCAGGCGGATGGCACTCTCAAACCAGTGGATGAAAAAG AGGAGGCAGTGGCCGCCGAGGTCGGCTGGATGACCTCCGTGAAGGACTGGGCGGGGGTGATGAT ATCCGCCCAGACACTGACTGGCAGAGTCCTGGTTGTCTTAGTCTTTGCTCTCAGCATCGGTGCA CTTGTAATATACTT CATAGAT T CAT СAAAC С СAATAGAAT С С T G С CAGAAT T T С TACAAAGAT T TCACATTACAGATCGACATGGCTTTCAACGTGTTCTTCCTTCTCTACTTTGGCTTGCGGTTTAT TGCAGCCAACGATAAATTGTGGTTCTGGCTGGAAGTGAACTCTGTAGTGGATTTCTTCACGGTG CCCCCCGTGTTTGTGTCTGTGTACTTAAACAGAAGTTGGCTTGGTTTGAGATTTTTAAGAGCTC T GAGAC T GATACAG T T T T CAGAAAT T T T G CAG T T T С T GAATAT T С T TAAAACAAG TAAT T С CAT CAAGCTGGTGAATCTGCTCTCCATATTTATCAGCACGTGGCTGACTGCAGCTGGGTTCATCCAT TTGGTGGAGAATTCAGGGGACCCATGGGAAAATTTCCAAAACAACCAGGCTCTCACCTACTGGG AATGTGTCATTTACTCATGGTCACAATGTCCACCGTTGGTTATGGGGATGTTTATGCAAAAACC ACACTTCGGCGCCTCTTCATGGTCTTCTTCATCCTCGGGGGACTGGCCATGTTTGCCAGCTACG TCCCTGAAATCATAGAGTTAATAGGAAACCGCAAGAAATACGGGGGCTCCTATAGTGCGGTTAG TGGAAGAAAGCACATTGTGGTCTGCGGACACATCACTCTGGAGAGTGTTTCCAACTTCCTGAAG GACTTTCTGCACAAGGACCGGGATGACGTCAATGTGGAGATCGTTTTTCTTCACAACATCTCCC CCAACCTGGAGCTTGAAGCTCTGTTCAAACGACATTTTACTCAGGTGGAATTTTATCAGGGTTC C G T С С T CAAT С CACAT GAT С T T G CAAGAG T CAAGATAGAG T CAG CAGAT GCATGCCTGATCCTT GCCAACAAGTACTGCGCTGACCCGGATGCGGAGGATGCCTCGAATATCATGAGAGTAATCTCCA TAAAGAAC TAG CAT С C GAAGATAAGAAT CAT САС T CAAAT GC T GCAG TAT CACAACAAGGC С CA TCTGCTAAACATCCGAGCTGGAATTGGAAAGAAGGTGATGACGCAATCTGCCTCGCAGAGTTGA AGTTGGGCTTCATAGCCCAGAGCTGCCTGGCTCAAGGCCTCTCCACCATGCTTGCCAACCTTCT CCAT GAGGT CAT T CATAAAGAT T GAGGAAGACACAT GGCAGAAATAC ТАС T T GGAAGGAGT С T C AAATCAAATGTACACAGAATATCTCTCCAGTGCCTTCGTGGGTCTGTCCTTCCCTACTGTTTGT GAGCTGTGTTTTGTGAAGCTCAAGCTCCTAATGATAGCCATTGAGTACAAGTCTGCCAACCGAG AGAG CCGTATATTAATTAATCCTG GAAAC CAT T T TAAGAT С CAAGAAG GTACTTTAGGATTTTT CATCGCAAGTGATGCCAAAGAAGTTAAAAGGGCATTTTTTTACTGCAAGGCCTGTCATGATGAC ATCACAGATCCCAAAAGAATAAAAAAATGTGGCTGCAAACGGCTTGAAGATGAGCAGCCGTCAA CACTATCACCAAAAAAAAAGCAACGGAATGGAGGCATGCGGAACTCACCCAACACCTCGCCTAA GCTGATGAGGCATGACCCCTTGTTAATTCCTGGCAATGATCAGATTGACAACATGGACTCCAAT GTGAAGAAGTACGACTCTACTGGGATGTTTCACTGGTGTGCACCCAAGGAGATAGAGAAAGTCA TCCTGACTCGAAGTGAAGCTGCCATGACCGTCCTGAGTGGCCATGTCGTGGTCTGCATCTTTGG CGACGTCAGCTCAGCCCTGATCGGCCTCCGGAACCTGGTGATGCCGCTCCGTGCCAGCAACTTT CATTACCATGAGCTCAAGCACATTGTGTTTGTGGGCTCTATTGAGTACCTCAAGCGGGAATGGG AGACGCTTCATAACTTCCCCAAAGTGTCCATATTGCCTGGTACGCCATTAAGTCGGGCTGATTT AAGGGCTGTCAACATCAACCTCTGTGACATGTGCGTTATCCTGTCAGCCAATCAGAATAATATT GATGATACTTCGCTGCAGGACAAGGAATGCATCTTGGCGTCACTCAACATCAAATCTATGCAGT TTGATGACAGCATCGGAGTCTTGCAGGCTAATTCCCAAGGGTTCACACCTCCAGGAATGGATAG ATCCTCTCCAGATAACAGCCCAGTGCACGGGATGTTACGTCAACCATCCATCACAACTGGGGTC AAGAT С С С CAT CAT СAC T GAAC TAG T GAAC GATACTAATGTT CAG T T T T T G GAC CAAGAC GAT G ATGATGACCCTGATACAGAACTGTACCTCACGCAGCCCTTTGCCTGTGGGACAGCATTTGCCGT CAGTGTCCTGGACTCACTCATGAGCGCGACGTACTTCAATGACAATATCCTCACCCTGATACGG ACCCTGGTGACCGGAGGAGCCACGCCGGAGCTGGAGGCTCTGATTGCTGAGGAAAACGCCCTTA GAGGTGGCTACAGCACCCCGCAGACACTGGCCAATAGGGACCGCTGCCGCGTGGCCCAGTTAGC TCTGCTCGATGGGCCATTTGCGGACTTAGGGGATGGTGGTTGTTATGGTGATCTGTTCTGCAAA GCTCTGAAAACATATAATATGCTTTGTTTTGGAATTTACCGGCTGAGAGATGCTCACCTCAGCA CCCCCAGTCAGTGCACAAAGAGGTATGTCATCACCAACCCGCCCTATGAGTTTGAGCTCGTGCC GACGGACCTGATCTTCTGCTTAATGCAGTTTGACCACAATGCCGGCCAGTCCCGGGCCAGCCTG TCCCATTCCTCCCACTCGTCGCAGTCCTCCAGCAAGAAGAGCTCCTCTGTTCACTCCATCCCAT CCACAGCAAACCGACAGAACCGGCCCAAGTCCAGGGAGTCCCGGGACAAACAGAAGTACGTGCA GGAAGAGCGGCTTTGATATGTGTATCCACCGCCACTGTGTGAAACTGTATCTGCCACTCATTTC CCCAGTTGGTGTTTCCAACAAAGTAACTTTCCCTGTTTTCCCCTGTAGTCCCCCCCTTTTTTTT TAGACATAT TTGCATATGTATGATAGTGTGCATGTGGTTGTCATTTTTATTT СAC CAC CATAAA ACCCTTGAGCACAACAGCAAATAAGCAGACGGGCTCCGGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCAC TAG (SEQ Ш NO: 6)

Модификации гена hSlo можно использовать для эффективного лечения заболевания человека, ко

- 10 046506 торое вызвано, например, изменениями экспрессии, активности, событий восходящей передачи сигналов и/или событий нисходящей передачи сигналов ВК-канала. Модификации нуклеотидной или пептидной последовательности hSlo дикого типа могут включать без ограничения делеции, инсерции, сдвиги рамок считывания, замены и инверсии. Например, предполагаемые модификации последовательности hSlo дикого типа включают замены одного нуклеотида в последовательности ДНК, кДНК или РНК, кодирующей hSlo, и/или одиночные аминокислотные замены в последовательности пептида или полипептида, кодирующей hSlo. Замена одного нуклеотида в последовательности ДНК, кДНК или РНК, кодирующей hSlo, и/или одной аминокислоты в последовательности пептида или полипептида, кодирующей hSlo, также обозначается как точечная мутация. Замены в последовательности ДНК, кДНК или РНК, кодирующей hSlo, и/или пептидной или полипептидной последовательности, кодирующей hSlo, могут быть консервативными или неконсервативными.

Предпочтительная модификация в гене hSlo включает точечную мутацию в положении 1054 нуклеиновой кислоты при нумерации в соответствии с SEQ ID NO: 7. Данная точечная мутация приводит к аминокислотной замене в положении 352 белка канала MaxiK при нумерации в соответствии с SEQ ID NO: 7. Например, точечная мутация представляет собой замену серина (S) на треонин (Т) (например, T352S). Необязательно дополнительные модификации в гене hSlo включают точечные мутации, которые приводят к одной или нескольким аминокислотным заменам в положениях аминокислот 496, 602, 681, 778, 805 или 977 при нумерации в соответствии с SEQ ID NO: 8.

Дополнительные мутации в аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 8) также выделяются белыми буквами на черном фоне и сопровождаются названием мутации (например, С977А (С1), С496А (С2), С681А (С3), M602L (M1), M778L (М2) и M805L (М3)).

ATGGCAAATGGTGGCGGCGGCGGCGGCGGCAGCAGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGAGGC 60 1MANGGGGGGGSSGGGGGGGG

AGCAGTCTTAGAATGAGTAGCAATATCCACGCGAACCATCTCAGCCTAGACGTGTCCTCC 120 21SSLRMSSNIHANHLSLDVSS

121 TCCTCCTCCTCCTCCTCTTCCTCTTCTTCTTCTTCCTCCTCCTCTTCCTCCTCGTCCTCG 180 41SSSSSSSSSSSSSSSSSSSS

181 GTCCACGAGCCCAAGATGGATGCGCTCATCATCCCGGTGACCATGGAGGTGCCGTGCGAC 240 61VHEPKMDALIIPVTMEVPCD

241 AGCCGGGGCCAACGCATGTGGTGGGCTTTCCTGGCCTCCTCCATGGTGACTTTCTTCGGG 300

SRGQRMWWAFLAS SMVTFFG

301 GGCCTCTTCATCATCTTGCTCTGGCGGACGCTCAAGTACCTGTGGACCGTGTGCTGCCAC 360

101 GLFIILLWRTLKYLWTVCCH

- 11 046506

361 TGCGGGGGCAAGACGAAGGAGGCCCAGAAGATTAACAATGGCTCAAGCCAGGCGGATGGC 420

121 CGGKTKEAQKINNGS SQADG

421 ACTCTCAAACCAGTGGATGAAAAAGAGGAGGCAGTGGCCGCCGAGGTCGGCTGGATGACC 480

141 TLKPVDEKEEAVAAEVGWMT

481 TCCGTGAAGGACTGGGCGGGGGTGATGATATCCGCCCAGACACTGACTGGCAGAGTCCTG 540

161 SVKDWAGVMI SAQTLTGRVL

541 GTTGTCTTAGTCTTTGCTCTCAGCATCGGTGCACTTGTAATATACTTCATAGATTCATCA 600

181 VVLVFALSIGALVIYFIDSS

601 AACCCAATAGAATCCTGCCAGAATTTCTACAAAGATTTCACATTACAGATCGACATGGCT 660

201 NPIESCQNFYKDFTLQIDMA

661 TTCAACGTGTTCTTCCTTCTCTACTTCGGCTTGCGGTTTATTGCAGCCAACGATAAATTG 720

221 FNVFFLLYFGLRFIAANDKL

721 TGGTTCTGGCTGGAAGTGAACTCTGTAGTGGATTTCTTCACGGTGCCCCCCGTGTTTGTG 780

241 WFWLEVNSVVDFFTVPPVFV

781 TCTGTGTACTTAAACAGAAGTTGGCTTGGTTTGAGATTTTTAAGAGCTCTGAGACTGATA 840

261 SVYLNRSWLGLRFLRALRLI

841 CAGTTTTCAGAAATTTTGCAGTTTCTGAATATTCTTAAAACAAGTAATTCCATCAAGCTG 900

281 QFSEILQFLNILKTSNSIKL

901 GTGAATCTGCTCTCCATATTTATCAGCACGTGGCTGACTGCAGCCGGGTTCATCCATTTG 960

301 VNLLSIFISTWLTAAGFIHL

961 GTGGAGAATTCAGGGGACCCATGGGAAAATTTCCAAAACAACCAGGCTCTCACCTACTGG 1020

321 VENSGDPWENFQNNQALTYW

1021 GAATGTGTCTATTTACTCATGGTCACAATGTCCACCGTTGGTTATGGGGATGTTTATGCA 1080 ATGGTCACAATGTCC CCGTTGGTTATGGGGAT (SEQ ID NO:11)

341 ECVYLLMVTMS VGYGDVYA

1081 AAAACCACACTTGGGCGCCTCTTCATGGTCTTCTTCATCCTCGGGGGACTGGCCATGTTT 1140

361 KTTLGRLFMVFFILGGLAMF

1141 GCCAGCTACGTCCCTGAAATCATAGAGTTAATAGGAAACCGCAAGAAATACGGGGGCTCC 1200

381 ASYVPEIIELIGNRKKYGGS

1201 TATAGTGCGGTTAGTGGAAGAAAGCACATTGTGGTCTGCGGACACATCACTCTGGAGAGT 1260

401 YSAVSGRKHIVVCGHITLES

1261 GTTTCCAACTTCCTGAAGGACTTTCTGCACAAGGACCGGGATGACGTCAATGTGGAGATC 1320

421 VSNFLKDFLHKDRDDVNVEI

1321 GTTTTTCTTCACAACATCTCCCCCAACCTGGAGCTTGAAGCTCTGTTCAAACGACATTTT 1380

441 VFLHNI SPNLELEALFKRHF

1381 ACTCAGGTGGAATTTTATCAGGGTTCCGTCCTCAATCCACATGATCTTGCAAGAGTCAAG 1440

461 TQVEFYQGSVLNPHDLARVK

1441 ATAGAGTCAGCAGATGCATGCCTGATCCTTGCCAACAAGTACTGCGCTGACCCGGATGCG 1500

- 12 046506

481 IESADACLILANKY ADPDA

1501 GAGGATGCCTCGAATATCATGAGAGTAATCTCCATAAAGAACTACCATCCGAAGATAAGA 1560

501 EDASNIMRVISIKNYHPKIR

1561 ATCATCACTCAAATGCTGCAGTATCACAACAAGGCCCATCTGCTAAACATCCCGAGCTGG 1620

521 IITQMLQYHNKAHLLNIPSW

1621 AATTGGAAAGAAGGTGATGACGCAATCTGCCTCGCAGAGTTGAAGTTGGGCTTCATAGCC 1680

541 NWKEGDDAICLAELKLGFIA

1681 CAGAGCTGCCTGGCTCAAGGCCTCTCCACCATGCTTGCCAACCTCTTCTCCATGAGGTCA 1740

561 QSCLAQGLSTMLANLFSMRS

1741 TTCATAAAGATTGAGGAAGACACATGGCAGAAATACTACTTGGAAGGAGTCTCAAATGAA 1800

581 FIKIEEDTWQKYYLEGVSNE

1801 ATGTACACAGAATATCTCTCCAGTGCCTTCGTGGGTCTGTCCTTCCCTACTGTTTGTGAG 1860

601 YTEYLSSAFVGLSFPTVCE

1861 CTGTGTTTTGTGAAGCTCAAGCTCCTAATGATAGCCATTGAGTACAAGTCTGCCAACCGA 1920

621 LCFVKLKLLMIAIEYKSANR

1921 GAGAGCCGTATATTAATTAATCCTGGAAACCATCTTAAGATCCAAGAAGGTACTTTAGGA 198 0

641 ESRILINPGNHLKIQEGTLG

1981 TTTTTCATCGCAAGTGATGCCAAAGAAGTTAAAAGGGCATTTTTTTACTGCAAGGCCTGT 2040

661 FFIASDAKEVKRAFFYCKA

2041 CATGATGACATCACAGATCCCAAAAGAATAAAAAAATGTGGCTGCAAACGGCTTGAAGAT 2100

681 HDDITDPKRIKKCGCKRLED

2101 GAGCAGCCGTCAACACTATCACCAAAAAAAAAGCAACGGAATGGAGGCATGCGGAACTCA 2160

701 EQPSTLSPKKKQRNGGMRNS

2161 CCCAACACCTCGCCTAAGCTGATGAGGCATGACCCCTTGTTAATTCCTGGCAATGATCAG 2220

721 PNTSPKLMRHDPLLIPGNDQ

2221 ATTGACAACATGGACTCCAATGTGAAGAAGTACGACTCTACTGGGATGTTTCACTGGTGT 2280

741 IDNMDSNVKKYDSTGMFHWC

2281 GCACCCAAGGAGATAGAGAAAGTCATCCTGACTCGAAGTGAAGCTGCCATGACCGTCCTG 2340

761 APKEIEKVILTRSEAA TVL

2341 AGTGGCCATGTCGTGGTCTGCATCTTTGGCGACGTCAGCTCAGCCCTGATCGGCCTCCGG 2400

781 SGHVVVCIFGDVSSALIGLR

2401 AACCTGGTGATGCCGCTCCGTGCCAGCAACTTTCATTACCATGAGCTCAAGCACATTGTG 2460

801 NLV PLRASNFHYHELKHIV

2461 TTTGTGGGCTCTATTGAGTACCTCAAGCGGGAATGGGAGACGCTTCATAACTTCCCCAAA 2520

821 FVGSIEYLKREWETLHNFPK

- 13 046506

2521 GTGTCCATATTGCCTGGTACGCCATTAAGTCGGGCTGATTTAAGGGCTGTCAACATCAAC 2580

841 VSILPGTPLSRADLRAVNIN

2581 CTCTGTGACATGTGCGTTATCCTGTCAGCCAATCAGAATAATATTGATGATACTTCGCTG 2640

861 LCDMCVILSANQNNIDDTSL

2641 CAGGACAAGGAATGCATCTTGGCGTCACTCAACATCAAATCTATGCAGTTTGATGACAGC 2700

881 QDKECILASLNIKSMQFDDS

2701 ATCGGAGTCTTGCAGGCTAATTCCCAAGGGTTCACACCTCCAGGAATGGATAGATCCTCT 2760

901 IGVLQANSQGFTPPGMDRSS

2761 CCAGATAACAGCCCAGTGCACGGGATGTTACGTCAACCATCCATCACAACTGGGGTCAAC 2820

921 PDNSPVHGMLRQPSITTGVN

2821 ATCCCCATCATCACTGAACTAGTGAACGATACTAATGTTCAGTTTTTGGACCAAGACGAT 2880

941 IPIITELVNDTNVQFLDQDD

2881 GATGATGACCCTGATACAGAACTGTACCTCACGCAGCCCTTTGCCTGTGGGACAGCATTT 2940

961 DDDPDTELYLTQPFA GTAF

2941 GCCGTCAGTGTCCTGGACTCACTCATGAGCGCGACGTACTTCAATGACAATATCCTCACC 3000

981 AVSVLDSLMSATYFNDNILT

3001 CTGATACGGACCCTGGTGACCGGAGGAGCCACGCCGGAGCTGGAGGCTCTGATTGCTGAG 3060

1001 LIRTLVTGGATPELEALIAE

3061 GAAAACGCCCTTAGAGGTGGCTACAGCACCCCGCAGACACTGGCCAATAGGGACCGCTGC 3120

1021 ENALRGGYSTPQTLANRDRC

3121 CGCGTGGCCCAGTTAGCTCTGCTCGATGGGCCATTTGCGGACTTAGGGGATGGTGGTTGT 3180

1041 RVAQLALLDGPFADLGDGGC

3181 TATGGTGATCTGTTCTGCAAAGCTCTGAAAACATATAATATGCTTTGTTTTGGAATTTAC 3240

1061 YGDLFCKALKTYNMLCFGIY

3241 CGGCTGAGAGATGCTCACCTCAGCACCCCCAGTCAGTGCACAAAGAGGTATGTCATCACC 3300

1081 RLRDAHLSTPSQCTKRYVIT

3301 AACCCGCCCTATGAGTTTGAGCTCGTGCCGACGGACCTGATCTTCTGCTTAATGCAGTTT 3360

1101 NPPYEFELVPTDLIFCLMQF

3361 GACCACAATGCCGGCCAGTCCCGGGCCAGCCTGTCCCATTCCTCCCACTCGTCGCAGTCC 3420

1121 DHNAGQSRASLSHSSHSSQS

3421 TCCAGCAAGAAGAGCTCCTCTGTTCACTCCATCCCATCCACAGCAAACCGACAGAACCGG 3480

1141 SSKKSSSVHSIPSTANRQNR

3481 CCCAAGTCCAGGGAGTCCCGGGACAAACAGAAGTACGTGCAGGAAGAGCGGCTT 3538 (SEQ ID NO:

7)

1161 PKSRESRDKQKYVQEERL (SEQ ID NO: 8)

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает клетку гладкой мышцы, которая экспрессирует последовательность экзогенной ДНК, кодирующую белок, участвующий в регуляции тонуса гладких мышц. Используемый в данном документе термин экзогенная означает любую ДНК, которая вводится в организм или клетку. В некоторых вариантах осуществления экзогенная последовательность ДНК кодирует hSlo.

Фармацевтические композиции.

Фармацевтическая композиция представляет собой состав, содержащий один или несколько активных ингредиентов, а также одно или несколько вспомогательных веществ, носителей, стабилизаторов или объемообразующих средств, который подходит для введения пациенту-человеку для достижения желаемого диагностического результата или терапевтического или профилактического эффекта. Для стабильности при хранении и удобства обращения фармацевтическая композиция может быть составлена в виде лиофилизированного (то есть высушенного путем замораживания) или высушенного в вакууме порошка, который может быть разведен в солевом растворе или воде перед введением пациенту. Альтерна

- 14 046506 тивно, фармацевтическая композиция может быть составлена в виде водного раствора. Фармацевтическая композиция может содержать белковый активный ингредиент. Различные вспомогательные вещества, такие как альбумин и желатин, использовались с разной степенью успеха, чтобы попытаться стабилизировать белковый активный ингредиент, присутствующий в фармацевтической композиции. Кроме того, криопротекторы, такие как спирты, используются для уменьшения денатурации белка в условиях замораживания при лиофилизации. Фармацевтические композиции, подходящие для внутреннего применения, включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального получения стерильных растворов или дисперсий для инъекций. Для внутривенного введения подходящие носители включают физиологический солевой раствор, бактериостатическую воду или фосфатносолевой буфер (PBS). Во всех случаях композиция должна быть стерильной и должна быть жидкой до такой степени, чтобы ее можно было легко вводить через шприц. Она должна быть стабильной в условиях получения и хранения и должна быть защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки. Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и тому подобное) и их подходящие смеси. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем использования поверхностно-активных веществ, таких как полисорбаты (Tween.TM.), додецилсульфат натрия (лаурилсульфат натрия), лаурилдиметиламиноксид, цетилтриметиламмонийбромид (СТАВ), полиэтоксилированные спирты, полиоксиэтиленсорбитан, октоксинол (Triton X100.TM.), ХН-диметилдодециламин-Н-оксид. гексадецилтриметиламмония бромид (НТАВ), простой лауриловый эфир полиоксила 10, Brij 721.TM, соли желчных кислот (дезоксихолат натрия, холат натрия), плюроновые кислоты (F-68, F-127), полиоксил касторового масла (Cremophor.TM.), этоксилат нонилфенола (Tergitol.TM), циклодекстрины и этилбензетония хлорид (Hyamine.TM.). Предотвращение действия микроорганизмов может быть достигнуто с помощью различных антибактериальных и противогрибковых средств, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимеросала и тому подобных. Во многих случаях будет предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, например, сахара, полиспирты, такие как манит, сорбит, хлорид натрия. Длительная абсорбция композиций для внутреннего применения может быть достигнута путем включения в композицию средства, которое задерживает абсорбцию, например моностеарата алюминия и желатина.

Стерильные растворы могут быть получены путем включения активного соединения в необходимом количестве в подходящий растворитель с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, по мере необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием. Как правило, дисперсии получают путем включения активного соединения в стерильную среду-носитель, которая содержит основную дисперсионную среду и необходимые другие ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных растворов для инъекций способами получения являются вакуумная сушка и сушка путем замораживания, которые обеспечивают получение порошка активного ингредиента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из их предварительно стерильно отфильтрованного раствора. Фармацевтические композиции могут быть включены в контейнер, упаковку или дозатор вместе с инструкциями для введения.

Некоторые композиции согласно настоящему изобретению также включают соединения-носители в состав. Используемый здесь термин соединение-носитель или носитель может относиться к нуклеиновой кислоте или ее аналогу, которая является инертной (то есть сама по себе не обладает биологической активностью), но распознается как нуклеиновая кислота процессами, происходящими in vivo, которые снижают биодоступность нуклеиновой кислоты, обладающей биологической активностью, например, путем разрушения биологически активной нуклеиновой кислоты или способствования ее удалению из кровообращения. Совместное введение нуклеиновой кислоты и соединения-носителя, как правило, с избытком последнего вещества может привести к значительному снижению содержания нуклеиновой кислоты, обнаруживаемой в печени, почках или других резервуарах вне кровообращения, предположительно из-за конкуренции между соединением-носителем и нуклеиновой кислотой за общий рецептор. Например, обнаружение частично модифицированного фосфоротиоатом олигонуклеотида в ткани печени может быть снижено при осуществлении его введения совместно с полиинозиновой кислотой, декстрансульфатом, полицитидной кислотой или 4-ацетамидо-4'-изотиоциано-стильбен-2,2'-дисульфоновой кислотой (Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183). Вектор может быть включен в фармацевтические композиции для введения пациентам, представляющим собой млекопитающих, в частности людям. Вектор или вирионы могут быть составлены с нетоксичными инертными фармацевтически приемлемыми водными носителями, предпочтительно при pH в диапазоне от 3 до 8, более предпочтительно в диапазоне от 6 до 8, наиболее предпочтительно в диапазоне от 6,8 до 7,2. Такие стерильные композиции будут содержать вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую терапевтическую молекулу, растворенный в водном буфере, характеризующимся приемлемым pH при разведении.

В некоторых аспектах фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, содержат терапевтически эффективное количество вектора в смеси с фармацевтически приемлемым носи

- 15 046506 телем и/или вспомогательным веществом, например солевым раствором, фосфатно-солевым буфером, фосфатом и аминокислотами, полимерами, полиолами, сахаром, буферами, консервантами и другими белками. Иллюстративными аминокислотами, полимерами и сахарами и т. п. являются соединения октилфеноксиполиэтоксиэтанола, соединения моностеарата полиэтиленгликоля, сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот, сахароза, фруктоза, декстроза, мальтоза, глюкоза, маннит, декстран, сорбит, инозитол, галактитол, ксилит, лактоза, трегалоза, бычий или человеческий сывороточный альбумин, цитрат, ацетат, растворы Рингера и Хэнка, цистеин, аргинин, карнитин, аланин, глицин, лизин, валин, лейцин, поливинилпирролидон, полиэтилен и гликоль.

В некоторых аспектах фармацевтическая композиция, предусмотренная в данном документе, содержит буфер, такой как фосфатно-солевой буфер (PBS) или натрий-фосфатный/натрий-сульфатный буфер, трис-буфер, глициновый буфер, стерильную воду и другие буферы, известные специалисту, такие как описанные в Good et al. (1966) Biochemistry 5:467. Предпочтительная фармацевтическая композиция содержит фосфат натрия, хлорид натрия и сахарозу.

В некоторых аспектах фармацевтическая композиция, предусмотренная в данном документе, содержит вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, сорбит, сахароза или декстран, в количестве приблизительно 1-30 процентов, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 процентов (об./об.). Предпочтительно сахароза составляет приблизительно 10-30% (об./об.), наиболее предпочтительно сахароза составляет приблизительно 20% (об./об.).

Перед введением фармацевтическая композиция не содержит компонентов, используемых в ходе получения, например, компонентов культуры, белка клетки-хозяина, ДНК клетки-хозяина, плазмидной ДНК и по сути не содержит загрязнений микоплазмами, эндотоксинами и микроорганизмами. Предпочтительно фармацевтическая композиция характеризуется менее 10, 5, 3, 2 или 1 КОЕ/мазок. Наиболее предпочтительно композиция характеризуется 0 КОЕ/мазок. Уровень эндотоксина в фармацевтической композиции составляет менее 20 ЕЭ/мл, менее 10 ЕЭ/мл или менее 5 ЕЭ/мл.

Наборы.

Композиции и реагенты, полезные для настоящего изобретения, могут быть упакованы в наборы для облегчения применения настоящего изобретения. В некоторых аспектах способ по настоящему изобретению предусматривает набор, содержащий рекомбинантную нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению. В некоторых аспектах способ по настоящему изобретению предусматривает набор, содержащий рекомбинантный вирус по настоящему изобретению. Инструкции могут быть в любой желаемой форме, включая без ограничения напечатанные на вкладыше набора, напечатанные на одном или нескольких контейнерах, а также хранимые в электронном виде инструкции, предоставленные на электронном носителе данных, таком как машиночитаемый носитель данных. Также необязательно включен пакет программного обеспечения на машиночитаемом носителе данных, который позволяет пользователю интегрировать информацию и рассчитывать контрольную дозу.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает набор, содержащий фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе. В еще одном аспекте изобретение предусматривает наборы для лечения заболеваний. В одном аспекте набор содержит: (а) рекомбинантный вирус, предусмотренный в данном документе, и (б) инструкции по введению в клетки или индивидууму терапевтически эффективного количества рекомбинантного вируса. В некоторых аспектах набор может содержать фармацевтически приемлемые соли или растворы для введения рекомбинантного вируса. Необязательно, набор может дополнительно содержать инструкции для подходящих рабочих параметров в форме этикетки или отдельного вкладыша. Например, в наборе могут находиться стандартные инструкции, информирующие врача или лаборанта в отношении получении дозы рекомбинантного вируса.

Необязательно набор может дополнительно содержать информацию в отношении стандарта или контроля для того, чтобы образец пациента можно было сравнить с контрольной информацией в отношении стандарта, чтобы определить, является ли тестируемое количество рекомбинантного вируса терапевтическим количеством. Необязательно набор может дополнительно содержать устройства для введения, такие как шприц, игла с фильтром, удлинительная трубка и канюля. Определения

Композиции и способы согласно настоящему изобретению, как описано в данном документе, могут предусматривать использование, если не указано иное, общепринятых методик и описаний молекулярной биологии (включая рекомбинантные методики), клеточной биологии, биохимии, иммунохимии и офтальмологии, которые известны специалистам в данной области техники. Такие общепринятые способы включают в себя способы наблюдения и анализа сетчатки или зрения у субъекта, клонирования и распространения рекомбинантного вируса, составления фармацевтической композиции и биохимической очистки и иммунохимии. Конкретные иллюстративные примеры подходящих методик можно получить посредством ссылки на приведенные в данном документе примеры. Однако эквивалентные общепринятые процедуры, конечно, также могут быть использованы. Такие общепринятые методы и описания можно найти в стандартных лабораторных руководствах, таких как

- 16 046506

Green, et al.,

Eds., Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV) (1999); Weiner, et al., Eds.,

Genetic Variation: A Laboratory Manual (2007); Dieffenbach, Dveksler, Eds., PCR Primer: A

Laboratory Manual (2003); Bowtell and Sambrook, DNA Microarrays: A Molecular Cloning

Manual (2003); Mount, Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis (2004); Sambrook and

Russell, Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2006) и

Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2002) (все от Cold Spring

Harbor Laboratory Press); Stryer, L., Biochemistry (4th Ed.) W.H. Freeman, N.Y. (1995); Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach IRL Press, London (1984); Nelson and Cox, Lehninger, Principles of Biochemistry, 3rd Ed., W.H. Freeman Pub., New York (2000) и Berg et al., Biochemistry, 5th Ed., W.H. Freeman Pub., New York (2002), все из которых полностью включены в данный документ посредством ссылки для любых целей. Используемые в данном документе формы единственного числа предназначены также для включения форм множественного числа, если контекст явно не указывает на иное. Кроме того, в той степени, в которой термины включая, включает, имеющий, имеет, с или их варианты используются в подробном описании и/или формуле изобретения, такие термины предназначены для включения, аналогично термину содержащий.

Диапазоны могут быть выражены в данном документе как от приблизительно одного конкретного значения и/или до приблизительно другого конкретного значения. В другом случае такой диапазон при его указании включает значения от одного конкретного значения и/или до другого конкретного значения. Подобным образом, когда значения выражены в виде аппроксимаций с использованием предваряющего слова приблизительно, будет понятно, что конкретное значение представляет собой другой случай. Кроме того, будет понятно, что конечные точки каждого из диапазонов являются значимыми как по отношению к другой конечной точке, так и независимо от другой конечной точки. Используемый в данном документе термин приблизительно относится к диапазону, который составляет плюс или минус 15% от заявленного числового значения в контексте конкретного использования. Например, приблизительно 10 будет включать диапазон от 8,5 до 11,5. Термин приблизительно также учитывает типичную ошибку или неточность измерения значений.

В контексте настоящего изобретения термин осуществление лечения или лечение, как используется в данном документе, означает регрессию, уменьшение выраженности, подавление развития или предупреждение нарушения или состояния, в отношении которого применяют такой термин, или одного или нескольких симптомов такого нарушения или состояния (например, синдрома идиопатической гиперактивности мочевого пузыря).

Согласно настоящему изобретению термин пациент или пациент, нуждающийся в этом предназначен для человека или млекопитающего, не являющегося человеком, затронутых, или которые, вероятно, могут быть затронуты синдромом идиопатического гиперактивного мочевого пузыря.

Используемый в данном документе термин детрузор или мышца детрузора означает мышцу мочевого пузыря. Под внутридетрузорно подразумевается введение в мышцу детрузора.

Как подразумевается в данном документе, выражение выделенная нуклеиновая кислота относится к любому типу выделенной нуклеиновой кислоты, в частности она может быть природной или синтетической, ДНК или РНК, одноцепочечной или двухцепочечной. В частности, если нуклеиновая кислота является синтетической, она может содержать неприродные модификации оснований или связей, в частности для повышения устойчивости к деградации нуклеиновой кислоты. Когда нуклеиновая кислота представляет собой РНК, модификации, в частности, включают кэпирование ее концов или модификацию 2'-положения рибозного остова, чтобы снизить реакционную способность гидроксильной группы, например, путем подавления гидроксильной группы (с получением 2'-дезоксирибозы или 2'дезоксирибозо-2'-фторибозы) или замены гидроксильной группы алкильной группой, такой как метильная группа (с получением 2'-О-метилрибозы).

Две аминокислотные последовательности или последовательности нуклеиновых кислот являются по сути гомологичными или по сути аналогичными, когда более 80%, предпочтительно более 85%, предпочтительно более 90% аминокислотных последовательностей или последовательностей нуклеиновых кислот являются идентичными или более чем приблизительно 90%, предпочтительно более 95% являются схожими (функционально идентичными). Чтобы определить процентную идентичность двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеиновых кислот, последовательности выравнивают с целью оптимального сравнения (например, могут быть добавлены гэпы в первой аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты для оптимального выравнивания со

- 17 046506 второй аминокислотой последовательностью или последовательностью нуклеиновой кислоты). Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих аминокислотных положениях или нуклеотидных положениях. Когда положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, то молекулы в этом положении идентичны. Процентная идентичность между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений, являющихся общими для последовательностей. В одном варианте осуществления две последовательности имеют одинаковую длину. Определение процентной идентичности между двумя последовательностями может быть выполнено с использованием математического алгоритма. Предпочтительно аналогичные или гомологичные последовательности идентифицируются путем выравнивания с использованием, например, программы наложения GCG (Genetics Computer Group, Руководство по работе с программным пакетом GCG, версия 7, Мадисон, Висконсин) или любого из алгоритмов сравнения последовательностей, таких как BLAST, FASTA и др.

Используемый в данном документе термин вектор относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она была связана. Одним типом вектора является плазмида, которая относится к кольцевой двухцепочечной петле ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации, и эписомальные векторы для экспрессии в млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы для экспрессии в млекопитающих) интегрируются в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина и, таким образом, реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы, векторы экспрессии, способны управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны.

Другие варианты осуществления.

Хотя настоящее изобретение было описано в сочетании с его подробным описанием, вышеприведенное описание предназначено для иллюстрации, а не для ограничения объема изобретения, который определяется объемом прилагаемой формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации находятся в пределах объема следующей формулы изобретения.

Примеры

Пример 1. Доклинические исследования в отношении переноса гена hMaxi-K.

Крысы.

Патофизиология частичной обструкции выходного отверстия мочеиспускательного канала в крысиной модели повторяет многие важные аспекты соответствующих симптомов, проявляемых в отношении нижних мочевыводящих путей, наблюдаемых у людей. Отмеченные физиологические и патофизиологические сходства дают основания предположить, что исследования на мочевом пузыре крысы позволят понять, по крайней мере, некоторые аспекты физиологии и дисфункции мочевого пузыря человека.

Поскольку физиология мочевого пузыря крысы аналогична многим аспектам мочевого пузыря человека, в ходе исследований была изучена потенциальная применимость предусматривающей введение в мочевой пузырь К-канала генной терапии с использованием кДНК hSlo (т. е. канала maxi-K) для улучшения проявлений гиперактивности мочевого пузыря в модели крыс с частичной обструкцией выходного отверстия мочеиспускательного канала.

В одном исследовании двадцать две самки крыс Sprague-Dawley были подвергнуты частичной обструкции уретры (то есть выходного отверстия мочеиспускательного канала, PUO), при этом 17 ложнооперированных контрольных крыс изучали параллельно. После 6 недель обструкции надлобковые катетеры хирургическим путем помещали в купол мочевого пузыря у всех крыс. Двенадцати крысам с обструкцией инсталлировали в мочевой пузырь 100 мкг hSlo/pcDNA в 1 мл 20% сахарозы в PBS во время катетеризации, и еще 10 крыс с обструкцией получали 1 мл 20% сахарозы в PBS (7 крыс) или 1 мл 20% сахарозы в PBS, содержащей только pcDNA (3 крысы). Через два дня после хирургической операции для всех животных проводили цистометрию для изучения характеристик рефлекса мочеиспускания у бодрствующих крыс в условиях свободного поведения. Обструкция была связана с увеличением веса мочевого пузыря в три-четыре раза и изменениями практически каждого значения оценки параметров мочеиспускания (см. табл. 1).

Крысы с обструкцией, которым вводили 20% сахарозу в PBS, регулярно проявляли спонтанные сокращения мочевого пузыря между мочеиспусканиями. В отличие от этого, инъекция hSlo устраняла гиперактивность мочевого пузыря, связанную с обструкцией, без заметного влияния на любой другой цистометрический параметр. Предположительно, экспрессия hSlo в мочевом пузыре у крыс функционально противодействует повышенной сократительной способности, обычно наблюдаемой у животных с обструкцией, и, таким образом, улучшает проявления гиперактивность мочевого пузыря.

В другом исследовании была изучена способность переноса гена hSlo изменять и/или улучшать флуктуации давления между мочеиспусканиями, наблюдаемые в модели самцов крыс с обструкцией. Для этих исследований крыс подвергали обструкции в течение 2 недель с использованием промежностного доступа. После 2 недель обструкции крыс катетеризировали для цистометрических исследований и по

- 18 046506 мещали в 1 из 2 групп лечения. Контрольные крысы одной возрастной группы подвергали ложной обструкции и изучали параллельно.

Средние значения параметров мочеиспускания у всех подопытных животных приведены в табл. 2, а отличительные характеристики из данных сведений графически изображены на фиг. 1 и 2. Важно отметить, что, как и при исследовании на самке крысы с 6-недельной обструкцией, однократная внутрипузырная инстилляция 100 мкг hSlo/pVAX была связана со статистически достоверными изменениями нескольких параметров мочеиспускания, имеющих большое физиологическое значение. В третьем исследовании оценивали эффекты переноса гена hSlo после 2 недель частичной обструкции выходного отверстия мочеиспускательного канала у самок крыс. Чтобы создать частичную обструкцию выходного отверстия мочеиспускательного канала (PUO), лигатура была помещена на мочеиспускательный канал самок крыс Sprague-Dawley весом 200-250 г (Christ et al., 2001), как описано выше. Через две недели после наложения лигатуры крыс подвергали хирургической операции по установке надлобкового катетера. Через два дня исследования функции мочевого пузыря (то есть цистометрия) были выполнены на бодрствующих крысах в условиях свободного поведения, находящихся в метаболических клетках. Как показано в табл. 3 и на фиг. 3, после 2 недель частичной обструкции выходного отверстия мочеиспускательного канала у самок крыс наблюдаются значительные изменения в отношении функции мочевого пузыря, о чем свидетельствует более чем двукратное увеличение емкости мочевого пузыря и появление значительных спонтанных сокращений мочевого пузыря. Повышенные спонтанные сокращения мочевого пузыря наблюдались как флуктуации давления между мочеиспусканиями (см. фиг. 3), и их можно количественно определить, как показано в табл. 3, по соответствующему увеличению, наблюдаемому для значений SA и IMP. Однократная внутрипросветная инъекция в мочевой пузырь 300 мкг и 1000 мкг pVAX/hSlo (в 1 мл 20% сахарозы в PBS) приводила к почти полному устранению гиперактивности детрузора. Этот эффект отражается в значительном снижении IMP и SA у крыс с обструкцией, которые получали hSlo, по сравнению с крысами, получавшими только вектор pVAX (см. табл. 3). Хотя истинная взаимосвязь эффекта в отношении DO для переноса гена hSlo не была показана в этой модели, это исследование продемонстрировало, что при вариации DO на 1 log-единицу (от 100 до 1000 мкг) имеется статистически достоверное и, более того, физиологически значимое уменьшение DO при отсутствии какого-либо обнаруживаемого влияния на способность мочевого пузыря к опорожнению. Таким образом, в данной животной модели pVAX/hSlo способен улучшать патофизиологические эффекты DO, связанной с обструкцией оттока, без какого-либо вредного влияния на функцию мочевого пузыря. Подобные эффекты наблюдались после инстилляции 100 мкг pVAX/hSlo у самок крыс Sprague Dawley с 6-недельной обструкцией, которые показаны ниже. Исследование на кроликах для оценки распределения различных объемов при переносе генов, введенных в стенку мочевого пузыря, выполняли до начала проведения клинического испытания у женщин с ОАВ с использованием прямых внутрипузырных инъекций (табл. 4). Использовали девять самок взрослых новозеландских белых кроликов весом в среднем 6 фунтов. Животных анестезировали и вводили pVAX-lacz в детрузор в аликвотах по 0,05, 0,1 и 0,15 мл в 4, 8 и 10 участков стенки мочевого пузыря. Дополнительной группе из 3 животных вводили только носитель только в самом большом объеме носителя (4, 8 или 10 участковх0,15 мл). Плазмиды находились в растворе в концентрации 4000 мкг/мл. Через неделю животных умерщвляли, а мочевые пузыри извлекали и взвешивали. Области, выделенные синим цветом, подготавливали для гистологического и молекулярного анализов. Молекулярный анализ экспрессирующей hSlo ткани проводили с помощью экстракции РНК и ПЦР в реальном времени. Кроме того, проводили гистопатологическое исследование различных тканей кролика. Из-за трудностей, связанных с осуществлением прямых инъекций в мочевой пузырь в данной животной модели, инъекцию 0,05 мл получал только один кролик. Шести кроликам вводили 0,1 мл в 4, 8 и 10 участков (3 изнутри мочевого пузыря; 3 снаружи мочевого пузыря). Трем кроликам вводили 0,15 мл в 4, 8 и 10 участков. Результаты показали, что кролики с большим количеством инъекций (8-10 инъекций) характеризовались меньшей экспрессией, чем некоторые животные с наименьшим количеством инъекций (4 инъекции). Общий вывод состоит в том, что прямая инъекция в стенку мочевого пузыря приводит к экспрессии гена, однако, по-видимому, наибольшая эффективность достигается при более широком рассредоточении инъекций, возможно, на расстоянии 1 см друг от друга. Ген выявляли в крови не позднее 30 мин после обработки. Из-за наложения швов наблюдались гранулематозные поражения (распространенный артефакт в модели кролика).

Токсикология.

Для показания ОАВ технически невозможно моделировать тот же трансуретральный путь внутрипузырного введения pVAX/hSlo у крыс, который будет использоваться в исследованиях с участием людях. Поэтому в исследованиях токсикологии и биораспределения, оценивающих внутрипузырную инъекцию pVAX/hSlo, к мочевому пузырю животных получали доступ хирургическим путем, а исследуемый материал вводился непосредственно в мочевой пузырь с помощью иглы Эффект pVAX/hSlo в отношении гематологических и химических показателей оценивали у пятнадцати нормальных самок крыс SpragueDawley весом 275-300 г. 1000 мкг либо вектора pVAX/hSlo (8 животных), либо вектора pVAX (7 животных) вводили непосредственно в просвет мочевого пузыря после получения доступа хирургическим путем. Образцы крови собирали посредством прокола сердца сразу после того, как животных умерщвляли с

- 19 046506 помощью анестезии с использованием CO2 через 4, 8 и 24 ч и через 1 неделю после введения испытуемого материала. Образцы анализировали на глюкозу, азот мочевины, креатинин, общий белок, общий билирубин, щелочную фосфатазу, ALT, AST, холестерин, натрий, калий, хлорид, соотношение A/G, соотношение BUN/креатинин, глобулин, липазу, амилазу, триглицериды, СРК, GTP, магний и осмоляльность. Лабораторные параметры были сходными между pVAX/hSlo и контролями в четырех временных точках.

Эффект pVAX/hSlo в отношении гистопатологии у самок крыс Sprague-Dawley (275-300 г) оценивали в двух исследованиях. В первом исследовании четырем крысам выполняли операцию по частичной обструкции мочевого пузыря, а спустя 2 недели вводили 100 мкг pVAX/hSlo в 1000 мкл 20% сахарозы в PBS непосредственно в просвет мочевого пузыря посредством обеспечения хирургического доступа к мочевому пузырю. По одному животному умерщвляли через 1, 8 и 24 ч и через одну неделю после введения pVAX/hSlo. Ткани 47 органов немедленно фиксировали в 10% формалине и обрабатывали для рутинного гистопатологического исследования. Гистопатологические изменения отмечали только в мочевом пузыре и состояли из серозита, отека, кровоизлияния и фиброза. Эти изменения соответствовали ожидаемым изменениям при частичной обструкции мочеиспускательного канала и не рассматривались как связанные с инъекцией pVAX/hSlo.

Ввиду гистопатологических изменений в мочевом пузыре крыс с PUO, которым вводили pVAX/hSlo, оценивали эффект pVAX/hSlo по сравнению с вектором (pVAX) и 20% сахарозы в PBS в отношении гистологии мочевого пузыря у нормальных крыс. После обеспечения доступа хирургическим путем непосредственно в просвет мочевого пузыря вводили следующий тестируемый материал: 1) 0,6 мл 20% сахарозы в PBS, 2) 1000 мкг pVAX в 0,6 мл 20% сахарозы в PBS или 3) 1000 мкг pVAX/hSlo в 0,6 мл 20% сахарозы в PBS. Животных умерщвляли с помощью CO2 через 72 ч после инстилляции и мочевые пузыри удаляли и немедленно фиксировали в 10% растворе формалина. Временную точку в 72 ч выбирали для ограничения механического воздействия прокола иглой на стенку мочевого пузыря и сведения к минимуму любых возможных эффектов воспаления, которые могут быть вызваны pVAX/hSlo, вектором или разбавителем. При осмотре мочевого пузыря не было выявлено никаких макроскопических изменений. В целом, не было выявлено никаких связанных с лечением различий между pVAX/hSlo и средойносителем или pVAX. Никаких связанных с лечением изменений в уротелии отмечено не было. Повреждения, видимые при гистологическом исследовании, соответствовали травме от иглы, использованной для инъекции, поскольку они были очаговыми, а не диффузными или многоочаговыми по распределению. В исследовании биораспределения испытуемый материал вводили непосредственно в просвет обнаженных мочевых пузырей нормальных самок крыс Sprague-Dawley весом 275-300 г. 1000 мкг pVAX/hSlo в 0,6 мл 20% сахарозы в PBS вводили 12 животным, и 0,6 мл 20% сахарозы в PBS вводили 5 животным (фиг. 4). По четыре животных умерщвляли через 24 ч, 1 неделю и 1 месяц после введения испытуемого материала. Образцы тканей собирали в следующем определенном порядке: сердце, печень, мозг, почка, селезенка, легкое, аорта, трахея, лимфатический узел, глаз, бицепс, толстая кишка, влагалище и матка.

Образцы геномной ДНК анализировали на ген канамицина с помощью валидированного способа QPCR. Результаты показывают, что после инъекции 1000 мкг pVAX/hSlo плазмиду можно обнаружить через 24 ч в аорте, матке, мочевом пузыре и уретре. Через 1 неделю в мочевом пузыре было измерено примерно 13 миллионов копий/мкг общей ДНК, а в бицепсах в незначительной степени также можно было выявить pVAX/hSlo. Результаты изображены в графическом виде на фиг. 4 (ниже).

Хотя эти результаты отличаются от результатов после интракавернозной инъекции, выявление 13 млн копий/мкг общей ДНК по-прежнему ниже, чем количество, составляющее <30 копий плазмиды/10 клеток-хозяев, которое поддерживается в месте инъекций ДНК-вакцины после 60 дней в клинических исследовательских испытаниях нового лекарственного средства (IND), проводимых для этих вакцин. Эти исследования ДНК-вакцины показали, что внутримышечная, подкожная, внутрикожная или биобаллистическая доставка не приводила к длительному присутствию плазмиды в эктопических участках. Кроме того, процедура введения pVAX/hSlo непосредственно в обнаженный хирургическим путем мочевой пузырь животных может объяснить возможность обнаружения плазмиды в ткани, отличной от мочевого пузыря. У людей hMaxi-K будут инсталлировать непосредственно в мочевой пузырь с использованием трансуретрального катетера, и риск распространения плазмиды из-за повреждения ткани или травмы, очевидно, заметно снижается.

Пример 2. Клиническое испытание переноса гена hMaxi-K, проводимое с участием людей.

Схема клинического испытания.

Данное исследование является многоцентровым исследованием фазы 1В, оценивающим безопасность и потенциальную активность двух возрастающих доз гена hMaxi-K, вводимых в виде прямой инъекции в стенку мочевого пузыря женщин с идиопатическим (не являющимся нейрогенным) синдромом гиперактивного мочевого пузыря (ОАВ) и гиперактивностью детрузора (DO).

Исследуемая популяция представляет собой женщин возрастом >18 лет, не обладающих детородным потенциалом (например, подвергнутых гистерэктомии, лигированию маточных труб или в постменопаузе, определяемой как последний менструальный цикл, произошедший за >12 месяцев до включения в исследование, или FSH в сыворотке >40 мМЕ/л), с гиперактивным мочевым пузырем (ОАВ) и гиперак

- 20 046506 тивностью детрузора, которые в остальном здоровы.

Критерии включения включают клинические симптомы гиперактивного мочевого пузыря продолжительностью >6 месяцев, включая по меньшей мере одно из следующего.

1. Частое мочеиспускание (> 8/24 ч).

2. Симптомы ургентности (жалоба на внезапное непреодолимое желание к мочеиспусканию, которое трудно отложить) или никтурия (жалоба на пробуждение ночью два или более раз для осуществления опорожнения).

3. Ургентное недержание мочи (в среднем 5 раз в неделю, при этом ургентное недержание мочи определяют как жалобу на непроизвольную утечку, сопровождающуюся или немедленно следующую за ургентностью).

У участников также сканировали мочевой пузырь при скрининге, демонстрируя остаточный объем <200 мл и задокументированную во время уродинамического исследования исходного уровня гиперактивность детрузора >1 неконтролируемому сокращению(-иям) детрузора при по меньшей мере 5 см/Н₂О.

В табл. 6 показаны обзор схемы лечения и процедур согласно визитам. Основной целью этого исследования является оценка возникновения нежелательных явлений и их связь с однократным лечением, предусматривающим примерно 20-30 внутримышечных инъекций hMaxi-K в стенку мочевого пузыря, по сравнению с плацебо (20% сахарозы в PBS). Данное исследование представляло собой двойное слепое несбалансированное плацебо-контролируемое испытание с последовательным введением доз. Участниками были здоровые женщины в возрасте 18 лет и старше, не обладающие детородным потенциалом, с умеренной OAB/DO продолжительностью > шести месяцев, сопровождающейся по меньшей мере одним из следующего: частыми мочеиспусканиями > 8 раз в день, симптомами ургентности или никтурии (жалобой на пробуждение ночью два или более раз для осуществления опорожнения), ургентным недержанием мочи (пятью или более эпизодами недержания в неделю) и гиперактивностью детрузора с >1 неконтролируемым фазическим сокращением(ми) детрузора при давлении по меньшей мере 5 см/Н₂О, задокументированном на CMG. Для всех участников предыдущее лечение антихолинергическими препаратами не было эффективным. Для четверых терапия ботулиническим токсином типа А не была эффективной.

Участникам случайным образом назначали либо hMaxi-K в одной из двух доз (16000 мкг или 24000 мкг), либо плацебо. Лечение проводилось в виде 20-30 внутримышечных инъекций в стенку мочевого пузыря во время цистоскопии. Участников осматривали 8 раз в течение 24-недельного периода со следующим после исследования наблюдением через 18 месяцев. Все сообщаемые нежелательные явления, возникающие после введения доз исследуемого лекарственного средства, были зарегистрированы. Комплексные CMG проводили при скрининговом визите 1А (неделя - 1) и на неделе 4 (визит 5) и на неделе 24 (визит 8) после инъекции. Остаточное содержание мочи (PVR) измеряли при каждом визите с помощью Bladderscan®.

Данные для оценки эффективности оценивали с использованием сводной описательной статистики по группам лечения (комбинированные группы с плацебо относительно 2 групп активного лечения и комбинированные группы с плацебо относительно комбинированные группы лечения). Линейные модели со смешанными эффектами использовали для оценки различий в изменениях по сравнению с исходным уровнем между плацебо и активным лечением, а также для проверки, присутствовала ли зависимость доза-реакция для разных результатов. Модели обобщенных оценочных уравнений (GEE) использовали для оценки эффектов для бинарных конечных точек. Имелось 6 участников, которые получали 16000 мкг, 3 участника, которые получали 24000 мкг, и 4 участника, которые получали плацебо. В обеих группах активного лечения большинство нежелательных явлений (АЕ) характеризовались легкой степенью тяжести, и все они считались не связанными с исследуемым лекарственным средством. После лечения hMaxi-K у двух женщин наблюдались умеренные не связанные с ним инфекции мочеполовых путей: одна получала 24000 мкг в месяц после введения дозы, а другая получала 16000 мкг через 6 месяцев после введения дозы. В группе, получавшей 16000 мкг, было зарегистрировано одно не связанное с лечением серьезное АЕ, представляющее собой обострение ранее существовавшей астмы из-за холодной погоды, которое потребовало посещения пункта неотложной помощи и разрешилось после лечения астмы. Ни один из субъектов не прекратил лечение из-за АЕ, и все включенные субъекты завершили 6-месячное испытание. Кроме того, в течение следующего после исследования 18-месячного долгосрочного наблюдения для оценки безопасности не было отмечено никаких проблем у субъектов, которых наблюдали до настоящего времени (9 из 13 завершили 18-месячные наблюдения; 13 из 13 завершили 12-месячные наблюдения).

Усредненные данные из дневников, собранные за 7 дней до каждого визита, выявили статистически достоверные (р<0,05) улучшения относительно плацебо и исходного уровня с длительным снижением среднего числа мочеиспусканий в день и среднего числа эпизодов ургентности в день в течение 6 месяцев испытания. Изменения, показанные в таблицах 7 и 8 ниже, представляют собой изменения среднего значения (± SE) относительно исходного уровня относительно плацебо.

Параметры качества жизни (согласно опроснику о состоянии здоровья больницы Королевского колледжа) показали статистически достоверные устойчивые изменения среднего значения для индивиду

- 21 046506 альных групп активного лечения и для комбинированных групп активного лечения (все дозы) относительно плацебо и относительно исходного уровня в областях воздействия на жизнь, ролевого функционирования, физических ограничений, социальных ограничений и сна и энергии. Результаты данной фазы IB клинического испытания показали значительное уменьшение числа эпизодов мочеиспускания и ургентности после однократного введения hMaxi-K, которое длилось в течение 6 месяцев испытания. Данные результаты наблюдались в отсутствие изменения PVR и серьезных нежелательных явлений, связанных с лечением. Результаты этого нового клинического испытания впервые показывают, что однократное внутридетрузорное введение человеческого гена Maxi-K являлось безопасным.

Несмотря на небольшую численность включенной популяции, общие результаты из дневников участников показали достоверные снижения (р<0,05) среднего числа мочеиспусканий и среднего числа эпизодов ургентности относительно плацебо и относительно исходного уровня для всех групп активного лечения и эпизодов ургентного недержания относительно исходного уровня для всех доз исследуемого лекарственного средства. Ответ участников на лечение показал некоторые положительные значения р для всех активных доз относительно плацебо в ходе визитов 3 и 5 (см. табл. 9). Что касается уменьшения количества мочеиспусканий и эпизодов ургентности, то эти достоверные изменения относительно плацебо и относительно исходного уровня наблюдались при всех визитах до последнего 8 визита (24 недели). Не имелось никаких достоверных различий между 2 вариантами активного лечения (16000 мкг и 24000 мкг), возможно, из-за небольшого числа участников, включенных в группу, получавшую 24000 мкг (N=3).

Параметры качества жизни (согласно опроснику о состоянии здоровья больницы Королевского колледжа) показали статистически достоверное среднее улучшение для индивидуальных групп активного лечения и для комбинированных групп активного лечения (все дозы) относительно плацебо и относительно исходного уровня во многих областях.

Это включало следующее.

Область 2. Воздействие на жизнь:

P=0,014 для всех активных доз и р=0,007 для 24000 мкг при визите 5 относительно исходного уровня;

P=0,016 для 24000 мкг при визите 5 относительно плацебо;

P=0,016 для группы, получавшей 24000 мкг, относительно группы, получавшей 16000 мкг, при визите 5;

P=0,043 для всех активных доз относительно исходного уровня при визите 6;

P=0,010 для 16000 мкг и p=0,005 для всех активных доз относительно исходного уровня при визите 7;

P=0,026 для всех активных доз относительно исходного уровня при визите 8.

Область 3. Ролевое функционирование:

P=0,004, p=0,015, p=0,001 для 16000 мкг, 24000 мкг и всех активных доз соответственно относительно исходного уровня при визите 5;

P=0,030, p=0,035 и p=0,015 для 16000 мкг, 24000 мкг и всех активных доз соответственно относительно плацебо при визите 5;

P=0-023, p=0,014 и p=0,001 для 16000 мкг, 24000 мкг и всех активных доз соответственно относительно исходного уровня при визите 6;

P=0,047, p=0,020 и p=0,014 для 16000 мкг, 24000 мкг и всех активных доз соответственно относительно плацебо при визите 6;

Р =0,012, p=0,014 и р<0,001 для 16000 мкг, 24000 мкг и всех активных доз соответственно относительно плацебо при визите 7;

Р =0,032 и р=0,021 для 24000 мкг и всех активных доз соответственно относительно плацебо при визите 7;

P=0,014 и p=0,005 для 24000 мкг и всех активных доз соответственно относительно исходного уровня при визите 8;

P=0,047, p=0,007 и р=0,007 для 16000 мкг, 24000 мкг и всех активных доз соответственно относительно плацебо при визите 8; Область 4. Физические ограничения:

Р=0,018 и p=0,005 для 24000 мкг и всех активных доз соответственно относительно исходного уровня при визите 6;

P=0,012, p=0,018 и p=0,001 для 16000 мкг, 24000 мкг и всех активных доз соответственно относительно исходного уровня при визите 7;

P=0,012, p=0,047 и Р=0,003 для 16000 мкг, 24000 мкг и всех активных доз соответственно относительно исходного уровня при визите 8.

Область 5. Социальные ограничения:

P=0,032 и р =0,22 для 24000 мкг относительно исходного уровня и плацебо соответственно при визите 6;

P=0,002 и p=0,004 для 24000 мкг и всех активных доз соответственно относительно исходного уровня при 7 визите;

P=0,008 и p=0,043 для 24000 мкг и всех активных доз соответственно относительно плацебо при 7 визите;

P=0,002 и p=0,014 для 24000 мкг и всех активных доз соответственно относительно исходного уровня при визите 8;

- 22 046506

P=0,006 для 24000 мкг относительно плацебо при визите 8.

Область 8. Сон и энергия:

P=0,047, p=0,007 и р=0,001 для 16000 мкг, 24000 мкг и всех активных доз соответственно относительно исходного уровня при 5 визите;

P=0,020 и p=0,015 для 24000 мкг и всех активных доз соответственно относительно плацебо при 5 визите;

P=0,005 и p=0,006 для 24000 мкг и всех активных доз соответственно относительно исходного уровня при визите 6;

P=0,001 и p=0,006 для 24000 мкг и всех активных доз соответственно относительно исходного уровня при 7 визите;

P=0,012 для 24000 мкг относительно плацебо при 7 визите.

72-часовой тест с прокладкой (табл. 12) показал некоторые статистически достоверные изменения при визитах 3-6 и визите 8 для активных доз hMaxi-K относительно исходного уровня, однако были также статистически достоверные изменения для плацебо при визитах 3-5 и визите 8. В целом, группа плацебо, по-видимому, характеризовалась менее тяжелой степенью заболевания, чем группы активного лечения, при этом значения исходного (V2) веса прокладок в группе активного лечения почти в 2 раза превышали таковое для группы плацебо. Кроме того, средний вес прокладки при VIA для плацебо составлял всего 29 грамм, тогда как вес при V2 для этой группы составлял 259 грамм (почти в 9 раз больше, чем при VIA). Это было связано с тем фактом, что участница 002-001 выбросила свои прокладки до VIA (поэтому она не была включена в подсчет среднего значения для VIA), и у нее, по-видимому, была более тяжелая степень заболевания, чем у других 3 участников, получавших плацебо (ее 3-дневный средний вес прокладки при V2 составлял 295 г по сравнению с 3,3-36 г для остальных 3 участников).

Таблица 1 Обобщенные данные в отношении влияния обработки на средние параметры мочеиспускания у самок крыс с 6-недельной обструкцией и ложнооперированных контролей

	WT (мг)	МР	ТНР	ВР	ВС	MV	RV	MIP (IP-BP)
Контроль: без	171	73,9	22,3	12,6	1,2	1,13	0,13+	3,49
обструкции	+	+	+	+	+	+	0,04	+
(п=17)	15,0	4,99	2,1	1,09	0,1	0,10		0,79
аС обструкцией:	*547,6	’128,9	’36,3	’22,1	’3,44	’3,22	’’’0,3	’’5,59
подвергнутые	+	+	+	+	+	+	+	+
введению pVAX/hSlo (п=12)	55,4	16,1	4,30	43,9	0,41	0,39	0,10	1,05
ЬС обструкцией:	*473,1	’132,7	’39,3	’18,8	’2,91	’2,94	0,09	9,37
без обработки	+	+	+	+	+	+	+	+
(п=10)	56,6	17,9	3,6	1,9	0,62	0,65	0,05	1,79

^а100 мкг pVAX/hSlo в 200 мкл 20% сахарозы в PBS ^b3 из этих крыс получали 1000 мкг pcDNA в 20% сахарозе в PBS

Контроль: ложнооперированные контрольные животные одной возрастной группы без обструкции, WT: масса мочевого пузыря (мг), МР: давление при мочеиспускании (см Н₂О), ТНР: пороговое давление (см Н₂О), ВР: базальное давление (см Н₂О), ВС: емкость мочевого пузыря (мл), MV: объем мочеиспускания (мл), RV: остаточный объем (мл), MIP: среднее давление между мочеиспусканиями ((см Н₂О; среднее давление за весь интервал между мочеиспусканиями минус базальное давление для одного и того же животного) *Достоверно отличается от ложнооперированных; р<0,05 **Достоверно отличается от контроля (с обструкцией, но без обработки); р<0,05, односторонний ANOVA, с апостериорными парными сравнениями Ньюмена-Кейлса

Таблица 2

Обобщенные данные в отношении влияния обработки на средние параметры мочеиспускания у самцов крыс с 2-недельной обструкцией и ложнооперированных контролей

	Всар	MV	RV	ВР	ТР	МР	IMP	SA	Всош	BW
рУАХ	2,36 ±	1,84	0,53 ±	18,65 ±	47,21 ±	91,28 ±	32,49 ±	13,84 ±	0,12 ±	348,3 ±
	Всар	MV	RV	ВР	ТР	МР	IMP	SA	Всош	BW
(п = 8/	0,48	±0,31	0,21	5,38	8,61е	18,52е	7,5е	2,57е	0,04	105,3
hSlo	2,48 ±	2,22 ±	0,27	7,66 ±	27,26 ±	54,05 ±	18,13 ±	10,47 ±	0,17 ±	352,3 ±
(η =16/	0,30с	0,26е	±0,12	l,35d	3,7rf	6,28rf	2,8rf	1,89е	0,03	42,99
Ложнооперированные	1,35 ±	1,32 ±	0,03	10,6	18,47 ±	46,58 ±	13,96 ±	3,39 ±	0,18 ±	274,4 ±
(η =10)“	0,14	0,12	±0,02	±0,81	0,79	3,34	1,09	0,61	0,018	24,5

Bcap: емкость мочевого пузыря (мл); MV: объем мочеиспускания (мл); RV: остаточный объем (мл); ВР: базальное давление (см Н₂О); ТР: пороговое давление (см Н₂О); МР: давление при мочеиспускании (см Н₂О); IMP: среднее давление между мочеиспусканиями (см Н₂О; среднее давление

- 23 046506 на протяжении всего интервала между мочеиспусканиями минус базальное давление для одного и того же животного); SA: спонтанная активность (см Н2О); Bcom: растяжимость мочевого пузыря (мл/см Н2О); BW: масса мочевого пузыря (мг) ^a5 из этих животных являются 2-недельными ложнооперированными контролями, а остальные 5 на 1 месяц старше (или 6-недельными ложнооперированными контролями). Однако статистический анализ показал, что не присутствовало каких-либо достоверных различий в отношении какого-либо из параметров мочеиспускания, и, таким образом, эти 2 популяции считались однородными для целей данного анализа ^b Всем получающим обработку крысам вводили 1000 мкг только pVAX или 100 мкг hSlo/pVAX в 1 мл 20% сахарозы в PBS. Все данные представлены в виде среднего значения ±S.E.M. и анализировали с использованием одностороннего дисперсионного анализа с использованием апостериорного критерия Тьюки для всех парных (множественных) сравнений ^c Достоверное отличие от соответствующего значения для ложнооперированного контроля ^d Достоверное отличие от соответствующего значения для pVAX

Таблица 3

Результаты влияния обработки на средние параметры мочеиспускания у самок крыс с 2-недельной обструкцией

	МР	ТР	ВР	ВС	MV	RV	MIP (IP-BP)	MF	SA	ВСОМ
Контроль: pVAX (п=10)	68,1±8,1	34,2±4,9	9,1±1,9	2,3±0,3	2,2±0,3	1,1±0,0	24,0±4,6	4,6±0,5	14,9±3,4	0,1±0,02
аС обструкцией: подвергнутые введению 10 мкг pVAX/hSlo (п=7)	65,3 + 10,5	30,3 ± 3,6	7,2 + 1,0	2,5 + 0,3	2,4 + 0,3	0,2 + 0,1	20,0 + 3,5	4,4 + 0,5	12,8 + 3,0	0,1 + 0,02
ЬС обструкцией: подвергнутые введению 30 мкг pVAX/hSlo (п=9)	81,1 ± 7,3	36,6 + 4,4	11,8 + 2,6	3,2 + 1,о	2,7 + 0,4	0,4 + 0,2	27,1 + 3,5	4,3 + 0,4	15,3 + 1,5	0,1 + 0,02
ЬС обструкцией: подвергнутые введению 300 мкг pVAX/hSlo (п=10)	47,8 + 3,7	17 7* ** + 1,6	6,3 + 1,1	2,3 + 0,4	2,2 ± 0,3	0,3 + 0,2	10,3*,** + 1,2	5,3 + 0,6	4 J* ** ± 0,4	Q 2* ** + 0,02
ьс обструкцией: подвергнутые	57,2 + 6,2	4* ** + 1,8	5,7 + 1,1	2,1 + о,1	2,0 ± о,1	0,1 + 0,04	11,6*,** + 1,3	5,2 + 0,3	g д* ** ± 0,5	Q ** + 0,01
введению 1000 мкг pVAX/hSlo (п=12)

^а10, 30, 300, 1000 мкг pVAX/hSlo в 200 мкл 20% сахарозы в PBS;

Контроль: Контрольные животные одной возрастной группы с обструкцией, которые получали 1000 мкг только pVAX, WT: масса мочевого пузыря (мг), МР: давление при мочеиспускании (см H2O);

ТР:пороговое давление (см Н2О), ВР: базальное давление (см Н2О), ВС: емкость мочевого пузыря (мл), MV: объем мочеиспускания (мл), RV: остаточный объем (мл);

MIP:среднее давление между мочеиспусканиями ((см Н2О; среднее давление на протяжении всего интервала между мочеиспусканиями минус базальное давление для одного и того же животного); SA:спонтанная активность (MIP-BP); ВСОМ: растяжимость мочевого пузыря (емкость мочевого пузыря/ТР-ВР);

*Достоверно отличается от контроля; р<0,05

Все парные множественные процедуры сравнения (метод Холма-Сидака).

Достоверно отличается от контроля; р<0,05, односторонний ANOVA.

Таблица 4

Протокол внутрипузырной инъекции кроликам

N = 12 кроликов	50-50 смесь рWXhslo (мл)	участки/кр олик	участки/кр олик	участки/кр олик
	0,05	4	8	10
	ОД	4	8	10
	0,15	4	8	10

- 24 046506

Конечная доза hMaxi-k

Таблица 5

Доза Л Maxi-К	16000 мкг | 20% сахароза в PBS	24000 мкг | 20% сахароза в PBS
Объем	4 мл	6 мл
Количество пробирок	2	3
Конечный объем	4 мл	6 мл
Количество внутримышечных инъекций	20 инъекций по 0,2 мл в указанные участки в стенке мочевого пузыря, расположенные примерно на расстоянии 1 см друг от друга (фигура 5)	30 инъекций по 0,2 мл в указанные участки в стенке мочевого пузыря, расположенные примерно на расстоянии 1 см друг от друга (фигура 5)

Примечание: В каждой дозовой когорте 6 участников получат hMaxi-K и 3 получат 20% сахарозы в PBS (плацебо)

Таблица 6

Обобщенные результаты тестов в соответствии с лабораторными визитами

Фаза	Скининговая фаза	Последующие визиты после получения лечения
Визит/период	Визит 1	Визит 1А	Визит 2	Последую щий контакт по телефону*	Визит 3	Визит 4	Визит 5	Визит б	Визит 7	Визит 8
День	-14	От -14 до 8	0 (исходный уровень)	Дни 1 и 3	8	15	29	57	85	169 (заключите льный)
Неделя	-2		0	0	1	2	4	8	12	24
Окно визитов (дни)		+2	+2	День 3±1	+2	+2	±2	±3	±5	±5
Подписанное информированное согласие	▲
Оценка критериев включения/исключен ИЯ	▲	А	Af
Демография и история болезни/ хирургическ ая история	▲
Физический осмотр	▲		А 1		А	А	А	А	А	А
ЭКГ	▲		▲ а		А		А			А
Оценка предыдущих/сопутст вующих лекарственных препаратов	▲	А	Af		А	А	А	А	А	А
Жизненные показатели h	▲		Af-‘		А	А	А	А	А	А
Объективная оценка О АВ/DO (цистометрия)ь		Ad					А			А
Сканирование мочевого пузыряс	▲					А		А		А
Выдача дневника ежедневных мочеиспусканий/анке тыургентности 1	А	А	Af		А	А	А	А	А
Тест с прокладкой m		А	А		А	А	А	А	А	А
QoL (опросник о состоянии здоровья больницы Королевского колледжа) и SF-12			Af				А	А	А	А
Субъективная оценка состояния заболеванияк			Af		А	А	А	А	А	А
Субъективная оценка ответа на лечениек					А	А	А	А	А	А
ICIQ-SF			Af				А	А	А	А
Анализ мочи и посев мочиа	▲	А	Af	А	А	А	А		А	А
Г ематологические лабораторные тестые	▲		A	А	А	А	А		А	А
Химические лабораторные тестые	А		A	А	А	А	А		А	А
Фармакокинетическа я оценка (кДНК hSlo в моче и крови)			A *		А	А	А	А	А	▲ s
Оценка нежелательных явлений		А	Af	А '	А	А	А	А	А	А
Введение исследуемого лекарственного средства			A

^аЭКГ будет проводиться до введения исследуемого лекарственного средства и через 2 ч после введения дозы.

- 25 046506 ^b Цистометрия включает: объем при первом позыве к мочеиспусканию, давление детрузора, внутрибрюшное давление, давление детрузора в начале мочеиспускания, давление детрузора при максимальном потоке, максимальное давление детрузора, объем при сильном позыве к опорожнению, пиковую скорость потока при мочеиспускании, объем мочеиспускания, объем при DO, остаточный объем после мочеиспускания, общий объем мочевого пузыря (объем мочеиспускания + остаточный объем), количество сокращений детрузора во время процедуры и продолжительность DO.

сКритерии включения предусматривают остаточный объем <200 мл. Сканирование мочевого пузыря при V1 и V8, которое подлежит выполнению до катетеризации ^d Общий анализ мочи в отношении эритроцитов и лейкоцитов, определяемых микроскопированием, белка, глюкозы, нитритов, pH и удельного веса при визитах V1, 3-5 и V7 и V8. При V1A и V2 будет проведен анализ мочи с помощью тест-полоски. Посевы мочи при V1 (путем катетеризации уродинамическим катетером), V3 (бактериологический анализ); при V1A, V2, V5 и V8 до цистометрии или цистоскопии (путем катетеризации уродинамическим катетером) и перед выпиской путем бактериологического анализа (при V2 использование полученной первой мочи после введения препарата). Анализ мочи при визите 2 с помощью тест-полоски будет проводиться до введения дозы, а посев мочи будет проводиться как до введения исследуемого лекарственного средства, так и до выписки еЛабораторные тесты, которые будут проведены при V1, V2 - 5, V7 и V8, включают: гематологию общий анализ крови с подсчетом лейкоцитарной формулы, количество тромбоцитов, скорость оседания, РТТ, РТ (без РТ и РТТ при V2 и V4), CRP, антиядерное антитело; биохимию - BUN, креатинин, Na⁺, K⁺, Mg++, Ca⁺⁺, CO₂, СГ, альбумин, щелочная фосфатаза, ALT, AST, GGT, общий билирубин, общий белок, СРК, LDH, глюкоза); серологический тест на беременность с определением бета-HCG, являющийся обязательным для женщин детородного возраста, которые не подвергались гистерэктомии на момент скрининга при V1 и далее по мере необходимости. Кроме того, FSH> 40 МЕ/л, если последний менструальный цикл имел место не > 12 месяцев до включения в исследование. HbA1c будет проводиться только при скрининге в ходе визита 1. При 2 (неделя 0) биохимия проводиться не будет. При V4 биохимия будет включать только BUN, креатинин, электролиты (Na⁺, K⁺), CRP, глюкозу и ANA. При визите 1А или V6 лабораторные анализы проводиться не будут. Лабораторные анализы должны проводиться в одно и то же время суток при всех визитах в ходе исследования f Анализ или процедура будет проведена до введения исследуемого лекарственного средства при визите 2 ^gПредварительное введение при V2. Если образец остается положительным на 24 неделе, участник должен возвращаться ежемесячно до тех пор, пока два последовательных образца не станут отрицательными в отношении ДНК hSlo ^h Жизненные показатели будут включать высоту только при V1; вес при V1 и V8; пероральную температуру тела при всех визитах (кроме V1A). Для всех измерений ВР необходимо использовать одну и ту же руку и указывать какую именно ¹ Дневники должны быть заполнены до V1A (для проверки на соответствие и критерии включения), за 7 дней до визита 2 и 7 дней до каждого визита в дальнейшем j C участниками свяжутся по телефону на 1-й и 3-й дни исследования (1 день и 3 дня ±1 после введения препарата при визите 2) для оценки нежелательных явлений ^k Субъективные оценки основаны на следующих вопросах, приведенных в приложении С: Насколько тягостной вы считаете свою проблему, связанную с мочевым пузырем? и Было ли лечение полезным для вас?

¹ ВР будет измеряться каждые 15 мин в течение 2 ч после введения исследуемого лекарственного средства ^m Участники принесут прокладки/подгузники, которые носили в течение 3 дней до визита 1А и 2 (в случае V1A после скрининга при V1) и 3 дней до всех последующих визитов (визит 3 -визит 8); также принесут чистые прокладку/подгузники для использования в качестве исходного уровня ^пВизит 1А может состояться в тот же день, что и V1. В этом случае все необходимые процедуры для V1A, которые еще не выполнены при V1, должны быть завершены. Цистоскопию необходимо выполнять после всех других процедур V1, а посев мочи после цистоскопии с использованием мочи, полученной для бактериологического анализа. Если V1A совпадает с V1, то поскольку сбор прокладок и дневников не будет завершен до V1, они должны быть проверены на соответствие при V2 ^o ЭКГ будет выполнена до начала исследования

- 26 046506

Таблица 7

Среднее количество мочеиспусканий/24 ч и уменьшение с течением времени - популяция для оценки эффективности

	hMaxi-K
Визит		Плацебо	16000 мкг	24000 мкг	Все дозы
Визит 1А (скрининг)	η	4	6	3	9
Среднее количество мочеиспусканий (SD)	10,46 (3,48)	11,99 (3,65)	17,39 (5,22)	13,79 (4,73)
Визит 2 (исходный уровень)	и	4	6	3	9
Среднее количество мочеиспусканий (SD)	10,18 (4,78)	11,26(2,70)	17,19(7,07)	13,24 (5,08)
Визит 3 (неделя 1)	η	4	6	3	9
Среднее количество мочеиспусканий (SD)	11,59 (4,98)	9,Ю (2,12)	14,46 (3,74)	10,89 (3,67)
Изменение среднего значения относительно исходного уровня(SD)	1,41 (0,78)	-2,16(1,80)	-2,73 (7,29)	-2,35 (3,92)
SEM	0,39	0,73	4,21	1,31
Значение р [1]	0,251	0,052	0,074	0,018
Значение р [2]		0,044	0,047	0,027
Различие средних значений, определенных методом наименьших квадратов, относительно плацебо		-3,57	-4,14	-3,86
95% CI		-7,01, -0,13	-8,22, -0,07	-7,12, -0,59
Визит 4 (неделя 2)	И	4	6	3	9
Среднее количество мочеиспусканий	10,68 (4,Ю)	8,35 (2,65)	13,52 (1,94)	10,07 (3,47)

- 27 046506

	(SD)
Изменение среднего значения относительно исходного уровня (SD)	0,51 (1,22)	-2,92 (2,04)	-3,67 (6,48)	-3,17 (3,64)
SEM	0,61	0,83	3,74	1,21
Значение р [1J	0,667	0,016	0,026	0,004
Значение р [2]		0,051	0,046	0,029
Различие средних значений, определенных методом наименьших квадратов, относительно плацебо		-3,42	-4,17	-3,80
95% CI		-6,87, 0,02	-8,25, -0,10	-7,06, -0,53
Визит 5 (неделя 4)	И	4	6	3	9
Среднее количество мочеиспусканий (SD)	11,40 (4,42)	8,87 (2,25)	13,48 (1,08)	10,40 (2,96)
Изменение среднего значения относительно исходного уровня (SD)	1,22 (0,69)	-2,40 (2,11)	-3,71 (7,27)	-2,84 (4,05)
SEM	0,35	0,86	4,20	1,35
Значение р [1]	0,315	0,035	0,025	0,006
Значение р [2]		0,042	0,024	0,017
Различие средних значений, определенных методом наименьших квадратов, относительно плацебо		-3,62	-4,93	-4,28
95% CI		-7,06, -0,17	-9,01, -0,86	-7,54, -1,01

hMaxi-K

Визит		Плацебо	16000 мкг	24000 мкг	Все дозы
Визит 6 (неделя 8)	И	4	6	3	9
Среднее количество мочеиспусканий (SD)	10,17 (3,89)	9,48 (2,73)	13,52 (2,19)	10,83 (3,15)
Изменение среднего	-0,01 (1,20)	-1,79 (2,15)	-3,67 (7,75)	-2,41 (4,33)

- 28 046506

	значения относительно исходного уровня(SD)
SEM	0,60	0,88	4,47	1,44
Значение р [11	0,996	0,094	0,026	0,011
Значение р [2]		0,261	0,071	0,090
Различие средних значений, определенных методом наименьших квадратов, относительно плацебо		-1,78	-3,66	-2,72
95% CI		-5,22, 1,66	-7,74, 0,41	-5,99, 0,55
Визит 7 (неделя 12)	И	4	6	3	9
Среднее количество мочеиспусканий (SD)	10,96 (4,30)	10,21(4,11)	12,90 (2,35)	11,11(3,71)
Изменение среднего значения относительно исходного уровня (SD)	0,79 (1,67)	-1,05 (2,90)	-4,29 (6,97)	-2,13 (4,47)
SEM	0,84	1,18	4,02	1,49
Значение р [1]	0,509	0,293	0,013	0,012
Значение р [2]		0,248	0,022	0,041
Различие средних значений, определенных методом наименьших квадратов, относительно плацебо		-1,83	-5,07	-3,45
95% CI		-5,28, 1,61	-9,15, -1,00	-6,72, -0,19
Визит 8 (окончательный визит - неделя 24)	И	4	6	3	9
Среднее количество мочеиспусканий (SD)	11,14(4,81)	9,74 (3,04)	13,86 (3,02)	11,11(3,51)
Изменение среднего значения относительно исходного уровня(SD)	0,96 (0,99)	-1,52 (2,55)	-3,33 (7,06)	-2,13 (4,16)
SEM	0,50	1,04	4,08	1,39
Значение р [1]	0,421	0,142	0,038	0,019
	Значение р [2]		0,131	0,041	0,044
Различие средних значений, определенных методом наименьших квадратов, относительно плацебо		-2,49	-4,30	-3,39
95% CI		-5,93, 0,96	-8,37, -0,22	-6,66, -0,13

[1]: Значение р для проверки наличия статистически достоверной разницы между значениями, измеренными в определенной временной точке, относительно измеренного значения исходного уровня для определенного лечения

[2]: Значение р для проверки наличия статистически достоверной разницы между изменениями

- 29 046506 относительно исходного уровня по сравнению с плацебо

Все значения р и оценки получены с использованием линейной модели смешанных эффектов с количеством мочеиспусканий в качестве зависимых переменных, вариантов лечения (плацебо, 16000 мкг, 24000 мкг и общего hMaxi-K), временных точек и взаимозависимости времени и лечения. Все дозы=все дозы hMaxi-K.

SD=стандартное отклонение; SEM=стандартная ошибка среднего значения.

Таблица 8

Среднее количество эпизодов ургентности/24 ч и уменьшение с течением времени - популяция для оценки эффективности

	hMaxi-K
Виз ИТ		Плацебо	16000 мкг	24000 мкг	Все дозы
Визит 1А (скрининг)	п	4	6	3	9
Среднее количество эпизодов ургентности (SD)	10,04 (3,80)	11,12(4,08)	17,27 (5,33)	13,17(5,19)
Визит 2 (исходный уровень)	п	4	6	3	9
Среднее количество эпизодов ургентности (SD)	9,82 (5,17)	10,21 (3,55)	17,19(7,07)	12,53 (5,71)
Визит 3 (неделя 1)	п	4	6	3	9
Среднее количество эпизодов ургентности (SD)	11,27 (5,25)	7,89 (3,11)	14,46 (3,74)	10,08 (4,51)
Изменение среднего значения относительн о исходного уровня (SD)	1,45 (0,83)	-2,31(2,17)	-2,73 (7,29)	-2,45 (4,03)
SEM	0,42	0,88	4,21	1,34
Значение р [1]	0,240	0,040	0,074	0,016
Значение р [2]		0,036	0,046	0,024
Различие средних значений, определенных методом наименьших квадратов, относительно плацебо		-3,76	-4,18	-3,97
95% CI		-7,20, -0,32	-8,25, -0,11	-7,23, -0,71
Визит 4 (неделя 2)	И	4	6	3	9
Среднее количество эпизодов ургентности (SD)	10,22 (4,49)	7,17(3,35)	13,52 (1,94)	9,29 (4,25)
Изменение среднего значения относительн о исходного уровня (SD)	0,40(1,03)	-3,04 (2,07)	-3,67 (6,48)	-3,25 (3,64)

- 30 046506

	SEM	0,51	0,85	3,74	1,21
Значение р [1]	0,734	0,013	0,026	0,004
Значение р [2]		0,050	0,050	0,030
Различие средних значений, определенных методом наименьших квадратов, относительно плацебо		-3,43	-4,07	-3,75
95% CI		-6,87, 0,01	-8,14, 0,00	-7,01, -0,49
Визит 5 (неделя 4)	п	4	6	3	9
Среднее количество эпизодов ургентности (SD)	11,04 (4,75)	7,87 (3,92)	13,48 (1,08)	9,74 (4,22)
Изменение среднего значения относительн о исходного уровня (SD)	1,22 (0,69)	-2,34 (2,07)	-3,71 (7,27)	-2,80 (4,04)
SEM	0,35	0,84	4,20	1,35
Значение р [1]	0,315	0,038	0,025	0,007
Значение р [2]		0,044	0,024	0,018
Различие средних значений, определенных методом наименьших квадратов, относительно плацебо		-3,56	-4,93	-4,25
95% CI		-7,00, -0,12	-9,00, -0,86	-7,51, -0,98

- 31 046506

Визит 6 (неделя 8)	η	4	6	3	9
Среднее количество эпизодов ургентности (SD)	9,60 (4,45)	8,32 (4,40)	13,52 (2,19)	10,05 (4,48)
Изменение среднего значения относительн о исходного уровня (SD)	-0,22 (0,89)	-1,89 (2,07)	-3,67 (7,75)	-2,48 (4,30)
SEM	0,45	0,85	4,47	1,43
Значение р [1]	0,851	0,079	0,026	0,010
Значение р [2]		0,289	0,085	0,106
Различие средних значений, определенных методом наименьших квадратов, относительно плацебо		-1,67	-3,45	-2,56
95% CI		-5,11, 1,77	-7,52, 0,62	-5,82, 0,71
Визит 7 (неделя 12)	И	4	6	3	9
Среднее количество эпизодов ургентности (SD)	10,86 (4,35)	10,00 (4,31)	12,86 (2,38)	10,95 (3,88)
Изменение среднего значения относительн о исходного уровня (SD)	1,04 (2,15)	-0,21 (2,41)	-4,33 (7,05)	-1,58 (4,51)
SEM	1,07	0,99	4,07	1,50
Значение р [1]	0,389	0,829	0,013	0,025
Значение р [2]		0,421	0,017	0,048
Различие средних значений, определенных методом наименьших квадратов, относительно плацебо		-1,24	-5,37	-3,31
95% CI		-4,68, 2,20	-9,44, -1,30	-6,57, -0,04
Визит 8	И	4	6	3	9

- 32 046506

(окончательный визит) (неделя 24)	Среднее количество эпизодов ургентности (SD)	10,89 (4,99)	9,29 (3,53)	13,86 (3,02)	10,81 (3,91)
Изменение среднего значения относительн о исходного уровня (SD)	1,07(1,18)	-0,92 (2,27)	-3,33 (7,06)	-1,72 (4,14)
SEM	0,59	0,92	4,08	1,38
Значение р [1]	0,373	0,350	0,037	0,032
Значение р [2]		0,213	0,038	0,054
Различие средних значений, определенных методом наименьших квадратов, относительно плацебо		-1,99	-4,40	-3,20
95% CI		-5,43, 1,45	-8,47, -0,33	-6,46, 0,06

[1]: Значение р для проверки наличия статистически достоверной разницы между значениями, измеренными в определенной временной точке, относительно измеренного значения исходного уровня для определенного лечения

[2]: Значение р для проверки наличия статистически достоверной разницы между изменениями относительно исходного уровня по сравнению с плацебо

Все значения р и оценки получены с использованием линейной модели смешанных эффектов с количеством мочеиспусканий в качестве зависимых переменных, вариантов лечения (плацебо, 16000 мкг, 24000 мкг и общего hMaxi-K), временных точек и взаимозависимости времени и лечения

Все дозы=все дозы hMaxi-K

SD=стандартное отклонение; SEM=стандартная ошибка среднего значения

Таблица 9

Количество эпизодов ургентного недержания и уменьшение с течением времени - популяция для оценки эффективности

	hMaxi-K
Визит		Плацебо	16000 мкг	24000 мкг	Все дозы
Визит 1А (скрининг)	η	4	6	3	9
Среднее количество эпизодов ургентного недержания/24 часа (SD)	1,88(1,25)	2,08 (0,57)	8,69 (12,02)	4,29 (6,87)
Визит 2 (исходный уровень)	η	4	6	3	9
Среднее количество эпизодов ургентного недержания/24 часа (SD)	1,82(1,52)	1,91 (0,83)	3,81 (3,30)	2,54 (2,01)

- 33 046506

Визит 3 (неделя 1)	η	4	6	3	9
Среднее количество эпизодов ургентного недержания/24 часа (SD)	1,43 (1,32)	1,29 (1,08)	2,74 (0,25)	1,77(1,13)
Изменение среднего значения относительно исходного уровня (SD)	-0,39 (0,22)	-0,63 (0,74)	-1,07 (3,15)	-0,78 (1,69)
SEM	0,11	0,30	1,82	0,56
Значение р [1]	0,460	0,164	0,103	0,045
Значение р [2]		0,718	0,395	0,470
Различие средних значений, определенных методом наименьших квадратов, относительно плацебо		-0,24	-0,68	-0,46
95% CI		-1,75, 1,27	-2,47, 1,10	-1,89, 0,97
Визит 4 (неделя 2)	И	4	6	3	9
Среднее количество эпизодов ургентного недержания/24 часа (SD)	1,23 (1,27)	0,86 (1,09)	2,95 (1,35)	1,56(1,51)
Изменение среднего значения относительно исходного уровня (SD)	-0,58 (0,81)	-1,05 (1,39)	-0,86 (2,60)	-0,99 (1,70)
SEM	0,40	0,57	1,50	0,57
Значение р [1]	0,277	0,035	0,177	0,029
Значение р [2]		0,487	0,728	0,559
Различие средних значений, определенных методом наименьших квадратов, относительно плацебо		-0,47	-0,27	-0,37
95% CI		-1,98, 1,04	-2,06, 1,51	-1,80, 1,06

- 34 046506

Визит 5 (неделя 4)	п	4	6	3	9
Среднее количество эпизодов ургентного	1,14 (0,95)	0,66 (0,81)	3,10 (2,08)	1,47 (1,72)
Изменение среднего значения относительно	-0,67 (0,98)	-1,25 (1,16)	-0,71 (1,76)	-1,07 (1,30)
SEM	0,49	0,48	1,01	0,43
Значение р	0,216	0,017	0,251	0,026
Значение р		0,393	0,958	0,623
Различие средних значений,		-0,58	-0,04	-0,31
95% CI		-2,09, 0,93	-1,83, 1,74	-1,74, 1,12
Визит 6 (неделя 8)	И	4	6	3	9
Среднее количество эпизодов ургентного	1,02(1,15)	0,50 (0,92)	2,57 (2,13)	1,19(1,66)
Изменение среднего значения относительно	-0,79 (0,49)	-1,41 (1,21)	-1,24 (1,67)	-1,35 (1,27)
SEM	0,25	0,49	0,97	0,42
Значение р	0,153	0,010	0,067	0,007
Значение р		0,363	0,573	0,407
Различие средних значений,		-0,62	-0,45	-0,53
95% CI		-2,13,0,89	-2,23, 1,34	-1,97, 0,90
Визит 7 (неделя 12)	И	4	6	3	9
Среднее количество эпизодов ургентного	1,25 (1,09)	0,64 (0,75)	3,29 (2,27)	1,52 (1,84)
Изменение среднего значения относительно	-0,57 (0,71)	-1,27 (1,17)	-0,52 (1,57)	-1,02 (1,27)
SEM	0,35	0,48	0,90	0,42
Значение р	0,290	0,016	0,389	0,037
Значение р		0,306	0,958	0,601
Различие средних значений,		-0,70	0,04	-0,33
95% CI		-2,21,0,81	-1,74, 1,83	-1,76, 1,10

- 35 046506

Визит 8 (окончательный визит) (неделя 24)	п	4	6	3	9
Среднее количество эпизодов ургентного недержания/24 часа (SD)	0,86 (0,76)	0,62 (0,84)	1,52 (1,39)	0,92 (1,06)
Изменение среднего значения относительно исходного уровня (SD)	-0,96 (0,94)	-1,29 (1,10)	-2,29 (2,72)	-1,62 (1,69)
SEM	0,47	0,45	1,57	0,56
Значение р [1]	0,094	0,015	0,005	0,001
Значение р [2]		0,616	0,122	0,212
Различие средних значений, определенных методом наименьших квадратов, относительно плацебо		-0,34	-1,33	-0,83
95% CI		-1,84, 1,17	-3,11,0,46	-2,26, 0,60

[1]: Значение р для проверки наличия статистически достоверной разницы между значениями, измеренными в определенной временной точке, относительно измеренного значения исходного уровня для определенного лечения

[2]: Значение р для проверки наличия статистически достоверной разницы между изменениями относительно исходного уровня по сравнению с плацебо

Все значения р и оценки получены с использованием линейной модели смешанных эффектов с количеством мочеиспусканий в качестве зависимых переменных, вариантов лечения (плацебо, 16000 мкг, 24000 мкг и общего hMaxi-K), временных точек и взаимозависимости времени и лечения Все дозы = все дозы hMaxi-K

SD=стандартное отклонение; SEM=стандартная ошибка среднего значения

- 36 046506

Таблица 10

Восприятие участниками ответа на лечение - популяция для оценки эффективности

	Плацебо, η (%)	hMaxi-K, η (%)
	Плацебо	16000 мкг	24000 мкг	Все дозы
V3 (№13)	Отсутствие положительного эффекта	3 (75,00)	1 (16,67)	0	1(11,11)
Имеется небольшой положительный	1 (25,00)	1 (16,67)	3 (100,0)	4 (44,44)
	эффект
Имеется существенный положительны й эффект	0	4 (66,67)	0	4 (44,44)
Значение р		0,1429	0,1429	0,0190
V4 (№13)	Отсутствие положительного эффекта	3 (75,00)	1 (16,67)	0	1(11,11)
Имеется небольшой положительный эффект	1 (25,00)	1 (16,67)	2 (66,67)	3 (33,33)
Имеется существенный положительны й эффект	0	4 (66,67)	1 (33,33)	5 (55,56)
Значение р		0,1429	0,2286	0,1202
V5 (№13)	Отсутствие положительного эффекта	3 (75,00)	1 (16,67)	0	1(11,11)
Имеется небольшой положительный эффект	1 (25,00)	0	2 (66,67)	2 (22,22)
Имеется существенный положительны й эффект	0	5 (83,33)	1 (33,33)	6 (66,67)
Значение р		0,0238	0,2286	0,0126
V6 (№13)	Отсутствие положительного эффекта	3 (75,00)	1 (16,67)	0	1(11,11)
Имеется небольшой положительный эффект	1 (25,00)	2 (33,33)	2 (66,67)	4 (44,44)
Имеется существенный положительны й эффект	0	3 (50,00)	1 (33,33)	4 (44,44)
Значение р		0,2286	0,2286	0,2727
V7 (№13)	Отсутствие положительного эффекта	3 (75,00)	2 (33,33)	0	2 (22,22)
Имеется небольшой положительный эффект	1 (25,00)	1 (16,67)	2 (66,67)	3 (33,33)
Имеется существенный положительны й эффект	0	3 (50,00)	1 (33,33)	4 (44,44)
Значение р		0,2857	0,2286	0,2727
V8 (№13)	Отсутствие положительного эффекта	3 (75,00)	2 (33,33)	0	2 (22,22)
Имеется небольшой	1 (25,00)	1 (16,67)	2 (66,67)	3 (33,33)

- 37 046506

	положительный эффект
Имеется существенный положительны й эффект	0	3 (50,00)	1 (33,33)	4 (44,44)
Значение р		0,2857	0,2286	0,2727

Примечание: значения р являются номинальными и относятся к тесту хи-квадрат для определения того, различается ли восприятие ответа на лечение у пациентов, получавших лечение, и пациентов, получавших плацебо

Все дозы = все дозы hMaxi-K

Таблица 11

Изменение среднего количества эпизодов ургентного недержания за 24 ч -популяция для оценки эффективности

	hMaxi-K
Визит		Плацебо	16000 мкг	24000 мкг	Все дозы
Эпизоды ургентного недержания за 24 часа
Визит 1А	п	4	6	3	9
Среднее значение (SD)	1,88 (1,25)	2,08 (0,57)	8,69 (12,02)	4,29 (6,87)
Визит 2	п	4	6	3	9
Среднее значение (SD)	1,82 (1,52)	1,91 (0,83)	3,81 (3,30)	2,54 (2,01)
Визит 3	п	4	6	3	9
Среднее значение (SD)	1,43 (1,32)	1,29 (1,08)	2,74 (0,25)	1,77(1,13)
Визит 4	п	4	6	3	9
Среднее значение (SD)	1,23 (1,27)	0,86 (1,09)	2,95 (1,35)	1,56(1,51)
Визит 5	п	4	6	3	9
Среднее значение (SD)	1,14(0,95)	0,66 (0,81)	3,10(2,08)	1,47 (1,72)
Визит 6	п	4	6	3	9
Среднее значение (SD)	1,02(1,15)	0,50 (0,92)	2,57 (2,13)	1,19(1,66)

- 38 046506

Визит 7	И	4	6	3	9
Среднее значение (SD)	1,25 (1,09)	0,64 (0,75)	3,29 (2,27)	1,52 (1,84)
Визит 8 (окончательный визит)	И	4	6	3	9
Среднее значение (SD)	0,86 (0,76)	0,62 (0,84)	1,52 (1,39)	0,92 (1,06)
Изменение относительно исходного уровня V2
Визит 3	И	4	6	3	9
Среднее значение (SD)	-0,39 (0,22)	-0,63 (0,74)	-1,07 (3,15)	-0,78 (1,69)
Значение р [1]	0,460	0,164	0,103	0,045
Значение р [2]		0,718	0,395	0,470
Различие средних значений, определенных методом наименьших квадратов, относительно плацебо		-0,24	-0,68	-0,46
95% CI		-1,75, 1,27	-2,47, 1,10	-1,89, 0,97
Значение р [3]			0,545
Различие средних значений, определенных методом наименьших квадратов, для 24000 мкг относительно 16000 мкг			-0,44
95% CI			-2,10, 1,21

- 39 046506

Визит 4	п	4	6	3	9
Среднее значение (SD)	-0,58 (0,81)	-1,05 (1,39)	-0,86 (2,60)	-0,99 (1,70)
Значение р [1]	0,277	0,035	0,177	0,029
Значение р [2]		0,487	0,728	0,559
Различие средних значений, определенных методом наименьших квадратов, относительно плацебо		-0,47	-0,27	-0,37
95% CI		-1,98, 1,04	-2,06, 1,51	-1,80, 1,06
Значение р [3]			0,789
Различие средних значений, определенных методом наименьших квадратов, для 24000 мкг относительно 16000 мкг			0,19
95% CI			-1,46, 1,85
Визит 5	И	4	6	3	9
Среднее значение (SD)	-0,67 (0,98)	-1,25 (1,16)	-0,71 (1,76)	-1,07 (1,30)
Значение р [1]	0,216	0,017	0,251	0,026
Значение р [2]		0,393	0,958	0,623
Различие средних значений, определенных методом наименьших квадратов, относительно плацебо		-0,58	-0,04	-0,31

- 40 046506

	95% CI		-2,09, 0,93	-1,83, 1,74	-1,74, 1,12
Значение р [3]			0,465
Различие средних значений, определенных методом наименьших квадратов, для 24000 мкг относительно 16000 мкг			0,54
95% CI			-1,11,2,19
Визит 6	И	4	6	3	9
Среднее значение (SD)	-0,79 (0,49)	-1,41 (1,21)	-1,24 (1,67)	-1,35 (1,27)
Значение р [1]	0,153	0,010	0,067	0,007
Значение р [2]		0,363	0,573	0,407
Различие средних значений, определенных методом наименьших квадратов, относительно плацебо		-0,62	-0,45	-0,53
95% CI		-2,13,0,89	-2,23, 1,34	-1,97, 0,90
Значение р [3]			0,810
Различие средних значений, определенных методом наименьших квадратов, для 24000 мкг относительно 16000 мкг			0,17
95% CI			-1,48, 1,83

- 41 046506

Визит 7	п	4	6	3	9
Среднее значение (SD)	-0,57 (0,71)	-1,27 (1,17)	-0,52 (1,57)	-1,02 (1,27)
Значение р [1]	0,290	0,016	0,389	0,037
	Значение р [2]		0,306	0,958	0,601
	Различие средних значений, определенных методом наименьших квадратов, относительно плацебо		-0,70	0,04	-0,33
	95% CI		-2,21,0,81	-1,74, 1,83	-1,76, 1,10
	Значение р [3]			0,321
	Различие средних значений, определенных методом наименьших квадратов, для 24000 мкг относительно 16000 мкг			0,75
	95% CI			-0,91,2,40
Визит 8 (окончательный визит)	η Среднее значение (SD)	4 -0,96 (0,94)	6 -1,29 (1,10)	3 -2,29 (2,72)	9 -1,62 (1,69)
	Значение р [1]	0,094	0,015	0,005	0,001
	Значение р [2]		0,616	0,122	0,212
	Различие средних значений, определенных методом наименьших квадратов, относительно плацебо		-0,34	-1,33	-0,83
	95% CI		-1,84, 1,17	-3,11,0,46	-2,26, 0,60
	Значение р [3]			0,199
	Различие средних значений, определенных методом наименьших квадратов, для 24000 мкг относительно 16000 мкг			-0,99
	95% CI			-2,65, 0,66

[1]: Значение р для проверки наличия статистически достоверной разницы между значениями, измеренными в определенной временной точке, относительно измеренного значения исходного уровня для определенного лечения

[2]: Значение р для проверки наличия статистически достоверной разницы между изменениями относительно исходного уровня по сравнению с плацебо

[3]: Значение р для проверки наличия разницы между группой, получавшей 24000 мкг, и груп- 42 046506 пой, получавшей 16000 мкг

Все значения р и оценки получены с использованием линейной модели смешанных эффектов с количеством мочеиспусканий за 24 ч в качестве зависимых переменных, вариантов лечения (плацебо, 16000 мкг, 24000 мкг и общего hMaxi-K), временных точек и взаимозависимости времени и лечения

Таблица 12

Изменение веса (г) во время 72-часового теста с прокладкой -популяция для оценки безопасности

	hMaxi-K
Визит		Плацебо	16000 мкг	24000 мкг	Все дозы
Визит 1А, скрининг	п	3	6	3	9
Средний (SD) вес в 72-часовом	29,33 (20,03)	345,00 (726,50)	611,67 (703,53)	433,89 (686,58)
Визит 2, ИСХОДНЫЙ	п	4	6	3	9
Средний (SD) вес в 72-часовом	259,25 (417,95)	314,00 (663,23)	677,33 (643,96)	435,11 (641,56)
Визит 3 (неделя 1)	п	4	6	3	9
Средний (SD) вес в 72-часовом	133,50 (206,99)	241,67 (541,39)	518,03 (499,37)	333,79 (514,42)
Изменение среднего значения (SD) веса	-125,75 (211,14)	-72,33 (123,08)	-159,30 (144,90)	-101,32 (128,87)
Значение р [1]	0,044	0,127	0,024	0,013
Значение р [2]		0,446	0,598	0,937
Различие средних значений,		53,42	-43,14	5,14
95% CI		-102,87, 209,70	-228,08, 141,80	-143,13, 153,41
Визит 4 (неделя 2)	И	4	6	3	9
Средний (SD) вес в 72-часовом	119,00(177,72)	231,83 (509,77)	528,00 (501,86)	330,56 (497,30)
Изменение среднего значения (SD) веса	-140,25 (242,66)	-82,17 (155,66)	-149,33 (142,12)	-104,56 (146,02)
Значение р |Т]	0,029	0,090	0,031	0,013
Значение р [2]		0,409	0,818	0,762
Различие средних значений,		58,08	-18,67	19,71
95% CI		-98,20, 214,37	-203,61, 166,27	-128,57, 167,98
Визит 5 (неделя 4)	И	4	6	3	9
Средний (SD) вес в 72-часовом	100,75 (84,24)	212,00 (485,13)	494,67 (508,22)	306,22 (481,29)
Изменение среднего значения (SD) веса	-158,50 (345,31)	-102,00 (179,22)	-182,67 (153,16)	-128,89 (166,03)
Значение р [1]	0,017	0,045	0,014	0,005
Значение р [2]		0,421	0,679	0,861
Различие средних значений,		56,50	-33,76	11,37
95% CI		-99,79, 212,79	-218,69, 151,18	-136,90, 159,64
Визит 6 [3] (неделя 8)	И	4	6	3	9
Средний (SD) вес в 72-часовом	164,00 (272,19)	186,33 (427,25)	489,33 (425,48)	287,33 (426,96)
Изменение среднего значения (SD) веса	-95,25 (145,96)	-127,67 (236,90)	-188,00 (361,87)	-147,78 (262,15)
Значение р |Т]	0,105	0,018	0,012	0,003
Значение р 121		0,639	0,232	0,318
Различие средних значений,		-32,42	-102,34	-67,38
95% CI		-188,70, 123,87	-287,28, 82,60	-215,65, 80,89

-

Claims (9)

Визит 7 [3] (неделя 12) η 4 6 3 9 Средний (SD) вес в 72-часовом тесте с 177,50 (307,75) 307,50 (709,54) 545,3 (621,50) 386,78 (652,19) Изменение среднего значения (SD) веса -81,75 (110,34) -6,50 (52,31) -191,00 (159,81) -52,63 (113,57) Значение р [1] 0,154 0,881 0,224 0,256 Значение р [2] 0,292 0,860 0,671 Различие средних значений, 75,25 -16,46 29,40 95% CI -81,04, 231,54 -228,54, 195,63 -127,70, 186,49 Визит 8 [3] (неделя 24) И 4 6 3 9 Средний (SD) вес в 72-часовом тесте с 85,00(126,10) 225,00 (520,04) 596,67 (528,52) 348,89 (522,87) Изменение среднего значения (SD) веса -174,25 (293,32) -89,00 (145,01) -80,67 (189,03) -86,22 (148,64) Значение р [1] 0,011 0,071 0,171 0,042 Значение р [2] 0,238 0,318 0,219 Различие средних значений, 85,25 83,99 84,62 95% CI -71,04, 241,54 -100,94, 268,93 -63,65, 232,89

1. Способ лечения или уменьшения выраженности признака или симптома синдрома гиперактивного мочевого пузыря или гиперактивности детрузора у субъекта-человека, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту единичной стандартной дозы фармацевтической композиции, содержащей вектор, содержащий открытую рамку считывания (ORF), кодирующую белок hSlo в соответствии с SEQ ID NO: 8 или его мутант, состоящий из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 8, в которой Т в положении 352 заменен на S, где единичная стандартная доза представляет собой внутримышечную стандартную дозу по меньшей мере 45000 мкг ±15% вектора, изготовленного для внутримышечного введения в мыщцу детрузора субъекта.

[1]: Значение p для проверки наличия статистически достоверной разницы между значениями, измеренными в определенной временной точке, относительно измеренного значения исходного уровня для определенного лечения

2. Способ по п.1, где фармацевтическую композицию вводят в мыщцу детрузора путем прямой инъекции.

[2]: Значение р для проверки наличия статистически достоверной разницы между изменениями относительно исходного уровня по сравнению с плацебо

3. Способ по п.1, где введение единичной стандартной дозы фармацевтической композиции, как она определена в п.1, субъекту значительно уменьшает число эпизодов мочеиспускания относительно плацебо или исходных уровней в течение по меньшей мере 6 месяцев после введения единичной стандартной дозы.

[3]: Результаты включают значение 0 для пациента 002019, результаты для которого были неправильно введены в базу данных. Результаты проверены исследовательским центром и CRA Все значения р и оценки получены с использованием линейной модели смешанных эффектов со значениями веса, полученными в ходе 72-часового теста с прокладкой, в качестве зависимых переменных, вариантов лечения (плацебо, 16000 мкг, 24000 мкг и общего hMaxi-K), временных точек и взаимозависимости времени и лечения

Все дозы=все дозы hMaxi-K, SD=стандартное отклонение

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

4. Способ по п.1, где введение единичной стандартной дозы фармацевтической композиции, как она определена в п.1, субъекту значительно уменьшает число эпизодов ургентности относительно плацебо или исходных уровней в течение по меньшей мере 6 месяцев после введения единичной стандартной дозы.

5. Способ по п.1, где стандартная доза содержит 20-25% сахарозы в солевом растворе.

6. Способ по п.1, где стандартная доза содержит 10-30% (об./об.) сахарозы.

7. Способ по п.6, где сахароза составляет приблизительно 20% (об./об.).

8. Способ по п.2, где прямую инъекцию проводят в 20-30 участков инъекции, расположенных примерно на расстоянии 1 см друг от друга ±15%, и где признак или симптом синдрома гиперактивного мочевого пузыря представляет собой ургентное недержание мочи.

9. Способ по п.1, где вектор включает плазмиду, аденовирусный вектор, вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV), ретровирусный вектор или липосому.

-