KR20210094567A

KR20210094567A - 평활근 기능장애의 치료를 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20210094567A
Application number: KR1020217018054A
Authority: KR
Inventors: 아놀드 멜만
Original assignee: 유로반트 사이언시즈 게엠베하
Priority date: 2018-11-14
Filing date: 2019-11-14
Publication date: 2021-07-29
Also published as: SG11202103659VA; CA3114691A1; US20220133849A1; TW202039531A; CN113164555A; EP3880229A2; MX2021003778A; IL282739A; WO2020100089A3; WO2020100089A2; JP2022511596A; AU2019381329A1

Abstract

본 개시는 평활근 기능장애와 관련된 질병 및 질환를 치료하거나, 이의 증상을 개선하기 위한 유전자 요법을 포함하는 조성물 및 방법을 제공하고, 여기서 Maxi-K 채널의 하나 이상의 서브유닛을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 돌연변이체, 변이체, 기능성 단편 또는 유도체(예를 들어, 융합체 및 키메라)가 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되며, 여기서 폴리펩티드의 투여는 표적화된 평활근에서 기능성 Maxi-K 채널의 발현을 초래한다. 일부 양태에서, 본 개시의 조성물은 Maxi-K 채널 펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산을 함유하는 플라스미드 벡터를 포함한다. 약학적 조성물, 물품 또는 제조물, 및 키트가 또한 개시된다.

Description

평활근 기능장애의 치료를 위한 조성물 및 방법

서열 목록의 통합

[0001] 본 출원에서 제출된 전자적으로 제출된 서열 목록(명칭: 3987.026PC03_SequenceListing_ST25.txt, Size: 267,369 bytes; 및 작성일: November 12, 2019)의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

기술 분야

[0002] 본 발명은 일반적으로 평활근 기능장애와 관련된 하나 이상의 증상을 개선하기 위한 유전자 치료 분야에 관한 것이다.

배경

[0003] 평활근은, 예를 들어, 혈관, 폐의 기도, 위장관, 자궁 및 요로에서 발견된다. 평활근의 조절되지 않는 수축을 포함하여 평활근 긴장도의 조절 완화에 의해 야기되는 많은 생리적 기능장애 또는 장애가 있다. 이들 중에는 천식; 전립선의 양성 증식(BPH); 관상 동맥 질환; 발기 부전, 방광, 내골반 근막, 전립선, 요관, 요도, 요로 및 정관의 비뇨생식기 기능장애; 과민성 대장 증후군; 편두통; 조기 진통; 레이노 증후군; 정맥류; 및 폐쇄혈전혈관염이 포함된다.

[0004] 평활근의 조절되지 않는 수축은 또한 고혈압(심장병의 알려진 위험 인자) 또는 월경통과 같은 상태와 관련이 있다. 고혈압은 심장과 혈관에 영향을 미치는 가장 흔한 질병이다. 통계에 따르면 고혈압은 미국 성인 5명 중 1명이 앓고 있다. 천식은 기도 과다활동을 특징으로 하는 만성 질병이며, 미국 인구의 5-8%에서 발생하며, 매우 흔한 폐 손상 원인이다. 과민성 대장 증후군은 일반적으로 복통과 함께 변비와 설사가 자주 번갈아 가며 나타나는 일반적인 증후군이다. 종종 스트레스가 유도되며, 이는 매운 음식, 식이 섬유 부족 및 과도한 카페인 섭취와 같은 물리적 요인으로도 유발된다. 월경통은 자궁 근육의 고통스러운 연축성 수축이다.

[0005] 요실금은 배뇨에 대한 자발적인 통제의 부족이다. 영아의 경우 외부 괄약근에 대한 뉴런이 완전히 발달하지 않았고 뇌가 배뇨를 방지하는 억제 기능을 발달시키지 않았기 때문에 이것이 정상이다. 성인의 경우, 이는 무의식, 방광을 제어하는 척추 신경의 손상, 소변의 비정상적인 성분으로 인한 자극, 방광의 질병 및 정서적 스트레스로 인한 배뇨근의 이완 불능의 결과로 발생할 수 있다.

[0006] 발기 부전은 미국에서 1천만에서 3천만 명의 남성에게 영향을 미치는 것으로 추정되는 흔한 질병이다. 발기 부전의 주요 질병-관련 원인 중에는 노화, 죽상경화증, 만성 신장 질환, 당뇨병, 고혈압 및 항고혈압 약물, 골반 수술 및 방사선 요법, 심리적 불안이 있다.

[0007] 비정상적인 방광 기능은 미국에서 수백만 명의 남성과 여성의 삶의 질에 중대한 영향을 미치는 또 다른 흔한 문제이다. 많은 흔한 질병(예를 들어, BPH, 당뇨병, 다발성 경화증 및 뇌졸중)이 정상적인 방광 기능을 변경시킨다. 방광 기능의 현저한 비정상적인 변화는 또한 노화의 당연한 결과이다.

[0008] 변경된 평활근 긴장도에 의해 야기된 질병에 대한 치유법 또는 치료법을 개발하려는 여러 시도에도 불구하고, 현재의 요법은 제한된 효능 및/또는 심각한 부작용을 제공하기 때문에 한계가 있다. 따라서, 최소한의 부작용으로 효능을 증가시킴으로써 변경된 평활근 긴장도의 근본 원인을 해결하고 장기간의 치료 해결책을 제공하기 위한 약학적 및/또는 의학적 개입이 당 분야에서 오랫동안 요구되고 있다.

간단한 개요

[0009] 본 개시는 Maxi-K 칼륨 채널 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 핵산(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 포함하는 적어도 1회 용량의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 평활근 기능장애, 예를 들어, 방광 기능장애, 예를 들어, 과활동성 방광(OAB)을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 대상체의 평활근 세포에서 Maxi-K 칼륨 채널 폴리펩티드의 발현은 평활근 수축성을 조절한다.

[0010] 일부 양태에서, Maxi-K 칼륨 채널 폴리펩티드는 (i) Maxi-K 알파 서브유닛(Slo)을 인코딩하는 폴리펩티드 또는 이의 단편, 변이체, 돌연변이체 또는 유도체; (ii) Maxi-K 베타 서브유닛을 인코딩하는 폴리펩티드 또는 이의 단편, 변이체, 돌연변이체 또는 유도체(여기서 Maxi-K 베타 서브유닛은 베타1 서브유닛, 베타2 서브유닛, 베타3 서브유닛, 베타4 서브유닛 또는 이들의 조합이다); 또는 (iii) 이들의 조합을 포함한다.

[0011] 일부 양태에서, 단편은 기능성 단편이다. 일부 양태에서, 변이체는 스플라이스 변이체이다. 일부 양태에서, 변이체는 대립유전자(다형성) 변이체이다. 일부 양태에서, 돌연변이체는 점 돌연변이체이다. 일부 양태에서, 돌연변이체는 결실 및/또는 삽입 돌연변이체이다. 일부 양태에서, 돌연변이체는 기능-획득 돌연변이체이다. 일부 양태에서, 돌연변이체는 기능-상실 돌연변이체이다.

[0012] 일부 양태에서, Maxi-K 칼륨 채널 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 핵산 또는 Maxi-K 칼륨 채널 폴리펩티드는 표 1에 개시된 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 양태에서, Maxi-K 칼륨 채널 폴리펩티드는 표 2에 개시된 돌연변이를 포함한다.

[0013] 일부 양태에서, 유도체는 융합 단백질이다. 일부 양태에서, 유도체는 키메라이다. 일부 양태에서, 평활근 수축성의 조절은 수축성의 증가를 포함한다. 다른 양태에서, 평활근 수축성의 조절은 수축성의 감소를 포함한다. 일부 양태에서, 평활근 기능장애는, 예를 들어, 과활동성 방광(OAB); 발기 부전(ED); 천식; 양성 전립선 비대(BPH); 관상 동맥 질환; 방광, 내골반 근막, 전립선, 요관, 요도, 요로 및 정관의 비뇨생식기 기능장애; 과민성 대장 증후군; 편두통; 조기 진통; 레이노 증후군; 배뇨근 과다활동; 녹내장; 안구 고혈압; 및 폐쇄혈전혈관염 또는 이들의 증상 또는 후유증으로 구성된 군으로부터 선택된다.

[0014] 일부 양태에서, 평활근 기능장애는 특발성이다. 일부 양태에서, 평활근 기능장애는 신경원성이다. 일부 양태에서, 평활근 기능 장애는 비신경원성이다.

[0015] 일부 양태에서, 분리된 핵산은 DNA이다. 일부 양태에서, DNA는 네이키드 DNA이다. 일부 양태에서, 분리된 핵산은 RNA이다. 일부 양태에서, RNA는 mRNA이다. 일부 양태에서, 분리된 핵산은 적어도 하나의 화학적으로 변형된 핵염기, 당, 백본 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 화학적으로 변형된 핵염기는 슈도우라실(ψ), N1-메틸슈도우라실(m1ψ), 2-티오우라실(s2U), 4'-티오우라실, 5-메틸시토신, 5-메틸우라실 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 분리된 핵산은 적어도 하나의 핵염기를 치환함으로써 변형되었고, 여기서 치환은 동의(synonymous) 치환이다.

[0016] 일부 양태에서, 분리된 핵산 서열은 코돈 최적화된다. 일부 양태에서, 분리된 핵산은 벡터이다. 일부 양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 양태에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 일부 양태에서, 아데노바이러스 벡터는 3세대 아데노바이러스 벡터이다. 일부 양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 일부 양태에서, 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 양태에서, 렌티바이러스 벡터는 3세대 또는 4세대 렌티바이러스 벡터이다. 일부 양태에서, 분리된 핵산 또는 벡터는 전달제와 함께 투여된다. 일부 양태에서, 전달제는, 예를 들어, 리피도이드, 리포좀, 리포플렉스, 지질 나노입자, 중합체 화합물, 펩티드, 단백질, 세포, 나노입자 모방체, 나노튜브 또는 컨쥬게이트를 포함한다.

[0017] 일부 양태에서, 분리된 핵산 또는 벡터는 생체내, 시험관내 또는 생체외 세포 내로 도입된다. 일부 양태에서, 세포는 줄기 세포, 근육 세포 또는 섬유모세포이다. 일부 양태에서, 조성물은 국소적으로 또는 비경구적으로 투여된다. 일부 양태에서, 비경구 투여는 주사에 의한 것이다. 일부 양태에서, 주사는 근육내 주사, 예를 들어, 방광 근육 조직으로의 주사이다. 일부 양태에서, 분리된 핵산 또는 벡터는 점적주입(예를 들어, 겔과 같은 적절한 비히클에서 이를 필요로 하는 대상체의 방광에 점적주입)을 통해 투여된다.

[0018] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물의 주사는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 주사 부위에서 투여된다. 일부 양태에서, 주사는 대상체의 방광에 투여된다. 일부 양태에서, 주사는 방광벽에 투여된다. 일부 양태에서, 주사는 배뇨근에 투여된다. 일부 양태에서, 주사는 삼각부에 투여된다. 일부 양태에서, 각 주사의 부피는 약 0.5 ml, 약 1 ml, 약 1.5 ml 또는 약 2 ml이다. 일부 양태에서, 주사 부위는 약 0.5 cm, 약 1 cm, 약 1.5 cm 또는 약 2 cm 떨어져 있다. 일부 양태에서, 주사는 약 2 mm, 약 2.5 mm, 약 3 mm, 약 3.5 mm 또는 약 4 mm의 주사 깊이로 투여된다.

[0019] 일부 양태에서, 조성물은 기관, 예를 들어, 방광 또는 자궁의 내강으로의 점적주입에 의해 투여된다. 일부 양태에서, 용량은 단일 단위 용량이다. 일부 양태에서, 용량은 5,000 mcg 내지 50,000 mcg이다. 일부 양태에서, 용량은 5,000 mcg 내지 100,000 mcg이다. 일부 양태에서, 용량은 적어도 10,000 mcg이다. 일부 양태에서, 용량은 50,000 mcg 내지 100,000 mcg이다. 일부 양태에서, 용량은 16,000, 24,000 mcg 또는 48,000 mcg이다. 일부 양태에서, 조성물의 투여는 평활근 기능장애의 적어도 하나의 증상을 개선시킨다.

도면의 간단한 설명

[0020] 도 1A, 1B, 1C 및 1D는 Sham-조작되고 연령-매칭된 대조군 래트에 비해 2개의 처리 그룹에서 관련 배뇨 파라미터에 대한 2주 폐쇄의 영향을 보여준다. 데이터는 표 3에 요약된 데이터에 해당한다.

[0021] 도 2A, 2B 및 2C는 각 처리 그룹에서 별개의 래트로부터 2주 폐쇄 후 약 1시간의 방광내압측정 기록의 대표적인 예를 보여준다: 대조군(도 2A), 벡터만(pVAX) 그룹(도 2B) 및 Maxi-K 알파 서브유닛(hSlo)으로 처리된 그룹(도 2C).

[0022] 도 3은 벡터만(pVAX), 및 300 및 1000 ug의 pVAX-hSlo가 제공된 래트에서의 방광내압측정 기록의 3개의 그래프를 보여준다. 처리된 동물에서 규칙적이고 주기적인 비우기, 및 배뇨간 압력 변동의 사실상 부재에 유의한다.

[0023] 도 4는 생체분포의 막대 그래프, 즉, 24시간 및 1주에 1,000 ug의 pVAX-hSlo 벡터를 주사한 후 암컷 동물의 조직에서 플라스미드의 평균 복사체 수/ug 총 DNA이다(N = 시점당 4마리의 동물); 이중 측정됨. 대조군 조직(pVAX-hSlo를 주사하지 않은 동물, 평균 39개 조직)에 대한 배경 값은 8.9x10^-3 ng 플라스미드/ug 총 DNA였으며, 상한 값은 8x10^-2 ng 플라스미드/ug 총 DNA였다. 따라서, 9.6 x 10⁵ 복사체/ug 총 DNA보다 큰 값만이 대조군 동물 값(굵은 수평선으로 표시됨)보다 높은 것으로 간주되었다.

[0024] 도 5는 인간 대상체에서 pVAX-hSlo 벡터의 주사 부위를 나타내는 다이어그램이다.

[0025] 도 6은 인간 대상체에서 치료에 의한 시간 경과에 따른 일당 평균 배뇨 횟수의 변화를 보여주는 막대 그래프이다(집단 효능). 오차 막대는 평균의 표준 오차(SEM)를 나타낸다.

[0026] 도 7은 인간 대상체에서 치료에 의한 시간 경과에 따른 평균 절박 에피소드의 변화를 보여주는 막대 그래프이다(집단 효능). 오차 막대는 평균의 표준 오차(SEM)를 나타낸다.

[0027] 도 8은 플라스미드 pVAX-hSlo(총 플라스미드 크기: 6880 bp)를 묘사하는 개략도이다. hSlo는 트랜스진의 업스트림에 위치하는 CMV 프로모터의 제어하에 있다. 작제물은 또한 소 성장 호르몬 폴리 A 부위, 카나마이신 내성 유전자 및 pUC 복제 기점을 함유한다. 다른 구체예에서, hSlo는 표적화된 기관의 평활근에서 유전자를 특이적으로 발현하는 프로모터의 제어하에 놓일 수 있다. 벡터 서열 및 원본을 따라 상이한 요소의 위치는 다음과 같다. 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(위치 137 내지 724; 바이러스); hSlo cDNA(위치 888 내지 4428 bp; 인간); 소 성장 호르몬(BGH) 아데닐중합체형성 신호(위치 4710 내지 4940; 소); 카나마이신 유전자(위치 5106 내지 5901; 박테리아); 및 pUC 기점(위치 6200 내지 6874; 박테리아).

[0028] 도 9는 방광 평활근 세포에서 막횡단 칼슘 플럭스 및 유리 세포내 칼슘 농도를 조절하는데 있어서 Maxi-K 채널의 역할을 개략적으로 도시한 것이다.

[0029] 도 10은 채널의 전기적 특성에 대한 hSlo 채널의 기공에서 점 돌연변이 T352S의 효과를 나타내는 그래프이다. T352S 돌연변이체 hSlo 채널은 야생형 hSlo 채널에 비해 훨씬 더 높은 전류를 표시한다. T352S 점 돌연변이를 포함하는 서열로 트랜스펙션된 293 세포를 패치-클램프 실험에 사용하였다.

[0030] 도 11은 실시예 4에 기재된 패치 클램프 실험의 결과를 나타내는 그래프이다. 묘사된 각 작제물은 HEK 세포로 트랜스펙션되었다. 전류는 높은 글루코스(22.5 mM) 환경에서 24-48시간 후에 측정되었다. T352S 단일 점 돌연변이는 산화 스트레스에 대한 내성을 부여한다. 이중 점 돌연변이(C1, C2, C3, M1, M2 및/또는 M3)는 산화 스트레스에 대한 T352S 단일 점 돌연변이의 내성을 손상시킬 수 있다. C1은 T352S + C496A 돌연변이체를 나타내고; C2는 T352S + C681A 돌연변이체를 나타내고; C3은 T352S + C977A 돌연변이체를 나타내고; M1은 T352S + M602L 돌연변이체를 나타내고; M2는 T352S + M788L 돌연변이체를 나타내고; M3은 T352S + M805L 돌연변이체를 나타낸다.

[0031] 도 12는 OAB의 PUO 모델에서 방광 기능에 대한 상이한 프로모터의 효과를 보여주는 차트이다. pVAX=벡터만, pUro-hSlo(유로플라킨(uroplakin) UPKII 프로모터로부터 발현된 hSlo), pVAX-hSlo(CMV 프로모터로부터 발현된 hSlo), pSMAA-hSlo(평활근 알파 액틴 프로모터로부터 발현된 hSlo). *=p<0.05.

[0032] 도 13A는 대조군(비당뇨병) 래트로부터 배설된 소변의 누적 부피를 보여주는 방광내압측정 실험의 결과를 나타낸다.

[0033] 도 13B는 당뇨병 래트(2개월 STZ-당뇨병 래트)로부터 배설된 소변의 누적 부피를 보여주는 방광내압측정 실험의 결과를 나타낸다.

[0034] 도 13C는 대조군(비당뇨병) 래트로부터의 방광내 압력을 보여주는 기관 욕(organ bath) 실험의 결과를 제시한다.

[0035] 도 13D는 당뇨병 래트(2개월 STZ-당뇨병 래트)로부터의 방광내 압력을 보여주는 기관 욕 실험의 결과를 나타낸다.

[0036] 도 13E는 대조군(비당뇨병) 방광으로부터의 방광 스트립의 등척성 기록을 보여주는 기관 욕 실험의 결과를 나타낸다.

[0037] 도 13F는 배뇨근 과다활동의 특징인 당뇨병 스트립에서 현저한 자발적 위상 수축을 예시하는 당뇨병(2개월 STZ-당뇨병 래트) 방광으로부터의 방광 스트립의 등척성 기록을 보여주는 기관 욕 실험의 결과를 나타낸다.

[0038] 도 13G는 Maxi-K 채널 차단제인 이베리오톡신(IBTX)의 농도를 증가시키는 처리에 의해 유도된 자발적 수축의 진폭의 상대적 증가를 보여주는 기관 욕 실험의 결과를 나타낸다. 데이터는 5마리 동물의 평균을 나타낸다.

[0039] 도 13H는 300 nM IBTX와 함께 세포를 인큐베이션하기 전후에 방광 과다활동을 갖는 2개월 STZ-래트 및 대조군으로부터 분리된 배뇨근 SM 세포에서 수행된 전압의 단계적 증가를 갖는 단일-세포 패치 클램핑 연구로부터의 결과를 보여준다. 세포막을 가로질러 단계적으로 전압을 인가하면 채널이 개방되고 외부로 전류가 흐른다. 300 nM IBTX와 인큐베이션 후 Imax에 대한 특정 전압(Imax)에서의 최대 전류의 평균 비율이 표시된다.

[0040] 도 14는 PUO 래트 방광의 자발적 전위(SA)를 보여준다. PUO 래트를 야생형 hSlo 및 돌연변이체 hSlo T352S 유전자의 발현을 위해 빈 pVAX(대조군) 및 pVAX로 방광내 처리하였다. 30 μg의 pVAX-hSlo T352S로 처리된 PUO 래트에 대한 본 발명자의 초기 방광내압측정 연구는 이전에 얻은 데이터와 비교할 때 이 hSlo 돌연변이체가 야생형 유전자보다 DO를 감소시키는데 더 효율적일 수 있음을 나타낸다(도 11). PUO 래트의 방광 SA를 감소시키는데 있어서 돌연변이체 hSlo T352S의 유의하게 더 높은 효과에 주목한다. 데이터는 평균±SEM에 해당한다; pVAX=14; pVAX-hSlo=17; pVAX-hSlo T352S=6; ANOVA에 이어 Dunnett의 다중 비교: *p<0.05, **p<0.01 vs. 대조군; 스튜던트 t-테스트, pVAX-hSlo vs. pVAX-hSlo T352S, $ p<0.05.

[0041] 도 15A는 전자 현미경으로 관찰한 나노입자를 보여준다.

[0042] 도 15B는 에피플루오레센스 현미경(20x 배율)으로 관찰한 용액 중의 FITC-표지된 나노입자를 보여준다.

[0043] 도 15C는 래트 음경 표면에 적용한 후 FITC-표지된 나노입자를 보여준다. 적용 1시간 후 동물을 희생시키고 음경을 단면화시켰다. 조직 섹션은 에피플루오레센스 현미경으로 4× 및 20×(삽도로 표시됨) 배율로 조사되었다. 형광성 나노입자는 작은 붉은 반점으로 나타나며 음경 주변부(진피)뿐만 아니라 해면체 정맥 내층과 해면체를 관통하는 것을 볼 수 있다.

[0044] 도 16A는 Maxi-K 알파 서브유닛 유전자 발현의 시험관내 모니터링을 보여준다. 나노입자는 적색 형광 단백질을 발현하는 mCherry 플라스미드를 캡슐화함으로써 생성되었고, HeLa 세포의 배양물에 첨가되었다. 7시간 후, 위상차(좌측 패널) 및 에피플루오레센스(중간 패널) 현미경을 사용하여 세포를 시각화하였다. 2개의 이미지의 오버레이(우측 패널)는 거의 모든 세포(약 95%)가 mCherry 형광단을 발현하고 있음을 보여주었다.

[0045] 도 16B는 Maxi-K 알파 서브유닛 유전자 발현의 시험관내 모니터링을 보여준다. 인간 Maxi-K(hSlo) 플라스미드를 캡슐화하는 나노입자를 생성하고 HEK293 세포의 배양물에 상이한 농도로 첨가하였다. 20시간 후 인간 Maxi-K 유전자의 발현을 qRT-PCR에 의해 결정하였다. 막대는 삼중 반복된 실험으로부터의 배경에 대한 Maxi-K 발현의 평균 배수 변화를 나타낸다.

[0046] 도 16C는 Maxi-K 알파 서브유닛 유전자 발현의 생체내 모니터링을 보여준다. 배뇨근에 염수(좌측) 또는 pmCherry-N1(우측) 주사 3일 후 전체 동물 형광 이미징.

[0047] 도 16D는 Maxi-K 알파 서브유닛 유전자 발현의 생체외 모니터링을 보여준다. 도 16C에서 동물로부터 방광을 제거하고 mCherry 형광에 대해 이미징하였다. 히트맵에서 적색은 더 높은 형광을 나타낸다.

[0048] 도 17은 Maxi-K 알파 서브유닛 및 Maxi-K 베타 조절성 서브유닛을 형성하는 기공을 보여주는 Maxi-K 채널의 개략도를 포함한다. Maxi-K 알파 서브유닛의 두 가지 대안적인 도식 표현이 도시된다(상단 및 하단 좌측 표현). 또한, 특히 전압 감지 번들과 기공 및 선택적 필터의 위치를 보여주는 Maxi-K 알파 서브유닛 막횡단 나선의 배열의 하향식 도면이 제시된다(우측 하단). 또한, 전압 감지 번들과 기공 및 선택성 필터 사이에 중첩된 베타 서브유닛의 2개의 막횡단 나선이 표시된다. Maxi-K 채널은 알파 서브유닛에 의해서만 또는 알파와 베타 서브유닛의 회합에 의해 형성될 수 있다.

[0049] 도 18은 정준 pVAX-hSlo1(SEQ ID NO: 16), 및 "변이체 1"(SEQ ID NO: 49) 및 "변이체 2"(SEQ ID NO: 50)로 지정된 2개 변이체의 뉴클레오티드 서열 간의 다중 서열 정렬을 보여준다. 서열 간의 차이의 위치는 N1 내지 N16으로 넘버링된 박스 안의 염기로 표시된다. 인간 Maxi-K 알파 서브유닛(hSlo) ORF의 시작 및 종료 지점도 표시된다.

[0050] 도 19는 정준 pVAX-hSlo1(SEQ ID NO: 16) 이의 2개의 변이체 "변이체 1"(SEQ ID NO: 49) 및 "변이체 2"(SEQ ID NO: 50)에서 인간 Maxi-K 알파 서브유닛(hSlo) ORF에 의해 인코딩된 단백질 서열 간의 다중 서열 정렬을 보여준다. 서열 간의 차이의 위치는 P1 내지 P2로 넘버링된 박스 안의 염기로 표시된다.

[0051] 도 20은 ION-02 방광내 점적주입 연구에 해당하는 CONSORT 다이어그램이다.

[0052] 도 21은 ION-03 직접 주사 연구에 해당하는 CONSORT 다이어그램이다.

[0053] 도 22는 ION-03 연구에서 24시간당 평균 절박 에피소드 수의 기준선으로부터의 변화를 보여준다.

[0054] 도 23은 ION-03 연구에서 24시간당 평균 배뇨 횟수의 기준선으로부터의 변화를 보여준다.

[0055] 도 24는 실시예 13에 제시된 2-코호트, 용량 증가 연구의 설계의 개략도를 보여준다.

[0056] 도 25 및 26은 은퇴한 브리더 Sprague-Dawley 래트에서 URO-902 대 PBS-20% 수크로스의 생물활성을 보여준다. 도 25는 신경자극에 반응하는 ICB/BP 비율을 보여준다. 도 26은 신경자극에 반응하는 시각적 음경 발기(%)를 보여준다.

[0057] 도 27 및 28은 상이한 전압 및 내부 칼슘 이온 농도에서 유도된 Maxi-K 전류를 보여준다. 도 27은 내부 완충액이 1 mM CaCl₂를 함유할 때 유도되는 전류를 보여준다. 도 28은 내부 완충액이 5 mM CaCl₂를 함유할 때 유도되는 전류를 보여준다.

[0058] 도 29는 Maxi-K 전류에 대한 TEAC1의 농도-반응 관계를 보여준다.

[0059] 도 30은 소변에서 URO-902의 안정성을 보여준다.

상세한 설명

[0060] 본 개시는 평활근 기능장애 및 이의 증상을 치료하기 위한 조성물 및 유전자 치료 방법을 제공한다. 본원에 개시된 조성물 및 방법의 주요 목적은 정상적인 평활근 기능을 회복시키는 것이다. 한 양태에서, 본 개시는 평활근에 투여하기에 적합한 Maxi-K 채널의 서브유닛(Maxi-K), 예를 들어, Maxi-K 알파-서브유닛, 베타-서브유닛 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임을 함유하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물("본 개시의 Maxi-K 조성물")을 평활근 기능장애를 갖는 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 과활동성 방광 또는 요실금과 같은 방광의 기능장애를 갖는 대상체)에게 제공한다. 당 분야에 공지된 임의의 유전자 치료 방법, 예를 들어, 네이키드 DNA 또는 mRNA, 캡슐화된 DNA 또는 mRNA(예를 들어, 지질 나노입자에서), 플라스미드, 바이러스 벡터, 유전자 편집 방법(예를 들어, CRISPR) 또는 트랜스펙션된 자가 또는 이종성 세포(예를 들어, 줄기 세포)를 사용한 Maxi-K 조성물의 투여(예를 들어, 국소, 비경구 또는 점적주입을 통해) 후, Maxi-K 채널 폴리펩티드(들)는 표적 조직의 평활근 세포에서 발현된다. 결과적으로 표적 조직에서 Maxi-K 활성은 평활근 기능장애의 증상을 현저히 완화, 치료 또는 예방한다.

[0061] 개시된 조성물 및 방법의 중요한 특징은 유리하게는 통상적인 치료적 개입과 관련하여, 이들이 만성 질환, 즉, 약물의 지속적인 투여를 달리 필요로 하는 질환에 사용될 수 있다는 것이다. 추가로, Maxi-K 조성물의 투여를 포함하는 개시된 유전자 치료 방법은 단일 투여, 예를 들어, 6개월마다 1회, 또는 긴 시간 간격(수개월)으로 일련의 투여를 필요로 할 것이다. 결과적으로, 만성 질환에서 만연한 치료 문제에 대한 고착이 제거될 수 있다.

[0062] 또한, 개시된 조성물 및 방법은 보툴리눔 신경독의 경우와 같이 신경 유도성 평활근 기능장애(신경원성 기능장애)의 치료에 적합할뿐만 아니라 비-신경 유도성 평활근 기능장애(비신경원성 기능장애)의 치료에도 적합하다.

I. 용어

[0063] 본 개시가 더욱 용이하게 이해되도록 하기 위해, 특정 용어가 먼저 정의된다. 본 출원에서 사용된 바와 같이, 본원에서 달리 명시적으로 제공된 경우를 제외하고, 다음의 각 용어는 아래에 명시된 의미를 갖는다. 추가 정의는 본 출원 전체에 제시되어 있다.

[0064] 본 개시는 제공된 생성물 또는 공정에 대해 그룹의 정확하게 하나의 일원이 존재하거나, 이용되거나, 달리 관련된 양태를 포함한다. 본 개시는 또한 제공된 생성물 또는 공정에 대해 하나 초과, 또는 모든 그룹 일원이 존재하거나, 이용되거나, 달리 관련된 구체예를 포함한다.

[0065] 본원에 기재된 바와 같은 본 개시의 조성물 및 방법은 달리 지시되지 않는 한, 분자 생물학(재조합 기술 포함), 세포 생물학, 생화학, 면역화학 및 안과 기술의 설명 및 기술을 적용할 수 있으며, 이는 당 분야에서 숙련된 기술의 범위 내에 있다. 그러한 기술은, 예를 들어, 대상체에서 평활근 기능을 관찰하고 분석하는 방법, 재조합 바이러스의 클로닝 및 증식, 약학적 조성물의 제형화, 및 생화학적 정제 및 면역화학을 포함한다. 적합한 기술의 구체적인 예시는 본원의 실시예를 참조하여 이루어질 수 있다. 그러나, 물론 동등한 통상적인 절차도 사용될 수 있다. 그러한 통상적인 기술 및 설명은 문헌[Green, et al., Eds., Genome Analysis: A Laboratory Manual (2007), Dieffenback, Dveksler, Eds., PCR Primer: A Laboratory Manual (2003); Bowtell and Sambrook, DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual (2003); Mount, Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis (2004); Sambrook and Russell, Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2006); and Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2002)(all from Cold Spring Harbor Laboratory Press); Stryer, L., Biochemistry (4th Ed.) W.H. Freeman, N.Y. (1995); Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" IRL Press, London (1984); Nelson and Cox, Lehninger, Principles of Biochemistry, 3rd Ed., W.H. Freeman Pub., New York (2000); and Berg et al., Biochemistry, 5th Ed., W.H. Freeman Pub., New York (2002)]과 같은 표준 실험실 매뉴얼에서 발견될 수 있으며, 이들 모두는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

[0066] 문헌[The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; and the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 본 개시에 사용된 많은 용어의 일반 사전을 당업자에게 제공한다.

[0067] 단위, 접두사 및 기호는 Systeme International de Unites(Si) 허용 양식으로 표시된다. 숫자 범위는 이러한 범위를 규정하는 숫자를 포함한다. 값의 범위가 언급되는 경우, 그 범위의 언급된 상한 및 하한 사이의 각각의 중간 정수 값 및 이의 각각의 분수가 또한 그러한 값 사이의 각각의 하위 범위와 함께 구체적으로 개시된 것으로 이해되어야 한다. 임의의 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 범위에 포함되거나 제외될 수 있으며, 둘 중 하나의 한계가 포함되거나, 둘 모두가 한계가 포함되지 않거나, 둘 모두의 한계가 포함된 각 범위도 본 발명에 포함된다.

[0068] 값이 명시적으로 언급되는 경우, 언급된 값과 거의 동일한 수량 또는 양이 되는 값이 또한 본 발명의 범위 내에 있음이 이해되어야 한다. 조합이 개시되는 경우, 그 조합의 요소의 각각의 하위조합이 또한 구체적으로 개시된 것이고 본 발명의 범위 내에 있다. 반대로, 상이한 요소 또는 요소 그룹이 개별적으로 개시되는 경우, 이들의 조합도 개시된 것이다. 본 발명의 임의의 요소가 복수의 대안을 갖는 것으로 개시되는 경우, 각각의 대안이 단독으로 또는 다른 대안과의 임의의 조합으로 제외된 본 발명의 예도 본원에 개시된 것이다; 본 발명의 하나 초과의 요소는 그러한 제외를 가질 수 있으며, 그러한 제외를 갖는 요소의 모든 조합이 본원에 개시된 것이다.

[0069] 뉴클레오티드는 일반적으로 허용되는 단일 문자 코드로 지칭된다. 달리 지시되지 않는 한, 핵산은 5'에서 3' 배향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기록된다. 뉴클레오티드는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 권장되는 일반적으로 알려진 1글자 기호로 본원에서 지칭된다. 따라서, A는 아데닌을 나타내고, C는 시토신을 나타내고, G는 구아닌을 나타내고, T는 티민을 나타내고, U는 우라실을 나타낸다.

[0070] 아미노산은 이들의 일반적으로 공지된 3문자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 권장되는 1문자 기호에 의해 본원에서 지칭된다. 달리 지시되지 않는 한, 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 배향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기록된다.

[0071] 약: 본원에서 사용되는 용어 "약"은 당업자에 의해 결정된 특정 값 또는 조성에 대해 허용되는 오차 범위 내에 있는 값 또는 조성을 지칭하며, 이는 부분적으로 값 또는 조성이 측정되거나 결정되는 방법, 즉, 측정 시스템의 한계에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, "약"은 당 분야의 관행에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 최대 20%의 범위를 의미할 수 있다. 더욱이, 특히 생물학적 시스템 또는 공정과 관련하여, 상기 용어는 최대 10배 또는 최대 5배의 값을 의미할 수 있다.

[0072] 특정 값 또는 조성이 본 출원 및 청구 범위에 제공될 때, 달리 언급되지 않는 한, "약"의 의미는 그 특정 값 또는 조성에 대해 허용되는 오차 범위 내에 있는 것으로 가정되어야 한다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용될 때, 이는 제시된 수치 값의 위와 아래의 경계를 확장함으로써 그 범위를 수정한다. 따라서, "약 10-20"은 "약 10 내지 약 20"을 의미한다. 일반적으로, 용어 "약"은 언급된 값의 위와 아래의 수치 값을, 예를 들어, 10%의 변화만큼 위 또는 아래(더 높거나 더 낮은)로 수정할 수 있다.

[0073] 조합하여 투여된: 본원에서 사용되는 용어 "조합하여 투여된", "조합된 투여" 또한 "조합 요법"은 2개 이상의 치료제, 예를 들어, 본 개시의 Maxi-K 조성물 및 제2 제제가 동시에 또는 환자에 대한 각 제제의 효과가 중첩될 수 있도록 하는 간격 내에 대상체에게 투여되는 것을 의미한다. 일부 양태에서, 제제의 투여는 조합(예를 들어, 상승작용) 효과가 달성되도록 함께 충분히 가깝게 이격된다. 조합 요법으로 간주되는 요법에 대해 동시 투여가 필수적인 것은 아니다. 예를 들어, 발기 부전(ED)의 치료를 위해, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 포함하는 유전자 요법이 투여된지 수주 또는 수개월 후에 ED 치료제(예를 들어, cGMP-특이적 포스포디에스테라제 타입 5 억제제)가 투여될 수 있다. 다시 말해서, 유전자 요법의 맥락에서, 조합 요법은 2개 이상의 치료제의 동시 투여를 요구하지 않는다. 대신, 트랜스진이 표적 조직에서 효과적으로 발현되는 동안의 임의의 추가 치료는 조합 요법으로 간주된다.

[0074] 및/또는: 본원에서 사용되는 "및/또는"은 다른 하나를 포함하거나 포함하지 않는 2개의 특정된 특징 또는 구성요소 각각의 특정 개시로 간주되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용된 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독) 및 "B"(단독)을 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용된 용어 "및/또는"은 다음 양태 각각을 포괄하는 것으로 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).

[0075] 아미노산 치환: 용어 "아미노산 치환"은 부모 또는 참조 서열(예를 들어, 야생형 Maxi-K 서열)에 존재하는 아미노산 잔기를 또 다른 아미노산 잔기로 대체하는 것을 지칭한다. 아미노산은, 예를 들어, 화학적 펩티드 합성을 통해 또는 당 분야에 공지된 재조합 방법을 통해, 부모 또는 참조 서열(예를 들어, 야생형 Maxi-K 폴리펩티드 서열)에서 치환될 수 있다. 따라서, "위치 X에서의 치환"에 대한 언급은 위치 X에 존재하는 아미노산을 대체 아미노산 잔기로 치환하는 것을 지칭한다. 일부 양태에서, 치환 패턴은 도식 AnY에 따라 기술될 수 있으며, 여기서 A는 자연적으로 또는 원래 위치 n에 존재하는 아미노산에 상응하는 단일 문자 코드이고, Y는 치환 아미노산 잔기이다. 다른 양태에서, 치환 패턴은 도식 An(YZ)에 따라 기술될 수 있으며, 여기서 A는 자연적으로 또는 원래 위치 n에 존재하는 아미노산 잔기를 치환하는 아미노산 잔기에 상응하는 단일 문자 코드이고, Y 및 Z는 A를 대체할 수 있는 대체 치환 아미노산 잔기이다.

[0076] 본 개시의 맥락에서, 치환(아미노산 치환으로 지칭되는 경우에도)은 핵산 수준에서 수행되며, 즉, 아미노산 잔기를 대체 아미노산 잔기로 치환하는 것은 제1 아미노산을 인코딩하는 코돈을 제2 아미노산을 인코딩하는 코돈으로 치환함으로써 수행된다.

[0077] 대략: 본원에서 사용되는 용어 "대략"은 하나 이상의 관심 값에 적용되며, 언급된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 양태에서, 용어 "대략"은 달리 언급되지 않거나 문맥에서 달리 명백하지 않는 한 언급된 참조 값의 어느 한 방향(크거나 작음)으로 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만에 속하는 값의 범위를 지칭한다(그러한 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우 제외).

[0078] 관련된: 평활근 기능장애와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "관련된"은 해당 증상, 측정, 특징 또는 상태가 그 기능장애의 진단, 발달, 존재 또는 진행과 연결되어 있음을 의미한다. 연관성은 원인으로서 질병과 관련이 있을 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없다. 예를 들어, 시력 상실은 평활근 기능장애인 녹내장과 관련된 상태이다. 다른 양태에서, 평활근 기능장애(예를 들어, 불량한 방광 조절)는, 예를 들어, 병변(예를 들어, 척수 손상), 신경퇴행성(예를 들어, 다발성 경화증) 또는 노화와 관련될 수 있다.

[0079] 양성 전립선 비대: 본원에서 사용되는 용어 "양성 전립선 비대"("BPH"로 약칭)는 전립선 전이 영역 내에서 평활근 및 상피 세포의 증식을 지칭하는 조직학적 진단을 나타낸다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 BPH를 치료하는데 사용될 수 있다.

[0080] 보존적 아미노산 치환: "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산 또는 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신 또는 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판 또는 히스티딘)을 포함하여, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당 분야에 정의되어 있다. 따라서, 폴리펩티드의 아미노산이 동일한 측쇄 패밀리의 다른 아미노산으로 대체되는 경우, 아미노산 치환은 보존적인 것으로 간주된다. 또 다른 양태에서, 아미노산 스트링은 측쇄 패밀리 구성원의 순서 및/또는 구성이 상이한 구조적으로 유사한 스트링으로 보존적으로 대체될 수 있다.

[0081] 비보존적 아미노산 치환은 (i) 전기양성 측쇄를 갖는 잔기(예를 들어, Arg, His 또는 Lys)가 전기음성 잔기(예를 들어, Glu 또는 Asp)로, 또는 이에 의해 치환되거나, (ii) 친수성 잔기(예를 들어, Ser 또는 Thr)가 소수성 잔기(예를 들어, Ala, Leu, Ile, Phe 또는 Val)로, 또는 이에 의해 치환되거나, (iii) 시스테인 또는 프롤린이 임의의 다른 잔기로, 또는 이에 의해 치환되거나, (iv) 부피가 큰 소수성 또는 방향족 측쇄를 갖는 잔기(예를 들어, Val, His, Ile 또는 Trp)가 더 작은 측쇄(예를 들어, Ala 또는 Ser)를 갖거나 측쇄가 없는(예를 들어, Gly) 잔기로, 또는 이에 의해 치환되는 것을 포함한다.

[0082] 다른 아미노산 치환은 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 알라닌의 경우, D-알라닌, 글리신, 베타-알라닌, L-시스테인 및 D-시스테인 중 어느 하나로부터 치환이 취해질 수 있다. 리신의 경우, 대체물은 D-리신, 아르기닌, D-아르기닌, 호모-아르기닌, 메티오닌, D-메티오닌, 오르니틴 또는 D-오르니틴 중 어느 하나일 수 있다. 일반적으로, 분리된 폴리펩티드의 특성 변화를 유도할 것으로 예상될 수 있는 기능적으로 중요한 영역에서의 치환은 (i) 극성 잔기, 예를 들어, 세린 또는 트레오닌이 소수성 잔기, 예를 들어, 류신, 이소류신, 페닐알라닌 또는 알라닌으로(또는 이에 의해) 치환되거나; (ii) 시스테인 잔기가 임의의 다른 잔기로(또는 이에 의해) 치환되거나; (iii) 전기양성 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘이 전기음성 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어, 글루탐산 또는 아스파르트산으로(또는 이에 의해) 치환되거나 또는 (iv) 부피가 큰 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어, 페닐알라닌이 그러한 측쇄를 갖지 않는 잔기, 예를 들어, 글리신으로 치환되는 것이다. 전술한 비보존적 치환 중 하나가 단백질의 기능적 특성을 변경할 수 있을 가능성은 또한 단백질의 기능적으로 중요한 영역과 관련된 치환의 위치와 상관된다: 따라서 일부 비보존적 치환은 생물학적 특성에 대해 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않을 수 있다.

[0083] 보존된: 본원에서 사용되는 용어 "보존된"은 비교되는 2개 이상의 서열의 동일한 위치에서 변경되지 않은 상태로 발생하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 각각 지칭한다. 상대적으로 보존된 뉴클레오티드 또는 아미노산은 서열의 다른 곳에 나타나는 뉴클레오티드 또는 아미노산보다 더 많은 관련 서열 중에서 보존된 것들이다.

[0084] 일부 양태에서, 2개 이상의 서열이 서로 100% 동일한 경우 이들은 "완전히 보존"되거나 "동일한" 것으로 언급된다. 일부 양태에서, 2개 이상의 서열이 서로 적어도 70% 동일하거나, 적어도 80% 동일하거나, 적어도 90% 동일하거나, 적어도 95% 동일한 경우 이들은 "고도로 보존된" 것으로 언급된다. 일부 양태에서, 2개 이상 이상의 서열이 서로 약 70% 동일하거나, 약 80% 동일하거나, 약 90% 동일하거나, 약 95%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 경우 이들은 "고도로 보존된" 것으로 언급된다. 일부 양태에서, 2개 이상의 서열이 서로 적어도 30% 동일하거나, 적어도 40% 동일하거나, 적어도 50% 동일하거나, 적어도 60% 동일하거나, 적어도 70% 동일하거나, 적어도 80% 동일하거나, 적어도 90% 동일하거나, 적어도 95% 동일한 경우 이들은 "보존된" 것으로 언급된다. 일부 양태에서, 2개 이상의 서열이 서로 약 30% 동일하거나, 약 40% 동일하거나, 약 50% 동일하거나, 약 60% 동일하거나, 약 70% 동일하거나, 약 80% 동일하거나, 약 90% 동일하거나, 약 95% 동일하거나, 약 98% 동일하거나, 약 99% 동일한 경우 이들은 "보존된" 것으로 언급된다. 서열의 보존은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전체 길이에 적용될 수 있거나 이의 일부, 영역 또는 특징에 적용될 수 있다.

[0085] 포함하는: 양태가 본원에서 "포함하는"이라는 언어로 기술될 때마다, "구성되는" 및/또는 "필수구성으로 포함하는"의 관점에서 기술된 다른 유사한 양태가 또한 제공되는 것으로 이해된다.

[0086] 배뇨근: 본원에서 사용되는 용어 "배뇨근(detrusor)" 또는 "배뇨근(detrusor muscle)"은 방광의 근육을 지칭한다. "배뇨근내"는 배뇨근 내를 의미한다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 조성물은 배뇨근내(즉, 배뇨근에) 주사된다.

[0087] 배뇨근 과다활동: 본원에서 사용되는 용어 "배뇨근 과다활동"은, 예를 들어, 충전 방광내압측정 동안 불수의 배뇨근 수축의 발생을 지칭한다. 자발적이거나 유발될 수 있는 이러한 수축은 환자에 의해 억제될 수 없다. 이들은 방광내압곡선에서 다양한 기간 및 진폭의 파동(위상) 형태를 취할 수 있다. 수축은 무증상이거나 배뇨에 대한 정상적인 욕구로 해석될 수 있지만 절박은 일반적으로 정상적인 방광 감각을 가진 여성과 관련이 있다. 요실금은 발생하거나 발생하지 않을 수 있다. 후속 감소 없는 배뇨근 압력의 점진적인 증가는 순응도의 변화로 가장 잘 간주된다. 용어 "배뇨근 과다활동"은 국제 요실금 학회(ICS)에 의해 다음과 같이 정의된다: 배뇨근 과다활동은 자발적이거나 유발될 수 있는 충전 단계 동안 불수의 배뇨근 수축을 특징으로 하는 요역학적 관찰이다(Abrams P et al., Urology 2003, 62(Supplement 5B): 28-37 and 40-42).

[0088] 유효량: 본원에서 사용되는 바와 같이, 임의의 투여 형태, 약학적 조성물 또는 제형에서 본 개시의 Maxi-K 조성물의 "유효량"이라는 용어는 유리하거나 원하는 결과를 달성하기에 충분한 양이다. 일부 양태에서, 유리하거나 원하는 결과는, 예를 들어, 임상 결과이고, 따라서 "유효량"은 적용되는 상황에 따라 달라진다. 용어 "유효량"은 "유효 용량", "치료적 유효량" 또는 "치료적 유효 용량"과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.

[0089] 발현 벡터: "발현 벡터"는 적절한 숙주 세포로 도입될 때 본 개시의 Maxi-K 폴리펩티드로 전사 및 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드이다. Maxi-K 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 당 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 표적 세포(예를 들어, 표적 조직의 평활근 세포, 또는 표적 조직에 후속 투여를 위한 줄기 세포)로 트랜스펙션될 수 있고, 표적 조직에서 본 개시의 Maxi-K 폴리펩티드로 전사 및 번역될 수 있다. 그러한 트랜스펙션 방법은 당 분야에 널리 알려져 있다.

[0090] 상동성: 본원에서 사용되는 용어 "상동성"은 중합체 분자 사이, 예를 들어, 핵산 분자(예를 들어, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 사이 및/또는 폴리펩티드 분자 사이의 전반적인 관련성을 지칭한다. 일반적으로, 용어 "상동성"은 2개 분자 사이의 진화적 관계를 의미한다. 따라서, 상동성인 2개의 분자는 공통의 진화적 조상을 가질 것이다. 본 개시의 맥락에서, 용어 상동성은 동일성 및 유사성 둘 모두를 포함한다.

[0091] 일부 양태에서, 중합체 분자는 분자 내의 단량체의 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%가 동일하거나(정확히 동일한 단량체) 유사한(보존적 치환) 경우 서로 "상동성"인 것으로 간주된다. 용어 "상동성"은 반드시 적어도 2개의 서열(폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열) 사이의 비교를 지칭한다.

[0092] hSlo: 용어 "Maxi-K 알파 서브유닛", "hSlo" 및 "hSlo1"은 본 명세서 전체에서 상호 교환적으로 사용된다.

[0093] 동일성: 본원에서 사용되는 용어 "동일성"은 중합체 분자 사이, 예를 들어, 폴리펩티드 분자 또는 폴리뉴클레오티드 분자(예를 들어, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 사이의 전반적인 단량체 보존을 지칭한다. 임의의 추가 한정어를 갖지 않는 용어 "동일한", 예를 들어, 단백질 A가 단백질 B와 동일하다는 것은 그 서열들이 100% 동일함을 의미한다(100% 서열 동일성). 예를 들어, "70% 동일한"으로 2개의 서열을 설명하는 것은 이들이, 예를 들어, "70% 서열 동일성"을 가짐을 설명하는 것과 같다.

[0094] 2개의 폴리뉴클레오티드 서열의 동일성 퍼센트의 계산은, 예를 들어, 최적의 비교 목적을 위해 2개의 서열을 정렬함으로써 수행될 수 있다(예를 들어, 최적 정렬을 위해 제1 및 제2 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭을 도입할 수 있으며 비교 목적을 위해 동일하지 않은 서열은 무시할 수 있다). 특정 양태에서, 비교를 위해 정렬된 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%이다. 이후 상응하는 뉴클레오티드 위치에 있는 뉴클레오티드를 비교한다.

[0095] 제1 서열의 위치가 제2 서열의 상응하는 위치와 동일한 뉴클레오티드에 의해 점유될 때, 분자는 그 위치에서 동일하다. 2개 서열 사이의 동일성 퍼센트는 2개 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다. 2개 서열 사이의 서열 비교 및 동일성 퍼센트의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. DNA와 RNA를 비교할 때, 티민(T) 및 우라실(U)은 동등한 것으로 간주될 수 있다.

[0096] 적합한 소프트웨어 프로그램은 다양한 공급처로부터, 그리고 단백질 및 뉴클레오티드 서열 둘 모두의 정렬을 위해 이용 가능하다. 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 하나의 적합한 프로그램은 미국 정부의 국립 생명 공학 정보 센터 BLAST 웹 사이트(blast.ncbi.nlm.nih.gov)에서 이용 가능한 BLAST 프로그램 제품군의 일부인 bl2seq이다. Bl2seq는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 2개 서열 간의 비교를 수행한다. BLASTN은 핵산 서열을 비교하는데 사용되는 반면 BLASTP는 아미노산 서열을 비교하는데 사용된다. 다른 적합한 프로그램은, 예를 들어, 생물 정보학 프로그램의 EMBOSS 제품군의 일부인 Needle, Stretcher, Water 또는 Matcher이며, 이는 또한 유럽 생물정보 협회(EBI)의 www.ebi.ac.uk/Tools/psa로부터 입수 가능하다.

[0097] 서열 정렬은 MAFFT, Clustal(ClustalW, Clustal X 또는 Clustal Omega), MUSCLE 등과 같은 당 분야에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.

[0098] 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 참조 서열과 정렬되는 단일 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 표적 서열 내의 상이한 영역은 각각 그들 자신의 서열 동일성 퍼센트를 가질 수 있다. 서열 동일성 퍼센트 값은 가장 가까운 10분의 1로 반올림되는 것에 유의한다. 예를 들어, 80.11, 80.12, 80.13 및 80.14는 80.1로 반내림되고 80.15, 80.16, 80.17, 80.18 및 80.19는 80.2로 반올림된다. 또한 길이 값은 항상 정수임에 유의한다.

[0099] 특정 양태에서, 제2 아미노산 서열(또는 핵산 서열)에 대한 제1 아미노산 서열(또는 핵산 서열)의 동일성 백분율(%ID)은 %ID = 100 x (Y/Z)로서 계산되며, 여기서 Y는 제1 및 제2 서열의 정렬에서 동일한 일치로 스코어링된 아미노산 잔기(또는 핵염기)의 수이고(시각적 검사 또는 특정 서열 정렬 프로그램에 의해 정렬됨), Z는 제2 서열의 총 잔기 수이다. 제1 서열의 길이가 제2 서열보다 길면, 제2 서열에 대한 제1 서열의 동일성 퍼센트는 제1 서열에 대한 제2 서열의 동일성 퍼센트보다 높을 것이다.

[0100] 당업자는 서열 동일성 퍼센트의 계산을 위한 서열 정렬의 생성이 1차 서열 데이터에 의해 독점적으로 구동되는 이원 서열-서열 비교에 제한되지 않음을 이해할 것이다. 서열 정렬은 서열 데이터를 구조적 데이터(예를 들어, 결정학적 단백질 구조), 기능적 데이터(예를 들어, 돌연변이의 위치) 또는 계통발생 데이터와 같은 이종 소스로부터의 데이터와 통합함으로써 생성될 수 있음이 또한 이해될 것이다. 이종 데이터를 통합하여 다중 서열 정렬을 생성하는 적합한 프로그램은 www.tcoffee.org에서 이용 가능하고, 대안적으로, 예를 들어, EBI로부터 이용 가능한 T-Coffee이다. 서열 동일성 퍼센트를 계산하는데 사용되는 최종 정렬은 자동 또는 수동으로 큐레이팅될 수 있음이 또한 이해될 것이다.

[0101] 과민성 대장 증후군: 본원에서 사용되는 용어 "과민성 대장 증후군"("IBS"로 약칭)은 소장 및 대장의 비정상적으로 증가된 운동성을 특징으로 하는 종종 재발하는 장애를 지칭하며, 복통, 변비 또는 설사를 유발한다. IBS를 특성화하는 한 가지 방법은 Rome III 또는 IV 기준을 포함하는 기능성 장 질환에 대한 Rome 기준이다. 상기 용어는 각각 설사-우세(IBS-D), 변비-우세(IBS-C), 혼합(IBS-M), 교대(IBS-A) 및 알 수 없는 서브타입을 갖는 IBS(IBS-U)를 포함하나 이에 제한되지 않는 과민성 대장 증후군의 모든 분류를 포함한다. Rome IV는 IBS 진단을 위해 개발된 가장 최근의 기준이며, Rome III에 비해 복통과 관련된 기준의 민감도 및 특이성을 증가시킨다. 문헌[Lacy et al., "Rome Criteria and a Diagnostic Approach to Irritable Bowel Syndrome," J. Clin. Med. 6, 99 (2017)] 참조. Rome IV에서, IBS는 지난 3개월 동안 다음의 기준 중 2개 이상과 관련된 평균 적어도 1일/주(week)로 재발되는 복통으로 진단된다: (1) 배변 관련됨; (2) 대변 빈도에서의 변화와 관련됨; (3) 대변 형태(모양)에서의 변화와 관련됨. 이전에 사용한 Rome III에서, IBS는 지난 3개월 동안 다음 중 2개 이상과 관련된 적어도 3일/월로 재발되는 복통 또는 불편함(통증으로 설명되지 않은 불편한 감각으로 정의됨)으로 진단된다: (1) 배변 개선; (2) 대변 빈도의 변화와 관련된 시작; 및 (3) 대변 형태(모양)의 변화와 관련된 시작. Rome III 및 IV 둘 모두에서, 진단하기 적어도 6개월 전에 증상 시작과 함께 지난 3개월 동안 상기 기준을 충족해야 하다.

[0102] 일부 양태에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 IBS를 치료하고/하거나 IBS와 관련된 증상을 예방 또는 개선하는데 사용될 수 있다.

[0103] 분리된: 본원에서 사용되는 용어 "분리된"은 (자연적이든 실험적 환경이든) 관련이 있는 성분 중 적어도 일부로부터 분리된 물질 또는 실체(예를 들어, 자연에서 발견되지 않는 형태의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물)를 지칭한다. 분리된 물질(예를 들어, 뉴클레오티드 서열 또는 단백질 서열)은 관련되었던 물질에 관하여 다양한 수준의 순도를 가질 수 있다.

[0104] 분리된 물질 및/또는 실체는 처음에 관련되었던 다른 성분의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 95% 이상으로부터 분리될 수 있다.

[0105] 일부 양태에서, 분리된 물질은 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과로 순수하다.

[0106] 본원에서 사용되는 물질은 다른 성분이 실질적으로 없는 경우 "순수하다". 용어 "실질적으로 분리된"은 화합물이 그것이 형성되거나 검출된 환경으로부터 실질적으로 분리됨을 의미한다. 부분적 분리는, 예를 들어, 본 개시의 화합물이 풍부한 조성물을 포함할 수 있다. 실질적 분리는 중량을 기준으로 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99%의 본 개시의 화합물 또는 이의 염을 함유하는 조성물을 포함할 수 있다.

[0107] 일부 양태에서, 본원에 개시된 "분리된" 폴리뉴클레오티드, 벡터, 폴리펩티드, 세포 또는 임의의 조성물은 자연에서 발견되지 않는 형태의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, Maxi-K 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산), 벡터, 폴리펩티드, 세포 또는 조성물이다. 분리된 폴리뉴클레오티드, 벡터, 폴리펩티드 또는 조성물은 이들이 더 이상 자연에서 발견되는 형태가 아닌 정도로 정제된 것들을 포함한다. 일부 양태에서, 분리된 폴리뉴클레오티드, 벡터, 폴리펩티드 또는 조성물은 실질적으로 순수하다.

[0108] 분리된 핵산: 본원에서 의도된 바와 같이, 표현 "분리된 핵산"은 임의의 유형의 분리된 핵산을 지칭하며, 이는 특히 자연 또는 합성, DNA 또는 RNA, 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 특히, 핵산이 합성 핵산인 경우, 이는 특히 핵산의 분해에 대한 내성을 증가시키기 위해 염기 또는 결합의 비-자연 변형을 포함할 수 있다. 핵산이 RNA인 경우, 변형은 특히, 예를 들어, 하이드록실 모이어티를 억제하거나(2'-데옥시리보스 또는 2'-데옥시리보스-2'-플루오로리보스를 생성하기 위해), 또는 하이드록실 모이어티를 메틸기과 같은 알킬기로 치환함으로써(2'-O-메틸-리보스를 생성하기 위해), 하이드록실 모이어티의 반응성을 감소시키기 위해 리보스 백본의 말단을 캡핑하거나 2' 위치를 변형시키는 것을 포함한다.

[0109] 평활근 수축 조절: 본원에서 사용되는 용어 "평활근 수축 조절"은, 예를 들어, 표적 상태의 치료를 허용하는 다양한 수준으로 평활근 수축을 억제하거나 자극하는 능력을 포함하는 것으로 의도된다. 상기 용어는 또한 평활근의 이완 유도, 예를 들어, 전체 이완, 및 이완된 상태에 있는 평활근의 수축을 포함하도록 의도되며, 근육이 더 수축된 상태, 예를 들어, 식도 역류의 조임근을 갖는 것이 요망된다.

[0110] 돌연변이: 본 개시의 내용에서, 상기 정의된 바와 같은 용어 "돌연변이" 및 "아미노산 치환"(때로는 간단히 "치환"으로 지칭됨)은 상호 교환 가능한 것으로 간주된다. 일부 양태에서, 용어 돌연변이는 생성된 폴리펩티드의 아미노산 서열이 하나 이상의 아미노산 잔기에서 변경되도록 하는 Maxi-K 폴리펩티드(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛)를 인코딩하는 핵산에서 화학적, 효소적 또는 임의의 다른 수단에 의한 임의의 뉴클레오티드의 결실, 삽입 또는 치환을 지칭한다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 핵산 서열의 돌연변이는 아미노산 치환을 발생시킨다. 다른 양태에서, 생성된 코돈이 동의 코돈(synonymous codon)인 본원에 개시된 핵산 서열에서 코돈의 돌연변이는 아미노산 치환을 발생시키지 않는다. 따라서, 일부 양태에서, 본원에 개시된 핵산 서열은 하나 이상의 동의 코돈 변화를 도입함으로써 코돈 최적화될 수 있다. 그러한 코돈 최적화는, 예를 들어, (i) 재조합 단백질 발현에서 단백질 수율을 개선하거나, (ii) 본원에 개시된 결합 분자를 인코딩하는 mRNA 또는 DNA의 안정성, 반감기 또는 다른 바람직한 특성을 개선할 수 있으며, 여기서 그러한 mRNA 또는 DNA가 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.

[0111] 야뇨증: 본원에서 사용되는 용어 "야뇨증"은 배뇨의 필요로 인한 1회 이상의 수면 중단에 대한 증상호소를 지칭한다. 각 배뇨의 앞뒤에 수면이 따른다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 야뇨증을 치료, 예방 또는 개선하는데 사용될 수 있다.

[0112] 과활동성 방광: 본원에서 사용되는 용어 "과활동성 방광"은 요로 감염 또는 다른 명백한 병리의 부재하에, 절박성 요실금이 있거나 없는, 일반적으로 빈뇨 및 야뇨증을 동반하는 요절박을 지칭한다. 용어 "과활동성 방광"은 국제 요실금 학회(ICS)에 의해 다음과 같이 정의된다: 과활동성 방광(OAB)은 국소 병리학 또는 호르몬 인자의 부재하에, 일반적으로 빈뇨 및 야뇨증을 동반한, 절박 요실금이 있거나 없는 절박으로 구성된 복합 증상이다(Abrams P et al., Urology 2003, 61(1): 37-49; Abrams P et al., Urology 2003, 62(Supplement 5B): 28-37 and 40-42). 과활동성 방광(OAB)의 동의어는 "절박 증후군" 및 "절박 빈뇨 증후군"을 포함한다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 과활동성 방광을 치료, 예방 또는 개선하는데 사용될 수 있다.

[0113] 환자: 본원에서 사용되는 "환자"는 치료를 받거나 받을 필요가 있거나, 치료를 요구하거나, 치료를 받고 있거나, 치료를 받을 예정인 대상체, 또는 특정 질병 또는 질환에 대해 훈련된 전문가에 의해 치료를 받고 있는 대상체를 지칭한다. 상기 용어는 또한 평활근 기능장애에 영향을 받거나 영향을 받을 가능성이 있는 임의의 인간 또는 비인간 포유동물을 포함한다.

[0114] 약학적 조성물: 용어 "약학적 조성물"은 활성 성분(예를 들어, 본 개시의 Maxi-K 조성물)의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태이며, 조성물이 투여될 대상체에게 허용되지 않는 독성인 추가 성분을 함유하지 않는 제조물을 지칭한다. 그러한 조성물은 멸균될 수 있다.

[0115] 약학적으로 허용되는: 용어 "약학적으로 허용되는"은 올바른 의학적 판단의 범위 내에서 합리적인 이익/위험 비에 상응하는 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 일반적으로, 동물 및 더욱 특히 인간에서 사용하기 위해 연방 또는 주 정부(또는 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정되는 약전에 등재됨)의 규제 기관의 승인은 그러한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태가 약학적으로 허용됨을 나타낸다. 일반적으로 치료 목적으로 안전한 것으로 허용되는 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태는 "치료적으로 허용"된다. 일반적으로 진단 목적으로 안전한 것으로 허용되는 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태는 "진단적으로 허용"된다.

[0116] 약학적으로 허용되는 부형제: 본원에서 사용되는 어구 "약학적으로 허용되는 부형제"는 본원에 기재된 화합물 이외의 임의의 성분(예를 들어, 활성 화합물을 현탁 또는 용해시킬 수 있는 비히클)을 지칭하며, 환자에서 실질적으로 비독성이고 비염증성인 특성을 갖는다. 부형제는, 예를 들어, 항부착제, 항산화제, 결합제, 코팅, 압축 보조제, 붕해제, 염료(색소), 완화제, 유화제, 충전제(희석제), 필름 형성제 또는 코팅, 풍미제, 향료, 활택제(유동 향상제), 윤활제, 보존제, 인쇄용 잉크, 흡착제, 현탁제 또는 분산제, 감미제 및 수화용 물을 포함할 수 있다.

[0117] 예시적인 부형제는 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), 칼슘 카르보네이트, 칼슘 포스페이트(이염기성), 칼슘 스테아레이트, 크로스카르멜로스, 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 시트르산, 크로스포비돈, 시스테인, 에틸셀룰로스, 젤라틴, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 락토스, 마그네슘 스테아레이트, 말티톨, 만니톨, 메티오닌, 메틸셀룰로스, 메틸 파라벤, 미세결정질 셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 포비돈, 사전 젤라틴화된 전분, 프로필 파라벤, 레티닐 팔미테이트, 셸락, 실리콘 디옥사이드, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소듐 시트레이트, 소듐 전분 글리콜레이트, 소르비톨, 전분(옥수수), 스테아르산, 수크로스, 탈크, 티타늄 디옥사이드, 비타민 A, 비타민 E, 비타민 C 및 자일리톨을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

[0118] 일반적으로 치료 목적에 안전한 것으로 허용되는 부형제는 "치료적으로 허용되는 부형제"이다.

[0119] 약학적으로 허용되는 염: 본 개시는 또한 본원에 기재된 화합물의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는 염"은 개시된 화합물의 유도체를 지칭하며, 여기서 부모 화합물은 기존 산 또는 염기 모이어티를 이의 염 형태로 전환함으로써(예를 들어, 유리 염기기를 적합한 유기산과 반응시킴으로써) 변형된다. 약학적으로 허용되는 염의 예는 아민과 같은 염기성 잔기의 무기산 또는 유기산 염; 카르복실산과 같은 산성 잔기의 알칼리 또는 유기 염 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

[0120] 대표적인 산 부가염은 아세테이트, 아세트산, 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤젠설폰산, 벤조에이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵토네이트, 헥사노에이트, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 하이드로아이오다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염 등을 포함한다.

[0121] 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 소듐, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등뿐만 아니라 비독성 암모늄, 4차 암모늄, 및 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 에틸아민 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 아민 양이온을 포함한다. 본 개시의 약학적으로 허용되는 염은, 예를 들어, 비독성 무기산 또는 유기산으로부터 형성된 부모 화합물의 통상적인 비독성 염을 포함한다. 본 개시의 약학적으로 허용되는 염은 통상적인 화학적 방법에 의해 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 부모 화합물로부터 합성될 수 있다. 일반적으로, 그러한 염은 이들 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 물 또는 유기 용매, 또는 이들 둘의 혼합물에서 화학량론적 양의 적절한 염기 또는 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있으며; 일반적으로, 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세토니트릴과 같은 비수성 매질이 사용된다. 적합한 염의 목록은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17^th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P.H. Stahl and C.G. Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008, and Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977)]에서 볼 수 있고, 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

[0122] 약학적으로 허용되는 용매화물: 본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는 용매화물"은 적합한 용매의 분자가 결정 격자에 혼입되어 있는 본 개시의 화합물을 의미한다. 적절한 용매는 투여되는 투여량에서 생리학적으로 관용될 수 있다. 예를 들어, 용매화물은 유기 용매, 물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 용액으로부터의 결정화, 재결정화 또는 침전에 의해 제조될 수 있다. 적합한 용매의 예는 에탄올, 물(예를 들어, 모노-, 디- 및 트리-하이드레이트), N-메틸피롤리디논(NMP), 디메틸 설폭사이드(DMSO), N,N'-디메틸포름아미드(DMF), N,N'-디메틸아세트아미드(DMAC), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논(DMEU), 1,3-디메틸-3,4,5,6-테트라하이드로-2-(1H)-피리미디논(DMPU), 아세토니트릴(ACN), 프로필렌 글리콜, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 2-피롤리돈, 벤질 벤조에이트 등이다. 물이 용매인 경우, 용매화물은 "수화물"로 지칭된다.

[0123] 폴리뉴클레오티드: 본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 이들의 유사체 또는 이들의 혼합물을 포함하는 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭한다. 이 용어는 분자의 주요 구조를 지칭한다. 따라서, 용어는 삼중-, 이중- 및 단일-가닥 데옥시리보핵산("DNA")뿐만 아니라 삼중-, 이중- 및 단일-가닥 리보핵산("RNA")을 포함한다. 이는 또한, 예를 들어, 알킬화 및/또는 캡핑에 의한 폴리뉴클레오티드의 변형된 형태 및 비변형된 형태를 포함한다. 보다 구체적으로, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 폴리데옥시리보뉴클레오티드(2-데옥시-D-리보스 함유), 폴리리보뉴클레오티드(D-리보스 함유), 예를 들어, 스플라이싱 여부에 관계 없이 tRNA, rRNA, hRNA, siRNA 및 mRNA, 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N- 또는 C-글리코시드인 임의의 다른 유형의 폴리뉴클레오티드, 및 노르뮤클레오티드(normucleotidic) 백본을 함유하는 다른 중합체, 예를 들어, 폴리아미드(예를 들어, 펩티드 핵산 "PNA") 및 폴리모르폴리노 중합체, 및 다른 합성 서열-특이적 핵산 중합체를 포함하고, 단, 중합체는 DNA 및 RNA에서 발견되는 것과 같은 염기 쌍 및 염기 적층을 허용하는 구성으로 핵염기를 함유한다.

[0124] 특정 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA, 예를 들어, mRNA를 포함한다. 다른 양태에서, DNA 또는 RNA, 예를 들어, mRNA는 합성 DNA 또는 RNA, 예를 들어, mRNA이다. 일부 양태에서, 합성 DNA 또는 RNA, 예를 들어, mRNA는 적어도 하나의 비자연 핵염기를 포함한다. 일부 양태에서, 특정 부류의 모든 핵염기는 비자연 핵염기로 대체되었다(예를 들어, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드의 모든 우리딘은 비자연 핵염기, 예를 들어, 5-메톡시우리딘으로 대체될 수 있다). 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 합성 RNA 또는 합성 DNA)는 자연 핵염기만을 포함하고, 즉, 합성 DNA의 경우 A, C, T 및 U, 또는 합성 RNA의 경우 A, C, T 및 U를 포함한다.

[0125] 당업자는 본원에 개시된 코돈 맵에서 T 염기가 DNA에 존재하는 반면, T 염기는 상응하는 RNA에서 U 염기로 대체될 것임을 이해할 것이다. 예를 들어, DNA 형태로 본원에 개시된 코돈-뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 벡터 또는 시험관내 번역(IVT) 주형은 이의 상응하는 전사된 mRNA에 기초하여 U로서 전사되는 T 염기를 가질 것이다. 이와 관련하여, 코돈-최적화된 DNA 서열(T 포함) 및 이들의 상응하는 RNA 서열(U 포함) 둘 모두는 본 개시의 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열로 간주된다. 당업자는 또한 동일한 코돈-맵이 하나 이상의 염기를 비자연 염기로 대체함으로써 생성될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 예를 들어, TTC 코돈(DNA 맵)은 UUC 코돈(RNA 맵)에 상응할 것이고, 이는 차례로 ΨΨC 코돈(U가 슈도우리딘으로 대체된 RNA 맵)에 상응할 것이다.

[0126] 표준 A-T 및 G-C 염기 쌍은 티미딘의 N3-H 및 C4-옥시와 아데노신의 N1 및 C6-NH₂ 사이에 각각, 그리고 시티딘의 C2-옥시, N3 및 C4-NH₂와 구아노신의 C2-NH₂, N'-H 및 C6-옥시 사이에 각각 수소 결합의 형성을 허용하는 조건하에 형성된다. 따라서, 예를 들어, 구아노신(2-아미노-6-옥시-9-β-D-리보푸라노실-퓨린)은 변형되어 이소구아노신(2-옥시-6-아미노-9-β-D-리보푸라노실-퓨린)을 형성할 수 있다. 그러한 변형은 더 이상 시토신과 표준 염기 쌍을 효과적으로 형성하지 않을 뉴클레오시드 염기를 초래한다. 그러나, 이소시토신(1-β-D-리보푸라노실-2-아미노-4-옥시-피리미딘-)을 형성하기 위한 시토신(1-β-D-리보푸라노실-2-옥시-4- 아미노-피리미딘)의 변형은 구아노신과 효과적으로 염기 쌍을 형성하지 않지만 이소구아노신과 염기 쌍을 형성할 변형된 뉴클레오티드를 발생시킨다(U.S. Pat. No. 5,681,702 to Collins et al.). 이소시토신은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, Mo.)로부터 이용 가능하고; 이소시티딘은 문헌[Switzer et al. (1993) Biochemistry 32:10489-10496] 및 그 안에 인용된 참고문헌에 기술된 방법에 의해 제조될 수 있으며; 2'-데옥시-5-메틸-이소시티딘은 문헌[Tor et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115:4461-4467] 및 그 안에 인용된 참고문헌의 방법에 의해 제조될 수 있으며; 이소구아닌 뉴클레오티드는 문헌[Switzer et al., 1993, supra, and Mantsch et al. (1993) Biochem. 14:5593-5601] 또는 Collins 등에 의해 미국 특허 번호 5,780,610에 기술된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.

[0127] 다른 비자연 염기 쌍은 2,6-디아미노피리미딘 및 이의 보체 (1-메틸피라졸로-[4,3]피리미딘-5,7-(4H,6H)-디온의 합성을 위해 문헌[Piccirilli et al. (1990) Nature 343:33-37]에 기술된 방법에 의해 합성될 수 있다. 고유한 염기 쌍을 형성하는 다른 그러한 변형된 뉴클레오티드 단위, 예를 들어, 문헌[Leach et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:3675-3683 and Switzer et al., supra]에 기술된 것들이 공지되어 있다.

[0128] 폴리펩티드: 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 중합체는 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 변형되거나 개입, 예를 들어, 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 포스포릴화 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예를 들어, 표지 성분을 이용한 컨쥬게이션에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 또한, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 유사체(예를 들어, 호모시스테인, 오르니틴, p-아세틸페닐알라닌, D-아미노산 및 크레아틴과 같은 비자연 아미노산 포함)를 함유하는 폴리펩티드뿐만 아니라 당 분야에 공지된 다른 변형이 그 정의 내에 포함된다.

[0129] 본원에서 사용되는 용어 폴리펩티드는 임의의 크기, 구조 또는 기능의 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드를 지칭한다. 폴리펩티드는 유전자 생성물, 자연 발생 폴리펩티드, 합성 폴리펩티드, 호몰로그, 오르톨로그, 파라로그, 단편 및 다른 등가물, 상기의 변이체 및 유사체를 포함한다. 폴리펩티드는 단일 폴리펩티드일 수 있거나 이량체, 삼량체 또는 사량체와 같은 다분자 복합체일 수 있다. 이들은 또한 단일 사슬 또는 다중 사슬 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 가장 일반적으로 디설파이드 결합은 다중 사슬 폴리펩티드에서 발견된다. 용어 폴리펩티드는 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학적 유사체인 아미노산 중합체에 적용될 수 있다. 일부 양태에서, "펩티드"는 50개 이하의 아미노산 길이, 예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개의 아미노산 길이일 수 있다.

[0130] 예방하는: 본원에서 사용되는 용어 "예방하는"은 질병, 장애 및/또는 질환의 발병을 부분적으로 또는 완전히 지연시키고/거나; 특정 질병, 장애 및/또는 질환의 하나 이상의 증상, 특징 또는 임상 소견의 개시를 부분적으로 또는 완전히 지연시키고/거나; 특정 질병, 장애 및/또는 질환의 하나 이상의 증상, 특징 또는 소견의 개시를 부분적으로 또는 완전히 지연시키고/거나; 특정 질병, 장애 및/또는 질환의 진행을 부분적으로 또는 완전히 지연시키고/거나; 질병, 장애 및/또는 질환과 관련된 병리가 발생할 위험을 감소시킨다.

[0131] 예방적(Prophylactic): 본원에서 사용되는 "예방적"은 질병 또는 질환의 발병을 예방하거나 평활근 기능장애와 관련된 질환과 관련된 증상을 예방 또는 지연시키는데 사용되는 치료 또는 작용 과정을 지칭한다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 예방적으로 적용될 수 있다.

[0132] 예방(Prophylaxis): 본원에서 사용되는 용어 "예방"은 건강을 유지하고 평활근 기능장애와 관련된 질병 또는 질환의 발병을 예방 또는 지연시키거나 증상의 정도 및/또는 중증도를 완화시키기 위해 취한 조치를 지칭한다. 따라서, 본원에 개시된 치료제의 예방적 사용은 유리하거나 원하는 결과를 달성하기에 충분한 양에 상응한다.

[0133] 범위: 본원에 기재된 바와 같이, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는, 달리 명시되지 않는 한, 언급된 범위 내의 임의의 정수의 값 및 적절한 경우 이의 분수(예를 들어, 정수의 1/10 및 1/100)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

[0134] 신장 장애: 본원에서 사용되는 용어 "신장 장애"는 콩팥 또는 신부전, 콩팥 또는 신장 기능부전, 콩팥 또는 신장 기능장애, 급성 신장 손상 및 만성 신장 질환 및 관련 질환뿐만 아니라 임상 증상, 실험실 및 다른 진단 측정값 및 이러한 각 질환과 관련된 합병증을 포함한다.

[0135] 유사성: 본원에서 사용되는 용어 "유사성"은 중합체 분자 사이, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 분자(예를 들어, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 사이 및/또는 폴리펩티드 분자 사이의 전반적인 관련성을 지칭한다. 중합체 분자의 서로에 대한 유사성 퍼센트의 계산은 동일성 퍼센트의 계산과 동일한 방식으로 수행될 수 있는데, 단, 유사성 퍼센트의 계산은 당 분야에서 이해되는 바와 같은 보존적 치환을 고려한다.

[0136] 평활근: 용어 "평활근"은 본 개시의 Maxi-K 조성물에 민감한 평활근을 포함하도록 의도된다. 평활근은 트랜스제닉으로 발현된 Maxi-K 폴리펩티드가 평활근의 수축을 조절하는 경우 본 개시의 Maxi-K 조성물에 민감한 것이다. 평활근의 예는 혈관, 폐의 기도, 위장관, 자궁 및 요로의 평활근을 포함한다.

[0137] 평활근 기능장애: 본원에서 사용되는 용어 평활근 기능장애는 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)의 트랜스제닉 발현에 의해 치료, 예방 또는 개선될 수 있는 임의의 질병, 질환, 증상 또는 후유증과 관련된다.

[0138] 대상체: "대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예후 또는 요법이 요망되는 임의의 대상체, 특히 포유동물 대상체를 의미한다. 포유동물 대상체는 인간, 가축, 농장 동물, 동물원 동물, 스포츠 동물, 애완 동물, 예를 들어, 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 젖소; 영장류, 예를 들어, 유인원, 원숭이, 오랑우탄 및 침팬지; 개 및 늑대와 같은 개과류; 고양이, 사자 및 호랑이와 같은 고양이과류; 말, 당나귀 및 얼룩말과 같은 말과류; 곰, 식용 동물, 예를 들어, 소, 돼지 및 양; 사슴 및 기린과 같은 유제류; 설치류, 예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터 및 기니피그 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 포유동물은 인간 대상체이다. 일부 양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 양태에서, 대상체는 인간 환자이다. 특정 양태에서, 대상체는 평활근 기능 장애를 갖는 인간 환자이다.

[0139] 실질적으로: 본원에서 사용되는 용어 "실질적으로"는 관심 특징 또는 특성의 전체 또는 거의 전체 범위 또는 정도를 나타내는 정성적 조건을 나타낸다. 생물학 분야의 당업자는 생물학적 및 화학적 현상이 완료된다 하더라도 완료되고/거나 완료까지 진행되는 것이 드물거나 절대적인 결과를 달성하거나 회피하는 것을 이해할 것이다. 따라서, 용어 "실질적으로"는 많은 생물학적 및 화학적 현상에 내재된 잠재적인 완전성 부족을 포착하기 위해 본원에서 사용된다.

[0140] 민감한: 질병, 장애 및/또는 질환에 "민감한" 개체는 질병, 장애 및/또는 질환의 진단을 받지 않았고/거나 증상을 나타내지 않을 수 있지만 질병 또는 이의 증상이 발병할 경향이 있다. 일부 양태에서, 질병, 장애 및/또는 질환(예를 들어, 암)에 민감한 개체는 다음 중 하나 이상을 특징으로 할 수 있다: (1) 질병, 장애 및/또는 질환의 발병과 관련된 유전적 돌연변이; (2) 질병, 장애 및/또는 질환의 발병과 관련된 유전적 다형성; (3) 질병, 장애 및/또는 질환과 관련된 단백질 및/또는 핵산의 증가 및/또는 감소된 발현 및/또는 활성; (4) 질병, 장애 및/또는 질환의 발병과 관련된 습관 및/또는 생활 양식; (5) 질병, 장애 및/또는 질환의 가족력; 및 (6) 질병, 장애 및/또는 질환의 발병과 관련된 미생물에 대한 노출 및/또는 감염. 일부 양태에서, 질병, 장애 및/또는 질환에 민감한 개체는 질병, 장애 및/또는 질환을 발병할 것이다. 일부 양태에서, 질병, 장애 및/또는 질환에 민감한 개체는 질병, 장애 및/또는 질환을 발병하지 않을 것이다.

[0141] 치료제: 본원에서 사용되는 용어 "치료제"는 이를 필요로 하는 대상체, 특히 평활근 기능장애로 고통받는 대상체에게 상당한 치료적 이익을 제공할 수 있는 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 포함하는 넓은 의미로 사용된다.

[0142] 용어 치료제는 또한 본원에 개시된 조성물을 포함하는 예방제를 포함하며, 여기서 치료제는 예를 들어, 비경구, 국소 또는 점적주입을 통해 투여된다. 일부 양태에서, 치료제는 주사를 통해 방광벽에 투여된다. 다른 양태에서, 치료제는 점적주입을 통해 대상체의 방광에 투여된다. 본 개시의 치료제는 평활근 기능장애뿐만 아니라 그러한 기능장애의 존재와 관련된 임의의 증상을 개선 및/또는 예방할 수 있는 제제도 포함한다. 따라서, 본원에 정의된 바와 같이, 용어 치료제는, 예를 들어, 평활근 기능장애에 의해 야기되는 특정 증상, 예를 들어, 염증 또는 통증을 감소시키거나 억제할 수 있는 제제를 포함할 것이다.

[0143] 표적 조직: 본원에서 사용되는 "표적 조직"은 본 개시의 치료제 및/또는 예방제의 전달이 원하는 생물학적 및/또는 약리학적 효과를 초래할 임의의 하나 이상의 관심 조직 유형을 지칭한다. 관심 표적 조직의 예는 특정 조직, 기관, 및 이의 시스템 또는 그룹을 포함한다. 특정 적용에서, 표적 조직은 평활근을 포함하는 임의의 조직, 예를 들어, 방광벽 조직, 장 조직, 혈관 조직 등일 수 있다.

[0144] 국소 투여: 본원에서 사용되는 용어 "국소 투여"는, 예를 들어, 피부, 오리피스 또는 점막 상의 국소 경로에 의한 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)의 임의의 투여를 지칭한다. 본원에서 사용되는 국소 투여는 피부, 귀, 코, 질, 요도 및 직장 투여 경로를 포함한다.

[0145] 치료하는, 치료, 요법: 본원에서 사용되는 용어 "치료하는" 또는 "치료" 또는 "요법"은 질병의 하나 이상의 증상 또는 특징, 또는 이들의 임의의 조합을 부분적으로 또는 완전히 완화, 호전, 개선, 경감, 발병 지연, 진행 억제, 중증도 감소, 발생률 감소시키는 것을 지칭한다.

[0146] 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 포함하는 치료는, 예를 들어, (i) 질병, 장애 및/또는 질환과 관련된 병리의 발병 위험을 감소시키거나, (ii) 질병, 장애 및/또는 질환, 또는 상기 질병, 장애 및/또는 질환과 관련된 병리의 발병을 지연시키거나, (iii) 질병, 장애 및/또는 질환, 또는 상기 질병, 장애 및/또는 질환과 관련된 병리의 증상 및/또는 후유증을 완화시키기 위해 질병, 장애 및 질환의 징후를 나타내지 않고/거나 질병, 장애 및/또는 질환의 초기 징후만을 나타내는 대상체에게 투여될 수 있다.

[0147] 따라서, 일반적으로, 용어 "치료"는 (i) 질환 또는 병리학적 상태의 진행을 억제하고, 즉, 이의 발병 또는 진행, 또는 그러한 장애 또는 질환의 하나 이상의 증상을 늦추거나 중지시키고; (ii) 질병 또는 병리학적 상태를 완화시키고, 즉, 상기 질병 또는 병리학적 상태 또는 이의 증상을 퇴보시키고; (iii) 질병 또는 병리학적 상태 또는 그러한 장애 또는 질환의 하나 이상의 증상을 안정화하고; (iv) 질병 또는 병리학적 상태 또는 그러한 장애 또는 질환의 하나 이상의 증상을 정상 상태로 역전시키고, (v) 질병 또는 병리학적 상태 또는 그러한 장애 또는 질환의 하나 이상의 증상을 예방하고, 그리고 (vi) 이들의 임의의 조합을 포함하여, 대상체에서 관심 질병 또는 병리학적 상태의 결과로서 야기되는 효과에 대응하는 것을 지칭한다.

[0148] ug, uM, uL: 본원에서 사용되는 용어 "ug," "uM" 및 "uL"는 "μg," "μΜ" 및 "μL"와 각각 상호 교환적으로 사용된다.

[0149] 절박 요실금: 본원에서 사용되는 용어 "절박 요실금"은 불수의 소변 손실에 대한 증상호소를 지칭한다.

[0150] 절박성 요실금: 본원에서 사용되는 용어 "절박성 요실금"은 절박과 관련된 불수의 소변 손실에 대한 증상호소를 지칭한다.

[0151] 요절박: 본원에서 사용되는 용어 "요절박"은 미루기 어려운 갑작스럽고 강력한 배뇨 욕구에 대한 증상호소를 지칭한다.

[0152] 빈뇨: 본원에서 사용되는 용어 "빈뇨"는 자신이 하루에 너무 자주 배뇨한다고 생각하는 환자의 증상호소를 지칭한다.

[0153] 벡터: "벡터"는 삽입된 핵산 분자를 숙주 세포 내로 및/또는 숙주 세포 사이에 전달하는, 특히 자가-복제하는 핵산 분자이다. 상기 용어는 DNA 또는 RNA를 세포로 삽입하기 위해 주로 기능하는 벡터(예를 들어, 염색체 통합), DNA 또는 RNA의 복제를 위해 주로 기능하는 벡터의 복제, 및 DNA 또는 RNA의 전사 및/또는 번역을 위해 기능하는 발현 벡터를 포함한다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 결합 분자를 인코딩하는 핵산(DNA 또는 RNA, 예를 들어, mRNA)의 투여 및/또는 발현은 시험관내(예를 들어, 재조합 단백질 생산 동안) 발생할 수 있는 반면, 다른 경우에 이것은 생체내(예를 들어, 대상체에 mRNA의 투여) 또는 생체외(예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위해 자가 또는 이종성 세포에 도입된 DNA 또는 RNA) 발생할 수 있다. 또한 설명된 하나 초과의 기능을 제공하는 벡터도 포함된다.

[0154] 본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 또한 일반적으로 이것이 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 임의의 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"이며, 이는 추가 DNA 세그먼트가 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 벡터의 다른 유형은 바이러스 벡터이며, 여기서 추가 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈에 라이게이션될 수 있다. 특정 벡터는 이것이 도입된 숙주 세포에서 자율 복제가 가능하다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터, 발현 벡터는 이것이 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다.

[0155] 비뇨기과적 상태와 관련된 추가 정의는, 예를 들어, 문헌[Chapple et al. (2018) "Terminology report from the International Continence Society (ICS) Working Group on Underactive Bladder (UAB)" Neurology and Urodynamics 37:2928-2931]에서 찾아볼 수 있다. 양성 전립선 비대와 관련된 추가 정의는, 예를 들어, www.auanet.org/benign-prostatic-hyperplasia-(2010-reviewed-and-validity-confirmed-2014)에서 이용 가능한 "Guidelines for Management of Benign Prostatic Hyperplasia"에서 볼 수 있다. 과민성 대장 증후군 및 만성 특발성 변비와 관련된 추가 정의는, 예를 들어, 문헌[Ford et al. (2014) "American College of Gastroenterology Monograph on the Management of Irritable Bowel Syndrome and Chronic Idiopathic Constipatoin" Am J Gastroenterol 109:S2 - S26]에서 볼 수 있다. 이러한 모든 문서는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

II. 평활근 기능장애의 치료 방법

[0156] 본 개시는 평활근 기능장애를 치료하기 위한 유전자 치료 방법을 제공한다. 특히, 본원에 개시된 방법은 이를 필요로 하는 대상체에서 평활근 기능장애를 치료 또는 예방하기 위해 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)의 투여를 포함하는 유전자 요법에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "본 개시의 Maxi-K 조성물", "본 개시의 조성물" 및 이의 문법적 변형은, 예를 들어,

(a) 도 17에 개략적으로 제시된 하나 이상의 Maxi-K 폴리펩티드, 및 이들의 도메인 또는 도메인의 조합을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(당 분야에 공지된 도메인 경계에 따름);

(b) 표 1에 제시된 하나 이상의 Maxi-K 폴리펩티드 서열(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛, Maxi-K 베타 서브유닛 또는 이들의 조합), 또는 이의 단편(예를 들어, 도 17 표시에 도시된 도메인 중 하나 이상이 결여된 알파 서브유닛), 아이소형, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 이를 테면, 예를 들어, 도 18에 제시된 폴리뉴클레오티드 및 도 18에 도시된 변이 N1 내지 N16 중 적어도 하나를 포함하는 이의 변이체 또는 이들의 임의의 조합;

(c) 본원에 개시된 Maxi-K 폴리펩티드, 예를 들어, 바람직한 특성을 부여하는 비-Maxi-K 폴리펩티드에 유전적으로 융합된 Maxi-K 알파 서브유닛, 또는 2개 이상의 Maxi-K 폴리펩티드, 예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛 및 Maxi-K 베타 서브유닛 간의 융합을 포함하는 융합 또는 키메라 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드;

(d) (a), (b), (c)의 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 플라스미드 또는 벡터;

(e) (a), (b) 또는 (c)의 폴리뉴클레오티드, (d)의 플라스미드 또는 벡터 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 세포;

(f) (a), (b) 또는 (c)의 폴리뉴클레오티드, (d)의 플라스미드 또는 벡터, (e)의 세포를 포함하는 약학적 조성물;

(g) 이들의 임의의 조합을 포함한다.

[0157] 일부 양태에서, 본 개시는 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 이를 필요로 하는 대상체에게, 예를 들어, 대상체의 방광으로의 주사, 이식 또는 점적주입에 의해(예를 들어, 배뇨근에 직접 주사에 의해) 투여하는 것을 포함하는 OAB를 치료하는 방법을 제공한다.

[0158] 일부 양태에서, 본 개시는 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 이를 필요로 하는 대상체에게, 예를 들어, 대상체의 방광으로의 주사, 이식 또는 점적주입에 의해(예를 들어, 배뇨근에 직접 주사에 의해) 투여하는 것을 포함하는 OAB를 예방하는 방법을 제공한다.

[0159] 일부 양태에서, 본 개시는 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 이를 필요로 하는 대상체에게, 예를 들어, 대상체의 방광으로의 주사, 이식 또는 점적주입에 의해(예를 들어, 배뇨근에 직접 주사에 의해) 투여하는 것을 포함하는 OAB의 적어도 하나의 증상을 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다.

[0160] 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 이를 필요로 하는 대상체에게, 예를 들어, 대상체의 방광으로의 주사, 이식 또는 점적주입에 의해(예를 들어, 배뇨근에 직접 주사에 의해) 투여하는 것을 포함하는, 예를 들어, OAB와 관련된 요절박 및/또는 빈뇨를 감소시키는 방법이 또한 제공된다.

[0161] 본 개시는 또한 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 이를 필요로 하는 대상체에게, 예를 들어, 대상체의 방광으로의 주사, 이식 또는 점적주입에 의해(예를 들어, 배뇨근에 직접 주사에 의해) 투여하는 것을 포함하는, 예를 들어, OAB와 관련된 UUI(절박 요실금)을 감소시키는 방법을 제공한다.

[0162] 본 개시는 또한 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 대상체에게, 예를 들어, 대상체의 방광으로의 주사, 이식 또는 점적주입에 의해(예를 들어, 배뇨근에 직접 주사에 의해) 투여하는 것을 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 방광 기능을 회복하는 방법을 제공한다.

[0163] 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 대상체에게, 예를 들어, 대상체의 방광으로의 주사, 이식 또는 점적주입에 의해(예를 들어, 배뇨근에 직접 주사에 의해) 투여하는 것을 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서, 예를 들어, OAB와 관련된 방광 연축을 감소시키는 방법이 또한 제공된다.

[0164] 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 대상체에게, 예를 들어, 대상체의 방광으로의 주사, 이식 또는 점적주입에 의해(예를 들어, 배뇨근에 직접 주사에 의해) 투여하는 것을 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서, 예를 들어, OAB와 관련된 방광의 평활근 조절 상실을 예방 또는 치료 또는 감소시키는 방법이 또한 제공된다.

[0165] 본 개시는 또한 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 대상체에게, 예를 들어, 대상체의 방광으로의 주사, 이식 또는 점적주입에 의해(예를 들어, 배뇨근에 직접 주사에 의해) 투여하는 것을 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 배뇨근 평활근 세포막에서 Maxi-K 채널의 수 및/또는 활성을 증가시키는 방법을 제공한다.

[0166] 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 대상체에게, 예를 들어, 대상체의 방광으로의 주사, 이식 또는 점적주입에 의해(예를 들어, 배뇨근에 직접 주사에 의해) 투여하는 것을 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 방광 평활근 세포 긴장도를 유지하거나 증가시키는 방법이 또한 제공된다.

[0167] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물은 SEQ ID NO: 16의 정준 pVAX-hSlo1 작제물이다. 다른 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물은 SEQ ID NO: 49의 pVAX-hSlo1 변이체 1 작제물이다. 다른 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물은 SEQ ID NO: 50의 pVAX-hSlo1 변이체 1 작제물이다. 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물은 이들의 조합을 포함한다.

[0168] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물은 SEQ ID NO: 51, 52 또는 53의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 핵산 서열은 Maxi-K 알파 서브유닛(hSlo1)을 인코딩한다.

[0169] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물은 SEQ ID NO: 54, 55 또는 56의 Maxi-K 알파 서브유닛(hSlo1)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

[0170] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물은 위치 23에 글리신 아미노산을 포함하는 Maxi-K 알파 서브유닛(hSlo1)을 인코딩한다. 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물은 위치 23에 세린 아미노산을 포함하는 Maxi-K 알파 서브유닛(hSlo1)을 인코딩한다. 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물은 위치 366에 아르기닌 아미노산을 포함하는 Maxi-K 알파 서브유닛(hSlo1)을 인코딩한다. 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물은 위치 366에 글리신 아미노산을 포함하는 Maxi-K 알파 서브유닛(hSlo1)을 인코딩한다.

[0171] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물은 위치 23에 글리신 아미노산 및 위치 366에 아르기닌 아미노산을 포함하는 Maxi-K 알파 서브유닛(hSlo1), 예를 들어, SEQ ID NO: 54의 Maxi-K 알파 서브유닛을 인코딩한다. 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물은 위치 23에 글리신 아미노산 및 위치 366에 글리신 아미노산을 포함하는 Maxi-K 알파 서브유닛(hSlo1), 예를 들어, SEQ ID NO: 55의 Maxi-K 알파 서브유닛을 인코딩한다. 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물은 위치 23에 세린 아미노산 및 위치 366에 글리신 아미노산을 포함하는 Maxi-K 알파 서브유닛(hSlo1), 예를 들어, SEQ ID NO: 56의 Maxi-K 알파 서브유닛을 인코딩한다.

[0172] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물은 도 18에서 확인된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 N1-N16 변이, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 SEQ ID NO: 16의 pVAX-hSlo1 작제물이다.

[0173] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물은 본원에 개시된 Maxi-K 알파 서브유닛 폴리펩티드의 발현을 초래하는 침묵 돌연변이를 적어도 포함하는 본원에 개시된 pVAX-hSlo로부터 유래된 pVAX-hSlo 작제물이다. 유전 코드의 축퇴성으로 인해, 코돈은 동일한 단백질 생성물을 생성하기 위해 그 안에 개시된 pVAX-hSlo 작제물에서 대체될 수 있다. 일부 경우에, 동일한 아미노산을 인코딩하는 코돈이 세 번째 위치에서만 다르다; 따라서, 2개의 코돈은 66% 서열 동일성을 가질 것이다. 일부 경우에, 동일한 아미노산을 인코딩하는 코돈은 2개의 위치(예를 들어, 둘 모두 아르기닌을 인코딩하는 CGC 및 AGA)에서 다를 수 있으며, 이 경우 2개의 코돈은 33% 서열 동일성을 가질 것이다. 또한, 동일한 아미노산을 인코딩하지만 0% 서열 동일성을 갖는 2개의 코돈, 예를 들어, 둘 모두 세린을 인코딩하는 AGU 및 UCA를 가질 수 있다. 그 결과, 서열 동일성 백분율이 매우 낮은 폴리뉴클레오티드는 그럼에도 불구하고 기능적으로 동등할 수 있고 동일한 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물은 본원에 개시된 Maxi-K-인코딩 폴리뉴클레오티드 서열에 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 벡터 또는 ORF)를 포함한다.

[0174] 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)은 당 분야에 공지된 유전자 전달 기술(예를 들어, 네이키드 DNA 또는 mRNA, 플라스미드, 바이러스 벡터, 또는 CRISPR과 같은 유전자 편집 기술)을 사용하여 투여되어, 표적 조직에서 Maxi-K 폴리펩티드(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛) 또는 Maxi-K 폴리펩티드의 조합(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛 및 Maxi-K 베타 서브유닛)을 발현시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하는 것은 유전자 요법으로 지칭될 수 있다.

[0175] Maxi-K 채널(BK 채널로도 알려짐)은 세포로부터 칼륨 이온에 대한 유출 경로를 제공하여, 전압 민감성 Ca²⁺ 채널을 억제함으로써 평활근의 이완을 가능하게 하고, 이에 따라 병리학적으로 고조된 평활근 긴장도를 감소시킴으로써 기관 기능의 정상화에 영향을 미친다. 용어 "Maxi-K 채널"및 "BK 채널"은 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 구조적으로, Maxi-K 채널은 알파 및 베타 서브유닛으로 구성된다. 4개의 알파 서브유닛은 채널의 기공을 형성하고, 이러한 알파 서브유닛은 단일 Slo1 유전자(Slo, hSlo, 칼륨 칼슘-활성화 채널 서브패밀리 M 알파 1, 또는 KCNMA1으로도 불림)에 의해 인코딩된다.

[0176] Maxi-K 채널 기능을 조절할 수 있는 4개의 Maxi-K 베타 서브유닛이 있다. 각 Maxi-K 베타 서브유닛은 평활근 세포에서 주로 발현되는 Maxi-K 베타 1 서브유닛(칼륨 칼슘-활성화 채널 서브패밀리 M 조절제 베타 서브유닛 1, 또는 KCNMB1)과 함께 별개의 조직 특이적 발현 및 조절 기능을 갖는다.

[0177] 기저 근육세포질그물의 리아노딘-민감성 칼슘 저장소에 매우 근접한 Maxi-K 채널의 전략적 클러스터는 다양한 평활근, 예를 들어, 방광 평활근에서 칼슘 신호 및 막 전위의 국소 조절을 위한 중요한 메커니즘을 제공한다.

[0178] 도 9에 도시된 바와 같이, 무스카린성 M3 수용체를 활성화시키는 신호는 세포내 칼슘 수준을 증가시킨다. 세포내 칼슘 수준의 증가는 Maxi-K 채널의 개방 확률을 증가시켜, 칼슘 민감성 Maxi-K 채널을 통한 K⁺의 외부 이동을 증가시킨다. K⁺의 유출은 세포 밖으로 양전하의 순 이동을 일으켜, 세포 내부를 외부에 비해 더 음으로 하전시킨다. 이것은 두 가지 주요 효과를 갖는다. 첫째, 증가된 막 전위는 칼슘 채널이 개방된 것보다 폐쇄된 시간을 더 많이 보낼 것을 보장한다. 둘째, 칼슘 채널이 폐쇄될 가능성이 더 높기 때문에, 세포로의 Ca²⁺의 순 플럭스가 감소하고 상응하는 유리 세포내 칼슘 수준이 감소한다.

[0179] 감소된 세포내 칼슘은 평활근 이완을 촉진한다. 예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛의 돌연변이를 통해 또는 야생형 또는 돌연변이체 Maxi-K 베타 서브유닛과의 상호작용을 통해 Maxi-K 알파 서브유닛의 기능을 상향조절 또는 하향조절함으로써 세포막에 더 많거나 더 적은 Maxi-K 채널을 갖거나 이들의 활성을 조절하는 것이 주로 시사하는 바는 평활근 세포 수축성이 조절될 수 있다는 것이다. 따라서, Maxi-K 알파 및/또는 베타 서브유닛의 상이한 조합의 트랜스제닉 발현은 평활근 기능장애를 치료하는데 적절하게 평활근 긴장도를 변형시키는데 사용될 수 있다.

[0180] 본 개시는 본 개시의 Maxi-K 조성물, 즉, Maxi-K 칼륨 채널 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 핵산(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 포함하는 적어도 1회 용량의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 평활근 기능장애(예를 들어, 과활동성 방광)를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 대상체의 평활근 세포에서 Maxi-K 칼륨 채널 폴리펩티드의 발현이 평활근 수축성을 조절한다. 본원에서 사용되는 용어 "맥시-K 칼륨 채널 폴리펩티드" 또는 "맥시-K 폴리펩티드"는 상호 교환적으로 사용되며, 예를 들어,

(i) Maxi-K 알파 서브유닛(Slo)을 인코딩하는 폴리펩티드 또는 이의 단편, 변이체, 돌연변이체 또는 유도체;

(ii) Maxi-K 베타 서브유닛을 인코딩하는 폴리펩티드 또는 이의 단편, 변이체, 돌연변이체 또는 유도체(여기서 Maxi-K 베타 서브유닛은 Maxi-K 베타1 서브유닛, Maxi-K 베타2 서브유닛, Maxi-K 베타3 서브유닛, Maxi-K 베타4 서브유닛 또는 이들의 조합이다); 또는

(iii) 이들의 조합을 지칭한다.

[0181] 일부 양태에서, 본 개시 내용의 Maxi-K 조성물을 사용한 유전자 요법의 결과로서 발현된 Maxi-K 폴리펩티드는 단일 폴리펩티드(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛 또는 Maxi-K 베타 서브유닛)인 반면, 다른 양태에서, Maxi-K 폴리펩티드는 하나 초과의 폴리펩티드(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛 및 Maxi-K 베타 서브유닛, 예를 들어, Maxi-K 베타1 서브유닛)를 포함하는 것이 이해되어야 한다.

[0182] 본 개시의 Maxi-K 폴리펩티드(예를 들어, hSlo)에 적용되는 바와 같이, 본원에서 사용되는 용어 "투여된"은 재조합 폴리펩티드의 투여를 지칭하지 않는다. 대신, 이는 Maxi-K 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛, Maxi-K 베타 서브유닛, 또는 둘 모두)를 포함하는 핵산을 포함하는 Maxi-K 조성물의 투여를 지칭한다.

[0183] Maxi-K 폴리펩티드(예를 들어, hSlo)는, 예를 들어, 각각이 Maxi-K 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 다수의 벡터(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛을 인코딩하는 제1 핵산을 포함하는 제1 플라스미드 및 Maxi-K 베타 서브유닛을 인코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제2 플라스미드)를 사용하거나, 상이한 Maxi-K 폴리펩티드를 인코딩하는 다수의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 단일 벡터(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛을 인코딩하는 제1 핵산 및 Maxi-K 베타 서브유닛을 인코딩하는 제2 핵산을 포함하는 플라스미드)를 사용하여 투여될 수 있다.

[0184] 당업자는 대안적인 배열, 예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛의 발현을 위한 제1 플라스미드 및 2개의 Maxi-K 서브유닛의 발현을 위한 제2 플라스미드가 또한 가능하다는 것을 이해할 것이다. Maxi-K 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 이러한 동일한 배열은 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 또는 렌티바이러스 벡터)에도 적용될 수 있다. 유사하게, 본 개시의 Maxi-K 폴리펩티드는, 예를 들어, 모노시스트로닉, 바이시스트로닉 또는 폴리시스트로닉 mRNA로서 투여될 수 있다.

[0185] 일부 양태에서, Maxi-K 폴리펩티드는 단편, 예를 들어, Maxi-K 기능성 단편(예를 들어, hSlo 단편)이다. 본원에서 사용되는 용어 "기능성 단편"은 Maxi-K 알파 서브유닛의 경우 Maxi-K 채널로서, 또는 Maxi-K 베타 서브유닛의 경우 조절성 서브유닛으로서 기능할 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 양태에서, Maxi-K 폴리펩티드 기능성 단편은 상응하는 전체 서열 Maxi-K 폴리펩티드의 활성의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 100%를 유지한다.

[0186] 일부 양태에서, Maxi-K 폴리펩티드 기능성 단편은 전체 서열 Maxi-K 폴리펩티드의 활성과 관련하여 활성 증가를 나타낸다. 따라서, 일부 양태에서, Maxi-K 폴리펩티드 기능성 단편은 상응하는 전체 서열 Maxi-K 폴리펩티드의 활성과 관련하여 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 100%의 활성 증가를 나타낸다

[0187] 본원에서 사용되는 용어 "변이체"는 천연 단백질의 구조적 특성의 일부 변형을 보유하는 Maxi-K 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 예를 들어, 변이체는 아미노 또는 카르복시 말단, 또는 양쪽 말단에서 트렁케이션될 수 있거나, 아미노산 결실되거나 치환될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 폴리펩티드의 "아미노 말단" 및 "N 말단"은 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 유사하게, 용어 "카르복시 말단" 및 "C 말단"이 상호 교환적으로 사용될 수 있다. Maxi-K의 특정 변이체는, 예를 들어, SEQ ID NO: 54, 55 또는 56이다.

[0188] 일부 양태에서, 변이체는 자연적으로 발생하는 대체 스플라이싱의 결과이다. 따라서, 일부 양태에서, Maxi-K 폴리펩티드(예를 들어, hSlo)는 스플라이스 변이체이다. Maxi-K 알파 및 베타 서브유닛의 예시적인 스플라이스 변이체 형태는 표 1에 포함되어 있다.

[0189] 일부 양태에서, 변이체는 당업자에게 잘 알려진 재조합 DNA 또는 RNA 기술을 통해 생성될 수 있다. 예를 들어, 당 분야에 공지된 돌연변이유발을 유도하는 재조합 DNA 또는 RNA 기술 또는 방법을 사용하여 돌연변이체 Maxi-K 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 일부 양태에서, 돌연변이체는 점 돌연변이체, 즉, 특정 위치의 아미노산이 대체 아미노산으로 치환된 Maxi-K 폴리펩티드이다. 상기 치환은 보존적이거나 비보존적일 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 폴리펩티드는 상응하는 야생형 Maxi-K 폴리펩티드와 관련하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 10개 초과의 돌연변이를 포함할 수 있다.

[0190] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 폴리펩티드(예를 들어, hSlo)는 삽입 및/또는 결실 돌연변이체, 즉, 아미노산의 하위서열(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 연속 아미노산)이 상응하는 야생형 Maxi-K 폴리펩티드의 서열에 삽입되거나 결실된 돌연변이체이다. 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 폴리펩티드는 하나 또는 하나 초과의 결실 및/또는 하나 또는 하나 초과의 삽입을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 하위서열은 Maxi-K 폴리펩티드로부터 결실될 수 있고 결실 부위에 삽입된 대체 서열로 대체될 수 있다.

[0191] 일부 양태에서, Maxi-K 폴리펩티드(예를 들어, hSlo)는 자연적으로 발생하거나, 대립유전자 변이를 함유하는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다(즉, Maxi-K 폴리펩티드는 대립유전자 변이체 또는 다형성 변이체일 수 있다). Maxi-K 폴리펩티드의 예시적인 다형성 및 돌연변이는, 예를 들어, 표 2에 개시되어 있다.

[0192] 일부 양태에서, Maxi-K 폴리펩티드(예를 들어, hSlo)는 기능-획득 돌연변이체이다. 본원에서 사용되는 용어 "기능-획득 돌연변이체" 또는 "기능-획득 돌연변이"는 Maxi-K 유전자에 의해 인코딩된 Maxi-K 폴리펩티드(즉, 돌연변이체 단백질)가 일반적으로 야생형 단백질과 자연적으로 관련이 없는 기능을 획득하거나, 기존 기능이 증가 또는 향상되는 상기 Maxi-K 유전자의 임의의 돌연변이를 지칭한다.

[0193] 예를 들어, Maxi-K와 같은 채널의 경우, 기능-획득은, 예를 들어, 채널 전도도의 변화, 이온 선택성의 변화, 조절제에 대한 민감도의 변화 또는 이들의 임의의 조합을 지칭할 수 있다. 기능-획득 돌연변이는 인코딩된 단백질의 기능의 변화를 야기하는 유전자 내의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 결실, 첨가 또는 치환일 수 있다. 한 양태에서, 기능-획득 돌연변이는 돌연변이체 단백질의 기능을 변화시키거나 다른 단백질과의 상호작용을 유발 또는 조절할 수 있다.

[0194] 일부 양태에서, 기능-획득 돌연변이는, 예를 들어, 변경된 돌연변이체 단백질과 정상 야생형 단백질의 상호작용에 의해 표적 조직으로부터 정상 야생형 단백질의 감소 또는 제거를 초래할 수 있다. 일부 양태에서, Maxi-K 알파 서브유닛의 활성을 증가시킬 수 있는 변경된 Maxi-K 베타 서브유닛으로 표적 평활근 세포를 트랜스펙션시킴으로써 내인성 야생형 Maxi-K 알파 서브유닛에 결합하고 Maxi-K 베타 서브유닛의 내인성 야생형 형태의 결합을 대신할 수 있다.

[0195] 다른 양태에서, Maxi-K 폴리펩티드(예를 들어, hSlo)는 기능-상실 돌연변이체이다. 본원에서 사용되는 용어 "기능-상실 돌연변이체" 또는 "기능-상실 돌연변이"는 유전자에 의해 인코딩된 단백질(즉, 돌연변이체 단백질)이 단백질(즉, 야생형 단백질)과 자연적으로 관련된 기능을 상실하거나, 기존 기능이 감소되는 상기 유전자의 임의의 돌연변이를 지칭한다. 예를 들어, Maxi-K와 같은 채널의 경우, 기능-상실은, 예를 들어, 채널 전도도의 감소 또는 상실, 선택성의 감소 또는 상실, 조절에에 대한 민감도의 감소 또는 상실, 또는 이들의 임의의 조합을 지칭할 수 있다.

[0196] 기능-상실 돌연변이는 인코딩된 단백질의 기능의 변화를 야기하는 Maxi-K 유전자 내의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 결실, 첨가 또는 치환일 수 있다. 한 양태에서, 기능-상실 돌연변이는, 예를 들어, 돌연변이체 단백질의 기능을 변화시키거나 다른 단백질과의 상호작용을 유발 또는 조절할 수 있다. 일부 양태에서, 기능-상실 돌연변이는, 예를 들어, 변경된 돌연변이체 단백질과 상기 정상 야생형 단백질의 상호작용에 의해 정상 야생형 단백질의 감소 또는 제거를 초래할 수 있다. 일부 양태에서, Maxi-K 알파 서브유닛의 활성을 감소시킬 수 있는 변경된 Maxi-K 베타 서브유닛은 Maxi-K 알파 서브유닛에 결합하고 Maxi-K 베타 서브유닛의 야생형 형태의 결합을 대신할 수 있다.

[0197] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 칼륨 채널 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 핵산은 표 1에 개시된 핵산 서열 또는 기능성 Maxi-K 폴리펩티드를 발현할 수 있는 이의 단편을 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 칼륨 채널 폴리펩티드 또는 Maxi-K 칼륨 채널 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 핵산은 표 2 및 본 출원의 다른 곳에 개시된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 표 1에 개시된 핵산 서열(또는 기능성 Maxi-K 폴리펩티드를 발현할 수 있는 이의 단편)을 포함한다.

[0198] 예를 들어, 돌연변이, 삽입, 결실 또는 번역 후 단편화의 존재로 인해, 본 개시의 Maxi-K 폴리펩티드는 인간 Maxi-K 폴리펩티드의 야생형 서열, 예를 들어, 표 1에 개시된 야생형 Maxi-K 폴리펩티드 서열과 적어도 약 50%, 51%, 52%. 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다.

[0199] 일부 양태에서, Maxi-K 폴리펩티드는 유도체이다. 본원에서 사용되는 용어 "유도체"는 Maxi-K 폴리펩티드에 추가 기능을 부여하는 하나 이상의 이종 모이어티를 포함하는 Maxi-K 폴리펩티드를 지칭한다. Maxi-K 폴리펩티드는, 예를 들어, 발현된 폴리펩티드의 단백질 분해 속도를 증가 또는 감소시킬 수 있는 이종 모이어티, 또는 Maxi-K 채널의 활성을 조절할 수 있는 이종 모이어티, 예를 들어, RCK1 및 RCK2 외에 추가 RCK(칼륨 전도도의 조절제) 도메인을 포함할 수 있다 - 예를 들어, 도 17 참조).

[0200] 일부 양태에서, 유도체는 융합 단백질이다. 본원에서 사용되는 용어 "융합 단백질"은 적어도 2개의 폴리펩티드의 유전적 융합으로부터 생성되는 폴리펩티드를 지칭하며, 여기서 폴리펩티드 중 적어도 하나는 Maxi-K 폴리펩티드이다. 예시적인 융합 단백질은 Maxi-K 알파 서브유닛 및 Maxi-K 베타 서브유닛의 유전적 융합으로부터 생성된 Maxi-K 폴리펩티드이며, 여기서 Maxi-K 베타 서브유닛은 Maxi-K 알파 서브유닛에 직접 부착되거나 링커, 예를 들어, (Gly₄Ser)_n 링커 또는 당 분야에 공지된 임의의 적합한 링커를 통해 공유적으로 부착된다. 당업자는 Maxi-K 알파 서브유닛(동일하거나 상이한 아이소형) 및/또는 Maxi-K 베타 서브유닛(동일하거나 상이한 아이소형)의 다중 복사체가 임의의 순서 및 위상 배열로 융합될 수 있음을 이해할 것이다.

[0201] 다른 양태에서, 유도체는 키메라이다. 본원에서 사용되는 용어 "키메라"는 제1 폴리펩티드의 도메인이 제2 폴리펩티드로부터의 유사한 도메인으로 치환된 결과 생성되는 폴리펩티드를 지칭한다. 예시적인 키메라는 Maxi-K 알파 서브유닛의 도메인, 예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛의 RCK 도메인이 다른 단백질로부터의 유사한 RCK 도메인(아키텍처에 Interpro "K+ 전도도의 IPR003148 조절제, N-말단" 도메인을 포함하는 임의의 단백질로부터의 RCK)으로 치환된 결과 생성되는 Maxi-K 폴리펩티드이다. 예를 들어, 평활근 베타 1 서브유닛 및 뉴런 베타 4 서브유닛의 세포외 루프가 교환된 Maxi-K 베타 서브유닛 키메라를 설명하는 문헌[Meera et al. (2000) Proc. Natl. Acad. USA 97: 5562-5567]을 참조한다.

[0202] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물을 사용한 유전자 요법 후 Maxi-K 폴리펩티드에 의한 평활근 수축성의 조절은 수축성의 증가를 포함한다. 일부 양태에서, 수축성의 증가는 본 개시에 따른 Maxi-K 유전자 요법의 투여 전 수축성과 관련하여 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 100%일 수 있다.

[0203] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물을 사용한 유전자 요법 후 Maxi-K 폴리펩티드에 의한 평활근 수축성의 조절은 수축성의 감소를 포함한다. 일부 양태에서, 수축성의 감소는 본 개시에 따른 Maxi-K 유전자 요법의 투여 전 수축성과 관련하여 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 100%일 수 있다.

[0204] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)은, 예를 들어, 과활동성 방광(OAB); 발기 부전(ED); 천식; 양성 전립선 비대(BPH); 관상 동맥 질환; 방광, 내골반 근막, 전립선, 요관, 요도, 요로 및 정관의 비뇨생식기 기능장애; 과민성 대장 증후군; 편두통; 조기 진통 또는 월경통; 레이노 증후군; 배뇨근 과다활동; 녹내장; 안구 고혈압; 및 폐쇄혈전혈관염 또는 이들의 증상 또는 후유증으로 구성된 군으로부터 선택되는 평활근 기능장애를 치료 또는 예방하기 위해 투여될 수 있다. 본 개시에 따른 유전자 요법의 투여에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 질병 및 질환뿐만 아니라 이들의 증상 및 후유증의 보다 포괄적인 목록은 하기 섹션 IV에 제공된다.

[0205] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물로 치료되는 평활근 기능장애는 특발성이다. 본원에서 사용되는 용어 특발성은 공지된 관련 질환 또는 원인이 없는 의학적 질병 또는 질환을 지칭하며, 여기서 질병 또는 질환은 변경된 평활근 수축성을 특징으로 한다. 일부 양태에서, 평활근 기능장애는 신경원성이고, 즉, 평활근 기능장애는 방광 평활근 조절에 관여하지 않는 중추 신경계 또는 말초 신경의 질병 또는 손상, 예를 들어, 신경원성 방광, 척수 손상 또는 신경퇴행성 질환에 기인한다.

[0206] 방광 및 방광 출구 구심성 및 원심성 신호전달을 손상시키는 모든 상태는 신경원성 방광을 유발할 수 있다. 이는 종종 척수 질환(예를 들어, 척수구멍증/수척수증), 부상(예를 들어, 탈출추간판 또는 척수 손상) 및 척추갈림증을 포함하는 신경관 결함과 관련이 있다. 이는 또한 뇌종양 및 다른 뇌 질환, 임신 및 당뇨병과 같은 말초 신경 질환, 에이전트 오렌지에 대한 장기간 노출로 인한 말초 신경병증, 알콜 중독 및 비타민 B12 결핍으로 인해 발생할 수 있으며, 이는 또한 엉치꼬리 기형종, 암성 방광, 전립선 종양, 직장 종양 및 다른 종양의 제거와 같은 골반의 주요 수술의 일반적인 합병증이다. 일부 양태에서, 신경원성 평활근 기능장애는 신경퇴행성 질환, 예를 들어, 파킨슨병 또는 다발성 경화증에 의해 야기된다.

[0207] 일부 양태에서, 평활근 기능장애는 비신경원성이고, 즉, 평활근 신경분포의 병리학적 변화에 의해 야기되지 않는다.

[0208] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 폴리펩티드(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛)를 인코딩하는 분리된 핵산 서열은 DNA, 예를 들어, 네이키드 DNA이다. 다른 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 폴리펩티드(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛)를 인코딩하는 분리된 핵산 서열은 RNA, 예를 들어, mRNA(예를 들어, 네이키드 RNA)이다. "네이키드 핵산", 예를 들어, "네이키드 DNA" 또는 "네이키드 RNA"는 본원에서 비-바이러스 벡터에 함유되지 않은 핵산, 예를 들어, DNA 또는 RNA로서 정의된다.

[0209] 일부 양태에서, RNA 핵산(예를 들어, mRNA)은 관심 유전자(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛)의 전사체, 인트론, 비번역 영역, 종결 서열 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 다른 경우에, DNA 핵산은 하이브리드 프로모터 유전자 서열, 강한 항시적 프로모터 서열, 관심 유전자(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛), 비번역 영역, 종결 서열 등과 같은 서열을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, DNA 및 RNA의 조합이 사용될 수 있다.

[0210] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 폴리펩티드(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛)를 인코딩하는 분리된 핵산 서열은 적어도 하나의 화학적으로 변형된 핵염기, 당, 백본 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 화학적으로 변형된 핵염기는 슈도우라실(ψ), N1-메틸슈도우라실(m1ψ), 2-티오우라실(s2U), 4'-티오우라실, 5-메틸시토신, 5-메틸우라실 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.

[0211] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 폴리펩티드(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛)를 인코딩하는 분리된 핵산 서열은 적어도 하나의 핵염기를 치환함으로써 변형되었으며, 여기서 치환은 동의 치환이다. 유전 코드의 축퇴성으로 인해, 매우 낮은 서열 동일성을 가짐에도 불구하고 동일한 폴리펩티드의 발현을 초래하는 폴리뉴클레오티드를 설계하는 것이 가능하다. 따라서, 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은, 예를 들어,

(a) 예를 들어, 도 18에 제시된 폴리뉴클레오티드 및 도 18에 제시된 변이 N1 내지 N16 중 적어도 하나 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 이의 변이체, 또는 도 19에 제시된 임의의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 도 19에 제시된 P1 또는 P2 변이 중 적어도 하나를 포함하는 이의 변이체를 포함하는, 표 1 또는 본 출원의 다른 곳에 개시된 Maxi-K 폴리펩티드를 인코딩하는 야생형 폴리뉴클레오티드 서열

(b) 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 US2018/311381 또는 US2018/01260031(그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 Maxi-K 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열;

(c) 본 출원이 출원된 시점에 당 분야에 공지된 임의의 다른 자연 또는 비자연(예를 들어, 코돈 최적화된 서열, 돌연변이체, 융합체 또는 키메라) Maxi-K 폴리뉴클레오티드 서열; 또는

(d) Maxi-K 오르톨로그를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열;

(e) Maxi-K 파라로그를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(여기서 파라로그는 평활근 수축성의 조절과 관련하여 Maxi-K와 기능적으로 동등하거나 부분적으로 동등하다)과 적어도 약 33%, 적어도 약 34%, 적어도 약 35%, 적어도 약 36%, 적어도 약 37%, 적어도 약 38%, 적어도 약 39%, 적어도 약 40%, 적어도 약 41%, 적어도 약 42%, 적어도 약 43%, 적어도 약 44%, 적어도 약 45%, 적어도 약 46%, 적어도 약 47%, 적어도 약 48%, 적어도 약 49%, 적어도 약 50%, 적어도 약 51%, 적어도 약 52%, 적어도 약 53%, 적어도 약 54%, 적어도 약 55%, 적어도 약 56%, 적어도 약 57%, 적어도 약 58%, 적어도 약 59%, 적어도 약 60%, 적어도 약 61%, 적어도 약 61%, 적어도 약 62%, 적어도 약 63%, 적어도 약 64%, 적어도 약 65%, 적어도 약 66%, 적어도 약 67%, 적어도 약 68%, 적어도 약 69%. 적어도 약 70%, 적어도 약 71%, 적어도 약 72%, 적어도 약 73%, 적어도 약 74%, 적어도 약 75%, 적어도 약 76%, 적어도 약 77%, 적어도 약 78%, 적어도 약 79%, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일하다.

[0212] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 폴리펩티드(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛)를 인코딩하는 분리된 핵산 서열은 코돈 최적화된다. 본원에서 사용되는 용어 "코돈 최적화", "코돈 최적화된" 및 이의 문법적 변형은 번역 효율을 증가시키기 위해 동의 코돈을 대체함으로써 핵산의 1차 서열을 변형하는 것을 지칭한다. 따라서, 코돈 최적화는 이것이 인코딩하는 아미노산 서열을 변경하지 않고 트랜스진(예를 들어, 본 개시 내용의 Maxi-K 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열)에서 사용된 코돈을 전환하는 것을 포함하며, 이는 전형적으로 코돈 최적화된 유전자가 인코딩하는 단백질의 풍부도를 극적으로 증가시키는데, 그 이유는 이것이 일반적으로 "희귀" 코돈을 제거하고 이를 풍부한 코돈으로 대체하거나, 낮은 tRNA 재충전 속도를 갖는 코돈을 높은 tRNA 재충전 속도를 갖는 코돈으로 제거하기 때문이다.

[0213] 본 개시의 Maxi-K 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)은 본 출원이 출원된 시점에 당 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 코돈 최적화될 수 있다.

[0214] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 폴리펩티드(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛)를 인코딩하는 분리된 핵산 서열은 서열 최적화되었다. 본원에서 사용되는 용어 "서열 최적화된"은 번역 효율을 증가시키는 특징을 도입하거나, 번역 효율을 감소시키는 특징을 제거하거나, 일반적으로 생체내 투여 후 발현 효능과 관련된 특성을 개선함에 의한 핵산 서열의 변형을 지칭한다. 그러한 특성은 핵산 안정성(예를 들어, mRNA 안정성) 개선, 표적 조직에서 번역 효능 증가, 발현된 트렁케이션된 단백질의 수 감소, 발현된 단백질의 폴딩 개선 또는 미스폴딩 방지, 발현된 생성물의 독성 감소, 발현된 생성물에 의한 세포 사멸 감소, 또는 단백질 응집 증가 및/또는 감소를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

[0215] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 폴리펩티드를 인코딩하는 서열 최적화된 뉴클레오티드 서열은 구조적 및 기능적 완전성을 유지하거나; 발현의 임계값을 극복하거나; 발현 속도를 개선하거나; 반감기 및/또는 단백질 농도; 단백질 국소화를 최적화하거나; 면역 반응 및/또는 분해 경로와 같은 유해한 생체 반응을 회피하면서, 예를 들어, 핵산-기반 치료제의 제형화 및 전달을 최적화하는데 유용한 특징인 당 분야의 하나 이상의 문제를 회피하는 구조적 및/또는 화학적 특징을 가지며, 인간 대상체에서 발현을 위해 코돈 최적화된다.

[0216] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 폴리펩티드를 인코딩하는 서열 최적화된 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, 다음을 포함하는 방법에 따라 서열 최적화되었다:

(i) 참조 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 야생형 Maxi-K 폴리펩티드를 인코딩하는 ORF)에서 적어도 하나의 코돈을 대체 코돈으로 치환하여 우리딘-변형된 서열을 생성하기 위해 우리딘 함량을 증가 또는 감소시킴;

(ii) 참조 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 야생형 Maxi-K 폴리펩티드를 인코딩하는 ORF)에서 적어도 하나의 코돈을 동의 코돈 세트에서 더 높은 코돈 빈도를 갖는 대체 코돈으로 치환시킴;

(iii) 참조 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 야생형 Maxi-K 폴리펩티드를 인코딩하는 ORF)에서 적어도 하나의 코돈을 대체 코돈으로 치환하여 G/C 함량을 증가시킴; 또는

(iv) 이들의 조합.

[0217] 핵산 서열에서 국소 고농도의 우리딘의 존재는 특히 변형된 우리딘 유사체가 합성 mRNA의 생산에 사용될 때 번역, 예를 들어, 느리거나 조기 종료된 번역에 해로운 영향을 미칠 수 있다. 게다가, 높은 우리딘 함량은 또한 TLR 활성화로 인해 합성 mRNA의 생체내 반감기를 감소시킬 수 있다. 따라서, Maxi-K 핵산 서열(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터 또는 그 안의 Maxi-K 인코딩 서열)은 적어도 하나의 우리딘 함량 최적화 단계를 포함하는 방법을 사용하여 서열 최적화될 수 있다. 그러한 단계는, 예를 들어, 우리딘-변형된 서열을 생성하기 위해 참조 핵산에서 적어도 하나의 코돈을 대체 코돈으로 치환하는 것을 포함하며, 여기서 우리딘-변형된 서열은 다음 특성 중 적어도 하나를 갖는다:

(i) 전체 우리딘 함량의 증가 또는 감소;

(ii) 국소 우리딘 함량의 증가 또는 감소(즉, 우리딘 함량의 변화는 특정 하위서열로 제한됨);

(iii) 전체 우리딘 함량을 변경하지 않고 우리딘 분포의 변화;

(iv) 우리딘 클러스터링의 변화(예를 들어, 클러스터의 수, 클러스터의 위치 또는 클러스터 사이의 거리); 또는

(v) 이들의 조합.

[0218] Maxi-K 핵산 서열은 또한 참조 핵산 서열의 구아닌/시토신(G/C) 함량(절대적 또는 상대적)을 변경하는 것을 포함하는 방법을 사용하여 서열 최적화될 수 있다. 그러한 최적화는 참조 핵산 서열의 전체 G/C 함량(절대적 또는 상대적)의 변경(예를 들어, 증가 또는 감소); 참조 핵산 서열에서 G/C 함량의 국소 변화의 도입(예를 들어, 참조 핵산 서열의 선택된 영역 또는 하위서열에서 G/C의 증가 또는 감소); 참조 핵산 서열에서 G/C 클러스터의 빈도, 크기 및 분포의 변경, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

[0219] 당 분야에 공지된 수많은 코돈 최적화 방법은 참조 핵산 서열의 코돈을 더 높은 빈도를 갖는 코돈으로 치환하는 것에 기초한다. 따라서, 일부 구체예에서, 본원에 개시된 Maxi-K 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 비-코돈 최적화된 서열에서의 사용 빈도와 관련하여 서열 최적화된 핵산에서 다른 동의 코돈에 비해 하나 이상의 코돈의 사용 빈도에서 변형을 사용하는 것을 포함하는 방법을 사용하여 서열 최적화될 수 있다.

[0220] 본원에서 사용되는 용어 "코돈 빈도"는 코돈 사용 편향, 즉, 코딩 DNA/RNA에서 동의 코돈의 발생 빈도의 차이를 지칭한다. 일반적으로 코돈 선호도는 번역 최적화를 위한 돌연변이 편향과 자연 선택 사이의 균형을 반영하는 것으로 알려져 있다. 최적의 코돈은 더 빠른 번역 속도와 높은 정확도를 달성하는데 도움이 된다. 이러한 인자의 결과로, 고도로 발현된 유전자에서 번역 선택이 더 강해질 것으로 예상된다.

[0221] 생물정보학 및 전산 생물학 분야에서, 코돈 사용 편향을 분석하기 위해 많은 통계적 방법이 제안되고 사용되었다. 예를 들어, 문헌[Comeron & Aguade (1998) J. Mol. Evol. 47: 268-74] 참조. 유전자 발현 수준을 예측하는데 '최적 코돈의 빈도'(Fop)(Ikemura (1981) J. Mol. Biol. 151 (3): 389-409), 상대 코돈 적응(RCA)(Fox & Eril (2010) DNA Res. 17 (3): 185-96) 또는 '코돈 적응 지수'(CAI)(Sharp & Li (1987) Nucleic Acids Res. 15 (3): 1281-95)와 같은 방법이 사용되는 반면, 코돈 사용 균일성을 측정하기 위해 정보 이론의 '유효 코돈 수'(Nc) 및 Shannon 엔트로피와 같은 방법이 사용된다. 대응성 분석 및 주성분 분석과 같은 다변량 통계 방법이 유전자 간 코돈 사용의 변화를 분석하는데 널리 사용된다(Suzuki et al. (2008) DNA Res. 15 (6): 357-65; Sandhu et al., In Silico Biol. 2008;8(2):187-92).

[0222] 서열 최적화에 영향을 미칠 수 있는 다양한 모티프가 있으며, 이는, 예를 들어, 다음의 다양한 비배타적 범주에 속한다:

(i) 1차 서열 기반 모티프: 뉴클레오티드의 단순한 배열에 의해 정의되는 모티프.

(ii) 구조적 모티프: 특정 2차 구조를 형성하는 경향이 있는 뉴클레오티드 배열에 의해 인코딩된 모티프.

(iii) 국소 모티프: 하나의 연속적인 하위서열로 인코딩된 모티프.

(iv) 분산된 모티프: 2개 이상의 분리된 하위서열로 인코딩된 모티프.

(v) 유리한 모티프: 뉴클레오티드 구조 또는 기능을 개선시키는 모티프.

(vi) 불리한 모티프: 뉴클레오티드 구조 또는 기능에 해로운 영향을 미치는 모티프.

[0223] 불리한 모티프의 범주에 맞는 많은 모티프가 있다. 일부 예는, 예를 들어, Xba1(TCTAGA), EcoRI(GAATTC), EcoRII(CCWGG, 여기서 W는 IUPAC 모호성 코드에 따라 A 또는 T를 의미한다) 또는 HindIII(AAGCTT)에 대한 제한 부위 모티프와 같은 상대적으로 짧고 정확한 서열의 경향이 있는 제한 효소 모티프; T7RNA 중합효소(GnnnnWnCRnCTCnCnnWnD, 여기서 n은 임의의 뉴클레오티드를 의미하고, R은 A 또는 G를 의미하고, W는 A 또는 T를 의미하고, D는 A 또는 G 또는 T를 의미하지만 C를 의미하지 않는다)에서와 같이 더 길고 정확한 서열이 아닌 컨센서스에 기반하는 경향이 있는 효소 부위; GGGG 반복부와 같은 구조적 모티프(Kim et al. (1991) Nature 351(6324):331-2); 또는 CUG-트리플렛 반복부와 같은 다른 모티프(Querido et al. (2014) J. Cell Sci. 124:1703-1714)를 포함한다.

[0224] 따라서, 본원에 개시된 Maxi-K 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 참조 핵산 서열에서 적어도 하나의 불안정화 모티프를 치환하고, 그러한 불리한 모티프를 제거하거나 이를 유리한 모티프로 대체하는 것을 포함하는 방법을 사용하여 서열 최적화될 수 있다.

[0225] 일부 양태에서, 본원에 개시된 Maxi-K 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열의 서열 최적화는 제한된 코돈 세트, 예를 들어, 20개의 자연 아미노산, 20개의 자연 아미노산의 서브세트, 또는 예를 들어, 비자연 아미노산을 포함하는 확장된 아미노산 세트를 인코딩하는데 천연 수보다 적은 수의 코돈이 사용되는 코돈 세트를 사용하여 수행될 수 있다.

[0226] 일부 양태에서, 서열 최적화를 통해 개선된 특성은 핵산 서열의 고유 특성이다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 생체내 또는 시험관내 안정성을 위해 서열 최적화될 수 있다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 특정 표적 조직 또는 세포에서의 발현을 위해 서열 최적화될 수 있다. 일부 양태에서, 핵산 서열은 엔도 및 엑소뉴클레아제에 의한 분해를 방지함으로써 이의 혈장 반감기를 증가시키도록 서열 최적화될 수 있다.

[0227] 다른 양태에서, 핵산 서열은, 예를 들어, 서열 최적화된 핵산 또는 서열 최적화된 핵산을 포함하는 약학적 조성물이 수성 조건하에 최소한의 분해로 저장될 수 있는 시간을 연장시키기 위해 용액에서의 가수분해에 대한 내성을 증가시키도록 서열 최적화될 수 있다.

[0228] 다른 양태에서, 서열 최적화된 핵산은, 예를 들어, 서열 최적화된 핵산이 최소한의 분해로 동결건조 후 저장될 수 있는 시간을 연장시키기 위해, 건조 저장 조건에서 가수분해에 대한 내성을 증가시키도록 최적화될 수 있다.

[0229] 일부 양태에서, 핵산 서열에 의해 인코딩된 이종 치료 단백질의 발현은 표적 조직 또는 세포에서 해로운 효과를 가져, 단백질 수율을 감소시키거나, 발현된 생성물의 품질을 감소시키거나(예를 들어, 단백질 단편 또는 봉입체에서 발현된 단백질의 침전으로 인해), 독성을 유발할 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 본원에 개시된 핵산 서열의 서열 최적화는 서열 최적화된 핵산에 의해 인코딩되는 Maxi-K 폴리펩티드를 발현하는 표적 세포의 생존력을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.

[0230] 이종성 단백질 발현은 또한 자가 또는 이종성 이식을 위해 핵산 서열로 트랜스펙션된 세포에 해로울 수 있다. 따라서, 본 개시의 일부 양태에서, 본원에 개시된 핵산 서열의 서열 최적화는 서열 최적화된 핵산 서열에 의해 인코딩되는 Maxi-K 폴리펩티드를 발현하는 표적 세포의 생존력을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 세포 또는 조직의 생존력, 독성 및 다른 생리학적 반응의 변화는 당 분야에 공지된 방법에 따라 측정될 수 있다.

[0231] 서열 최적화된 핵산을 포함하는 Maxi-K 폴리뉴클레오티드는 당 분야에 공지된 방법을 사용하여 적어도 하나의 핵산 서열 특성(예를 들어, 뉴클레아제에 노출될 때 안정성) 또는 발현 특성이 서열 최적화되지 않은 핵산에 대해 개선되었는지 여부를 결정하기 위해 시험될 수 있다.

[0232] 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터), 특히 폴리뉴클레오티드는 전기천공, DEAE 덱스트란, 일가양이온성 리포좀 융합, 다가양이온성 리포좀 융합, 원형질체 융합, 폴리뉴클레오티드(예를 들어, DNA)-코팅된 미세발사체 충격, 생체내 전기장의 생성, 재조합 복제-결함 바이러스에 의한 주사, 상동성 재조합, 나노입자, 및 예를 들어, 방광내 점적주입에 의한 네이키드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, DNA) 전달과 같은 당업자에게 공지된 다수의 절차에 의해 평활근 세포 내로 도입될 수 있다. 당업자는 상기 폴리뉴클레오티드(예를 들어, DNA) 전달의 임의의 방법이 조합될 수 있음을 인식해야 한다.

[0233] 일부 양태에서, 본원에 개시된 Maxi-K 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 핵산은 벡터, 예를 들어, 바이러스 벡터이다. 일부 양태에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터(예를 들어, 3세대 아데노바이러스 벡터)이다. AdEasy™는 아데노바이러스 벡터 작제물을 만드는데 단연코 가장 널리 사용되는 방법이다. 상기 시스템은 셔틀(또는 전달) 벡터와 아데노바이러스 벡터의 2개 유형의 플라스미드로 구성된다. 관심 트랜스진을 셔틀 벡터로 클로닝하고, 검증하고, 제한 효소 PmeI로 선형화한다. 이후 상기 작제물은 pAdEasy™을 함유하는 BJ5183 E. 콜리(E. coli) 세포인 AdEasier-1 세포로 형질전환된다. PAdEasy™는 바이러스 생산에 필요한 아데노바이러스 유전자를 함유하는 약 33Kb 아데노바이러스 플라스미드이다. 셔틀 벡터 및 아데노바이러스 플라스미드는 매칭된 좌측 및 우측 상동성 아암을 가지며, 이는 아데노바이러스 플라스미드로의 트랜스진의 상동성 재조합을 촉진한다. 또한 수퍼코일 pAdEasy™ 및 셔틀 벡터로 표준 BJ5183을 공동-형질전환할 수 있지만, 이 방법은 더 높은 배경의 비-재조합 아데노바이러스 플라스미드를 초래한다. 이후 트랜스진이 아데노바이러스 플라스미드 내로 삽입되었고, 다른 재조합 패턴이 발생하지 않았음을 결정하기 위해 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 크기 및 적절한 제한 분해 패턴에 대해 검증한다. 일단 검증되면, 재조합 플라스미드는 PacI로 선형화되어 ITR이 측면에 있는 선형 dsDNA 작제물을 생성한다. 293 또는 911 세포를 선형화된 작제물로 트랜스펙션시키며, 바이러스는 약 7-10일 후에 수확될 수 있다. 상기 방법에 추가하여, 본 출원이 출원된 시점에 당 분야에 공지된 아데노바이러스 벡터 작제물을 생성하기 위한 다른 방법이 본원에 개시된 방법을 실행하는데 사용될 수 있다.

[0234] 다른 양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터(예를 들어, 3세대 또는 4세대 렌티바이러스 벡터)이다. 렌티바이러스 벡터는 일반적으로 세포주가 3개의 개별적인 플라스미드 발현 시스템으로 트랜스펙션되는 일시적인 트랜스펙션 시스템에서 생성된다. 이들은 전달 벡터 플라스미드(HIV 프로바이러스의 일부), 패키징된 플라스미드 또는 작제물, 및 상이한 바이러스의 이종성 외피 유전자(env)를 갖는 플라스미드를 포함한다. 벡터의 3개의 플라스미드 성분을 패키징 세포에 넣은 다음 HIV 껍질에 삽입한다. 벡터의 바이러스 부분은 바이러스가 세포 시스템 내부에서 복제될 수 없도록 삽입 서열을 함유한다. 현재의 3세대 렌티바이러스 벡터는 9개의 HIV-1 단백질 중 3개만을 인코딩하며(Gag, Pol, Rev), 이는 복제-적격 바이러스의 재조합-매개 생성을 피하기 위해 별도의 플라스미드로부터 발현된다. 4세대 렌티바이러스 벡터에서, 레트로바이러스 게놈은 추가로 감소되었다(예를 들어, TAKARA® LENTI-X™ 4세대 패키징 시스템 참조).

[0235] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열은 CRISPR/Cas 시스템 및 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 및 메가뉴클레아제(MN)와 같은 게놈 편집 대안을 사용하여 표적 세포(예를 들어, 표적 조직의 근육 세포) 또는 숙주 세포(예를 들어, 표적 조직으로의 이식을 위한 줄기 세포)의 게놈 내로 삽입될 수 있다.

[0236] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)은 전달제, 예를 들어, 리피도이드, 리포좀, 리포플렉스, 지질 나노입자, 중합체 화합물, 펩티드, 단백질, 세포, 나노입자 모방체, 나노튜브 또는 컨쥬게이트와 함께 투여된다. 일부 특정 양태에서, 전달제는 열가역성 하이드로겔, 예를 들어, RTGel™이다. 예를 들어, 미국 출원 공개 번호 US2014/0142191, US2013/0046275 및 US2006/0057208(이들 모두는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다) 참조.

[0237] 일부 양태에서, 분리된 핵산 또는 벡터는 생체내, 시험관내 또는 생체외 세포에 도입된다. 예를 들어, 세포는 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)로 트랜스펙션된 줄기 세포, 근육 세포 또는 섬유모세포일 수 있고, 여기서 세포는 Maxi-K 폴리펩티드(예를 들어, Maxi-K 알파, Maxi-K 베타 서브유닛 또는 둘 모두)를 발현한다. 일부 양태에서, 세포, 예를 들어, 줄기 세포는 이식 과정의 효능 및/또는 하나 이상의 확장 주기(예를 들어, 세포 배양)를 증가시키기 위해, 예를 들어, MAPK 억제제, 줄기 세포 증식 억제제, 자극성 사이토카인 또는 이들의 조합을 이용한 하나 이상의 처리를 받을 수 있다.

[0238] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)은 표적 조직에 투여되거나 표적화된다. 특히, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO:16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)은 특정 표적 기관 또는 조직(예를 들어, 배뇨근의 평활근 세포)에서 평활근 세포에 투여되거나 표적화된다.

[0239] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)은 표적 세포 또는 표적 조직에 직접 투여되거나(예를 들어, 방광벽의 평활근에 직접 주사하거나, 호흡기의 평활근 세포에 투여하기 위한 흡입을 통해) 특정 기관 또는 조직을 특이적으로 표적화하는 전달 시스템을 사용하여 원위 위치에서 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)은 적어도 하나의 항원-결합 모이어티, 예를 들어, 항체 또는 이의 단편을 포함하는 리포좀 또는 나노입자에 캡슐화되어, 특정 조직 또는 표적 기관에서 항원에 대한 리포좀 또는 나노입자를 표적화할 수 있다.

[0240] 본 개시의 방법은 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 이를 필요로 하는 대상체에서 표적 조직 및 특히 그러한 표적 조직의 평활근 세포에 전달하기 위한 임의의 적합한 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)은 국소적으로 또는 비경구적으로 투여된다. 일부 양태에서, 비경구 투여는 주사(예를 들어, 배뇨근에 직접 주사), 이식 또는 점적주입에 의한 것이다.

[0241] 주사 경로는 피하, 정맥내, 근육내 또는 골반내 주사를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 주사는 근육내 주사, 특히 표적 조직 또는 기관, 예를 들어, 방광 또는 자궁벽, 또는 대상체의 음경의 평활근으로의 주사이다. 일부 양태에서, 주사는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50개 이상의 주사 부위에서 투여된다.

[0242] 이식을 위한 위치는 신체의 피하, 정맥내, 근육내 또는 골반내 영역을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)은 대상체의 골반, 방광, 결장, 자궁 또는 음경 내에 이식될 수 있다. 일부 양태에서, 이식은 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50개 이상의 이식 부위에서 발생할 수 있다.

[0243] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)은 기관의 내강으로의 점적주입에 의해 투여된다. 특정 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물은 방광의 내강 또는 자궁의 내강으로의 점적주입에 의해 도입된다.

[0244] 당업자는 투여 경로가 일반적으로 특정 표적 조직에 좌우됨을 이해할 것이다. 예를 들어, 방광의 평활근 기능장애(예를 들어, OAB)는, 예를 들어, 주사, 점적주입, 카테터 삽입, 또는 방광 벽에 대한 고압 적용에 의해 치료될 수 있다; 전립선의 평활근 기능장애(예를 들어, BPH)는 또한, 예를 들어, 주사 또는 주입에 의해 치료될 수 있다; 폐의 평활근 기능장애(예를 들어, 천식)는, 예를 들어, 흡입에 의해 치료될 수 있다; 음경의 평활근 기능장애(예를 들어, ED)는, 예를 들어, 주사 또는 국소 적용에 의해 치료될 수 있다; 장 평활근 기능장애(예를 들어, IBS)는, 예를 들어, 관장에 의해 치료될 수 있다; 자궁 평활근 기능장애(예를 들어, 월경통 또는 조기 진통 동안의 자궁 수축)는, 예를 들어, 주사, 점적주입 또는 카테터 삽입에 의해 치료될 수 있다; 안구 평활근 기능장애(예를 들어, 높은 안압 또는 녹내장)는, 예를 들어, 주사에 의해 치료될 수 있다.

[0245] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)의 용량은 단일 단위 용량이다. 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)의 용량은 조성물(예를 들어, 네이키드 핵산, 플라스미드 또는 벡터)의 적어도 약 5,000 mcg, 적어도 약 6,000 mcg, 적어도 약 7,000 mcg, 적어도 약 8,000 mcg, 적어도 약 9,000 mcg, 적어도 약 10,000 mcg, 적어도 약 11,000 mcg, 적어도 약 12,000 mcg, 적어도 약 13,000 mcg, 적어도 약 14,000 mcg, 적어도 약 15,000 mcg, 적어도 약 16,000 mcg, 적어도 약 17,000 mcg, 적어도 약 18,000 mcg, 적어도 약 19,000 mcg, 적어도 약 20,000 mcg, 적어도 약 21,000 mcg, 적어도 약 22,000 mcg, 적어도 약 23,000 mcg, 적어도 약 24,000 mcg, 적어도 약 25,000 mcg, 적어도 약 26,000 mcg, 적어도 약 27,000 mcg, 적어도 약 28,000 mcg, 적어도 약 29,000 mcg, 적어도 약 30,000 mcg, 적어도 약 31,000 mcg, 적어도 약 32,000 mcg, 적어도 약 33,000 mcg, 적어도 약 34,000 mcg, 적어도 약 35,000 mcg, 적어도 약 36,000 mcg, 적어도 약 37,000 mcg, 적어도 약 38,000 mcg, 적어도 약 39,000 mcg, 적어도 약 40,000 mcg, 적어도 약 41,000 mcg, 적어도 약 42,000 mcg, 적어도 약 43,000 mcg, 적어도 약 44,000 mcg, 적어도 약 45,000 mcg, 적어도 약 46,000 mcg, 적어도 약 47,000 mcg, 적어도 약 48,000 mcg, 적어도 약 49,000 mcg, 적어도 약 50,000 mcg, 적어도 약 51,000 mcg, 적어도 약 52,000 mcg, 적어도 약 53,000 mcg, 적어도 약 54,000 mcg, 적어도 약 55,000 mcg, 적어도 약 56,000 mcg, 적어도 약 57,000 mcg, 적어도 약 58,000 mcg, 적어도 약 59,000 mcg, 적어도 약 60,000 mcg, 적어도 약 61,000 mcg, 적어도 약 62,000 mcg, 적어도 약 63,000 mcg, 적어도 약 64,000 mcg, 적어도 약 65,000 mcg, 적어도 약 66,000 mcg, 적어도 약 67,000 mcg, 적어도 약 68,000 mcg, 적어도 약 69,000 mcg, 적어도 약 70,000 mcg, 적어도 약 71,000 mcg, 적어도 약 72,000 mcg, 적어도 약 73,000 mcg, 적어도 약 74,000 mcg, 적어도 약 75,000 mcg, 적어도 약 76,000 mcg, 적어도 약 77,000 mcg, 적어도 약 78,000 mcg, 적어도 약 79,000 mcg, 적어도 약 80,000 mcg, 적어도 약 81,000 mcg, 적어도 약 82,000 mcg, 적어도 약 83,000 mcg, 적어도 약 84,000 mcg, 적어도 약 85,000 mcg, 적어도 약 86,000 mcg, 적어도 약 87,000 mcg, 적어도 약 88,000 mcg, 적어도 약 89,000 mcg, 적어도 약 90,000 mcg, 적어도 약 91,000 mcg, 적어도 약 92,000 mcg, 적어도 약 93,000 mcg, 적어도 약 94,000 mcg, 적어도 약 95,000 mcg, 적어도 약 96,000 mcg, 적어도 약 97,000 mcg, 적어도 약 98,000 mcg, 적어도 약 99,000 mcg 또는 적어도 약 100,000 mcg를 구성한다. 본원에서 사용되는 mcg 및 μg는 상호 교환적으로 사용된다. 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)의 용량은 조성물(예를 들어, 네이키드 핵산, 플라스미드 또는 벡터)의 약 6,000 mcg이다. 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)의 용량은 조성물(예를 들어, 네이키드 핵산, 플라스미드 또는 벡터)의 약 12,000 mcg이다. 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)의 용량은 조성물(예를 들어, 네이키드 핵산, 플라스미드 또는 벡터)의 약 24,000 mcg이다. 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)의 용량은 조성물(예를 들어, 네이키드 핵산, 플라스미드 또는 벡터)의 약 48,000 mcg이다.

[0246] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)의 용량은 약 5,000 mcg 내지 약 10,000, 또는 약 10,000 내지 약 15,000 mcg, 또는 약 15,000 mcg 내지 약 20,000 mcg, 또는 약 20,000 mcg 내지 약 25,000 mcg, 또는 약 25,000 mcg 내지 약 30,000 mcg, 또는 약 30,000 mcg 내지 약 35,000 mcg, 또는 약 35,000 mcg 내지 약 40,000 mcg, 또는 약 40,000 mcg 내지 약 45,000 mcg, 또는 약 45,000 mcg 내지 약 50,000 mcg, 또는 약 50,000 mcg 내지 약 55,000 mcg, 또는 약 55,000 mcg 내지 약 60,000 mcg, 또는 약 60,000 mcg 내지 약 65,000 mcg, 또는 약 65,000 mcg 내지 약 70,000 mcg, 또는 약 70,000 mcg 내지 약 75,000 mcg, 또는 약 75,000 mcg 내지 약 80,000 mcg, 또는 약 80,000 mcg 내지 약 85,000 mcg, 또는 약 85,000 mcg 내지 약 90,000 mcg, 또는 약 90,000 mcg 내지 약 95,000 mcg 또는 약 95,000 mcg 내지 약 100,000 mcg이다.

[0247] 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)의 실험적 투여 동안, 시험된 최고 농도에서도 독성은 확인되지 않았다. 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)의 투여에서 제한 인자는 조성물의 용해도였다.

[0248] 따라서, 본 개시의 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)의 용량은 50,000 mcg 초과일 수 있다. 따라서, 본 개시의 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)의 용량은 100,000 mcg 초과일 수 있다. 용해도가 본 개시의 Maxi-K 조성물의 투여에서 제한 인자일 수 있다는 점을 감안할 때, 일부 양태에서, Maxi-K 조성물은, 예를 들어, 전달 시스템에 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리글리세롤과 같은 친수성 중합체를 혼입(예를 들어, 컨쥬게이션)함으로써, 당 분야에 공지된 방법을 사용하여 이들의 용해도를 개선하고/거나 침전을 감소시키도록 최적화될 수 있다.

[0249] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)의 총 용량은 단일 투여(예를 들어, 단일 주사) 또는 다중 투여(예를 들어, 다중 주사)로 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 다중 주사는 동시에(예를 들어, 단기간 내에, 예를 들어, 30분, 1시간, 2시간 또는 같은 날 내에) 투여되며, 다른 양태에서 실질적인 기간은 주사 사이의 경과 시간이다(예를 들어, 주사 사이에 1일 이상).

[0250] 일부 양태에서, 다중 용량은, 예를 들어, 매월, 2개월마다, 3개월마다, 4개월마다, 5개월마다 또는 6개월마다 투여된다.

[0251] 특정 양태에서, 방광 평활근 기능장애(예를 들어, OAB)를 갖는 대상체는, 예를 들어, 방광벽(예를 들어, 방광 중간선 아래 또는 밑의 표적 부위)에 20-30회 근육내 주사로 투여되는, 예를 들어, 16,000 mcg 또는 24,000 mcg 또는 48,000 mcg의 총 용량의 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 pVAX 플라스미드와 같은 플라스미드)을 수용할 수 있다. 특정 양태에서, 방광 평활근 기능장애(예를 들어, OAB)를 갖는 대상체는, 예를 들어, 배뇨근으로 20-30회 근육내 주사로 투여되는, 예를 들어, 16,000 mcg 또는 24,000 mcg 또는 48,000 mcg의 총 용량의 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 pVAX 플라스미드와 같은 플라스미드)을 수용할 수 있다. 특정 양태에서, 방광 평활근 기능장애(예를 들어, OAB)를 갖는 대상체는, 예를 들어, 삼각부로 20-30회 근육내 주사로 투여되는, 예를 들어, 16,000 mcg 또는 24,000 mcg 또는 48,000 mcg의 총 용량의 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 pVAX 플라스미드와 같은 플라스미드)을 수용할 수 있다.

[0252] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 pVAX 플라스미드와 같은 플라스미드)은 방광벽(예를 들어, 배뇨근)의 10 내지 50개의 주사 부위(예를 들어, 적어도 약 10, 적어도 약 15, 적어도 약 20, 적어도 약 25, 적어도 약 30, 적어도 약 35, 적어도 약 40, 적어도 약 45 또는 적어도 약 50회 주사)에서 투여된다.

[0253] 일부 양태에서, 주사 표적 부위는 방광 기저, 후방 및 외측 방광벽, 또는 둘 모두를 포함한다. 일부 양태에서, 방광 중간선 아래(또는 밑)의 표적 부위는 방광 기저, 후방 및 외측 방광벽, 삼각부를 제외한 방광 기저, 삼각부를 제외한 방광기저와 방광목, 삼각근만, 방광목만으로 구성된 영역으로부터 선택된다. 한 양태에서, 방광 중간선은 요관 오리피스 위의 삼각부를 교차하는 가상의 선보다 약 2-3cm 위에 상응한다.

[0254] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)은 방광벽(예를 들어, 방광벽만)의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 부위에 주사된다.

[0255] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)은 배뇨근(예를 들어, 배뇨근만)의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 부위에 주사된다.

[0256] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)은 삼각부(예를 들어, 삼각부만)의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 부위에 주사된다.

[0257] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)은 방광 기저(예를 들어, 방광 기저만)의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 부위에 주사된다.

[0258] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)은 후방 방광벽(예를 들어, 후방 방광벽만)의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 부위에 주사된다.

[0259] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)은 외측 방광벽(예를 들어, 외측 방광벽만)의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 부위에 주사된다.

[0260] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)은 방광 중간선 아래(예를 들어, 방광 중간선 아래만)의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 부위에 주사된다.

[0261] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)은 삼각부를 제외한 방광 기저의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 부위에 주사된다.

[0262] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)은 삼각부를 제외한 방광 기저와 방광목의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 부위에 주사된다.

[0263] 인간 방광의 정면 단면도는 도 5에 표시된다. 중공 기관은 꼭지점 또는 정점, 상부 표면(돔으로도 지칭됨), 및 하부 표면 또는 기저를 갖는다. 기저는 기관의 후방 및 하부를 향하는 표면을 포함한다. 삼각부는 방광의 기저(및 그 내부)에 있으며 방광목의 뒤쪽에 접해 있다. 방광목은 방광 기저 내에 있으며 방광벽이 수렴하여 요도와 연결되는 영역에 해당한다. 삼각부의 외측 지점에서 요관은 요관 오리피스를 통해 방광 강으로 비워진다. 배뇨근은 평활근 섬유의 방광벽에 있는 층이다.

[0264] 일부 양태에서, 주사 부위의 일부는 방광벽(예를 들어, 방광 벽의 하부, 예를 들어, 방광 중간선 아래의 방광벽의 후방의 하부)에 있다. 일부 양태에서, 주사 부위의 일부는 삼각부에 있다. 일부 양태에서, 주사 부위의 일부는 배뇨근에 있다.

[0265] 일부 양태에서, 모든 주사 부위는 방광벽(예를 들어, 방광 벽의 하부, 예를 들어, 방광 중간선 아래의 방광벽의 후방의 하부)에 있다. 일부 양태에서, 모든 주사 부위는 삼각부에 있다. 일부 양태에서, 모든 주사 부위는 배뇨근에 있다.

[0266] 일부 양태에서, 주사 부위가 배뇨근에 있지 않다. 일부 양태에서, 주사 부위가 삼각부에 있지 않다.

[0267] 일부 양태에서, 주사 부위의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100%는 삼각부에 있다.

[0268] 일부 양태에서, 주사 부위의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100%는 배뇨근에 있다.

[0269] 일부 양태에서, 주사 부위의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100%는 방광벽의 하부에 있다.

[0270] 일부 양태에서, 주사 부위의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100%는 방광의 기저에 있다.

[0271] 일부 양태에서, 주사는 격자 패턴으로 등거리에 위치한다. 일부 양태에서, 주사 부위 사이의 거리는 적어도 약 0.5 cm, 적어도 약 0.75 cm, 적어도 약 1 cm, 적어도 약 1.25 cm, 적어도 약 1.5 cm, 적어도 약 1.75 cm 또는 적어도 약 2 cm이다.

[0272] 일부 양태에서, 주사 깊이는 배뇨근 내로 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 2.5 mm, 약 3.0 mm, 약 3.5 mm 또는 약 4.0 mm이고, 즉, 바늘은 배뇨근 내로 약 1.5 mm, 2 mm, 2.5 mm, 3.0 mm, 3.5 mm 또는 4 mm 삽입된다. 일부 양태에서, 주사 깊이는 삼각부 내로 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 2.5 mm, 약 3.0 mm, 약 3.5 mm 또는 약 4.0 mm이고, 즉, 바늘은 삼각부 내로 약 1.5 mm, 2 mm, 2.5 mm, 3.0 mm, 3.5 mm 또는 4 mm 삽입된다. 일부 양태에서, 주사 깊이는 방광벽 내로 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 2.5 mm, 약 3.0 mm, 약 3.5 mm 또는 약 4.0 mm이고, 즉, 바늘은 방광벽 내로 약 1.5 mm, 2 mm, 2.5 mm, 3.0 mm, 3.5 mm 또는 4 mm 삽입된다.

[0273] 일부 양태에서, 주사 부피는 약 0.5 ml, 약 0.6 ml, 약 0.7 ml, 약 0.8 ml, 약 0.9 ml, 약 1 ml, 약 1.1 ml, 약 1.2 ml, 약 1.3 ml, 약 1.4 ml 또는 약 1.5 ml의 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 pVAX 플라스미드와 같은 플라스미드)을 포함하는 용액이다.

[0274] 특정 양태에서, 방광 평활근 기능장애(예를 들어, OAB)를 갖는 대상체는, 예를 들어, 방광벽의 하부로, 예를 들어, 약 20회 근육내 주사로 투여되는, 예를 들어, 16,000 mcg, 24,000 mcg 또는 48,000 mcg의 총 용량의 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 pVAX 플라스미드와 같은 플라스미드)를 수용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[U.S. Prov. Appl. 62/505,382, International Application PCT/US2018/032574 (published as Int. Publ. WO2018209351A1) and U.S. Appl. Publ. Nos. 2017/0258878, and 2017/0136106, 이들 모두는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다] 참조.

[0275] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)의 투여는 대상체의 방광으로의 점적주입에 의한 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "점적주입"은 튜브(예를 들어, 카테터)가 먼저 방광에 삽입되고, 약물이 방광의 내부를 짧은 시간 동안 코팅할 수 있도록 이를 통해 주입되는 절차를 지칭한다. 일부 양태에서, 점적주입에 의한 투여는 빈 방광에서 수행된다. 일부 양태에서, 환자는 방광에 의한 점적주입된 조성물의 흡수를 증가시키기 위해 약간 탈수된다.

[0276] 일부 양태에서, 방광 내부에 점적주입된 용액의 부피는 적어도 약 50 ml, 적어도 약 60 ml, 적어도 약 70 ml, 적어도 약 80 ml, 적어도 약 90 ml, 적어도 약 100 ml, 적어도 약 110 ml, 적어도 약 120 ml, 적어도 약 130 ml, 적어도 약 140 ml, 적어도 약 150 ml, 적어도 약 160 ml, 적어도 약 170 ml, 적어도 약 180 ml, 적어도 약 190 ml, 적어도 약 200 ml, 적어도 약 210 ml, 적어도 약 220 ml, 적어도 약 230 ml, 적어도 약 240 ml, 적어도 약 250 ml, 적어도 약 260 ml, 적어도 약 270 ml, 적어도 약 280 ml, 적어도 약 290 또는 적어도 약 300 ml이다.

[0277] 일부 양태에서, 방광 내부에 점적주입된 용액은 비우기 전에 적어도 약 5분, 적어도 약 10분, 적어도 약 15분, 적어도 약 20분, 적어도 약 25분, 적어도 약 30분, 적어도 약 35분, 적어도 약 40분, 적어도 약 45분, 적어도 약 50분, 적어도 약 55분 또는 적어도 약 60분 동안 유지된다. 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 pVAX 플라스미드와 같은 플라스미드)의 투여는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 점적주입을 포함한다.

[0278] 본 개시는 또한 본원에 개시된 방법에 따른 Maxi-K 조성물의 투여의 잠재적인 임상 효과의 결정이 환자가 Maxi-K 조성물을 사용한 치료로부터 이익을 얻을 수 있음을 나타내는 경우 환자에게 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 투여하는 것을 포함하는 평활근 긴장도와 관련된 질환 또는 장애를 갖거나 가질 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

[0279] 환자로부터 수득된 샘플의 분석이 환자가 그러한 치료로부터 이익을 얻을 것을 나타내는 경우(예를 들어, 샘플에서 Maxi-K의 발현의 상향조절 또는 하향조절로 인해) 환자에게 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 포함하는 치료제를 투여하는 것을 포함하는 평활근 긴장도와 관련된 질환 또는 장애를 갖거나 가질 위험이 있는 환자를 치료하는 방법이 또한 제공된다. 일부 양태에서, 샘플은 환자로부터 수득되고 기능적 또는 유전적 시험을 위해, 예를 들어, 임상 실험실에 제출된다.

[0280] 샘플의 분석이 환자가 그러한 치료로부터 이익을 얻을 것을 나타내는 경우(예를 들어, 샘플에서 Maxi-K의 발현의 상향조절 또는 하향조절로 인해) (a) 검사(예를 들어, 유전자 검사)를 위해 환자로부터 채취한 샘플을 제출하는 단계; 및 (b) 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 포함하는 치료제를 투여하는 단계를 포함하는 평활근 긴장도와 관련된 질병 또는 장애를 갖거나 가질 위험이 있는 환자를 치료하는 방법이 또한 제공된다.

[0281] 본 개시는 또한 (a) 질병 또는 장애를 갖거나 가질 위험이 있는 환자로부터 얻은 샘플에서 근육 긴장도 및/또는 Maxi-K 발현을 측정하는 단계; (b) 정상 근육 긴장도 및/또는 Maxi-K 발현 수준의 존재/부재에 기반하여 환자가 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)를 포함하는 치료제를 사용한 치료로부터 이익을 얻을 수 있는지 여부를 결정하는 단계; 및 (c) 근육 긴장도 및/또는 Maxi-K 발현 수준이 비정상인 경우 의료 제공자에게 환자에게 치료제를 투여할 것을 조언하는 단계를 포함하는 평활근 긴장도와 관련된 질병 또는 장애를 갖거나 가질 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 근육 긴장도는 변경된 근육 긴장도를 나타내는 대리 측정을 통해 평가된다(예를 들어, 배뇨의 빈도는 OAB와 같은 방광 평활근 기능장애임).

[0282] 특정 양태에서, 당 분야에 공지된 방법에 따라 평활근 기능을 결정하는 임상 실험실(예를 들어, 유전자 검사 실험실) 또는 임상의는 환자가 본 개시의 특정 Maxi-K 조성물을 사용한 치료로부터 이익을 얻을 수 있는지 여부에 대해 의료 제공자 또는 의료 혜택 제공자에게 조언할 것이다.

[0283] 일부 양태에서, 임상 실험실은 환자가 본 개시의 특정 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 사용한 치료의 개시, 중단 또는 변형으로부터 이이을 얻을 수 있는지 여부에 대해 의료 제공자(예를 들어, 의사 또는 병원) 또는 의료 혜택 제공자(예를 들어, 혜택 관리자 또는 의료 보험 회사)에게 조언할 수 있다.

[0284] 일부 양태에서, 당 분야에 공지된 방법에 따라 수행되는 평활근 기능장애의 존재 또는 부재, 평활근 기능장애의 발생 위험, 또는 평활근 기능장애와 관련된 증상의 존재 또는 부재를 결정하는 시험 절차의 결과는 환자의 보험이 본 개시의 특정 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 사용한 치료를 보장할지 여부를 결정하기 위해 의료 제공자 또는 의료 혜택 제공자에게 제출될 수 있다.

[0285] 예를 들어, 방광 평활근 기능장애의 경우, 요역학적 연구를 사용하여 기능장애의 중증도, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 사용한 치료에 대한 반응 또는 반응 부족을 평가하거나, 환자 집단을 계층화할 수 있다.

[0286] 특정 양태에서, 본 개시는 평활근 기능장애를 갖거나 평활근 기능장애를 가질 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 (i) 평활근 기능장애의 존재 또는 부재 또는 그러한 평활근 기능장애와 관련된 증상의 존재 또는 부재를, 예를 들어, 유전자 검사 실험실에서 또는 임상의에 의해 진단하는 단계; 및 (ii) 진단이 환자가 Maxi-K 조성물을 사용한 치료로부터 이익을 얻을 수 있음을 나타내는 경우 의료 제공자에게 환자에게 본 개시의 특정 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 투여하도록 조언하거나 의료 혜택 제공자에게 투여를 허가하도록 조언하는 단계를 포함한다.

[0287] 특정 양태에서, 치료 방법은 다음을 포함할 수 있다: (i) 평활근 기능장애의 존재 또는 부재 또는 그러한 평활근 기능장애와 관련된 증상의 존재 또는 부재를, 예를 들어, 유전자 검사 실험실에서 또는 임상의에 의해 진단하는 단계; (ii) 진단이 환자가 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 사용한 치료로부터 이익을 얻을 수 있음을 나타내는지 여부를 결정하는 단계; 및 (iii) 지시된 경우, 예를 들어, 다음을 위해 의료 제공자에게 본 개시의 Maxi-K 조성물의 투여량을 조정하도록 조언하거나 의료 혜택 제공자에게 투여량의 조정을 허가하도록 조언하는 단계:

(a) 환자에 대한 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)의 투여량 또는 빈도를 증가시키거나 유지시킴,

(b) 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)의 투여를 중단시킴, 또는

(c) 투여되는 본 개시의 Maxi-K 조성물의 양(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터) 또는 본 개시의 Maxi-K 조성물의 투여 빈도를 유지하거나 감소시킴.

[0288] (i) 평활근 기능장애의 존재 또는 부재, (ii) 평활근 기능장애의 출현 위험, (iii) 평활근 기능장애로 인한 증상 또는 후유증의 존재 또는 부재, (iv) 평활근 기능장애로 인한 증상 또는 후유증의 출현 위험, (v) 평활근 기능장애 또는 평활근 기능장애와 관련된 증상 또는 후유증의 중증도, (vi) 평활근 기능장애 또는 평활근 기능 장애와 관련된 증상 또는 후유증의 표준 치료에 대한 환자의 반응 또는 이의 결여, (vii) 평활근 기능장애 또는 평활근 기능장애와 관련된 증상 또는 후유증을 치료하기 위한 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)의 투여에 대한 환자의 반응 또는 이의 결여, 또는 (viii) 이들의 임의의 조합의 결정은, 상기 논의된 바와 같이, 평활근 기능장애 또는 평활근 기능장애와 관련된 증상 또는 후유증의 치료의 일부로서 사용될 수 있다. 또한, 이러한 결정은, 예를 들어, 다음을 위해 사용될 수 있다:

(a) 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)으로 치료할 환자를 선택하거나;

(b) 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 사용한 치료로부터 환자를 배제하거나;

(c) 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 표준 치료(조합 치료)에 추가하거나;

(d) 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)의 용량을 증가시키거나;

(e) 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)의 용량을 감소시키거나;

(f) 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)의 투여 빈도를 증가시키거나;

(g) 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)의 투여 빈도를 감소시키거나;

(h) 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)에 대한 대안적인 투여 경로를 선택하거나;

(i) 치료를 위한 옵션으로서 본 개시의 몇몇 잠재적인 Maxi-K 조성물 중에서 본 개시의 특정 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 선택하거나;

(j) 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 사용하는 임상 시험을 위한 환자를 선택하거나;

(k) 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 사용하는 임상 시험을 위한 환자를 배제하거나;

(l) 환자의 예후를 결정하거나;

(m) 이들의 임의의 조합.

[0289] 본원에 개시된 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)의 투여의 잠재적 표현형 영향에 응답하여, 의료 제공자, 혜택 제공자 또는 상담자는 치료 조언 및/또는 생활 습관 조언을 치료의 일부로 제공할 수 있다. 따라서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 사용하여 치료할 수 있는 평활근 기능장애의 확인에 응답하여, 대상체에게, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)를 투여하는 것에 추가하여, 예를 들어, 그의 또는 그녀의 식이 요법을 조절하거나, 흡연을 중단하거나, 알콜 섭취를 중단 또는 감소시킬 것이 조언될 수 있다.

[0290] 특정 양태에서, 본 개시는 구체적으로 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)의 투여가 방광의 평활근의 이완을 조절하는 유전자 치료 방법을 제공한다. 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 사용한 유전자 치료의 결과로서 방광벽의 근육에서 발현되는 이러한 Maxi-K 폴리펩티드는 평활근의 이완을 촉진 또는 향상시켜, 평활근의 긴장도를 감소시킨다. 특히, 방광의 평활근 긴장도가 감소하면, 방광 수축성이 증가한다. 이러한 특정 양태에서, 본 개시의 방법은 과반사성 방광을 완화시키는데 사용될 수 있다. 과반사성 방광은 신경원성 및 동맥원성 기능장애를 포함하는 다양한 장애뿐만 아니라 불완전한 이완 또는 방광의 평활근의 고조된 수축성을 야기하는 다른 상태로 인해 발생할 수 있다.

[0291] 특정 양태에서, 본 개시의 방법은 대상체의 방광 평활근 세포에 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을, 예를 들어, 방광벽(예를 들어, 배뇨근) 및 특히, 방광벽의 특정 위치(예를 들어, 삼각부)로의 주사를 통해 도입함으로써 과활동성 방광(OAB) 증후군 또는 배뇨근 과다활동의 증상을 치료하거나 완화시키는데 사용된다. 핵산은 방광 평활근 긴장도가 조절되도록 방광 평활근 세포에서 발현되고; 따라서, 방광 평활근 긴장도의 조절은 대상체에서 평활근의 수축성을 덜 고조시킨다.

[0292] 본 개시의 일부 양태에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 난치성 과활동성 방광으로 고통받는 환자에게 적용된다. 본 개시의 방법의 특정 양태에서, 대상체는 과활동성 방광 및 절박 요실금으로 고통받는 여성 환자 또는 여성 환자의 집단이다. 다른 양태에서, 대상체는 과활동성 방광 및 절박 요실금으로 고통받는 남성 환자 또는 남성 환자의 집단이다. 또 다른 양태에서, 대상체는 과활동성 방광 및 절박 요실금으로 고통받는 남성 및 여성 환자의 집단이다. 특정 양태에서, 그러한 환자에게 본 개시의 Maxi-K 조성물, 예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 pVAX와 같은 벡터가 투여된다.

[0293] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)은, 예를 들어, 방광 배뇨근의 20 내지 30개 부위에서, 근육 내로 약 2 mm의 깊이로, 주사 부위 사이에 약 1 cm의 간격을 두고, 방광으로의 주사를 통해 그러한 환자에게 투여되며, 여기서 각 주사는 16000 ug, 24000 ug 또는 48000 ug의 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, pVAX-hSlo1)을 포함한다.

[0294] 본원에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 치료될 수 있는 다른 질병 및 질환은 본 출원의 섹션 IV에 제시되어 있다.

III. 평활근 기능장애의 치료를 위한 Maxi-K 조성물

[0295] 본 개시는, 예를 들어, 상기 개시된 방법에 따라 투여될 수 있는 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 제공한다. 상기 논의된 바와 같이, 본 개시의 Maxi-K 조성물은, 예를 들어,

(a) 도 17에 개략적으로 제시된 하나 이상의 Maxi-K 폴리펩티드, 및 이들의 도메인 또는 도메인의 조합을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(당 분야에 공지된 도메인 경계에 따름);

(b) 표 1에 제시된 하나 이상의 Maxi-K 폴리펩티드 서열(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛, Maxi-K 베타 서브유닛 또는 이들의 조합), 또는 이의 단편(예를 들어, 도 17 표시에 도시된 도메인 중 하나 이상이 결여된 알파 서브유닛), 아이소형, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드;

(c) 본원에 개시된 Maxi-K 폴리펩티드, 예를 들어, 바람직한 특성을 부여하는 비-Maxi-K 폴리펩티드에 유전적으로 융합된 Maxi-K 알파 서브유닛, 또는 2개 이상의 Maxi-K 폴리펩티드, 예를 들어, 알파 서브유닛 및 베타 서브유닛 간의 융합을 포함하는 융합 또는 키메라 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드;

(e) (a),(b) 또는(c)의 폴리뉴클레오티드, (d)의 플라스미드 또는 벡터 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 세포;

(f) (a), (b) 또는 (c)의 폴리뉴클레오티드, (d)의 플라스미드 또는 벡터, (e)의 세포를 포함하는 약학적 조성물; 또는 (g) 이들의 임의의 조합을 포함한다.

[0296] 일부 양태에서, Maxi-K 조성물은 벡터(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)를 포함한다. 적합한 벡터는, 예를 들어, 바이러스 벡터, 예를 들어, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV) 및 레트로바이러스(예를 들어, 렌티바이러스), 리포좀, 다른 지질-함유 복합체, 나노입자, 및 표적 세포로의 폴리뉴클레오티드의 전달을 매개할 수 있는 임의의 다른 분자 또는 다른 거대분자 복합체를 포함한다. 본 개시의 재조합 벡터 및 플라스미드는 또한 적합한 숙주 세포에서 벡터 작제물의 발현을 달성하기 위해 적합한 조절 요소를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "발현"은 삽입된 핵산에 의해 인코딩된 단백질의 합성이 일어날 수 있도록 삽입된 DNA 서열을 mRNA로 전사하는 벡터의 능력을 지칭한다.

[0297] 당업자는 다양한 인핸서 및 프로모터가 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)에서 작제물에 사용하기에 적합하고; 상기 작제물이, 숙주 세포로의 재조합 벡터 작제물의 도입시에, 필요한 시작, 종결 및 제어 서열 또는 평활근 긴장도의 조절에 관여하는 단백질을 인코딩하는 DNA 서열의 적절한 전사 및 처리를 포함할 것임을 인식할 것이다.

[0298] Maxi-K 폴리펩티드(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛, Maxi-K 베타 서브유닛 또는 이들의 조합)를 인코딩하는 핵산 서열의 평활근 세포에서의 발현을 위해, 본 개시에 의해 제공되는 비-바이러스 벡터는 당업자에게 공지된 임의의 다음 벡터의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다: pVax(Thermo Fisher Scientific), pCMVβ(Invitrogen), pcDNA3(Invitrogen), pET-3d(Novagen), pProEx-1(Life Technologies), pFastBac 1(Life Technologies), pSFV(Life Technologies), pcDNA2(Invitrogen), pSL301(Invitrogen), pSE280(Invitrogen), pSE380(Invitrogen), pSE420(Invitrogen), pTrcHis A, B, C(Invitrogen), pRSET A, B, C(Invitrogen), pYES2(Invitrogen), pAC360(Invitrogen), pVL1392 및 pVI1392(Invitrogen), pCDM8(Invitrogen), pCDNA I(Invitrogen), pREP4(Invitrogen), pREP8(Invitrogen), pREP9(Invitrogen), pREP10(Invitrogen), pCEP4(Invitrogen), pEBVHis(Invitrogen) 및 λPop6. 다른 벡터도 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 벡터는 pVax이고, pVax에서 Maxi-K 오픈 리딩 프레임은 Maxi-K 알파 서브유닛(예를 들어, 본원에 개시된 야생형 Maxi-K 알파 서브유닛 또는 Maxi-K 돌연변이체 서브유닛)을 인코딩한다.

[0299] 일부 양태에서, pVax 벡터 서열은 SEQ ID NO: 10의 서열을 포함한다. 일부 양태에서, pVAX 벡터 서열은 SEQ ID NO: 10과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 양태에서, pVAX 서열은 SEQ ID NO: 10의 위치 2에서 G의 A로의 치환, SEQ ID NO: 10의 위치 5에서 추가적인 G, SEQ ID NO: 10의 위치 1158에서 T의 C로의 치환, SEQ ID NO: 10의 위치 2092에서 A 누락, SEQ ID NO: 10의 위치 2493에서 T의 C로의 치환 또는 이들의 조합을 포함한다.

[0300] pVax 벡터의 추가 변이는 도 18에 도시되어 있다(변이 N1-N4 및 N10-16). 일부 양태에서, pVax 벡터는 Maxi-K-인코딩 부분(즉, SEQ ID NO: 51, 52 또는 53)을 제외하고, SEQ ID NO: 16, 49, 또는 50의 서열을 포함한다. 일부 양태에서, pVax 벡터는 SEQ ID NO: 16에서 Maxi-K-인코딩 부분(즉, SEQ ID NO: 51)을 뺀 서열 및 도 18의 N1, N2, N3, N4, N10, N11, N12, N13, N14, N15 또는 N16 변이 중 적어도 하나 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, pVax 벡터는 SEQ ID NO: 49에서 Maxi-K-인코딩 부분(즉, SEQ ID NO: 52)을 뺀 서열 및 도 18의 N1, N2, N3, N4, N10, N11, N12, N13, N14, N15 또는 N16 변이 중 적어도 하나 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, pVax 벡터는 SEQ ID NO: 50에서 Maxi-K-인코딩 부분(즉, SEQ ID NO: 53)을 뺀 서열 및 도 18의 N1, N2, N3, N4, N10, N11, N12, N13, N14, N15 또는 N16 변이 중 적어도 하나 또는 이들의 조합을 포함한다.

[0301] 일부 양태에서, 핵산 분자는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 프로모터는 요로상피 특이적 발현 프로모터가 아니다. 예를 들어, 프로모터는 CMV 프로모터(VAX) 또는 평활근 특이적 발현 프로모터(SMAA)이다.

[0302] 본 개시의 방법의 실행에 적합한 프로모터는 항시적 프로모터, 조직-특이적 프로모터 및 유도성 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 프로모터는 평활근 프로모터이다. 다른 양태에서, 프로모터는 근육 세포 프로모터이다. 일부 양태에서, 프로모터는 요로상피 특이적 발현 프로모터가 아니다.

[0303] 한 양태에서, 본원에 개시된 Maxi-K 폴리펩티드(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛, Maxi-K 베타 서브유닛 또는 이들의 조합)를 인코딩하는 Maxi-K 폴리뉴클레오티드 서열의 발현은 Maxi-K 폴리뉴클레오티드 서열이 도입된 특정 벡터에 의해 제어되고 영향을 받는다. 일부 진핵 벡터는 삽입된 핵산을 숙주 세포 내에서 높은 수준으로 발현할 수 있도록 조작되었다. 그러한 벡터는 많은 강력한 프로모터 중 하나를 사용하여 높은 수준의 발현을 유도한다. 진핵 벡터는 바이러스 유전자, 특히 종양 바이러스의 프로모터-인핸서 서열을 사용한다.

[0304] 일부 양태에서, Maxi-K 폴리펩티드 단백질을 인코딩하는 Maxi-K 폴리뉴클레오티드 서열의 발현은 유도성 프로모터의 사용을 통해 조절된다. 유도성 프로모터의 비제한적인 예는, 예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터 및 마우스 유방 종양 바이러스 프로모터를 포함한다. 벡터에 따라, 평활근 세포에서 Maxi-K 폴리펩티드 서열의 발현은 세포의 성장 주기의 특정 지점에서 특정 화합물의 첨가에 의해 유도될 수 있다. 본 개시의 재조합 벡터에 사용하기에 효과적인 프로모터 및 인핸서의 다른 예는 CMV(사이토메갈로바이러스), SV40(원숭이 바이러스 40), HSV(단순 포진 바이러스), EBV(엡스타인-바 바이러스), 레트로바이러스, 아데노바이러스 프로모터 및 인핸서, 및 평활근 특이적 프로모터 및 인핸서를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

[0305] 평활근 특이적 프로모터의 예는 SM22a이다. 예시적인 평활근 프로모터는 미국 특허 번호 7,169,764에 기재되어 있으며, 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 본 개시의 일부 특정 양태에서, 벡터는 SEQ ID NO: 9와 같은 서열을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는 SM22a 프로모터 서열을 포함한다.

[0306] 일부 양태에서, 벡터는 SEQ ID NO: 1과 같은 서열을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는 인간 사이토메갈로바이러스 중간-초기 프로모터(CMEV) 서열을 프로모터로 포함한다. 일부 양태에서, 벡터는 SEQ ID NO: 2와 같은 서열을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는 T7 프라이밍 부위를 포함한다.

[0307] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 폴리펩티드를 발현시키는데 사용되는 재조합 바이러스 및/또는 플라스미드는 본원에 제공된 것과 같은 폴리A(아데닐중합체형성) 서열(예를 들어, BGH 폴리A 서열)을 포함한다. 일반적으로, 임의의 적합한 폴리A 서열이 트랜스진의 원하는 발현을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 본 개시는 BGH 폴리A 서열 또는 BGH 폴리A 서열의 일부를 포함하는 서열을 제공한다. 일부 경우에, 본 개시는 하나 이상의 폴리A 서열 또는 서열 요소의 조합을 포함하는 폴리A 서열을 제공한다. 일부 경우에, 폴리A 서열이 사용되지 않는다. 일부 경우에, 하나 이상의 폴리A 서열은 비번역 영역(UTR), 3'UTR 또는 종결 서열로 지칭될 수 있다.

[0308] 폴리A 서열은 약 1-10 bp, 약 10-20 bp, 약 20-50 bp, 약 50-100 bp, 약 100-500 bp, 약 500 bp-1 Kb, 약 1 Kb-2Kb, 약 2Kb-3Kb, 약 3Kb-4Kb, 약 4Kb-5Kb, 약 5Kb-6Kb, 약 6Kb-7Kb, 약 7Kb-8Kb, 약 8Kb-9Kb 또는 약 9Kb-10Kb의 길이를 포함할 수 있다. 폴리A 서열은 적어도 1bp, 적어도 2bp, 적어도 3bp, 적어도 4bp, 적어도 5bp, 적어도 6bp, 적어도 7bp, 적어도 8bp, 적어도 9bp, 적어도 약 10bp, 적어도 약 20bp, 적어도 약 30bp, 적어도 약 40bp, 적어도 약 50bp, 적어도 약 60bp, 적어도 약 70bp, 적어도 약 80bp, 적어도 약 90bp, 적어도 약 100bp, 적어도 약 200bp, 적어도 약 300bp, 적어도 약 400bp, 적어도 약 500bp, 적어도 약 600bp, 적어도 약 700bp, 적어도 약 800bp, 적어도 약 900bp, 적어도 약 1Kb, 적어도 약 1.5 Kb, 적어도 약 2Kb, 적어도 약 2.5 Kb, 적어도 약 3Kb, 적어도 약 3.5Kb, 적어도 약 4Kb, 적어도 약 4.5 Kb, 적어도 약 5Kb, 적어도 약 5.5 Kb, 적어도 약 6Kb, 적어도 약 6.5 Kb, 적어도 약 7Kb, 적어도 약 7.5 Kb, 적어도 약 8Kb, 적어도 약 8.5 Kb, 적어도 약 9Kb, 적어도 약 9.5 Kb 또는 적어도 약 10Kb의 길이를 포함할 수 있다.

[0309] 일부 양태에서, BGH 폴리A는 SEQ ID NO: 3과 같은 서열을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 폴리A 서열은 세포에서 트랜스진의 mRNA 반감기, 트랜스진의 mRNA의 안정성 또는 전사 조절을 포함하나 이에 제한되지 않는 단백질 발현에 영향을 미치는 다양한 파라미터에 대해 최적화될 수 있다. 예를 들어, 폴리A 서열은 트랜스진의 mRNA 전사를 증가시키기 위해 변경될 수 있으며, 이는 증가된 단백질 발현을 초래할 수 있다. 일부 양태에서, 폴리A 서열은 트랜스진의 mRNA 전사체의 반감기를 감소시키기 위해 변경될 수 있으며, 이는 감소된 단백질 발현을 초래할 수 있다.

[0310] 일부 양태에서, 벡터는 본원에 제공된 것과 같은 복제 기점 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 복제 기점 서열은 일반적으로 플라스미드/벡터를 전파하는데 유용한 서열을 제공한다. 일부 양태에서, 복제 기점은 pUC 복제 기점이다. 일부 경우에, pUC 복제 기점은 SEQ ID NO: 4와 같은 서열을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.

[0311] 일부 양태에서, 벡터는 또한 선택 가능한 마커를 포함할 수 있다. 선택 가능한 마커는 양성, 음성 또는 이기능성일 수 있다. 양성 선택 가능한 마커는 마커를 운반하는 세포에 대한 선택을 허용하는 반면, 음성 선택 마커는 마커를 운반하는 세포가 선택적으로 제거되도록 한다. 이기능성(즉, 양성/음성) 마커를 포함하는 다양한 마커 유전자가 기재되어 있다(예를 들어, 문헌[Lupton, S., WO 92/08796, published May 29, 1992; and Lupton, S., WO 94/28143, published Dec. 8, 1994] 참조). 음성 선택 가능한 마커의 예는 암피실린 또는 카나마이신과 같은 항생제에 대한 내성 유전자의 포함을 포함할 수 있다. 그러한 마커 유전자는 유전자 치료 상황에서 유리할 수 있는 추가된 제어 척도를 제공할 수 있다. 매우 다양한 그러한 벡터가 당 분야에 공지되어 있고 일반적으로 이용 가능하다.

[0312] 일부 경우에, 벡터는 카나마이신에 대한 내성을 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 카나마이신에 대한 내성을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 5의 서열을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.

[0313] 일부 양태에서, 벡터는 Maxi-K 폴리펩티드(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛, Maxi-K 베타 서브유닛 또는 조합), 돌연변이체 Maxi-K 폴리펩티드, Maxi-K 폴리펩티드 단편(예를 들어, 기능성 단편), 본 출원의 이전 섹션에 개시된 바와 같은 변이체, 유도체, 융합 또는 키메라를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. Maxi-K 폴리펩티드를 인코딩하는 예시적인 핵산은 SEQ ID NO: 6(야생형 인간 Maxi-K 알파 서브유닛), 또는 SEQ ID NO: 51, 52 또는 53의 핵산 서열을 포함한다.

[0314] Maxi-K 유전자의 변형(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛 및/또는 Maxi-K 베타 서브유닛에서)은, 예를 들어, Maxi-K 채널 발현, 활성, 업스트림 신호전달 사건 및/또는 다운스트림 신호전달 사건의 변화를 야기하는 인간 질병을 효과적으로 치료하는데 사용될 수 있다. 야생형 Maxi-K 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 대한 변형은 결실, 삽입, 프레임 이동, 치환 및 반전을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

[0315] 야생형 Maxi-K 알파 서브유닛 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 고려되는 변형은 Maxi-K를 인코딩하는 DNA, cDNA 또는 RNA(예를 들어, mRNA) 서열에서 적어도 하나의 뉴클레오티드(예를 들어, 단일 뉴클레오티드)의 치환 및/또는 Maxi-K 폴리펩티드 서열에서 적어도 하나의 아미노산(예를 들어, 단일 아미노산)의 치환을 포함한다.

[0316] 인간 Maxi-K 채널의 알파 또는 기공-형성 서브유닛의 단일 점 돌연변이는 야생형 Maxi-K 알파 서브유닛 유전자보다, 평활근 기능장애, 예를 들어, 방광 평활근에서 배뇨근 과다활동(DO)을 감소시키는데 더 효율적이다. 구체적으로, Maxi-K 알파 서브유닛 유전자의 뉴클레오티드 위치 1054에서 단일 점 돌연변이는 아미노산 서열의 위치 352에서 트레오닌(T)을 세린(S)으로 치환시키고(T352S), 이는 돌연변이되지 않은 유전자에 의해 발현된 채널과 비교할 때 더 낮은 세포내 칼슘 이온 농도에서 Maxi-K 채널의 전류를 증가시킨다.

[0317] 단일 돌연변이는 다중 돌연변이를 갖는 유전자에 비해 높은 산화 스트레스 환경의 높은 글루코스에서 전도도를 개선시킨다. Maxi-K 알파 서브유닛 인코딩된 T352S 돌연변이체(예를 들어, pVAX로의 혼입으로 pVAX-hSlo-T352S 작제물 생성)는 야생형 Maxi-K 채널 기능에서 연령- 및 질병-유도된 교대를 처리하기에 야생형 서열 또는 야생형 서열을 인코딩하는 Maxi-K 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물에 의해 인코딩되는 Maxi-K 채널보다 생리학적으로 더욱 효과적이다.

[0318] 일부 양태에서, Maxi-K 알파 서브유닛을 인코딩하는 Maxi-K 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 7에 따라 넘버링될 때 핵산 위치 1054에 점 돌연변이를 포함한다. 상기 점 돌연변이는 SEQ ID NO: 7에 따라 넘버링될 때 Maxi-K 알파 서브유닛의 위치 352에서 아미노산 치환을 초래한다. 예를 들어, 점 돌연변이는 트레오닌(T)에 대한 세린(S)의 치환이다(예를 들어, T352S).

[0319] 선택적으로, Maxi-K 알파 서브유닛 야생형 서열의 추가 변형은 SEQ ID NO: 8에 따라 넘버링될 때 아미노산 위치 496, 602, 681, 778, 805, 977 또는 이들의 임의의 조합에서 하나 이상의 아미노산 치환을 초래하는 점 돌연변이를 포함한다. 특정 양태에서, 그러한 위치에서의 돌연변이는 C496A("C2 돌연변이"), M602L("M1 돌연변이"), C681A("C3 돌연변이"), M778L("M2 돌연변이"), M805L("M3 돌연변이") 또는 C977A("C1 돌연변이")이고, 이는 검은색 바탕에 흰색 글자로 강조 표시되고 아래 SEQ ID NO:8에서 돌연변이의 명칭과 함께 표시된다:

[0320] 본 개시는 또한 평활근 긴장도의 조절에 관여하는 단백질, 예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛, Maxi-K 베타 서브유닛 또는 이들의 조합과 같은 Maxi-K 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 DNA 또는 RNA(예를 들어, mRNA) 서열을 발현하는 세포, 예를 들어, 평활근 세포 또는 줄기 세포를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 본원에서 사용되는 "외인성"은 유기체 또는 세포에 도입되는 임의의 DNA 또는 RNA(예를 들어, mRNA)를 의미한다.

[0321] 본 개시의 방법을 실행하는데 사용될 수 있는 예시적인 핵산 분자는 벡터 pVAX-hSlo-T352S; pVAX-hSlo-T352S-C997; pVAX-hSlo-T352S-C496A; pVAX-hSlo-T352S-C681; pVAX-hSlo-T352S-M602L; pVAX-hSlo-T352S-M778L; pVAX-hSlo-T352S-M805L; pSMAA-hSlo-T352S; pSMAA-hSlo-T352S-C997; pSMAA-hSlo-T352S-C496A; pSMAAhSlo-T352S-C681A; pSMAA-hSlo-T352S-M602L; pSMAA-hSlo-T352S-M778L; 및 pSMAA-hSlo-T352S-M805L을 포함한다.

[0322] 본 출원은 다음 문서를 그 전체로 참조로서 포함한다:

● 미국 특허 출원 공개 2008/0269159,

● 국제 출원 공개 WO2013151665A2 및 미국 특허 출원 공개 번호 US2018311381 (및 특히 그 안에 개시된 SEQ ID NO: 23235, 23242, 23240 및 23238 및 그 안에 개시된 관련 코돈 최적화된 서열), 및

● 미국 특허 출원 공개 2018/0126003 (및 특히 그 안에 개시된 SEQ ID NO: 126837, 282951, 282944 및 282928 및 그 안에 개시된 관련 코돈 최적화된 서열).

[0323] 상기 특허 및 출원 공개에 개시된 Maxi-K 서열은 또한 본 개시의 Maxi-K 조성물로서, 그러한 조성물의 제조를 위해, 그리고 본원에 개시된 평활근 기능장애의 치료를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 포함된 특허 및 출원 공개에 개시된 Maxi-K 서열은 바이러스 벡터에서, 또는 숙주 세포(예를 들어, 평활근 세포)에서의 발현을 위해 핵산을 숙주 세포에 효과적으로 도입할 수 있는 당 분야에 공지된 임의의 시스템에서, 예를 들어, 네이키드 투여를 위해, 플라스미드/벡터에서 사용될 수 있다.

[0324] 본 개시에 따라 사용될 수 있는 Maxi-K 폴리뉴클레오티드 서열 및 상응하는 폴리펩티드는 표 1에 제시되어 있다.

표 1: Maxi-K 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 서열.

[0325] 하기 표(표 2)는 본 개시의 방법에 따라 사용될 수 있는 Maxi-K 폴리펩티드(알파 및 베타 서브유닛)의 추가 돌연변이를 제시한다.

표 2: Maxi-K 폴리펩티드의 돌연변이.

[0326] Maxi-K의 알파 서브유닛은 전압 센서 도메인(VSD)과 2개의 RCK(칼륨 전도도 조절제) 도메인, RCK1및 RCK2를 포함한다. RCK2에는 칼슘 결합 부위가 있다. 이들 도메인은 2개의 고친화성 Ca²⁺ 결합 부위를 포함한다: 하나는 RCK1도메인에 있고 다른 하나는 RCK2 도메인에 위치한 일련의 아스파르트산(Asp) 잔기로 구성된 Ca²⁺ 보울로 명명된 영역에 있다. Mg²⁺ 결합 부위는 VSD와 세포질 도메인 사이에 위치하며, 이는 S0-S1 루프 내의 Asp 잔기, S2의 세포질 말단의 아스파라긴 잔기 및 RCK1의 글루타민 잔기에 의해 형성된다. Mg²⁺ 결합 부위를 형성할 때, 2개의 잔기는 하나의 Slo1 서브유닛의 RCK1에서 유래되고 다른 2개의 잔기는 이웃 서브유닛의 VSD에서 유래된다. 이러한 부위의 특정 돌연변이는 2가 양이온 변조에 대한 채널의 민감도를 변경할 수 있다. 본 개시는 또한 이러한 특정 위치, 부위 및 도메인에서 돌연변이가 발생한 Maxi-K 알파 서브유닛을 포함한다.

[0327] 단백질 키나제 C(PKC)에 의한 Ser695의 포스포릴화에 의한 Maxi-K 채널 활성의 억제는 Maxi-K 알파-서브유닛의 C 말단에서 Ser1151의 포스포릴화에 의존한다. 4량체 구조에서 이들 포스포릴화 중 하나만이 성공적으로 억제될 필요가 있다. 따라서, Maxi-K의 활성은 Maxi-K 알파 서브유닛의 Ser695 및/또는 Ser1151의 돌연변이를 통해 조절될 수 있다.

[0328] Maxi-K 베타 4 서브유닛은 포스포릴화될 수 있으며, 그 포스포릴화는 Maxi-K 알파 서브유닛과의 상호작용을 극적으로 변화시킨다. 따라서, Maxi-K 베타 4 서브유닛에서 포스포릴화되는 아미노산의 돌연변이는 Maxi-K 알파 서브유닛의 활성을 조절할 수 있다.

[0329] 본 개시의 Maxi-K 폴리펩티드는 또한 포스포릴화되기 쉬운 아미노산 위치(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛의 세린 765, 778, 782, 978, 982, 1221 또는 1224, 또는 트레오닌 763 또는 970), 지질화 위치(예를 들어, Maxi-K 알파 서브유닛의 위치 118, 119 또는 121), 글리코실화 위치 또는 이들의 조합이 돌연변이된 변이체를 포함한다. 예를 들어, Maxi-K 베타 4 서브유닛이 이의 세포외 도메인에 2개의 컨센서스 N-연결된 글리코실화 부위를 포함함을 개시하는 문헌[Jin et al. (2002) J. Biol. Chen. 277:43724-43729] 참조. Maxi-K 베타 4의 세포외 루프가 또한 Maxi-K 베타 1 서브유닛에서 발생하는 것으로 나타났기 때문에 이는 글리코실화될 수 있다. 그러나, Maxi-K 알파 서브유닛은 골지 구획에서 추가적인 Maxi-K 베타 4 글리코실화를 촉진한다. 차례로, Maxi-K 베타 4는 Maxi-K 알파 서브유닛의 독소 민감도의 조절에 영향을 미친다. 따라서, Maxi-K 채널의 기공-형성 Maxi-K 알파 서브유닛과 이의 보조 Maxi-K 베타 서브유닛 사이에 상호 변조가 존재한다.

[0330] 본 개시의 Maxi-K 폴리펩티드는 또한, 선택적으로 표 2에 개시된 하나 이상의 돌연변이 또는 본 출원이 출원된 시점에 당 분야에 공지된 임의의 돌연변이를 포함하여, 위치 352-355(칼륨 선택성을 담당하는 영역); 1003-1025(칼슘 보울); 1012, 1015, 1018 또는 1020(특이적 칼슘 결합 아미노산); 671-681(헴-결합 모티프); 439, 462 및 464(마그네슘 결합 아미노산)의 임의의 아미노산이 돌연변이되거나; 이들의 임의의 조합인 Maxi-K 알파 서브유닛 변이체를 포함한다.

[0331] 본 개시의 Maxi-K 폴리펩티드는 또한 채널 기공을 라이닝하는 아미노산 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 Maxi-K 알파 서브유닛 변이체, 또는 Maxi-K 알파 및 그 임의의 보조 베타 서브유닛 사이의 계면에 있는 아미노산 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변이체를 포함한다.

[0332] 본 개시의 Maxi-K 폴리펩티드는 또한 PKA 및/또는 PKG와 같은 키나제에 의한 Maxi-K 알파 서브유닛의 포스포릴화를 증가 또는 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 Maxi-K 알파 서브유닛 변이체를 포함한다.

[0333] 본 개시의 Maxi-K 폴리펩티드는 또한 원형질막의 위치를 조절하는, S0 및 S1 막횡단 도메인 사이의 세포내 링커 내에서 ZDHHC22(징크 핑거 DHHC 도메인-함유 단백질 22) 및 ZDHHC23(징크 핑거 DHHC 도메인-함유 단백질 23)에 의한 Maxi-K 알파 서브유닛의 팔미토일화; 및/또는 트랜스-골지 네트워크로부터의 지연된 출구로 이어지는, LYPLA1(아실-단백질 티오에스테라제 1) 및/또는 LYPLAL1(리소포스포리파제-유사 1)에 의한 탈팔미토일화를 조절하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 Maxi-K 알파 서브유닛 변이체를 포함한다

IV. 평활근 기능장애 관련 질환

[0334] 본 개시는 일반적으로 평활근 기능장애의 치료를 위한 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터) 및 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터) 및 방법은 주로 평활근 기능장애 및 그러한 기능장애와 관련된 증상에 의해 야기되는 질병 및 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 평활근 기능장애는 특발성이다. 다른 양태에서, 본 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터) 및 방법은 기저 질병, 질환 또는 병변의 결과인 평활근 기능장애를 치료하는데 사용될 수 있다(예를 들어, 신경원성 평활근 기능장애). 일부 특정 양태에서, 대상체는 과활동성 방광(OAB) 증후군, 발기 부전(ED), 천식; 전립선의 양성 증식(BPH); 관상 동맥 질환(혈관조영술 동안 주입됨); 방광, 내골반 근막, 전립선, 요관, 요도, 요로 및 정관의 비뇨생식기 기능장애; 과민성 대장 증후군; 편두통; 조기 진통; 레이노 증후군; 또는 폐쇄혈전혈관염을 갖는다.

[0335] 미국에서 수백만 명의 남성과 여성의 삶의 질에 중대한 영향을 미치는 일반적인 문제인 비정상적인 방광 기능은 BPH, 당뇨병, 다발성 경화증 및 뇌졸중과 같은 많은 일반적인 질병의 결과일 수 있다. 한 양태에서, 본 개시는 본 개시의 Maxi-K 조성물을 투여하는 것을 포함하는 비정상적인 방광 기능을 치료하는 방법을 제공한다.

[0336] 방광 기능의 현저한 비정상적인 변화는 또한 노화 진행의 정상적인 결과이다. 변화된 방광 생리학의 두 가지 주요 임상 증상이 있다: 무력성 방광 및 과반사성 방광. 본 개시는 Maxi-K 기능을 상향조절하거나 하향조절할 수 있는 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 제공함으로써, 본 개시의 Maxi-K 조성물을 투여하는 것을 포함하는 무력성 방광과 관련된 상태 및 과반사성 방광과 관련된 상태를 치료하는 방법을 제공한다.

[0337] 무력성 방광 또는 배뇨 저활동은 배뇨근 평활근(방광벽의 외부 평활근)의 비효율적인 수축성으로 인해 소변 내용물을 비우는 능력이 감소되었다. 무력성 또는 저활동 상태에서, 감소된 평활근 수축성은 방광 기능장애의 병인과 관련이 있다. 따라서, 평활근 긴장도의 약리학적 조절이 근본적인 문제를 교정하기에 불충분하다는 것은 놀라운 일이 아니다. 사실, 이 상태를 치료하기 위한 일반적인 방법은 깨끗한 간헐적 카테터 삽입을 사용한다; 이것은 만성 요로 감염, 신우신염 및 궁극적인 신부전을 예방하는 성공적인 수단이다. 이와 같이, 무력성 방광의 치료는 질병의 증상을 호전시키지만 근본적인 원인을 교정하지는 못한다.

[0338] 반대로, 과반사성, 비억제 또는 배뇨근 과다활동을 나타내는 방광은 방광을 채우는 동안 자발적으로 수축한다. 이는 빈뇨, 요절박 및 절박 요실금을 발생시킬 수 있으며, 이 때 개체는 소변의 흐름을 제어할 수 없다. 과반사성 방광은 치료하기 더 어려운 문제이다. 이 상태를 치료하기 위해 사용된 약물은 일반적으로 부분적으로만 효과적이며, 환자의 사용 및 열의를 제한하는 심각한 부작용이 있다. 현재 허용되는 치료 옵션(예를 들어, 옥시부티닌 및 톨테라딘)은 대체로 비특이적이며, 가장 빈번하게는 방광 근세포 상의 무스카린 수용체 경로 및/또는 칼슘 채널의 차단을 수반한다. 신체의 기관 시스템의 세포 기능에서 이러한 두 가지 경로의 핵심적인 중요성을 고려할 때, 그러한 치료 전략은 방광 평활근 긴장도를 조절하기 위한 조잡한 방법에 불과하다. 오히려, 바로 그 작용 메커니즘(들) 때문에, 이들은 또한 실질적으로 중요하고 바람직하지 않은 전신 효과를 가질 것이 분명하다.

[0339] 노화 및 질병은 Maxi-K 채널의 Maxi-K 알파(hSlo) 서브유닛의 발현을 변화시킬 수 있다. 이러한 변화는 기관을 구성하는 평활근의 긴장도의 기관 특이적 생리학적 변형을 감소시킬 수 있다. 그 효과는 기관에서 평활근 세포의 긴장도를 고조시켜 음경의 발기 부전(ED), 요절박, 빈뇨, 야뇨증 및 방광의 요실금(예를 들어, 과활동성 방광(OAB) 증후군), 폐의 천식, 결장의 과민성 장, 눈의 녹내장, 및 전립선의 방광 출구 폐쇄와 같은 인간 질병을 유발한다. 따라서, 본 개시는 본 개시의 Maxi-K 조성물을 투여함으로써 그러한 질병을 치료하는 방법을 제공한다.

[0340] 노화는 평활근에서 Maxi-K 알파 서브유닛 전사체 하향조절을 초래한다. 또한, Maxi-K 베타 1 서브유닛의 발현에 있어서 연령-관련 감소가 존재한다. [Nishimaru et al. (2004) J. Physiol. 559:849-862] 참조. Maxi-K 알파 및 베타 1 서브유닛의 발현 감소는 기저 긴장도 및 자극된 수축에 주요한 기능적 영향을 미친다. 노인의 경우, 관상 동맥은 반응성항진이며, 이러한 반응성항진은 갑작스럽고 강렬한 관상 동맥 연축을 유발할 수 있다. 따라서, Maxi-K 발현의 연령-의존적 감소와 관련된 평활근 기능장애(예를 들어, 관상 동맥의 긴장도 변화, 고혈압, 발기 부전, 불량한 방광 조절 등)는 Maxi-K 알파 서브유닛, Maxi-K 베타 서브유닛(예를 들어, 베타 1 서브유닛) 또는 둘 모두를 인코딩하는 핵산을 포함하는 본 개시의 Maxi-K 조성물로 치료될 수 있다.

[0341] 배뇨근 과다활동은 충전 단계 동안 자발적이거나 유발될 수 있는 불수의 배뇨근 수축을 특징으로 하는 요역학적 관찰로 정의된다. 배뇨근 과다활동은 특발성 배뇨근 과다활동 및 신경원성 배뇨근 과다활동으로 세분된다. 본 개시는 본 개시의 Maxi-K 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 특발성 배뇨근 과다활동 또는 신경원성 배뇨근 과다활동을 치료하는 방법을 제공한다.

[0342] 배뇨근 과다활동(DO)을 갖는 인간과 부분 요도 폐쇄(PUO)의 동물 모델 둘 모두에서 배뇨근 근세포 사이의 증가된 세포간 소통이 발생한다. 증가된 세포간 소통과 관련하여, 증가된 칼슘 신호전달의 영향은 잠재적으로 더 낮은 수준의 세포간 커플링을 갖는 정상 방광과 비교할 때 증가될 수 있다. 이 증가된 칼슘 신호전달은, 적어도 부분적으로, PUO 래트 모델에서 관찰된 "비-배뇨 수축"에 기여한다. 그러나, Maxi-K 채널 발현의 병렬 증가가 있다면(예를 들어, 본 개시의 조성물 또는 방법의 트랜스진을 인코딩하는 Maxi-K 채널의 과발현의 결과로서), 아마도 이들 트랜스펙션된 세포에 의해 발현되는 생성된 재조합 및/또는 또는 트랜스제닉 Maxi-K 채널은 비정상적으로 증가된 칼슘 신호를 "단락(short circuit)"시킬 수 있다. 이는 갭 접합부를 통한 추가 확산을 방지하고, 따라서 비정상적이고 증가된 칼슘 신호전달(예를 들어, 트랜스펙션되지 않은 근세포 동원에 의해)의 충분한 증가를 방지하여 비정상적인 수축 반응을 완화시킨다. 본 개시의 조성물 또는 방법의 트랜스진을 인코딩하는 Maxi-K 채널의 과발현에 의한 개별 세포 또는 세포 그룹에서 비정상적인 수축 반응의 감소는 DO, 임상적 상관 관계 또는 절박의 특징인 비-배뇨 수축을 제거하거나 개선시킨다.

[0343] 반대로, 배뇨 반응에서 척추 반사의 연루는 DO와 관련된 비정상적으로 증가하는 칼슘 신호전달을 훨씬 초과하는 조정된 배뇨근 수축을 일으키기 때문에, Maxi-K 트랜스진 과발현은 더 강력한 배뇨 수축 반응에 유의하거나 검출 가능한 영향을 주지 않으면서, DO에 기여하는 보다 약한 비정상적으로 증가하는 칼슘 신호를 효과적으로 감소 또는 억제할 수 있다(동물 모델에서 대조군 수준에 비해 IMP(배뇨간 압력) 또는 SA(자발적 전위)의 감소로 측정됨).

[0344] 발기 부전은 미국에서 1천만에서 3천만 명의 남성에게 영향을 미치는 것으로 추정되는 흔한 질병이다. 기존 요법은 해로운 부작용을 갖는다. 포스포디에스테라제 타입 5(PDE5) 억제제의 사용은 단지 60%의 성공률을 갖는다. 장치 및 수술 절차에 대해 $20,000를 초과하는 ED 비용을 처리하기 위한 외과적 임플란트. 또한, 기존 요법은 ED 환자에게 성교에 대한 계획을 요구한다.

[0345] 발기 부전의 주요 질병-관련 원인 중에는 노화, 죽상경화증, 만성 신장 질환, 당뇨병, 고혈압 및 항고혈압 약물, 골반 수술 및 방사선 요법, 및 심리적 불안이 있다. 발기 부전은 평활근의 불완전한 이완을 유발하는 다른 상태뿐만 아니라 신경원성, 동맥원성 및 정맥 폐쇄성 기능장애를 포함하는 다양한 장애로 인해 발생할 수 있다. 따라서, 본 개시의 방법은, 예를 들어, 이를 테면, 노화, 죽상 경화증, 만성 신장 질환, 당뇨병, 고혈압, 약물로부터의 부작용(예를 들어, 항고혈압 약물), 골반 수술, 방사선 요법 및 심리적 불안으로 구성된 군으로부터 선택되는 질병 또는 질환의 증상을 치료, 예방 또는 개선할 수 있으며, 여기서 상기 증상은 발기 부전이다.

[0346] 본 개시는 또한 대상체의 충분한 수의 음경 평활근 세포에서 Maxi-K 알파 서브유닛, Maxi-K 베타 서브유닛 또는 이들의 조합의 발현이 대상체에서 음경 발기를 유도할 때, 대상체의 음경 평활근 세포 내로 Maxi-K 알파 서브유닛, Maxi-K 베타 서브유닛 또는 이들의 조합을 인코딩하는 Maxi-K 폴리뉴클레오티드 서열을 도입하는 단계를 포함하는 대상체에서 음경 평활근 긴장도를 조절하는 방법을 제공한다. 이러한 양태에서, 본 개시의 방법은 발기 부전을 완화시키기 위해 사용된다.

[0347] 음경 이완은 대상체에서 음경 평활근의 고조된 수축성에 의해 야기될 수 있다. 이 상태는 대상체의 음경 평활근 세포에 본 개시의 Maxi-K 조성물을 도입함으로써 치료될 수 있다. Maxi-K 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 음경 평활근 세포에서 발현되어 음경 평활근 긴장도를 조절한다. 따라서, 음경 평활근 긴장도의 조절은 음경 평활근의 수축성을 덜 고조시킨다.

[0348] 일반적으로, 본 발명의 유전자 치료 방법이 사용될 수 있는 평활근 세포는 방광, 장, 폐의 기관지, 음경(해면체), 전립선, 요관, 요도(해면체), 요로 및 정관의 내장 평활근 세포뿐만 아니라 내골반 근막의 평활근 및/또는 골격근 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 청구된 유전자 치료 방법은 방광 평활근 세포, 결장 평활근 세포, 음경해면체 평활근 세포, 위장 평활근 세포, 전립선 평활근 및 요도 평활근에서 사용될 수 있다. 평활근 조직 및 다른 혈관 조직의 긴장도를 조절하는 인자의 많은 총체적 조직학적 및 생리학적 유사성을 고려할 때, 유사한 원리가, 예를 들어, 방광, 장, 폐의 기관지, 음경(해면체), 전립선, 요관, 요도(해면체), 요로 및 정관의 동맥 평활근 세포에 본 유전자 치료 방법의 적용을 허용하는 것은 당연한 일이다.

[0349] 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)은 또한, 예를 들어, 문헌[International Application PCT/US2018/032574, U.S. Patent Nos. 6,150,338, 6,239,117, 6,271,211, and 7,030,096, and U.S. Patent Appl. Publ. Nos. 2014/0088176 and 2016/0184455, 이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨]에 개시된 바와 같은 평활근 기능장애와 관련된 질병 및 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.

[0350] 본원에 개시된 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)은 또한, 예를 들어, 허혈 또는 뇌졸중(예를 들어, Herman et al. Biomolecules. 5 (3): 1870-911 (2015), The Neuroscientist. 7 (2): 166-77 (2001) 참조), 관상 동맥 혈류 감소, 고혈압 또는 체액 저류(Grimm et al. (2010) Kidney International 78:956-962) 또는 만성 통증(Review of Neurobiology. 128: 281-342 (2016))을 치료하는데 사용될 수 있다.

V. 약학적 조성물 및 전달 시스템

[0351] 본 개시는 또한 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)은 전달제, 예를 들어, 리피도이드, 리포좀, 리포플렉스, 지질 나노입자, 중합체 화합물, 펩티드, 단백질, 세포, 나노입자 모방 체, 나노튜브 또는 컨쥬게이트와 함께 투여될 수 있다. 일부 특정 양태에서, 전달제는 열가역성 하이드로겐, 예를 들어, RTGel™이다. 예를 들어, 미국 출원 번호 US20140142191, US20130046275 및 US20060057208(이들 모두는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다) 참조.

[0352] 약학적 조성물은 하나 이상의 활성 성분, 예를 들어, 본 개시의 하나 이상의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)뿐만 아니라 원하는 진단 결과 또는 치료 또는 예방 효과(예를 들어, 평활근 수축성을 증가 또는 감소)를 달성하기 위해 인간 환자에게 투여하기에 적합한 하나 이상의 부형제, 담체, 안정화제 또는 증량제를 함유하는 제형이다.

[0353] 저장 안정성 및 취급의 편의를 위해, 본 개시의 Maxi-K 조성물을 포함하는 약학적 조성물은 환자에게 투여하기 전에 염수 또는 물로 재구성될 수 있는 동결건조(즉, 냉동 건조) 또는 진공 건조된 분말로서 제형화될 수 있다. 대안적으로, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 포함하는 약학적 조성물은 수용액으로 제형화될 수 있다.

[0354] 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 포함하는 약학적 조성물은 단백질성 성분을 함유할 수 있다. 알부민 및 젤라틴과 같은 다양한 부형제는 약학적 조성물을 시도하고 안정화시키는데 상이한 성공 정도를 가지며 사용되어 왔다. 또한, 동결건조의 동결 조건하에서 변성을 감소시키기 위해 알콜과 같은 동결방지제가 제공되었다.

[0355] 내부 사용에 적합한 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 포함하는 약학적 조성물은 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리 식염수, 정균수 또는 포스페이트 완충 염수(PBS)를 포함한다.

[0356] 모든 경우에, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 포함하는 조성물은 멸균되어야 하고 용이한 주사 가능성이 존재할 정도로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건하에 안정적이어야 하고, 미생물, 예를 들어, 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 폴리소르베이트(Tween. TM.), 소듐 도데실 설페이트(소듐 라우릴 설페이트), 라우릴 디메틸 아민 옥사이드, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB), 폴리에톡실화된 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비탄, 옥톡시놀(Triton X100™), N,N-디메틸도데실아민-N-옥사이드, 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드(HTAB) 에테르, 폴리옥실 10 라우릴 에테르, Brij 721™, 담즙염(소듐 데옥시콜레이트, 소듐 콜레이트), 플루론산(F-68, F-127), 폴리옥실 피마자유(Cremophor™) 노닐페놀 에톡실레이트(TergitolTM), 사이클로덱스트린 및 에틸벤제토늄 클로라이드(Hymaine™)과 같은 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.

[0357] 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 조성물 내에 등장성 제제, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 소듐 클로라이드를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 내부 조성물의 연장된 흡수는 조성물 내에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 발생할 수 있다.

[0358] 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 포함하는 멸균 용액은 필요한 양의 활성 화합물을, 필요에 따라, 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합을 갖는 적절한 용매에 혼입시키고, 이어서 여과 멸균시킴에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법은 활성 성분의 분말 및 이의 이전의 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가적인 요망되는 성분을 수득하는 진공 건조 및 냉동-건조이다.

[0359] 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 포함하는 약학적 조성물은 용기, 팩 또는 디스펜서에 투여 설명서와 함께 포함될 수 있다.

[0360] 본 개시의 특정 Maxi-K 조성물은 또한 제형에 담체 화합물을 포함한다. 본원에서 사용되는 "담체 화합물" 또는 "담체"는 불활성(즉, 그 자체로 생물학적 활성을 갖지 않음)이지만, 예를 들어, 생물학적 활성 핵산을 분해하거나 순환으로부터 이의 제거를 촉진함으로써 생물학적 활성을 갖는 핵산의 생체이용률을 감소시키는 생체내 과정에 의해 핵산으로 인식되는 핵산 또는 이의 유사체를 지칭할 수 있다. 일반적으로 담체 화합물이 과량인 핵산과 담체 화합물의 공동-투여는, 아마도 공통 수용체에 대한 담체 화합물과 핵산의 경쟁으로 인해, 간, 신장 또는 다른 추가 순환 저장소에서 회수되는 핵산의 양을 실질적으로 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 간 조직에서 부분적으로 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 회수는 이것이 폴리이노신산, 덱스트란 설페이트, 폴리시티드산 또는 4-아세트아미도-4"이소티오시아노-스틸벤-2,2'디설폰산과 함께 (Miyao)과 함께 공동-투여될 때 감소될 수 있다(Miyao et al., Antisenses Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183).

[0361] 벡터(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)를 포함하는 본 개시의 Maxi-K 조성물의 경우, 벡터는 포유동물 환자, 특히 인간에게 투여하기 위해 약학적 조성물에 혼입될 수 있다. 벡터 또는 비리온은 바람직하게는 3 내지 8의 범위, 보다 바람직하게는 6 내지 8의 범위, 가장 바람직하게는 6.8 내지 7.2 범위의 pH에서 비독성, 불활성의 약학적으로 허용되는 수성 담체에서 제형화될 수 있다. 그러한 멸균 조성물은 재구성시 허용되는 pH를 갖는 수성 완충액에 용해된 Maxi-K 치료 분자를 인코딩하는 핵산을 함유하는 벡터를 포함할 것이다.

[0362] 일부 양태에서, 본원에 제공된 약학적 조성물은 치료적 유효량의 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터), 예를 들어, 벡터와 함께 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제, 예를 들어, 염수, 포스페이트 완충 염수, 포스페이트 및 아미노산, 중합체, 폴리올, 당, 완충액, 보존제 및 다른 단백질을 포함한다. 예시적인 아미노산, 중합체 및 당 등은 옥틸페녹시 폴리에톡시 에탄올 화합물, 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트 화합물, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 수크로스, 프럭토스, 덱스트로스, 말토스, 글루코스, 만니톨, 덱스트란, 소르비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 자일리톨, 락토스, 트레할로스, 소 또는 인간 혈청 알부민, 시트레이트, 아세테이트, 링거 및 행크 용액, 시스테인, 아르기닌, 카르니틴, 알라닌, 글리신, 리신, 발린, 류신, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 및 글리콜이다.

[0363] 일부 양태에서, 본원에 제공된 약학적 조성물은 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터) 및 완충액, 예를 들어, 포스페이트 완충 염수(PBS) 또는 소듐 포스페이트/소듐 설페이트, 트리스 완충액, 글리신 완충액, 멸균수 및 문헌[Good et al. (1966) Biochemistry 5:467]에 기재된 것과 같은 당업자에게 공지된 다른 완충액을 포함한다. 일부 양태에서, 약학적 조성물은 소듐 포스페이트, 소듐 클로라이드, 수크로스 또는 이들의 조합을 함유한다.

[0364] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 포함하는 약학적 조성물은 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 현탁액 점도를 증가시키는 물질을 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20%(v/v)와 같은 약 1-30%의 양으로 포함한다. 바람직하게는 수크로스는 약 10-30%(v/v)이고, 가장 바람직하게는 수크로스는 약 20%(v/v)이다.

[0365] 투여 전에 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 포함하는 약학적 조성물에는 제조 동안 사용되는 성분, 예를 들어, 배양 성분, 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 DNA, 플라스미드 DNA가 없고 마이코플라스마, 내독소 및 미생물 오염이 실질적으로 없다. 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 포함하는 약학적 조성물은 10, 5, 3, 2 또는 1 CFU/스왑(swab) 미만을 갖는다. 일부 양태에서, 약학적 조성물은 0 CFU/스왑을 갖는다. 약학적 조성물에서 내독소 수준은 20 EU/ml 미만, 10 EU/ml 미만 또는 5 EU/ml 미만일 수 있다.

[0366] 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물은 이를 필요로 하는 대상체로의 전신(예를 들어, 경구 또는 비경구) 또는 국소 투여에 적합한 나노입자에 캡슐화될 수 있다. 일부 양태에서, 나노입자는 사용자가 내부(예를 들어, 소수성, 전하) 및 외부(예를 들어, 표면 전하, 페길화) 특성 둘 모두를 화학적으로 조정할 수 있도록 하는 고유 가소성을 갖는 생체적합성 나노입자 플랫폼이다. 생체적합성 나노입자 플랫폼의 물질은 약 10 내지 약 99 나노미터(nm)의 평균 직경을 갖는 나노입자로 구성된 분말로 전환될 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)은 단지 나노입자의 성분과 회합되거나 나노입자 내에 캡슐화된다. 다른 양태에서, 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)은 나노입자의 성분, 예를 들어, 지질 분자에 컨쥬게이션된다.

[0367] 나노입자로 구성된 분말은 연장된 기간에 걸쳐 본 개시의 캡슐화된 Maxi-K 조성물의 특정 농도를 전달할 수 있다. 이 플랫폼은 생물활성 분자를 전신 및 국소적으로 전달할 수 있다. 유도된 염증 또는 독성의 징후는 관찰되지 않았다. 나노입자의 현저한 세포 흡수는 세포독성 없이 발생한다. 흡수 후, 나노입자는 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 방출한다.

[0368] 나노입자는 나노 플랫폼-테트라메톡시실란(TMOS)의 기본 빌딩 블록에 존재하는 네 번째 메톡시기 대신 네 번째 부위에 원하는 화학적 모이어티(예를 들어, 알킬 또는 아민기)를 갖는 도펀트 트리메톡시실란의 사용을 통해 내부 전하 및 소수성을 조작함으로써 광범위한 생물분자를 수용하도록 조정될 수 있다. 양전하를 갖는 실란(아민)과 접촉한 TMOS 입자가 플라스미드 캡슐화를 위해 고려된다.

[0369] 국소 전달은 표적 특이적 영향, 감소된 전신 독성, 처음 통과 대사의 회피, 다양한 투여 일정 및 다양한 환자 집단에 대한 확장된 유용성과 관련하여 다른 투여 경로(경구 또는 주사)에 비해 몇 가지 다른 이점을 제공한다. 화학적 침투 증강제는 표피 장벽(예를 들어, 막 각질 및 지질 이중층)을 교란시키기 위해 사용될 수 있다.

[0370] 방광의 요로상피는 외인성 분자의 통과를 방해하는 메커니즘을 진화시켰다. 결과적으로, 국소 방광 요법은 요로상피를 횡단하는 어려움을 회피하는 독특하고 유리한 일련의 생리학적 속성을 갖는다. 본원에 개시된 나노입자는 요로상피 장벽을 가로지르는 네이키드 DNA에 비해 증가된 효율을 나타내며, 이는 나노입자가 과활동성 방광(OAB) 증후군과 같은 방광 상태를 치료하는데 사용될 때 특히 유리한 특성이다.

V. 키트 및 제조 물품

[0371] 본 개시는 또한 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 포함하는 키트 및 제조 물품을 제공한다. 키트에 패키징된 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)은 이를 필요로 하는 대상체로의 Maxi-K 조성물의 적용을 용이하게 할 수 있다.

[0372] 일부 양태에서, 키트는 본 개시의 Maxi-K 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, DNA, RNA(예를 들어, mRNA) 또는 플라스미드(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)를 포함한다. 일부 양태에서, 키트는 바이러스 발현 벡터, 예를 들어, 아데노바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 다른 양태에서, 키트는 본 개시의 Maxi-K 조성물로 트랜스펙션된 세포를 포함한다.

[0373] 특정 양태에서, 키트는 (i) 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터) 또는 이들의 조합, 및 (ii) 사용 설명서를 포함한다. 설명서는 키트 삽입물에 인쇄되고, 하나 이상의 용기에 인쇄될 뿐만 아니라 사용자가 정보를 통합하고 제어 용량을 계산할 것을 허용하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체와 같은 전자 저장 매체로 제공되는 전자적으로 저장된 설명서를 비제한적으로 포함하는 임의의 원하는 형태일 수 있다.

[0374] 키트 및 제조 물품에 포함된 설명서는 패키징 재료에 부착되거나 패키지 삽입물로 포함될 수 있다. 설명서는 전형적으로 서면 또는 인쇄된 자료이지만 이에 제한되지 않는다. 그러한 설명을 저장하고 이를 최종 사용자에게 전달할 수 있는 임의의 매체가 고려된다. 그러한 매체는 전자 저장 매체(예를 들어, 자기 디스크, 테이프, 카트리지, 칩), 광학 매체(예를 들어, CD ROM) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 용어 "설명서"는 설명을 제공하는 인터넷 사이트의 주소를 포함할 수 있다.

[0375] 일부 양태에서, 키트는 하나 이상의 용기에 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 포함한다. 일부 양태에서, 키트는 본 개시의 Maxi-K 조성물을 갖는 바이알 또는 다른 용기, 주사기, 바늘, 대조군, 검정을 수행하기 위한 지침 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 투여하는데 필요하고/거나 충분한 모든 성분을 함유한다.

[0376] 당업자는 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)이 당업자에게 잘 알려진 확립된 키트 포맷 중 하나에 용이하게 혼입될 수 있음을 용이하게 인식할 것이다.

[0377] 한 특정 양태에서, 키트는 (a) 본원에 제공된 재조합 플라스미드, 예를 들어, pVAX-hSlo(도 8 참조) 및 (b) 치료적 유효량의 재조합 플라스미드를 세포 또는 개체에게 투여하기 위한 설명서를 포함한다. 일부 양태에서, 키트는 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 투여하기 위한 약학적으로 허용되는 염 또는 용액을 포함한다.

[0378] 선택적으로, 키트는 라벨 또는 별도 삽입물의 형태로 적합한 작업 파라미터에 대한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 의사 또는 실험실 기술자에게 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)의 용량을 제조하도록 알리는 표준 설명서를 가질 수 있다.

[0379] 선택적으로, 키트는 환자 샘플을 대조군 정보 표준과 비교하여 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)의 시험 양이 치료량인지를 결정할 수 있도록 하는 표준 또는 대조군 정보를 추가로 포함할 수 있다.

[0389] 선택적으로, 키트는 주사기, 필터 바늘, 연장 튜브, 캐뉼라 또는 이들의 임의의 조합과 같은 투여용 장치를 추가로 포함할 수 있다.

[0381] 일부 양태에서, 키트 또는 제조 물품은 다수의 바이알을 포함할 수 있으며, 이들 각각은 단일 용량의 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 함유한다. 다른 양태에서, 키트 또는 제조 물품은 하나 이상의 바이알을 포함할 수 있으며, 이들 각각은 1회 초과 용량의 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 포함한다.

[0382] 일부 양태에서, 제조 물품은 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)의 용액을 함유하는 백이다. 다른 양태에서, 제조 물품은 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 함유하는 병(예를 들어, 유리병 또는 플라스틱병)이다. 일부 양태에서, 제조 물품은 적절한 용매에서 재구성하기 위한 분말 형태로 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 함유하는 백이다. 다른 양태에서, 제조 물품은 적절한 용매에서 재구성하기 위한 분말 형태로 본 개시의 Maxi-K 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 49 또는 50의 pVAX-hSlo 벡터)을 함유하는 병이다.

실시예

실시예 1

HMAXI-K 유전자 전달에 대한 비임상 연구

래트 모델 연구

[0383] 래트 모델에서 부분 배뇨구 폐쇄의 병리생리학은 인간에서 관찰되는 상응하는 하부 요로 증상의 많은 관련된 양태를 요약한다. 언급된 생리학적 및 병리생리학적 유사성은 래트 방광에 대한 연구가 인간 방광 생리학 및 기능장애의 적어도 일부 양태에 대한 통찰력을 제공할 수 있다는 가정을 합리적으로 만들었다.

[0384] 래트 방광의 생리학이 인간 방광의 많은 양태와 유사하기 때문에, 연구는 부분 배뇨구 폐쇄의 래트 모델에서 방광 과다활동을 개선하기 위해 hSlo cDNA(즉, 맥시-K 채널 알파 서브유닛)를 사용한 방광 점적주입된 K 채널 유전자 요법의 잠재적 유용성을 조사하였다.

[0385] 한 연구에서, 22마리의 암컷 Sprague-Dawley 래트를 부분 요도(즉, 출구, PUO) 폐쇄에 노출시켰으며, 17마리의 sham-조작된 대조군 래트를 병렬로 진행시켰다. 6주의 폐쇄 후, 모든 래트에서 치골상 카테터를 방광의 돔에 외과적으로 배치하였다. 12마리의 폐쇄된 래트는 카테터 삽입 동안 1 m1 PBS-20% 수크로스 중 100 ug의 hSlo/pcDNA의 방광 점적주입을 수용하였고, 다른 10마리의 폐쇄된 래트는 1 ml PBS-20% 수크로스(7마리 래트) 또는 pcDNA만을 함유하는 1 ml PBS-20% 수크로스(3마리 래트)를 수용하였다. 수술 2일 후 모든 동물에서 방광내압측정을 수행하여 의식이 있는 긴장되지 않은 래트에서 배뇨 반사의 특성을 조사하였다. 폐쇄는 방광 중량의 3-4배 증가 및 사실상 모든 배뇨 파라미터 추정치의 변경과 관련이 있었다(표 3 참조).

[0386] PBS-20% 수크로스를 주사한 폐쇄된 래트는 일상적으로 배뇨 사이에 자발적인 방광 수축을 나타내었다. 대조적으로, hSlo 주사는 임의의 다른 방광내압측정 파라미터에 검출 가능한 영향을 주지 않으면서, 폐쇄-관련 방광 과다활동을 제거하였다. 아마도, 래트 방광에서 hSlo의 발현은 폐쇄된 동물에서 일반적으로 관찰되는 증가된 수축성을 기능적으로 길항하여 방광 과다활동을 개선시킨다.

[0387] 또 다른 연구에서는 폐쇄된 수컷 래트 모델에서 관찰된 배뇨간 압력 변동을 변경 및/또는 개선하는 hSlo 유전자 전달의 능력을 조사하였다. 이러한 연구를 위해 회음부 접근법을 사용하여 2주 동안 래트를 폐쇄하였다. 2주의 폐쇄 후, 방광내압측정 조사를 위해 래트에 카테터를 삽입하고 래트를 2개의 처리 그룹 중 하나에 배치하였다. 연령-매칭된 대조군 래트를 sham 폐쇄에 노출시키고 병렬로 진행시켰다.

[0388] 모든 실험 동물에서 배뇨 파라미터에 대한 평균 값이 표 4에 요약되어 있고, 이러한 발견의 두드러진 특징은 도 1A, 1B, 1C 및 1D 및 도 2A, 2B 및 2C에 그래프로 도시되어 있다. 중요하게는, 6주 폐쇄된 암컷 래트의 연구에서와 같이, 100 ug hSlo/pVX의 단일 방광내 점적주입은 주요 생리학적 관련성의 여러 배뇨 파라미터에서의 통계적으로 유의한 변화와 관련이 있었다.

[0389] 세 번째 연구는 암컷 래트에서 2주의 부분 요도 출구 폐쇄 후 hSlo 유전자 전달의 효과를 평가하였다. 부분 요도 출구 폐쇄(PUO)를 생성하기 위해, 전술한 바와 같이 체중이 200-250 g인 암컷 Sprague-Dawley 래트(Christ et al., 200l)의 요도에 묶음실을 배치하였다. 묶음실 배치 2주 후, 래트를 치골상 카테터 배치를 위해 수술하였다. 2일 후, 방광 기능 연구(즉, 방광내압측정)를 대사 케이지에서 의식이 있고 긴장되지 않은 래트에 대해 수행하였다. 표 5 및 도 3에 예시된 바와 같이, 2주의 부분 요도 출구 폐쇄 후 암컷 래트는 방광 용량의 2배 초과의 증가 및 유의한 자발성 방광 수축의 출현에 의해 입증되는 바와 같이, 방광 기능에 상당한 변화를 나타낸다. 증가된 자발적 방광 수축은 배뇨 사이의 압력 변동으로 관찰되었고(도 3 참조), SA 및 IMP 값에서 관찰되는 상응하는 증가에 의해 표 5에 나타낸 바와 같이 정량화되었다. 300 ug 및 1000 ug의 pVAX-hSlo(1ml PBS-20% 수크로스 중)의 단일 관내 방광 주사는 배뇨근 과다활동의 거의 완전한 제거를 초래하였다. 상기 효과는 pVAX 벡터만으로 처리된 래트와 비교했을 때 hSlo 처리되고 폐쇄된 래트에서 IMP 및 SA의 현저한 감소에 의해 반영된다(표 5 참조). HSlo 유전자 전달에 대한 진정한 DO 효과 관계는 이 모델에서 나타나지 않았지만, 상기 연구는 DO의 1-로그 단위 변동(100 내지 1000 ug)에 대해, 방광을 비우는 능력에 대한 임의의 검출 가능한 효과의 부재하에, DO의 통계적으로 유의하고, 더욱이 생리학적으로 관련성이 있는 감소가 존재함을 입증하였다. 즉, 상기 동물 모델에서, pVAX-hSlo는 방광 기능에 어떠한 해로운 영향도 미치지 않으면서 유출 폐쇄-관련 DO의 병리생리학적 효과를 개선할 수 있었다. 유사한 효과가 6주 폐쇄된 암컷 Sprague-Dawley 래트에서 100 ug pVAX-hSlo의 점적주입 후 관찰되었으며, 이는 아래에 제시된다.

표 3. 6주 폐쇄된 암컷 래트 및 sham-조작된 대조군에서 평균 배뇨 파라미터에 대한 처리 효과 요약

^a 200 μl PBS-20% 수크로스 중 100 μg pVAX-hSlo

^b 이들 중 3마리는 PBS-20% 수크로스 중 1000 μg pcDNA를 수용하였다. 대조군: sham 조작되고, 폐쇄되지 않은 연령-매칭된 대조군 동물, WT: 방광 중량 (mg), MP: 배뇨 압력 (cm H₂O), THP: 임계 압력 (cm H₂O), BP: 기저 압력 (cm H₂O), BC: 방광 용량 (ml), MV: 배뇨 부피 (ml), RV: 잔여 부피 (ml), MIP: 평균 배뇨간 압력 (cm H₂O; 전체 배뇨간 간격 동안 평균 압력에서 동일한 동물에 대한 기저 압력을 뺀 값).

* Sham-op와 유의하게 상이함; p<0.05.

** 대조군과 유의하게 상이함 (폐쇄되었으나 미처리됨); p<0.05, Newman Keuls 사후 쌍별 비교와 함께, 일원 ANOVA.

표 4. 2주 폐쇄된 수컷 래트 및 sham-조작된 대조군에서 평균 배뇨 파라미터에 대한 처리 효과 요약.

Bcap, 방광 용량 (ml); MV, 배뇨 부피 (ml); RV, 잔여 부피 (ml); BP, 기저 압력 (cm H₂O); TP, 임계 압력 (cm H₂O); MP, 배뇨 압력 (cm H₂O); IMP, 평균 배뇨간 압력 (cm H₂O; 전체 배뇨간 간격 동안 평균 압력에서 동일한 동물에 대한 기저 압력을 뺀 값); SA, 자발적 전위 (cm H₂O); Bcom, 방광 순응도 (ml/cm H₂O); BW, 방광 중량(mg).

^a 이들 동물 중 5마리는 2주 sham 대조군이고, 나머지 5마리는 1개월령(또는 6주 sham 대조군)이다. 그러나, 통계적 분석은 배뇨 파라미터 중 어느 것도 유의한 차이가 없었음을 나타내었고, 따라서, 상기 2개의 집단은 이 분석의 목적을 위해 동질적인 것으로 간주되었다.

^b 모든 처리된 래트에게 20% 수크로스를 갖는 1 ml PBS 중 1000 μg pVAX 단독 또는 100 μg hSlo/pVAX를 제공하였다. 모든 데이터는 평균 ± S.E.M을 나타내고, 모든 쌍별(다중) 비교에 대한 사후 Tukey 테스트와 함께 일원 분산 분석을 사용하여 분석되었다.

^c 상응하는 sham 대조군 값으로부터 유의한 차이.

^d 상응하는 pVAX 값으로부터 유의한 차이.

표 5. 2주 폐쇄된 암컷 래트에서 평균 배뇨 파라미터에 대한 처리 효과 요약

^a 200 μl PBS-20% 수크로스 중 10, 30, 300, 1000 μg pVAX-hSlo

^b 대조군: 1000 μg의 pVAX만을 수용한 폐쇄된 연령-매칭된 대조군 동물, WT: 방광 중량 (mg), MP: 배뇨 압력 (cm H₂O).

TP: 임계 압력 (cm H₂O), BP: 기저 압력 (cm H₂O), BC: 방광 용량 (ml), MV: 배뇨 부피 (ml), RV: 잔여 부피 (ml).

MIP: 평균 배뇨간 압력 (cm H₂O; 전체 배뇨간 간격 동안 평균 압력에서 동일한 동물에 대한 기저 압력을 뺀 값).

SA 자발적 전위 (MIP-BP); BCOM 방광 순응도 (방광 용량/TP-BP)

* 대조군과 유의한 차이; p<0.05. 모든 쌍별 다중 비교 절차 (Holm-Sidak 방법).

대조군과 유의한 차이; p<0.05, 일원 ANOVA.

토끼 모델 연구

[0390] 방광벽에 주사된 상이한 부피의 유전자 전달의 분포를 평가하기 위한 토끼 연구는 직접 방광내 주사를 사용하여 OAB를 갖는 여성에서 임상 시험을 시작하기 전에 수행되었다(표 6). 평균 6파운드 중량의 9마리의 암컷 성체 뉴질랜드 흰 토끼를 사용하였다. 동물을 마취시키고 pVAX-lacZ를 방광벽의 4, 8 및 10개 부위에 0.05, 0.1 및 0.15 ml 분취량으로 배뇨근에 주사하였다. 3마리 동물의 추가 세트에는 단지 최고 부피의 담체(4, 8, 또는 10개 부위 x 0.15 ml)만을 담체로 주사하였다. 플라스미드는 용액에서 4000 ug/ml의 농도였다. 1주일 후에 동물을 안락사시키고 방광을 절제하고 칭량하였다. 조직학적 검사 및 분자 분석을 위해 청색을 갖는 영역을 준비하였다. hSlo 발현 조직의 분자 분석은 RNA 추출 및 실시간 PCR로 수행되었다. 또한, 다양한 토끼 조직에 대해 조직병리학을 수행하였다.

[0391] 상기 동물 모델에서 직접 방광 주사의 어려움으로 인해, 단 한 마리의 토끼에게 0.05 ml 주사가 제공되었다. 6마리의 토끼는 4, 8 및 10개 부위(방광 내부에서 3; 방광 외부에서 3)에 0.1 ml를 가졌다. 3마리의 토끼는 4, 8 및 10개 부위에 0.15 ml를 가졌다. 결과는 주사 횟수가 더 많은 토끼(8-10회 주사)가 가장 적은 횟수의 주사(4회 주사)를 겪은 일부 동물보다 덜 발현되었음을 나타내었다. 전체적인 결론은 방광벽에 직접 주사하면 유전자가 발현되었다는 것이다; 그러나, 이것은 아마도 1 cm 떨어진 주사의 더 넓은 분산에서 가장 잘 작용하는 것처럼 보였다. 유전자는 처리 후 30분까지 혈액에서 검출되었다. 봉합사(토끼 모델의 일반적인 인공물)로 인해 육아종성 병변이 관찰되었다.

표 6. 토끼 방광내 주사 프로토콜

래트 모델의 독성학 및 조직병리학

[0392] OAB 적응증의 경우 인간 시험에서 사용된 것과 동일한 pVAX-hSlo의 방광내 투여의 동일한 경요도 경로를 래트에서 시뮬레이션하는 것이 기술적으로 불가능하였다. 따라서, pVAX-hSlo의 방광내 주사를 평가하는 독성학 및 생체분포 연구에서, 동물은 방광의 외과적 노출을 겪었고 연구 물질은 바늘을 사용하여 방광에 직접 주사되었다.

[0393] 혈액학적 및 화학적 파라미터에 대한 pVAX-hSlo의 효과는 15마리의 275-300 g 정상 암컷 Sprague-Dawley 래트에서 평가되었다. 외과적 노출 후 1000 ug의 pVAX-hSlo(8마리 동물) 또는 pVAX 벡터(7마리 동물)를 방광의 내강에 직접 주사하였다. 동물을 CO₂ 마취에 의해 시험 물질을 주사한지 4, 8 및 24시간 및 1주일 후에 안락사시킨 직후에 심장 스틱을 통해 혈액 샘플을 수집하였다. 샘플을 글루코스, 요소 질소, 크레아티닌, 총 단백질, 총 빌리루빈, 알칼리성 포스파타제, ALT, AST, 콜레스테롤, 소듐, 칼륨, 클로라이드, A/G 비율, BUN/크레아티닌 비율, 글로불린, 리파제, 아밀라제, 트리글리세리드, CPK, GTP, 마그네슘 및 삼투압에 대해 분석하였다. 실험실 파라미터는 4개 시점에서 pVAX-hSlo와 대조군 간에 유사하였다.

[0394] 암컷 Sprague-Dawley 래트(275 내지 300 gr)의 조직병리학에 대한 pVAX-hSlo의 효과를 2개 연구에서 평가하였다. 첫 번째 연구에서, 4마리의 래트가 부분 방광 폐쇄 수술을 받았으며, 2주 후 1,000 uL PBS-20% 수크로스 중 100 ug pVAX-hSlo를 방광의 외과적 노출과 함께 방광의 내강에 직접 투여하였다. 단일 동물을 pVAX-hSlo 주사 후 1, 8 및 24시간 및 1주일 후에 안락사시켰다.

[0395] 47개 기관의 조직을 즉시 10% 포르말린에 고정하고 일상적인 조직병리학적 검사를 위해 처리하였다. 조직병리학적 변화는 방광에서만 나타났으며 장막염, 부종, 출혈 및 섬유증으로 구성되었다. 이러한 변화는 부분 요도 폐쇄로 예상되는 변화와 일치하며 pVAX-hSlo의 주사와 관련이 없는 것으로 간주되었다.

[0396] pVAX-hSlo가 투여된 PUO 래트 방광의 조직병리학적 변화 때문에, 방광의 조직학에 대한 벡터(pVAX) 및 PBS-20% 수크로스에 비해 pVAX-hSlo의 효과가 정상 래트에서 평가되었다. 외과적 노출 후, 다음 시험 물질을 방광 내강에 직접 주사하였다: 1) 0.6 ml PBS-20% 수크로스, 2) 0.6 ml PBS-20% 수크로스 중 1,000 ug pVAX 또는 3) 0.6 ml PBS-20% 수크로스 중 1000 ug pVAX-hSlo. 동물을 점적주입 72시간 후에 CO₂로 안락사시키고 방광을 제거하고 즉시 10% 포르말린 용액에 고정시켰다. 72시간 시점은 방광벽에 대한 바늘 천자의 기계적 효과를 제한하고 pVAX-hSlo, 벡터 또는 희석제에 의해 야기될 수 있는 염증의 잠재적인 영향을 최소화하기 위해 선택되었다.

[0397] 방광 검사에 대한 총체적인 소견은 없었다. 전반적으로, pVAX-hSlo와 비히클 또는 pVAX 사이에는 처리-관련 차이가 없었다. 요로상피에서 처리와 관련된 변화는 관찰되지 않았다. 조직학적 검사에서 관찰된 병변은 이들이 분포에 있어서 분산 또는 다초점이라기보다 초점이었기 때문에 주사에 사용된 바늘의 외상과 일치하였다.

래트 모델에서의 생체분포

[0398] 생체분포 연구에서, 시험 물질은 275-300 g의 정상 암컷 Sprague-Dawley 래트의 노출된 방광의 내강에 직접 주사되었다. 0.6 ml의 PBS-20% 수크로스 중 1000 ug pVAX-hSlo를 12마리 동물에게 투여하고 0.6 ml PBS-20% 수크로스를 5마리 동물에게 투여하였다(도 4). 시험 물질을 주사한지 24시간, 1주일 및 1개월 후에 각각 4마리의 동물을 희생시켰다. 조직 샘플은 심장, 간, 뇌, 신장, 비장, 폐, 대동맥, 기관, 림프절, 눈, 이두근, 결장, 질 및 자궁과 같은 특정 순서로 수집되었다.

[0399] 검증된 QPCR 방법을 사용하여 카나마이신 유전자에 대해 게놈 DNA 샘플을 분석하였다. 결과는 1,000 ug pVAX-hSlo의 주사 후, 플라스미드가 대동맥, 자궁, 방광 및 요도에서 24시간 후에 검출될 수 있었음을 나타낸다. 1주에, 방광에서 약 1,300만 개 복사체/총 DNA ug가 측정되었고, pVAX-hSlo가 또한 이두근에서 약간 검출될 수 있었다. 결과는 도 4에 그래픽 형식으로 표시된다.

[0400] 이러한 결과는 해면체내 주사 후의 소견과는 달랐지만, 1,300만 개 복사체/총 DNA ug의 검출은 이러한 백신에 대한 임상 조사 신약(IND) 시험에서 60일 후에 DNA 백신 주사 부위에서 지속되는 <30개 복사체 플라스미드/10⁵ 숙주 세포보다 여전히 낮았다. 이러한 DNA 백신 연구는 근육내, 피하, 피내 또는 입자-매개 전달이 이소성 부위에서 플라스미드의 장기간 지속성을 초래하지 않았음을 입증하였다. 또한, 동물에서 외과적으로 노출된 방광에 pVAX-hSlo를 직접 주사하는 절차는 방광 이외의 조직에서 플라스미드를 검출하는 능력을 설명하였다. 인간에서, hMaxi-K는 경요도 카테터를 사용하여 방광에 직접 점적주입되었고, 조직 손상 또는 외상으로 인한 플라스미드 분포의 위험은 분명히 현저하게 감소되었다.

실시예 2

HMAXI-K 유전자 전달을 이용한 인간 임상 시험

시험 설계

[0401] 이는 특발성(비신경원성) 과활동성 방광 증후군(OAB) 및 배뇨근 과다활동(DO)을 갖는 여성 환자에서 방광벽에 직접 주사로 투여되는 증가하는 2회 용량의 hMaxi-K 알파 서브유닛 유전자(hSlo)의 안전성 및 잠재적 활성을 평가하는 1B 상 다기관 연구였다.

[0402] 연구 집단은 다른 곳은 건강이 양호하지만 과활동성 방광(OAB) 및 배뇨근 과다활동을 갖는 임신 가능성이 없는(예를 들어, 자궁절제술, 난관 결찰술 또는 연구 등록 > 12개월 전의 마지막 월경 주기로 정의된 폐경 후, 또는 혈청 FSH >40 mIU/L) 적어도 18세의 여성으로 구성되었다.

[0403] 포함 기준은 다음 중 적어도 하나를 포함하는 적어도 6개월 기간의 과활동성 방광의 임상 증상을 포함하였다:

1. 빈뇨 (적어도 8/24hrs)

2. 요절박(참기 어려운 갑작스럽고 강렬한 소변 배출 욕구에 대한 증상호소) 또는 야뇨증(배뇨를 위해 밤에 두 번 이상 깨는 증상호소)의 증상

3. 절박 요실금(주당 평균 5회 - 절박 요실금은 다음과 같이 정의된다: 절박을 동반하거나 절박 직전의 불수의 누출에 대한 증상호소)

[0404] 참가자들은 또한 스크리닝에서 200 ml 이하의 잔여 부피를 나타내는 방광 스캔과 기준선 요역학적 시험 동안 적어도 5 cm/H₂O의 배뇨근의 적어도 1회의 제어되지 않는 수축(들)으로 기록되는 배뇨근 과다활동을 가졌다.

[0405] 상기 연구의 주요 목적은 플라시보(PBS-20% 수크로스)와 비교하여 hMaxi-K의 약 20 내지 30회 방광벽 근육내 주사의 단일 치료에 대한 부작용의 발생 및 이들의 관계를 평가하는 것이었다. 이는 이중 맹검, 불균형 플라시보 대조된 순차적 투여 시험이었다. 참가자들은 다음 중 적어도 하나를 나타내는 적어도 6개월 지속되는 중등도 OAB/DO를 갖는 임신 가능성이 없는 18세 이상의 건강한 여성이었다: 하루에 빈뇨 적어도 8회, 요절박 또는 야뇨증의 증상(배뇨를 위해 밤에 두 번 이상 깨는 증상호소), 절박 요실금(주당 5회 이상의 요실금 에피소드) 및 CMG 상에 기록된 적어도 5 cm/H₂O 압력의 배뇨근의 적어도 1회의 제어되지 않는 위상 수축(들)을 갖는 배뇨근 과다활동. 모든 참가자들은 항콜린제를 사용한 사전 치료에 실패하였다. 4명은 오나보툴리눔 독소 A 요법에 실패하였다.

[0406] 참가자들은 2개의 용량(16,000 ug 또는 24,000 ug) 중 하나의 hMaxi-K 또는 플라시보에 무작위로 할당되었다. 방광경검사 동안 방광벽에 20-30회 IM 주사로 치료를 투여하였다. 참가자들은 18개월의 연구 추적으로 24주 기간 내에 8회 관찰되었다. 연구 약물 투여 후 발생하는 보고된 모든 부작용을 기록하였다. 복합 CMG는 스크리닝 방문 1A(-1주) 및 주사 후 4주(방문 5) 및 24주(방문 8)에 수행되었다. 방문할 때마다 BLADDERSCAN®으로 배뇨 후 잔여 부피(PVR)를 측정하였다.

[0407] 효능을 평가하기 위한 데이터는 처리 그룹(조합된 플라시보 vs. 2개의 활성 처리 그룹 및 조합된 플라시보 vs. 조합된 처리 그룹)에 의한 요약 기술 통계를 사용하여 평가되었다. 선형 혼합 효과 모델을 사용하여 플라시보와 활성 처리 사이의 기준선으로부터의 변화의 차이를 추정하고 다른 결과에 대한 용량 반응이 있는지 여부를 시험하였다. 이원 종말점에 대한 효과를 추정하기 위해 일반화된 추정 방정식(GEE) 모델을 사용하였다.

[0408] 16,000 ug를 수용한 6명의 참가자, 24,000 ug를 수용한 3명의 참가자 및 플라시보를 수용한 4명의 참가자가 있었다. 표 7 참조.

표 7. 최종 용량-hMaxi-k

참고: 각 용량 코호트에서 6명의 참가자는 hMaxi-K를 수용하였고 3명은 PBS-20% 수크로스(플라시보)를 수용할 것이다.

[0409] 표 8은 방문에 의해 수행된 치료 일정 및 절차의 개요를 보여준다.

표 8. 실험실 방문에 의한 시험 요약

^a ECG는 연구 약물의 투여 전 및 투여 2시간 후에 수행되었다.

^b 방광내압측정은 다음을 포함하였다: 배뇨에 대한 첫 번째 욕구의 부피, 배뇨근 압력, 복압, 배뇨 시작시 배뇨근 압력, 최대 유량에서의 배뇨근 압력, 최대 배뇨근 압력, 배뇨에 대한 강한 절박의 부피, 배뇨 중 최대 유량, 배뇨된 부피, DO에서의 부피, 배뇨 후 잔여 부피, 총 방광 부피(배뇨된 부피 + 잔여 부피), 절차 및 DO 기간 동안 배뇨근 수축 수.

^c 포함 기준은 잔여 부피 ≤200 ml를 지정한다. V1 및 V8에서 방광 스캔은 카테터 삽입 전에 수행되었다.

^d V 1, 3-5 및 V7 및 V8에서 현미경 RBC 및 WBC, 단백질, 글루코스, 니트라이트, pH 및 비중을 사용한 소변검사. V1A 및 V2에서, 딥스틱에 의한 소변검사가 수행되었다. V1(요역학적 카테터를 사용한 카테터 삽입에 의해), V3(깨끗한 배뇨)에서 소변 배양; V1A, V2, V5 및 V8에서 방광내압측정 또는 방광경검사 전(요역학적 카테터를 사용한 카테터 삽입에 의해) 및 깨끗한 배뇨로 배출 전(V2에서 약물 투여 후 처음으로 배뇨된 소변 사용). 딥스틱에 의한 방문 2 소변검사는 투여 전에 수행되었고 소변 배양은 연구 약물 투여 전 및 배출 전 둘 모두에 수행되었다.

^e Lab 시험은 V1, V2-5, V7 및 V8에서 수행되었으며 다음을 포함하였다: 혈액학-차등, 혈소판 수, 침강 속도, PTT, PT(V2 및 V4에서 PT 및 PTT 없음), CRP, 항핵 항체를 이용한 CBC; 화학-BUN, 크레아티닌, Na⁺, K⁺, Mg⁺⁺, Ca⁺⁺, CO₂, Cl^-, 알부민, 알칼리성 포스파타제, ALT, AST, GGT, 총 빌리루빈, 총 단백질, CPK, LDH, 글루코스); 베타-HCG에 대한 혈청 임신 검사는 스크리닝 V1에서 그리고 필요에 따라 자궁절제술을 받지 않은 가임기 여성에게 요구되었다. 또한, 연구 등록 전 마지막 생리 주기가 12개월을 초과하지 않는 경우 FSH> 40 IU/L. HbA1c는 스크리닝 방문 1에서만 수행되었다. 2(0주)에는 어떠한 화학도 수행되지 않았다. V4에서, 화학은 BUN, 크레아티닌, 전해질(Na⁺, K⁺), CRP, 글루코스 및 ANA만을 포함하였다. 방문 1A 또는 V6에서 Lab 시험이 수행되지 않았다. Lab 시험은 모든 연구 방문에서 같은 시간에 수행되었다.

^f 시험 또는 절차는 방문 2에서 연구 약물의 투여 전에 수행되었다.

^g V2에서 투여 전. 표본이 24주에 여전히 양성이면, 참가자는 2개의 연속적인 표본이 hSlo DNA에 대해 음성일 때까지 매달 돌려보냈다.

^h 활력 징후는 V1에서만 신장; V1 및 V8에서 체중; 모든 방문에서 구강 체온(V1A 제외)을 포함하였다. 모든 BP 측정에 동일한 아암이 사용되고 지정되었다.

ⁱ V1A 전(준수 및 포함 기준에 대한 시험을 위해), 방문 2 이전 7일 동안 및 그 후 각 방문 전 7일 동안 일지를 완료하였다.

^j 참가자들은 부작용의 평가를 위해 연구 1일 및 3일(방문 2에서 약물 투여 후 1일 및 3일±1)에 전화로 연락하였다.

^k 주관적인 평가는 "당신의 방광 문제를 얼마나 성가시게 생각하십니까?" 및 "치료가 당신에게 유익했습니까?"라는 질문에 기초하였다.

^l 연구 약물 투여 후 2시간 동안 15분마다 BP를 측정하였다.

^m 참가자들은 방문 1A & 2(V1 스크리닝 후 V1A인 경우) 이전 3일 동안 및 모든 후속 방문(방문 3 내지 방문 8) 전 3일 동안 착용한 패드/기저귀를 가져왔다; 기준선으로 사용하기 위해 깨끗한 패드/기저귀도 가져왔다.

ⁿ 방문 1A는 일부 경우에 V1과 같은 날에 발생하였다. 이 경우에 V1에서 아직 완료되지 않은 모든 V1A 절차가 완료되었다. 모든 다른 V1 절차 후 방광경검사를 수행하고 방광경검사 후 소변 배양을 깨끗한 배뇨를 사용하여 수득하였다. V1A가 V1와 동시에 일어나면, V1 이전에 패드 수집 및 일지가 완료되지 않았으므로, V2에서 준수 여부를 확인하였다.

^o ECG는 연구 투여 전에 수행되었다.

[0410] 두 활성 처리 그룹에서, 대부분의 부작용(AE)은 중증도가 경미했으며 모두 연구 약물과 관련이 없는 것으로 간주되었다. 2명의 여성이 hMaxi-K로 치료 후 경미한 관련이 없는 UTI를 가졌다; 1명은 투여 1개월 후에 24,000 ug를, 다른 1명은 투여 6개월 후에 16,000 ug를 수용하였다. 16,000 ug 그룹에서 보고된 관련이 없는 심각한 AE가 하나 있었다; ER 방문이 필요하고 천식 치료를 받은 후 해결된 추운 날씨로 인한 기존 천식의 악화. AE로 인해 중단한 대상체는 없었으며 등록된 모든 대상체가 6개월 시험을 완료하였다. 또한, 18개월의 장기간 연구 후 안전성 추적 동안, 지금까지 추적된 대상체에서 문제는 보고되지 않았다(13명 중 9명이 18개월 추적을 완료하였고; 13명 중 13명이 12개월 추적을 완료하였다).

[0411] 각 방문 전 7일 동안 수집된 일지 데이터의 평균은 6개월의 시험 동안 일일 평균 배뇨 횟수 및 일일 평균 절박 에피소드 수의 지속적인 감소와 함께 플라시보 및 기준선에 비해 통계적으로 유의한(p<0.05) 개선을 나타내었다. 하기 표 9 및 표 10에 표시된 변화는 플라시보와 비교하여 기준선으로부터 평균 변화(+/- SE)였다.

표 9: 평균 배뇨 횟수/24시간 및 시간 경과에 따른 감소 - 효능 집단

[1]: 특정 시점에서 측정된 값과 특정 치료에 대한 기준선 측정 사이에 통계적으로 유의한 차이가 있는지 여부를 시험하기 위한 p-값.

[2]: 플라시보와 비교하여 기준선으로부터의 변화 간에 통계적으로 유의한 차이가 있는지 여부를 시험하기 위한 p-값.

모든 p-값 및 추정치는 종속 변수로서 배뇨 횟수, 치료(플라시보, 16000 ug, 24000 ug 및 총 hMaxi-K), 시점 및 시간과 치료의 상호작용을 갖는 선형 혼합 효과 모델로부터 유래되었다. 모든 용량 = 모든 hMaxi-K 용량.

SD = 표준 편차; SEM = 평균의 표준 오차.

표 10: 평균 절박 에피소드 수/24시간 및 시간 경과에 따른 감소 - 효능 집단

모든 p-값 및 추정치는 종속 변수로서 배뇨 횟수, 치료(플라시보, 16000 ug, 24000 ug 및 총 hMaxi-K), 시점 및 시간과 치료의 상호작용을 갖는 선형 혼합 효과 모델로부터 유래되었다.

모든 용량 = 모든 hMaxi-K 용량.

SD = 표준 편차; SEM = 평균의 표준 오차.

[0412] 삶의 질 파라미터(킹스 건강 설문지)는 삶에 미치는 영향, 역할 제한, 신체적 제한, 사회적 제한 및 수면 에너지의 도메인에서 플라시보에 비해 그리고 기준선에 비해 개별 활성 치료 및 조합된 활성 치료 그룹(모든 용량)에 대한 통계적으로 유의한 지속적인 평균 변화를 보여주었다.

[0413] 상기 1B 상 임상 시험의 결과는 6개월 시험 기간 동안 지속된 hMaxi-K의 단일 투여 후 배뇨 및 절박 에피소드 수의 현저한 감소를 보여주었다. 이러한 결과는 PVR 및 치료 관련 심각한 부작용의 변화가 없는 상태에서 관찰되었다. 상기 새로운 임상 시험의 결과는 인간 Maxi-K 유전자의 단일 배뇨근내 투여가 안전하다는 것을 처음으로 보여주었다.

[0414] 등록된 집단이 작았음에도 불구하고, 참가자 일지의 전체 결과는 플라시보에 비해 그리고 모든 활성 치료에 대한 기준선에 비해 평균 배뇨 횟수 및 평균 절박 에피소드 수, 및 모든 용량의 연구 약물에 대한 기준선에 비해 절박 요실금 에피소드 수의 현저한 감소(p<0.05)를 보여주었다. 치료에 대한 참가자의 반응은 방문 3 및 5에서 모든 플라시보에 비해 모든 활성 용량에 대해 일부 양성 p 값을 나타내었다(표 11 참조).

표 11: 절박 요실금 에피소드 수 및 시간 경과에 따른 감소 - 효능 집단

모든 용량 = 모든 hMaxi-K 용량

SD = 표준 편차; SEM = 평균의 표준 오차

[0415] 배뇨 및 절박 에피소드 수의 감소에 대해, 플라시보 및 기준선에 비해 이러한 유의한 변화는 최종 방문 8(24주)까지의 모든 방문에서 관찰되었다. 아마도 24,000 ug 그룹(N=3)에 등록된 적은 수의 참가자로 인해 2개의 활성 치료(16,000 ug 및 24,000 ug) 사이에 유의한 차이가 보이지 않았다.

[0416] 삶의 질 파라미터(킹스 건강 설문지)는 플라시보 및 많은 도메인의 기준선에 비해 개별 활성 치료 및 조합된 활성 치료 그룹(모든 용량)에 대해 통계적으로 유의한 평균 개선을 나타내었다. 여기에는 다음이 포함되었다:

● 도메인 2: 삶에 미치는 영향

o 기준선에 비해 모든 활성 용량에 대해 P=0.014 및 방문 5의 24000 ug에 대해 p=0.007,

o 플라시보에 비해 방문 5의 24000 ug에 대해 P=0.016;

o 방문 5의 16000 ug 그룹에 비해 24000 ug 그룹에 대해 P=0.016

o 방문 6의 기준선에 비해 모든 활성 용량에 대해 P=0.043

o 방문 7의 기준선에 비해 16000 ug에 대해 P=0.010 및 모든 활성 용량에 대해 p=0.005

o 방문 8의 기준선에 비해 모든 활성 용량에 대해 P=0.026

● 도메인 3: 역할 제한

o 방문 5의 기준선에 비해 16000 ug, 24000 ug 및 모든 활성 용량에 대해 각각 P=0.004, P=0.015, P<0.001

o 방문 5의 플라시보에 비해 16000 ug, 24000 ug 및 모든 활성 용량에 대해 각각 P=0.030, P=0.035 및 P=0.015

o 방문 6의 기준선에 비해 16000 ug, 24000 ug 및 모든 활성 용량에 대해 각각 P=0.023, P=0.014 및 P=0.001

o 방문 6의 플라시보에 비해 16000 ug, 24000 ug 및 모든 활성 용량에 대해 각각 P=0.047, P=0.020 및 P=0.014

o 방문 7의 플라시보에 비해 16000 ug, 24000 ug 및 모든 활성 용량에 대해 각각 P=0.012, P=0.014 및 P<0.001

o 방문 7의 플라시보에 비해 24000 ug 및 모든 활성 용량에 대해 각각 P=0.032 및 P=0.021

o 방문 8의 기준선에 비해 24000 ug 및 모든 활성 용량에 대해 각각 P=0.014 및 P=0.005

o 방문 8의 플라시보에 비해 16000 ug, 24000 ug 및 모든 활성 용량에 대해 각각 P=0.047, P=0.007 및 P=0.007

● 도메인 4: 신체적 제한

o 방문 6의 기준선에 비해 24000 ug 및 모든 활성 용량에 대해 각각 P=0.018 및 P=0.005

o 방문 7의 기준선에 비해 16000 ug, 24000 ug 및 모든 활성 용량에 대해 각각 P=0.012, P=0.018 및 P=0.001

o 방문 8의 기준선에 비해 16000 ug, 24000 ug 및 모든 활성 용량에 대해 각각 P=0.012, P=0.047 및 P=0.003

● 도메인 5: 사회적 제한

o 방문 6에서 기준선 및 플라시보에 비해 24000 ug에 대해 각각 P=0.032 및 P=0.22

o 방문 7의 기준선에 비해 24000 ug 및 모든 활성 용량에 대해 각각 P=0.002 및 P=0.004

o 방문 7의 플라시보에 비해 24000 ug 및 모든 활성 용량에 대해 각각 P=0.008 및 P=0.043

o 방문 8의 기준선에 비해 24000 ug 및 모든 활성 용량에 대해 각각 P=0.002 및 P=0.014

o 방문 8의 플라시보에 비해 24000 ug에 대해 P=0.006

● 도메인 8: 수면 에너지

o 방문 5의 기준선에 비해 16000 ug, 24000 ug 및 모든 활성 용량에 대해 각각 P=0.047, P=0.007 및 P =0.001

o 방문 5의 플라시보에 비해 24000 ug 및 모든 활성 용량에 대해 각각 P=0.020 및 P=0.015

o 방문 6의 기준선에 비해 24000 ug 및 모든 활성 용량에 대해 각각 P=0.005 및 P=0.006

o 방문 7의 기준선에 비해 24000 ug 및 모든 활성 용량에 대해 각각 P=0.001 및 P=0.006

o 방문 7의 플라시보에 비해 24000 ug에 대해 P=0.012

[0417] 72시간 패드 시험(표 12)은 기준선에 비해 hMaxi-K 활성 용량에 대해 방문 3-6 및 방문 8에서 통계적으로 유의한 변화를 나타내었으나, 방문 3-5 및 방문 8에서 플라시보에 대해서도 통계적으로 유의한 변화가 있었다. 전반적으로, 플라시보 그룹은 활성 치료를 위한 기준선(V2) 패드 중량이 플라시보 그룹보다 거의 2배 더 큰 활성 치료 그룹보다 덜 중증인 질병을 갖는 것으로 나타났다. 또한, 플라시보에 대한 VIA 평균 패드 중량은 29 g에 불과한 반면, 이 그룹의 V2에서의 중량은 259 g이었다(VIA보다 거의 9배 더 큼). 이것은 참가자 002-001이 VIA 이전에 그녀의 패드를 버렸다는 사실 때문이고(따라서 그녀는 VIA 수단에 포함되지 않았음) 그녀는 다른 3명의 플라시보 참가자보다 더 중증의 질병을 가졌던 것으로 보인다(V2에서 그녀의 3일 평균 패드 중량은 295그램이었고 다른 3명의 참가자의 경우 3.3 내지 36그램이었다).

표 12: 치료에 대한 반응에 대한 참가자 지각 - 효능 집단

참고: p-값은 명목상이었고, 이는 치료에 대한 반응의 지각이 치료를 받은 환자와 플라시보를 받은 환자의 경우에 달랐는지 확인하기 위한 카이-제곱 테스트에 대한 것이었다.

모든 용량 = 모든 hMaxi-K 용량

표 13: 24시간당 평균 절박 요실금 에피소드 수의 변화 - 효능 집단

[3]: 24000 ug 그룹과 16000 ug 그룹 사이에 차이가 있는지 여부를 시험하기 위한 p-값.

Ss 모든 p-값 및 추정치는 종속 변수로서 24시간당 절박 요실금 에피소드 수, 치료(플라시보, 16000 ug, 24000 ug 및 총 hMaxi-K), 시점 및 시간과 치료의 상호작용을 갖는 선형 혼합 효과 모델로부터 유래되었다.

표 14: 72시간 패드 시험의 중량(gm) 변화 - 안전성 집단

[3]: 결과가 데이터베이스에 잘못 입력된 대상체 002019에 대한 값 0을 포함하였다. 현장 및 CRA에 의해 검증된 결과.

모든 p-값 및 추정치는 종속 변수로서 72시간 패드 시험의 중량, 치료(플라시보, 16000 ug, 24000 ug 및 총 hMaxi-K), 시점 및 시간과 치료의 상호작용을 갖는 선형 혼합 효과 모델로부터 유래되었다.

모든 용량 = 모든 hMaxi-K 용량 SD = 표준 편차

실시예 3

일반적인 방법

[0418] 방광 과다활동의 동물 모델: 상응하는 인간 상태의 모든 측면을 완전히 요약하는 동물 모델은 없지만, 래트(본원에서 제안된 동일한 동물 모델)에서 배뇨근 과다활동(DO)을 유발하는 부분 요도 폐쇄(PUO) 모델이 일반적으로 동료 검토 문헌과 NIH에 의해 승인되었다. 더욱이, 상기 동물 모델은 FDA에 의해 OAB 적응증에 대한 Maxi-K 치료를 위한 성공적인 IND 적용을 지원하기 위해 ICI에 의해 사용되었다. (Melman et al. Isr. Med. Assoc. J. 2007; 9: 143-146; Andersson J. Urol. 2013; 189: 1622-1623; Chang et al. Am. J. Physiol Renal Physiol 2010; 298: F1416-F1423; Christ et al. BJU, 2006, pp 1076-1083; Jin et al. Am. J. Physiol Regul. Integr. Comp Physiol 2011; 301: R896-R904; Melman et al. Urology 2005; 66: 1127-1133; Melman et al. BJU. Int. 2009; 104: 1292-1300).

[0419] 암컷 Sprague-Dawley (250g) 래트를 상기 연구에 사용하였다. PUO는 전술한 바와 같이 유도될 것이다(Thorneloe et al. Am. J. Physiol Renal Physiol 2005; 289: F604-F610). 간단히 말해서, 요도를 분리하고, 직경 0.91 mm의 멸균 금속 막대를 요도 표면에 배치하고, 요도와 막대 둘 모두의 주위에 3-0 실크 봉합사를 묶었다. 봉합사가 고정되었을 때, 막대를 제거하여, 부분적으로 폐쇄된 요도를 남겼다. 이후 복근 층과 피부를 닫았다. 대조군(sham)은 요도 주위를 봉합사로 묶는 것을 제외하고는, 동일한 수술 절차를 거쳤다.

[0420] 치골상 방광 카테터 삽입: PUO 절차 2주 후 모든 래트에 대해 두 번째 수술 절차를 수행하였다. 하복부 및 회음부 중간선 절개를 하고, 방광을 노출시키고, 폐쇄용 요도 실크 봉합사를 제거하고, 방광 돔에 작은 절개를 내고, 커핑된 폴리에틸렌 캐뉼라를 방광에 삽입하고, 주머니끈 봉합사로 고정시켰다. 이후 캐뉼라를 피하 공간을 통해 터널링하고, 동물의 목 뒤쪽에 있는 절개를 통해 빼 내고, 닫고, 봉합사로 고정시켰다. 감염을 예방하기 위해, 모든 래트에게 설파독신(24 mg/kg) 및 트리메토프림(4.8 mg/kg)을 피하 주사하였다.

[0421] 방광내압측정: 방광 카테터 삽입 및 요도 폐쇄 제거(기준선 측정) 48시간 후, 및 나노입자로 방광내 처리 48시간 후에 억제되지 않은 래트에서 방광내압측정 연구를 수행하였다. 방광내압측정은 이전에 기술된 바와 같이 수행되었다(Suadicani et al. BJU Int 2009; 103: 1686-93; Christ et al. BJU, 2006, pp 1076-1083; Melman et al. BJU. Int. 2009; 104: 1292-1300). 간단히 말해서, 동물을 대사 챔버에 배치하고, 유치 방광 카테터를 양방향 밸브에 연결하고, 압력 변환기 및 주입 펌프에 부착하였다. 압력 변환기는 변환기 증폭기(ETH 400 CB Sciences)를 통해 데이터 수집 보드(MacLab/8e, ADI Instruments)에 연결되었다. 압력 측정의 실시간 표시 및 기록은 Macintosh 컴퓨터(MacLab software, version 3.4, ADI Instruments)에서 수행되었다. 압력 변환기는 각 실험 전에 보정되었다(cmH₂O로). 방광 주입 속도는 프로그래밍 가능한 하버드 주입 펌프(모델 PHD 2000)를 사용하여 1.5 mL/분으로 설정되었다. 방광내압측정 활성은 첫 번째 배뇨 후와 후속하여 적어도 10회의 추가로 재현 가능한 배뇨 주기 동안 연속적으로 기록되었다; 배뇨가 약 20분 간격으로 발생함에 따라, 각 동물로부터 적어도 1.5시간의 데이터가 기록되었다. 이후 관련 요역학적 파라미터를 이전에 기술된 바와 같이(Suadicani et al. BJU Int 2009; 103: 1686-93; Christ et al. BJU, 2006, pp 1076-1083; Melman et al. BJU. Int. 2009; 104: 1292-1300) 각 방광내압곡선(아래 세부사항 참조)으로부터 오프라인으로 정량화하였다.

[0422] 네이키드 플라스미드 및 나노입자 캡슐화 플라스미드의 방광내 투여: 방광내압측정 평가(기준선 측정의 획득) 1시간 후, 동물을 이소플루란으로 마취시키고, 골반 영역을 마사지하여 방광을 비우고, 네이키드 플라스미드 또는 나노입자 캡슐화 플라스미드를 방광 유치 카테터를 통해 방광 내강에 주사하였다. 플라스미드 및 나노입자를 멸균 0.9% 염수로 재구성하고, 200 uL의 원하는 농도를 주사한 다음, 50 μL 카테터 "데드스페이스"를 설명하기 위해 100 μL의 염수만을 주사하였다.

[0423] 방광 기능의 평가: 방광 기능은 다음의 요역학적 파라미터에 기초하여 평가되었다: 1) 방광 용량, 배뇨시 주입된 염수의 부피; 2) 기저 압력, 배뇨 사이의 방광내압측정 동안 기록된 최저 방광 압력; 3) 임계 압력, 배뇨 직전 방광 압력; 4) 배뇨 압력, 배뇨 중 최대 방광 압력; 5) 배뇨 부피, 배뇨 중에 배출되는 소변의 부피; 6) 잔여 부피, 주입된 염수의 부피에서 각 배뇨에 대한 배뇨 부피를 뺀 값; 및 7) 자발적 전위(SA)=평균 배뇨간 압력(IMP) - 평균 기저 압력(BP), 배뇨 사이의 자발적 방광 수축의 대략적인 지수. IMP는 배뇨 사이에 기록된 평균 압력이다. BP의 평균 값을 평균 IMP에서 빼서 연구 동안 6 내지 8회 배뇨의 단일 SA를 얻었다. 이와 같이, SA는, 존재하는 경우, 기록된 배뇨 반사 간의 방광 압력 변동의 지표, DO의 척도, 및 요절박과 유전자 전달에 대한 반응 척도의 추정적 임상 상관 관계로 사용되었다(Babaoglu et al. Int Urol. Nephrol. 2013; 45:1001-1008; Andersson J. Urol. 2013; 189: 1622-1623)

[0424] hSlo 및 hSlo T352S를 사용한 치료에 의해 유도된 배뇨근 기능 변화의 생체외 평가: 예비 데이터에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 배뇨근 수축성 및 흥분성에 대한 효과를 기관 욕 및 전기생리학(패치 클램핑)에 의해 결정하였다(도 13H 참조). 이러한 평가를 수행하기 위해, 방광내압측정 후, 방광을 수확하고 돔에서 목까지 반으로 절단한다. 절반을 기관 욕 연구에 사용된 스트립으로 더 절단하였고, 나머지 절반을 전기생리학적 연구를 위해 배뇨근 평활근 세포를 분리하는데 사용하였다.

[0425] 기관 욕: 방광 스트립을 1.0 g의 휴지 장력으로 기관 욕에 장착하고, 전술한 바와 같이 힘 변환기를 사용하여 자발적인 위상 수축을 기록하였다(Wang et al. Int J Urol 2014; 21:1059-1064). 도 13E 및 도 13F 참조.

[0426] Maxi-K 채널 차단제인 이베리오톡신(IBTX; 300 nM)의 부재 및 존재하에 실험을 수행하여, 배뇨근 자발적 전위의 발달에 대한 Maxi-K 채널 활성의 상대적 기여도를 평가하였다.

[0427] 전기생리학: 배뇨근 흥분성의 변화에 대한 Maxi-K의 전체적인 기여도를 결정하기 위해 IBTX의 부재 및 존재하에, 배뇨근 평활근 세포(SMC)를 분리하고, 단일 세포 패치-클램핑 기록을 이전에 기재된 바와 같이 수행할 것이다(Davies et al. Eur. Urol. 2007; 52: 1229-1237; Wang et al. Am J Physiol Cell Physiol 2001; 281: C75-88; Wang et al. Int J Impot Res 2000; 12: 9-18).

실시예 4

T352S 인간 BKA 작제물의 생성

(PVAX-HSLO-T352S)

[0428] hSlo 유전자의 변형은, 예를 들어, 연령 및 질병에 의한 BK 채널의 변화에 의해 야기되는 인간 질병을 효과적으로 치료하는데 사용될 수 있다. 인간 BKα 채널(hslo) cDNA를 pVAX에 서브클로닝하여 pVAX-hSlo를 생성하였다. T352S 인간 BKα 작제물(pVAX-hSlo-T352S)은 제조업체의 지침에 따라 QuickChange II 부위-지정 돌연변이유발 키트(Agilent Technologies, Inc.)를 사용하여 pVAX-hSlo로부터 제조되었다. T352S 돌연변이에 사용된 프라이머는 다음과 같았다: 5'-ATGGTCACAATGTCCTCCGTTGGTTATGGGGAT-3' (SEQ ID NO: 12) 및 5'-ATCCCCATAACCAACGGAGGACATTGTGACCAT-3' (SEQ ID NO: 13). T352S 돌연변이는 DNA 시퀀싱에 의해 검증되었다. HEK293 세포의 일시적인 트랜스펙션은 제조업체의 지침에 따라 FuGENE® 6(Roche)로 수행되었다. HEK 세포는 다음 조건하에 전기생리학적 패치 클램프 분석으로 연구되었다: 전류는 실온에서 전체-세포 패치-클램프로 기록되었다. 보로실리케이트 유리 전극은 내부 용액으로 채워졌을 때 4 내지 20 MΩ의 팁 저항을 가졌다. 세포외 용액은 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 2.3 mM NaOH, 5 mM HEPES 및 10 mM 덱스트로스(NaOH로 pH 7.4)로 구성되었다. 내부 용액은 120 mM K-아스파르테이트, 3 mM Na2ATP, 5 mM HEPES 및 5 mM EGTA(KOH로 pH 7.2)를 함유하였다. 전류는 -60 mV에서 +110 mV까지 10 mV 증분의 200 ms 기간 시험 펄스를 가지며 -80 mV의 유지 전위로 유도되었다.

[0429] Clampfit™(Molecular Devices, Sunnyvale, Calif., USA) 및 GraphPad™ Prism™(GraphPad Software, San Diego, Calif., USA)를 데이터 분석에 사용하였다. 데이터는 평균±SEM으로 표시된다. 이원 ANOVA(그룹 간 비교) 또는 스튜던트 t-테스트(개별 전압 단계 비교)에 의한 P<0.05는 통계적 유의성을 나타내는 것으로 간주되었다.

[0430] T352S 부위-지정 돌연변이유발의 결과는 도 10에 표시된 대로 전압-의존적 활성화 곡선에서 왼쪽으로 이동하는 것을 보여준다.

[0431] hSlo T352S 채널의 전기적 특성에 대한 이중 점 돌연변이의 효과를 시험하기 위해, 6개의 개별 이중 돌연변이가 생성되었다. 각각의 이중 점 돌연변이는 이중 돌연변이가 BK 채널의 퍼옥시니트라이트의 부정적인 효과를 억제하고 저 칼슘에서 측정된 전류 상태를 증가시킬 것이라는 기대로 생성되었다. 이중 돌연변이는 하기 작제물에서 시토신을 아데닌(C에서 A)으로 그리고 메티오닌을 류신(M에서 L)으로 치환하였다; pVAX-hSloT352S-C977A(C1), pVAX-hSloT352S-C496A(C2), pVAX-hSloT352S-C681A(C3), pVAX-hSloT352S-M602L(M1), pVAX-hSloT352S-M778L(M2) 및 pVAX-hSloT352S-M805L(M3).

[0432] 이들 치환 작제물의 전기생리학적 패치 클램프 분석은 고 글루코스(22.5 mM) 환경에서 24-48시간 동안 HEK 세포로 트랜스펙션 후에 수행되었다. T352S 단일 점 돌연변이는 산화 스트레스에 내성이 있지만, 이중 점 돌연변이(C1, C2, C3, M1, M2 및 M3)는 고 클루코스 환경에서 T352S 단일 점 돌연변이의 효과를 손상시키는 것으로 보인다. 이러한 패치 클램프 실험의 결과는 도 11에 표시되어 있다.

실시예 5

HSLO 유전자 T352S를 발현하는 벡터의 평가

[0433] PUO에 의해 생성된 방광 과다활성을 갖는 래트에서 본 발명자 그룹의 이전 연구는 Maxi-K를 발현하는 플라스미드(pVAX-hSlo)의 트랜스펙션이 개선될 수 있고, 일부 경우에, 이 동물 모델에서 배뇨근 과다활동의 많은 특성을 사실상 정상화할 수 있음을 보여주었다(Chang et al. Am. J. Physiol Renal Physiol 2010; 298: F1416-F1423). 이러한 연구는 OAB를 갖는 20명 여성에서의 인간 시험으로 확장되었으며, 연구된 용량에서의 결과는 래트 PUO 모델에서의 본 발명자의 임상 전 연구에서 관찰된 것보다 더 제한적인 효능을 가짐에도 불구하고, 안전성 및 OAB 치료에 일부 잠재적인 효능을 보여 주었다. 상기 아암에서 본 발명자는 칼슘에 더 높은 민감도를 갖는 Maxi-K 채널을 인코딩하는 hSlo 돌연변이체(T352S)를 발현하는 벡터(pVAX-hSlo T352S)를 사용함으로써 pVAX-hSlo를 사용한 DO의 방광내 치료의 유리한 효과가 개선될 수 있는지 여부를 결정하기 위해 PUO 래트 모델을 사용하였다(도 10 및 Gordon et al. J Pharmacol Exp Ther 2010; 334: 402-9).

[0434] 연구는 최저 유효 용량을 결정할 수 있도록 절반 로그 용량 농도(0, 10, 30 및 100 μg)에서 유전자의 활성을 시험하도록 설계되었다. CMV(pVAX) 및 평활근 알파 액틴(pSMAA) 프로모터로부터 유전자를 발현하는 벡터를 시험하였다. 표 15에 나타낸 바와 같이 총 172마리로 추정되는 래트가 사용되었다.

[0435] 대조군 빈 벡터, 및 CMV 및 SMAA 프로모터에 의해 유도되는 hSlo 및 hSlo T352S에 의한 PUO 래트의 방광내 치료의 효과를 방광내압측정에 의해 평가하고(상기 일반적인 방법 참조) 그룹 간에 비교하였다(표 15 참조). 방광내압측정 평가의 끝에, 동물을 안락사시키고, 방광을 수확하여 전체 배뇨근 수축성 및 SMC 흥분성에 대한 각 치료의 효과를 결정하는 기관 욕 및 전기생리학 연구(상기 일반적인 방법 참조)에 사용하였다.

[0436] 근거 및 예비 데이터: OAB 환자 및 DO의 동물 모델로부터 분리된 방광 스트립은 증가된 자발적인 위상 수축을 나타내었다(Kinder & Mundy Br J Urol 1987; 60: 509-15; Mills et al. J Urol 2000; 163: 646-51; Banks et al. BJU Int 2006; 97: 372-8; Milicic et al., Eur J Pharmacol 2006; 532: 107-14; Oger et al. BJU Int 2011; 108: 604-11). 칼륨 채널은 이러한 위상 수축의 발달 및 조절에 역할을 하는 것으로 보였고, Maxi-K 채널의 감소된 활성은 더 큰 자발적인 전위와 관련이 있다(Oger et al. BJU Int 2011; 108: 604-11; Petkov, Nat Rev Urol 2012; 9: 30-40; Karicheti & Christ Curr Drug Targets 2001; 2: 1-20; Hypolite et al. Am J Physiol Renal Physiol 2013; 304: F451-62). 방광 과다활동의 스트렙토조토신(STZ) 타입 1 당뇨병 모델을 사용한 이전 연구는 이 현상에서 Maxi-K의 관련성을 추가로 뒷받침하였다.

[0437] STZ 래트의 방광내압측정 연구는 특징적으로 더 높은 배뇨 빈도 및 과활동성 방광 압력(도 13A, 13B, 13C 및 13D, 및 Davies et al. Eur. Urol. 2007; 52: 1229-1237)을 나타내었고, 기관 욕 연구는 동일한 동물로부터 분리된 방광 스트립이 증가된 위상 활성을 나타내었음을 보여주었다.

[0438] 도 13E, 도 13F는 Maxi-K 채널의 특정 억제제인 Maxi-K 억제제, 이베리오톡신(IBTX)을 사용한 치료가 이러한 위상 수축의 진폭을 증가시켰음을 보여준다. 문헌[Vahabi et al. BJU Int 2011; 107: 1480-7; Stevens et al. Auton Autacoid Pharmacol 2006; 26: 303-9; Tammela et al. Br J Pharmacol 1994; 113: 195-203] 참조. 그러나, 상기 효과는 아마도 당뇨병성 방광에서 Maxi-K 활성의 더 낮은 활성으로 인해, 당뇨병성 동물로부터 분리된 스트립에서 더 낮았다. 이 예측은 이러한 채널의 기능적 발현을 찾기 위해 표준 단일 전체 세포 패치 기술을 사용하는 전기생리학적 연구에 의해 뒷받침되었다(도 13H). 문헌[Davies et al. Eur. Urol. 2007; 52: 1229-1237; Wang et al. Am J Physiol Cell Physiol 2001; 281: C75-88; Wang et al. Int J Impot Res 2000; 12: 9-18] 참조.

[0439] 세포막을 가로질러 단계적으로 전압을 인가하면 채널이 개방되고 외부로 전류가 흘렀다. 기록은 5마리의 동물로부터 분리된 배뇨근 세포로부터 삼중으로 이루어졌다. 방광 과다활동을 갖는 STZ-당뇨병 동물 및 대조군 래트로부터 분리된 세포 사이에 외향 전류와 인가 전압 사이에 유의한 차이는 없었다. 그러나, IBTX를 첨가한 후, 당뇨병성 배뇨근 세포에 비해 대조군에서 인가 전압에 반응하여 더 큰 감소(>50%)가 있었고(도 13H), 이는 당뇨병성 동물의 방광 배뇨근에서 Maxi-K 채널의 활성의 감소를 뒷받침한다.

[0440] 본 발명자의 이전 연구에서, 본 발명자는 PUO 래트(STZ 랫트와 유사)의 방광내압측정 평가가 DO와 상관 관계가 있는 더 높은 수준의 방광 자발적 전위를 입증하였음을 관찰하였다. pVAX-hSlo 및 pSMAA-hSlo를 사용한 처리는 이들 동물에서 DO를 상당히 개선시켰다(도 12 참조). 30 μg의 pVAX-hSlo T352S로 처리된 PUO 래트에 대한 본 발명자의 초기 방광내압측정 연구는 본 발명자의 이전 데이터(도 12)와 비교했을 때 상기 hSlo 돌연변이체가 야생형 유전자보다 DO를 더 효율적으로 감소시켰음을 나타내었다. 이러한 예비 발견 및 돌연변이된 Maxi-K 채널의 특징적인 특성에 기초하여(도 10 참조), 본 발명자는 돌연변이체 hSlo 유전자가 OAB를 치료하기 위해 보다 효율적이고 매력적인 생성물을 제공할 것을 예상하였다.

[0441] PUO 배뇨근 수축성 및 흥분성에서 hSlo 및 hSlo T352S 발현의 직접적인 효과가 결정되었다. hSlo 처리된 동물에서 감소된 방광 자발적 전위에 대한 본 발명자의 예비 방광내압측정 결과에 따라, 그리고 방광 과다활동과 감소된 Maxi-K 발현의 밀접한 연관성을 입증하는 DO의 STZ 모델을 사용한 본 발명자의 연구로부터, PUO 처리된 래트에서 분리된 방광 스트립의 자발적인 위상 수축은 처리되지 않은 PUO 동물에서 분리된 방광 스트립에 비해 현저히 낮았고, IBTX 차단에 더 민감하였는데, 이는 PUO 배뇨근에서 증가된 Maxi-K 발현(즉, 발현의 구제)을 반영한다.

[0442] 통계: 모든 연속 변수의 분포가 정규성에 대해 조사되었다. 정규 분포를 따르지 않은 것은 로그 척도를 사용하여 변환되었으며, 경험상 변환은 합리적으로 정상인 것으로 밝혀졌다. 일원 분산 분석을 수행하여 그룹 간의 차이의 전체 유의성을 결정하고, Duncan의 다중 비교 절차를 사용하여 그룹 간의 쌍별 차이의 유의성을 평가하였다. 전체 유의성 수준은 α=0.05로 선험적으로 설정되었다.

표 15

실시예 6

HSLO 발현 벡터를 보유하는 나노입자의 생성

[0443] 하이드로겔/유리 복합재의 제조를 위한 기본 프로토콜: 테트라메톡시실란(TMOS, 5 mL)을 HCl 용액(600 μl의 탈이온수에 첨가된 560 μl의 0.2 mM HCl)과 혼합한 다음 즉시 냉수 조에서 45분 동안 초음파 처리한 후 혼합물을 얼음 위에 놓는다. 이후 D-글루코스를 40 mg 글루코스/완충된 소듐 니트라이트 용액 mL의 용액에 첨가하였다. 글루코스가 용해된 후, 이어서 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 400을 1 mL PEG/20 mL의 완충 용액의 비율로 첨가하였다. 키토산[5 mg의 키토산/산성화된 증류수 mL(1M HCl 포함) pH 4.5]을 1 mL 키토산 용액/20 mL의 완충 용액의 비율로 첨가하였다. 완충 용액을 잘 교반한 후, 이전에 초음파 처리된 TMOS를 2 mL TMOS/20 mL 완충액의 비율로 천천히 도입하였다. 이후 합친 혼합물을 즉시 교반하고 따로 두었다. 생성된 혼합물은 1-2시간 내에 겔화되었다. 이후 이러한 단일체(블록) 졸-겔 샘플을 용기에서 꺼내고, 가열 또는 동결건조 전에 종이 타월로 블롯팅하여 대강 건조시켰다. 몇몇 대조군 샘플은 동일한 전체 프로토콜로 제조되었지만, 일부는 니트라이트, 글루코스, 키토산 및 PEG와 같은 특정 개별 성분이 결여되어 있다. 예를 들어, 니트라이트를 보류하고, 즉, 글루코스, 키토산 및 PEG만을 혼입함으로써, NO-비함유 "빈 겔"을 제조하였다.

[0444] 열 처리된 하이드로겔/유리 복합재의 제조: 겔이 경질의 백색 유리질 물질이 될 때까지(24-48시간) 샘플을 폐쇄된 대류 오븐에서 70℃로 가열하였다. 과도한 가열은 당의 캐러멜화를 나타내는 갈색 변색을 초래하였다. 샘플이 70℃ 이하의 온도에서 가열될 때 캐러멜화는 관찰되지 않았다. 변색된 물질은 버렸다. 이후 물질을 140 rpm의 속도로 60분 동안 유성 볼 밀(Fritsch, "Pulverisette 6")에 두었다.

[0445] 동결건조된 하이드로겔/유리 복합재의 제조: 상기 기재된 프로토콜을 사용하여 생성된 하이드로겔 단일체를 동결건조 플라스크에 넣고 24시간 동안 동결건조시켰다. 생성된 물질은 거칠고 미세한 백색 미립자 물질의 혼합물이었다. 이후 상기 혼합물을 막자 사발과 막자로 분쇄하여 미세한 백색 분말을 얻었다.

[0446] hSlo 벡터를 함유하는 나노입자에 대한 제조 프로토콜: 이러한 프로토콜은 수성 환경에 노출될 때 pVAX-hSlo의 지속 방출이 가능한 나노-크기 또는 나노-규모 입자의 비교적 균일한 분포로 구성된 미세 분말을 산출하였다. 다양한 두께의 하이드로겔 단일체를 공기 건조시키고, 분쇄한 다음, 상기 기재된 바와 같이 가열하였다. 생성된 분말을 다양한 기간 동안 볼 밀을 사용하여 추가로 분쇄하였다.

[0447] 생성된 분말 및 이들 분말의 제조 방법은 단일체 두께, 초기 건조 시간, 가열 온도, 가열 기간 및 볼 밀링 기간을 포함하나 이에 제한되지 않는 파라미터에 따라 달라질 수 있다. 다양한 두께의 하이드로겔 단일체는 공기 건조된 후 동결건조될 수 있다. 동결건조된 물질은 막자 사발 및 막자 또는 볼 밀을 사용하여 분쇄될 수 있다. 이후 생성된 분말은 45분 동안 50℃에서 후속 가열 사이클을 포함하거나 포함하지 않고 평가될 수 있다.

[0448] 새로 형성된 하이드로겔 단일체는 미세하게 분쇄된 다음, 약간 과량의 완충액의 존재하에 동일한 부피의 고 분자량 PEG(올리고머 또는 에틸렌 옥사이드의 중합체, 예를 들어, 비제한적으로, PEG3K 또는 PEG5K)와 혼합될 수 있다. 혼합물을 건조하기 전에 몇 시간 동안 격렬하게 교반한 다음 동결건조시킬 수 있다. 하이드로겔 입자의 표면을 큰 PEG 분자로 코팅하면 동결건조 후 생성된 입자의 분산 특성을 향상시킬 수 있다. 일부 상황에서, PEG 분자는 TMOS 유래 하이드로겔의 표면에 비가역적으로 결합한다.

[0449] 테트라메톡시실란(TMOS)은 전술한 바와 같이 하이드로겔 형성을 위한 기초로 사용될 수 있다. 다음의 비제한적인 성분들의 조합이 고려된다:

● TMOS+pVAX-hSlo;

● TMOS+pVAX-hSlo+키토산;

● TMOS+pVAX-hSlo+PEG;

● TMOS+pVAX-hSlo+PEG+키토산;

● 일치환된 유기실란(예를 들어, 알킬기가 메틸, 에틸 또는 N-프로필인 알킬트리메톡시실란)과 접촉된 TMOS+pVAX-hSlo;

● 일치환된 유기실란(예를 들어, 알킬기가 메틸, 에틸 또는 N-프로필인 알킬트리메톡시실란)과 접촉된 TMOS+pVAX-hSlo+키토산;

● 일치환된 유기실란(예를 들어, 알킬기가 메틸, 에틸 또는 N-프로필인 알킬트리메톡시실란)과 접촉된 TMOS+pVAX-hSlo+PEG;

● 일치환된 유기실란(예를 들어, 알킬기가 메틸, 에틸 또는 N-프로필인 알킬트리메톡시실란)과 접촉된 TMOS+pVAX-hSlo+글루코스;

● 일치환된 유기실란(예를 들어, 알킬기가 메틸, 에틸 또는 N-프로필인 알킬트리메톡시실란)과 접촉된 TMOS+pVAX-hSlo+키토산+PEG;

● 일치환된 유기실란(예를 들어, 알킬기가 메틸, 에틸 또는 N-프로필인 알킬트리메톡시실란)과 접촉된 TMOS+pVAX-hSlo+키토산+글루코스; 및

● 일치환된 유기실란(예를 들어, 알킬기가 메틸, 에틸 또는 N-프로필인 알킬트리메톡시실란)과 접촉된 TMOS+pVAX-hSlo+PEG+글루코스.

[0450] 상기 프로토콜에 대한 전략은 졸-겔 매트릭스에서 소수성 도펀트로서 소량의 첨가된 알킬 치환된 실란을 사용함으로써(즉, 일정량의 알킬 치환된 실란을 졸-겔 매트릭스에 접촉) 입자 내부의 소수성을 조정하는 것이었다. 이러한 알킬-치환된 메톡시실란의 사용은 캡슐화된 효소의 반응성을 향상시킬 수 있는 졸-겔을 생성시켰다. 이러한 캡슐화된 효소는 소수성 표면을 가지며 순수한 TMOS 유래 졸-겔 매트릭스에서 활성 및 안정성을 상실하였다. 입자 내부의 소수성을 증가시키는 것은 pVAX-hSlo의 더 느린 방출을 초래하여, 지속되거나 더욱 지속되는 전달을 가능하게 한다. 비수성 전달 비히클이 분말에 사용된 경우 입자의 소수성을 조정하는 것이 바람직하였다.

실시예 7

pVAX-hSLO 플라스미드를 포함하는 나노입자의 시험관내 특성화

[0451] pVAX-hSlo 플라스미드는 260 nm에서 흡광도 피크를 갖는 핵산이다. 따라서, 나노입자로부터의 방출 동역학은 흡광도의 변화에 의해 결정될 수 있다. hSlo 벡터를 함유하는 새로 제조된 나노입자를 다양한 시간 동안(예를 들어, 0 내지 24시간) 수용액에서 인큐베이션하였다. 후속하여, 나노입자를 원심분리하고, 흡광도를 통해 상청액으로의 핵산 방출을 결정하였다. 벡터-특이적 프라이머를 사용하여, 정량적-RT-PCR을 수행하여 나노입자로부터 핵산의 방출 동역학을 추가로 특성화하였다. 안정성은 다양한 기간(예를 들어, 1일 내지 3개월(또는 90일) 범위) 동안 hSlo 벡터를 함유하는 나노입자를 보유하고 새로 제조된 나노입자에 사용된 것과 동일한 방법에 의해 보유된 나노입자의 방출 동역학을 결정함으로써 시험되었다. 방출된 플라스미드의 완전성은 아가로스 겔 전기영동에 이어 핵산 염색에 의해 결정되었다. 상기 분석의 결과는 나노입자로부터 방출된 핵산의 물리적 형태, 예를 들어 원형, 닉 또는 슈퍼코일을 나타내었다. 또한, 방출된 핵산은 제한 효소 분석을 받았다.

실시예 8

나노입자 전달 시스템의 국소 투여

[0452] 본 발명의 나노입자는 본 연구를 위해 Maxi-K를 캡슐화하는데 사용되었다. 이 연구의 데이터는 나노입자가 진피를 가로지를 수 있음을 보여주었다. ED의 래트 모델은 치료 후 입증 가능한 기능적 개선을 나타내었다.

[0453] 마취하에 래트의 음경에 형광-표지된 나노입자를 적용하였다. 1시간 후 래트를 안락사시키고, 전체 음경을 포스페이트 완충 염수로 세척하고 5% 파라포름알데히드에 24시간 동안 고정시켰다. 음경의 축을 따라 다양한 지점에서 단면을 취하였다. 전형적인 결과는 도 15C에 도시되어 있다. 대조군 동물(나노입자로 치료되지 않음)은 어떤 붉은 반점도 나타내지 않았다. 모든 섹션에서, 음경의 진피에서 반점이 관찰될 수 있었다. 데이터는 음경의 세척 및 고정이 외부 나노입자를 제거할 것이기 때문에 이러한 나노입자가 피부의 진피를 관통했다는 것을 나타내었다. 더욱이, 붉은색 형광의 패치는 해면체 및 해면체 정맥에서 볼 수 있다.

[0454] 발기제(NO 또는 시알로핀)를 캡슐화한 나노입자는 노화된 래트에서 발기를 촉진시켰다. 9개월령 Sprague-Dawley 래트의 해면체 다리를 노출시키고 그 안에 삽입된 23-게이지 바늘을 사용하여 체내 압력(ICP)을 측정하였다. 안정된 기준선을 결정한 후, NO- 또는 시알로핀-함유 나노입자의 점성 용액을 음경의 축에 적용하였다. 주목할 점은, 음경의 피부가 온전하게 ICP 측정 부위와 다른 위치에서 유지되었다는 것이다. 대조군 동물은 포스페이트 완충액만을 함유하는 "빈" 나노입자로 처리되었다.

[00455] 이 초기 연구에는 총 7마리의 실험 동물이 사용되었다. 7마리의 동물 중 5마리에서, 해면체내 압력(ICP)에 뚜렷한 긍정적인 영향이 있었고, 그 결과 눈에 보이는 발기가 발생하였다(조직학적 분석을 위해 조직이 준비됨). 조직학적 분석 후, 이들 샘플에서 염증 또는 울혈의 증거는 없었다. 전반적으로 조직은 정상으로 보였다. 이러한 예비 데이터는 큰 분자를 포함하는 조작된 나노입자가 "피부" 장벽을 안전하게 통과하는 능력을 입증하였다(독성 효과의 제시 없이).

실시예 9

나노입자의 생물안전성/생체분포 프로파일

[0456] 나노입자에는 2개의 성분이 있었다: 나노입자 및 hSlo 벡터. 각 성분의 생체분포 및 약동학을 결정하였다. 병리학 및 조직병리학 분석을 수행하여 다른 기관이 영향을 받았는지 여부와, 영향을 받은 경우 어떤 기관인지를 결정하였다.

[0457] 병리학 결정: 방광 기능에 대한 나노입자 캡슐화된 hSlo 벡터의 효과를 결정하기 위한 생리학적 연구 동안, 동물을 잠재적인 전신 부작용에 대해 모니터링하였다. 생성물 및 빈 벡터를 캡슐화한 나노입자(대조군)로 처리된 동물은 기초 심박수, 수축기 압력, 이완기 압력 및 평균 동맥압과 같은 혈관 웰빙과 관련된 여러 생리학적 파라미터에 대해 모니터링되었다. 혈관 생리학적 파라미터의 비침습적 측정을 허용하는 꼬리 커프 시스템(Kent Scientific Corp., Torrington, Conn.의 CODA™2 마우스/래트 꼬리 커프 시스템)을 사용하였다. 생리학적 측정 후, 동물을 안락사시키고 총 병리학을 수행하였다. 방광의 섹션이 조직학 및 검사를 위해 준비되었다. 특히, 혈관 병리학 또는 염증의 징후를 찾았다.

[0458] 생체분포: hSlo 벡터를 함유하는 나노입자를 방광내압측정에 사용된 유치 방광 카테터를 통해 건강한 마취된 래트의 방광 내강에 점적주입하였다. 이후 동물을 상이한 시점(1시간 내지 1주)에 안락사시키고, hSlo 벡터 또는 나노입자의 존재/양을 결정하기 위해 조직을 제거하였다. 조사할 주요 조직은 방광, 혈액, 심장, 간, 신장, 뇌, 비장, 고환, 폐, 눈, 전립선, 겨드랑이 림프절, 부고환, 이두근, 음경 및 결장이었다. 생체분포 연구를 수행하기 위해 투여된 생성물의 양(용량)은 PUO 래트에서 DO를 감소시키는데 가장 중요한 생리학적 효과를 유도하는 방광 기능 연구에서 나타난 것과 동일하였다.

[0459] a) 나노입자 검출: 생체분포 실험에 사용된 나노입자는 형광단(FITC 또는 DsRed)과의 컨쥬게이션에 의해 표지되거나(도 15B에서와 같이) 비오티닐화되었다(항체에 의한 검출을 허용하기 위해). 상기 인용된 기관을 분리하고 조직학적 섹션 및 조직 추출물을 제조하였다. 비오티닐화된 나노입자의 검출을 위해, 비오티닐화된 나노입자에 대한 항체를 사용하여 조직의 면역조직화학 및 웨스턴 블롯 분석을 수행하였고, 이는 이미지의 밀도계 분석에 의한 개별 조직에서의 나노입자의 정량화를 허용하였다. 형광 나노입자의 경우, 조직 섹션을 에피플루오레센스 또는 공초점 현미경으로 조사하였다.

b) hSlo 벡터 검출: 래트에서 해면체내 주사 후 pVAX-hSlo의 광범위한 생체분포 연구를 수행하였다. 이들 연구에서, pVAX 벡터의 카나마이신 내성 유전자에 대한 프라이머를 사용하여 플라스미드 분포의 시간적 연구를 수행하기 위해 qRT-PCR을 사용하였다. 이들 연구는 생리학적 효과가 결정된 시점을 포함하는 1주일(4, 8, 24시간 및 1주) 동안 다양한 시점에서 수행되었다. hSlo-나노입자가 해면체에 주사된 연구에서, 플라스미드는 투여 4시간 후에 여러 조직에서 검출될 수 있었지만, 1주일 후에는 그 발현이 해면체로 제한되었다.

[0461] 유사한 시간 경과 연구를 사용하여 방광내 투여 후 hSlo 벡터의 생체분포를 결정하였다. 따라서, PUO-처리된 래트의 방광 조직에서 hSlo 벡터를 검출하기 위해 동일한 절차를 따랐다. 방광은 기능적 방광내압측정 평가 후에 수확되었고, 요로상피 및 배뇨근 조직은 해부 현미경 하에서 분리되었고, 조직은 qRT-PCR 분석을 위해 준비되었다.

[0462] 방광에서 트랜스펙션 효율 및 hSlo 유전자 발현 모니터링: 나노입자로 표적화된 세포의 트랜스펙션 효율을 결정하는 두 가지 성분: 세포에 의한 나노입자의 흡수 및 이후 트랜스펙션된 세포 내에서 캡슐화된 벡터의 발현. 나노입자 흡수는 비오티닐화되거나 형광-태그된 나노입자를 사용하여, 상기 기재된 바와 같이 모니터링되는 반면, 카고(벡터) 세포내 방출은 벡터의 내성 유전자의 발현을 표적화하는 qRT-PCR에 의해 결정되었다. 그러나, 유사한 접근법은 hSlo 유전자가 이미 방광에서 내인성으로 발현된다는 점을 고려할 때, hSlo 유전자 발현을 검출하고 모니터링하는데 사용될 수 없었다. 따라서, 생성물의 흡수시 세포가 실제로 hSlo 유전자를 효율적으로 발현하는지 확인하기 위해, 본 발명자는 유전자에 mCherry 형광 리포터(적색)를 태그하고 FITC-표지된 나노입자로 생성물을 캡슐화하였다(도 15B 참조). 이는 방광(녹색 형광) 및 hSlo 발현(적색 형광)에서 나노입자의 흡수 및 지속성을 동시에 모니터링할 수 있게 하였다. 상기 접근법의 장점은 생체내, 생체외 및 시험관내 모니터링 둘 모두를 허용한다는 것이다(도 16A, 16B, 16C 및 16D 참조). mCherry 및 FITC에 대한 프라이머 및 항체는 상업적으로 이용 가능하다.

[0463] 예비 데이터: HeLa 세포로 수행된 시험관내 연구는 나노입자로부터 방출될 때 나노입자 세포 흡수의 효율 및 플라스미드의 발현이 형광 리포터 유전자를 사용하여 모니터링될 수 있음을 입증하였다. 도 16A에 도시된 바와 같이, mCherry를 발현하는 벡터를 캡슐화하는 나노입자의 첨가 직후, 95%에 가까운 높은 트랜스펙션 비율이 HeLa 세포 배양에서 관찰되었다. 매우 높은 Maxi-K 유전자의 발현 수준은 pMaxi-K를 캡슐화하는 나노입자로 트랜스펙션된 HEK293에서 또한 나타났다. HEK293 세포는 일반적으로 매우 낮은 수준의 Maxi-K를 발현한다(도 16B). 최저량의 Maxi-K-나노입자에서도 20시간 후에 유전자 발현이 100,000배 증가하였다. 생체내 유전자 발현을 위한 리포터로서 mCherry의 적합성은 본 발명자가 pmCherry-N1을 방광 배뇨근에 주사한 실험에서 나타났다. 도 16C에 도시된 바와 같이, mCherry 형광은 처리된 동물의 골반 영역에서 명확하게 검출될 수 있으며, 방광을 제거한 후 히트맵을 사용하여 발현을 정량화하였다(도 16D).

[0464] 샘플 크기 고려 사항 및 동물의 수: 각 생체분포 연구를 위해 5개의 시점 각각에 대해 8마리의 동물을 사용하였다. 동물의 수는 pVAX-hSlo의 생체분포에 대해 이전에 최소로 허용되는 수(FDA에 의해 임상 시험을 위한 안전성 연구를 위해 허용됨) 및 또한 허가의 후반기에 8마리 동물로부터 16개의 조직을 분석하기 위한 합리적인 작업 수준을 기반으로 하였다. 총 40마리의 암컷 Sprague Dawley 래트를 이들 실험에 사용하였다.

실시예 10

방광내 전달을 위한 나노입자의 결정

[0465] 방광내 요법의 효능은 요로상피의 매우 낮은 투과성 및 소변으로의 약물 희석 및 배뇨로 인한 세척에 의해 잠재적으로 제한된다. 일시적으로 요로상피 장벽을 파괴함으로써 약물 흡수를 향상시키기 위해 화학적 및 물리적 방법이 사용되어 왔다. 그러나 이러한 방법을 사용하면 부작용 및 조직 손상이 발생할 수 있다. 이들 실험의 목표는 hSlo 생성물의 방광내 전달을 위한 플랫폼으로서 나노입자를 사용하는 것이 PUO 래트에서 DO를 교정하기 위해 hSlo를 단독으로 사용하는 것보다 더 나은 치료 결과를 도출하는지 여부를 결정하는 것이었다.

[0466] DO에서 가장 현저한 개선을 유도한 플라스미드 작제물 및 최고의 플라스미드 카고 로딩 능력, 최고의 조직 침투 및 카고 방출 프로파일을 갖는 나노입자를 사용하여 PUO 모델에서 시험하기에 충분한 양으로 새로운 생성물을 제조하였다. 네이키드 벡터와 나노입자 캡슐화된 벡터를 비교할 수 있도록 동일한 양의 네이키드 벡터를 함유하도록 나노입자 제조물을 생성하였다.

[0467] PUO 래트의 방광 기능에 대한 새로운 생성물의 효과는 방광내압측정 파라미터에 기초하여 평가되었다. 방광내압측정 데이터를 네이키드 벡터로 처리한 동물로부터 얻은 데이터와 비교하였다. 통계 분석이 수행되었다. 이 실시예에서 사용되는 실험 그룹 및 동물의 수는 표 16에 제시되어 있다.

[0468] 방광내압측정 평가 후, 처리된 대조군 및 나노입자 + 플라스미드 벡터 처리된 PUO 래트로부터 방광을 수확하고, 기관 욕 및 경로-클램핑 연구에 의한 배뇨근 기능 변화의 생체외 평가에 사용하였다.

표 16

실시예 11

PSMAA-HSLO 벡터의 작제

[0469] SMP8-BP-4 키메라 유전자는 마우스 SM-α-액틴의 3.6-kb 단편을 rIGFBP-4 cDNA에 융합시킨 다음 SV40 초기 아데닐중합체형성 신호 단편을 융합시킴으로써 작제되었다. SMP8은 21074 bp의 59-플랭킹 영역, 63 bp의 59-UT 및 2.5-kb의 SM-α-액틴의 제1 인트론을 포함한다. BamHI로 분해하여 pSMP8로부터 방출되고 Klenow에 의해 채워진 3.6-kb SMP8 단편을 HindIII로 부분적으로 분해하고 HindIII 및 EcoRv 부위에서 pRBP-4-SV로 클로닝하여, SV40 초기 아데닐중합체형성 신호에 융합된 ratIGFBP-4가 SMP8에 의해 유도된다.

[0470] pSMAA-EYFP: pSMP8의 3.7kb 단편(SMAA 프로모터 함유)을 BspluIIi/BamHI를 사용하여 절제하고 동일한 효소로 절단한 pEYFP-N1(Clontech)에 클로닝하였다.

[0471] pSMAA-hSlo(SEQ ID NO: 48): pVAX-hSlo를 BamHI로 절단하여 BamH1로 절단된 pSMAA/EYFP에 라이게이션된 hSlo 유전자를 제거하고 송아지 장내 알칼리성 포스파타제(CIP)로 처리하였다.

실시예 12

방광내 점적주입 또는 직접 주사에 의한 HMAXIK 유전자 전달의 안전성 및 활성

[0472] 방광내 점적주입 또는 방광벽으로의 직접 주사에 의한 hMaxi-K 유전자 전달의 안전성 및 잠재적인 활성을 2개의 이중 맹검, 불균형, 플라시보 대조된 무작위화 1 상 시험에서 특발성(비신경원성) 과활동성 방광 증후군(OAB) 및 배뇨근 과다활동(DO)을 갖는 여성 참가자에서 평가하였다. 인간의 큰 칼륨 채널 α 서브유닛을 발현하는 유전자 치료 플라스미드 벡터(URO-902)의 안전성 및 잠재적인 효능을 입증할 목적으로, OAB 증후군을 갖고 요역학적으로 DO를 입증한 건강한 여성에서 2개의 1 상 시험을 수행하였다.

[0473] ION-02(방광내 점적주입) 및 ION-03(직접 주사)은 이중 맹검, 플라시보 대조, 다기관 연구였다. 활성 용량을 투여하고 안전성을 위해 순차적으로(최저 용량 먼저) 평가하였다. ION-02 참가자들은 5000μg 또는 10000μg URO-902 또는 플라시보를 수용하였다. ION-03 참가자들은 방광경검사를 사용하여 방광벽으로 직접 주사되는 16000μg 또는 24000μg URO-902 또는 플라시보를 수용하였다. 1차 결과 변수는 URO-902 투여 후 발생하는 안전성 파라미터였다; 2차 효능 변수도 평가되었다. 안전성 결과 중에서, 두 시험 동안 용량 상승을 막는 용량 제한 독성 또는 유의한 부작용(AE)은 없었고, AE로 인해 철회한 참가자도 없었다. 효능의 경우, ION-02(N=21)에서, URO-902를 수용한 환자에서 24주에 요역학에 대한 불수의 배뇨근 수축이 감소되었고(P<0.0508 vs. 플라시보), 평균 절박 요실금 에피소드는 5000μg 그룹에서 기준선으로부터 감소되었다(P=0.0812 vs. 플라시보). ION-03(N=13)에서, 절박 에피소드(16000μg, P=0.036; 24000μg, P=0.046) 및 배뇨 횟수(16000μg, 2.16, P=0.044; 24000μg, 2.73, P=0.047)에서 플라시보에 비해 유의한 감소가 주사 1주 후에 관찰되었다.

[0474] 서론: OAB는 요실금이 있거나 없고, 주간 빈뇨 및 야간뇨가 증가하며, 감염 또는 다른 명백한 병리학적 특징이 없는 요절박으로 정의되는 증후군이다. Abrams et al., Neurourol. Urodyn. 2002;21(2):167-178. OAB는 미국에서 수백만 명의 남성과 여성에게 영향을 미치는 흔하고 중요한 문제이다(Andersson et al., Nat. Clin. Pract. Urol. 2004;1(2):103-108; Hashim & Abrams, Drugs. 2006;66(5):591-606; Subak et al., Obstet. Gynecol. 2006;107(4):908-916) with a major negative impact on quality of life (QOL). Stewart et al., World J Urol. 2003;20(6):327-336.

[0475] OAB 증상에 대한 총 치료 비용은 미국에서만 365억 달러 이상으로 추정된다. Reynolds et al., Curr. Bladder Dysfunct. Rep. 2016;11(1):8-13. OAB는 배뇨근 과다활동(DO)의 요역학적 소견과 관련이 있거나 없을 수 있는 증상 진단이다. Digesu et al., Neurourol. Urodyn. 2003;22(2):105-108.

[0476] OAB에 대한 1차 약리학적 요법은 경구 항무스카린제 또는 아드레날린성 베타-3 수용체 효능제로 구성된다. Lightner et al., J Urol. 2019:101097JU0000000000000309; Maman et al., Eur Urol. 2014;65(4):755-765; Warren et al., Ther Adv Drug Saf. 2016;7(5):204-216. 그러나, 이러한 약물은 방광 선택성이 부족하며 모든 환자에게 효과적이지 않다. 또한, 구강 건조, 변비 및 인지 결함과 같은 심각한 부작용은 많은 항무스카린제의 사용을 제한한다. Yamada et al., Pharmacol Ther. 2018; 189:130-148; Coupland et al., JAMA Intern Med. 2019; 179(8):1084-1093.

[0477] 효능의 부족 및 부작용으로 인해 장기간 치료 지속성이 낮아졌다(5% 내지 47% 범위). Chancellor et al., Clin Ther. 2013;35(11):1744-1751; Yeowell et al., BMJ Open. 2018;8(11):e021889.

[0478] 보툴리눔 독소(예를 들어, 오나보툴리눔독소A)와 같은 OAB 및 DO의 치료를 위한 화학적 신경차단제는 카테터 삽입을 필요로 하는 불완전한 방광 비우기/요폐 및 요로 감염을 포함하는 부작용에 의해 제한된다. Moga et al., Toxins (Basel). 2018;10(4):169. 따라서, 더 효과적이고/거나 관용되는 대체 치료가 환영받을 것이다.

[0479] 큰 전도도의 Ca²⁺-활성화된 K⁺(큰 칼륨[BK], MaxiK⁺, BK_Ca, K_Ca1.1로도 알려짐) 채널은 방광 평활근 세포에서 고도로 발현되고 명백하게 방광 배뇨근 기능을 조절하는 중요하고 생리학적으로 관련된 K⁺ 채널이다. Petkov, American journal of physiology. 2014;307(6):R571-R584; Latorre et al., Physiol Rev. 2017;97(1):39-87. BK 채널은 전압 및 세포질 Ca²⁺ 둘 모두의 변화에 의해 활성화되고, 세포 흥분성 및 따라서 평활근 수축 정도를 제어한다. Petkov, American journal of physiology. 2014;307(6):R571-R584; Latorre et al., Physiol Rev. 2017;97(1):39-87. BK 채널의 활성화는 평활근 세포 흥분성을 감소시키며 OAB의 치료를 위한 잠재적인 치료 옵션일 수 있다. Hristov et al., Am J Physiol Cell Physiol. 2012;302(11):C1632-1641. 플라스미드 벡터를 사용한 유전자 요법은 인간 BK 채널 α 서브유닛(기공 형성 단위)의 과발현이 동물 및 인간 적용 둘 모두에서 조직/기관 기능을 변화시킨다는 것을 입증하였다. Christ et al., Eur Urol. 2009;56(6):1055-1066; Christ et al., Urology. 2001;57(6 Suppl 1):111; Melman et al., Isr. Med. Assoc. J. 2007;9(3):143-146.

[0480] 인간 BK 채널 α 서브유닛을 발현하는 유전자 치료 플라스미드 벡터를 포함하는 URO-902의 안전성 및 잠재적 효능을 입증하는 2개의 1 상 시험으로부터의 데이터가 아래에 제시된다. 이러한 연구에서, URO-902는 단일 방광내 점적주입 또는 방광 배뇨근에 직접 주사에 의해 전달되었다.

I. 물질 및 방법

[0481] URO-902는 pVAX(Invitrogen) 백본 및 hSlo cDNA에서 유래된 비-바이러스 이중 가닥 네이키드 플라스미드 DNA 분자(6880 bp)이다. hSlo의 발현은 사이토메갈로바이러스 프로모터에 의해 유도되고, 전사체 성숙은 소 성장 호르몬 폴리(A) 부위로 지지된다. 작제물은 또한 카나마이신 내성 유전자 및 pUC 복제 기점을 포함한다. Melman et al., Hum Gene Ther. 2006;17(12):1165-1176.

연구 설계

[0482] 방광내 점적주입(ION-02, NCT00495053) 및 직접 주사(ION-03, NCT01870037) 연구 둘 모두는 ≥18세이고 임신 가능성이 없으며 DO와 관련된 ≥6개월 기간의 중등도 OAB 및 다음 중 적어도 하나를 갖는 건강한 여성에서의 이중 맹검, 플라시보 대조, 다기관, 순차적 활성 용량, 1 상 연구였다: 하루에 ≥8회 배뇨, 요절박 증상(갑작스럽고 강렬한 배뇨 욕구) 또는 야뇨증(배뇨를 위해 밤에 ≥2회 깸), 절박성 요실금(주당 ≥5 요실금 에피소드), 및 방광내압곡선에 기록된 적어도 5cm/H₂O 압력의 ≥1회의 제어되지 않는 위상 수축(들)을 갖는 DO. 추가 포함 기준은 ≤200mL의 잔여 부피, 이전의 OAB 치료(예를 들어, 항무스카린성/항콜린성 제제, 베타-3 효능제 또는 오나보툴리툼 독소 A)에 대한 무반응 및/또는 관용 불량이었고, 이러한 치료를 계속하길 원하지 않았다. 제외 기준은 양성 혈청(HCG) 임신 테스트 또는 수유, 1년에 3회 이상의 요로 감염의 병력, 및 요실금을 제외한 임의의 중요한 비뇨생식기 장애를 포함하였다.

[0483] 둘 모두의 연구에서, 활성 용량을 투여하고 안전성을 위해 순차적으로(최저 용량 먼저) 평가하였다. 각 코호트에서 처음 4명의 참가자의 등록은 각 참가자의 투여 후 2일의 대기 기간을 가지며 연구 현장에 의해 관리되었다. 다음 참가자는 현장에서 이전에 투여된 참가자와 전달 3일 후에 연락하여 임상적으로 유의한 부작용(AE)이 발생했는지를 결정한 후에만 등록되었다. 임상적으로 유의한 AE가 보고된 경우, 의료 모니터는 모든 현장에 연락해야 했고, 의료 모니터 또는 스폰서가 승인할 때까지 추가 등록을 수행하지 않아야 했다.

[0484] 방광내 점적주입(ION-02) 연구의 참가자들은 5000μg 또는 10000μg URO-902, 또는 PBS 20% 수크로스 용액 중 플라시보의 단일 투여(각 용량은 90mL 총 부피였다)를 수용하였다. 용량 수준 당 최대 13명의 여성 참가자가 등록되었다(활성 치료에 10명, 플라시보에 3명). 직접 주사 연구(ION-03)의 환자들은 방광경검사를 사용하여 방광벽에 직접 PBS 20% 수크로스 중 16000μg(20회 분배된 0.2mL 주사로 총 4mL) 또는 24000μg(30회 분배된 0.2mL 주사로 총 6mL)의 URO-902, 또는 플라시보(20회 또는 30회 분산 주사)의 단일 투여를 수용하였다. 용량 수준 당 최대 9명의 여성 참가자가 등록되었다(활성 치료에 6명, 플라시보에 3명).

[0485] ION-02 및 ION-03 둘 모두에 대한 연구 기간은 URO-902로 치료한 후 6개월이었다. 치료 후 방문은 1, 2, 4, 8, 16 및 24주에 발생하였다. 미리 지정된 간격으로, 신체 검사, 심전도(화학, 혈액학 및 소변 검사실 샘플 포함), 방광내압측정, 일일 배뇨 일지 정보, 패드 시험 결과 및 방광 스캔을 수행하고 검토하였다. hSlo DNA의 검출을 위한 소변 샘플은 둘 모두의 연구에서 각각의 방문시에 수집되었다. hSlo DNA의 검출을 위한 혈액 샘플은 주사 2시간 후에 수집되었다. 연구 약물을 수용한 모든 참가자들은 초기 6개월 연구 기간을 완료한지 6, 12 및 18개월 후에 지연된 AE를 모니터링하기 위해 연구 후 설문 조사를 받았다.

방광내 점적주입(ION-02) 및 직접 주사(ION-03) 절차

[0486] ION-02, 방광내 점적주입 절차: 각 90mL 용량을 작은 직경의 카테터를 통해 방광의 내강에 점적주입하였다. 참가자들은 적어도 2시간 동안(체류 시간) 용액을 유지하도록 요청받았다.

[0487] ION-03, 직접 주사 절차: 방광에 40mL의 2% 리도카인을 점적주입하고 요도에 10cc의 2% 자일로카인 겔을 점적주입한지 10 내지 20분 후 경질 방광경을 통해 전신 또는 국소 마취 없이 치료를 투여하였다. URO-902는 삼각부를 피하면서, 배뇨근에 Bonee® 바늘로 주사되었다. 바늘을 배뇨근에 약 2mm 삽입하고, 0.2mL의 20회 주사(16000μg 용량) 또는 0.2mL의 30회 주사(24000μg 용량)를 각각 약 1cm 이격시켰다.

안전성 및 효능 평가

[0488] ION-02 및 ION-03 둘 모두에 대한 1차 결과 변수는 모든 AE를 포함하여 플라시보와 비교한 URO-902의 투여 후 발생하는 모든 안전성 파라미터, 모든 임상 실험실 시험에 대한 기준선으로부터의 변화, 소변 및/또는 혈액 내 hSlo의 존재에 대한 측정, 심전도(속도, 리듬, PR, QT, QT_cF, QT_cB, QRS) 및 신체 검사를 포함하였다. 요로 감염은 카테터를 사용한 소변에서 나온 요로 병원균의 양성 소변 배양(≥1000 콜로니/mL)으로 정의되었다. 요폐는 방광 스캔으로 측정된 ≥400mL의 소변으로 정의되었다. 치료 응급 부작용(TEAE)만 평가되었다.

[0489] 2차 결과 변수는 OAB/DO를 갖는 참가자에서 URO-902의 효능 및 잠재적인 활성을 결정하기 위해 측정되었다. 2차 효능 변수는 URO-902의 단일 투여 후 1, 2, 4, 8, 12 및 24주까지 기준선으로부터의 평균 점수의 변화였고, 이는 일일 배뇨 횟수, 절박 요실금 에피소드 및 절박 에피소드(배뇨당 일일 배뇨 부피도 ION-03 연구에 기록됨)와 같은 일지 변수를 포함하였다. 또한 킹스 건강 설문지(KHQ)로부터 기준선으로부터의 QOL 점수의 평균 등급 변화가 포함되었다. 요역학은 기준선과 4주 및 24주에 수행되었다. 요역학적 변수는 방광내압측정 능력과 불수의 배뇨근 수축 평가를 포함하였다. 요역학은 맹검 중앙 판독가에 의해 해석되었다.

데이터 분석

[0490] 안전성 및 효능 데이터 둘 모두는 치료 그룹(조합된 플라시보 vs. 2개의 활성 치료 그룹 및 조합된 플라시보 vs. 조합된 치료 그룹) 및 총 연구 집단에 의한 요약 기술 통계를 사용하여 요약되었다. 선형 혼합 효과 모델을 사용하여 플라시보와 활성 치료 사이의 기준선으로부터의 변화의 차이를 추정하였고 다른 결과에 대한 용량 반응이 있었는지 여부를 시험하였다. 이원 종말점에 대한 효과를 추정하기 위해 일반화된 추정 방정식 모델이 사용되었다.

[0491] 탐색적 분석의 경우, 분산 분석 또는 공변량으로서 기준선 측정 값과의 공분산 분석을 적용하여 각각의 개별 주에 치료 차이에 대해 시험하였다. 치료에 대한 반응의 참가자의 지각에서 치료 vs. 플라시보의 차이를 시험하기 위해 카이-제곱을 사용하였다. 작은 샘플 크기와 효능 데이터의 탐색적 특성을 고려할 때, 다중 비교에 대한 조정은 이루어지지 않았다. 제시된 모든 P-값은 명목상 P-값이었다.

II. 결과

환자 인구 통계

[0492] 41명의 참가자가 ION-02 (방광내 점적주입)에 대해 스크리닝되었다; 20명은 포함/제외 기준을 충족하지 못해 제외되었다. ION-3에서, 24명의 환자가 평가되었고, 9명이 제외되었다. 두 연구에 대한 전체 CONSORT 다이어그램은 도 20 및 도 21에서 볼 수 있다. 두 연구의 모든 참가자들은 항콜린제를 사용한 사전 치료에 실패하였으며, ION-03의 4명은 보툴리눔 독소 A 요법시에 문제가 있었다. 환자 인구 통계 및 기준선 특성은 일반적으로 두 연구에서 치료 그룹 간에 유사하였다(표 17 및 18).

표 17. ION-02 방광내 점적주입 연구의 환자 인구 통계

BMI, 체질량 지수; max, 최대; min, 최소; SD, 표준 편차.

표 18. ION-03 직접 주사 연구의 환자 인구 통계

BMI, 체질량 지수; max, 최대; min, 최소; SD, 표준 편차.

안전성 결과

[0493] ION-02 동안 모든 참가자의 소변에서 URO-902의 검출 가능한 증거가 없었다. ION-03에서, 한 참가자는 혈액에서 URO-902가 검출되었고, 4명의 참가자는 투여 직후 소변에서 URO-902가 검출되었다(후속 검정은 음성이었다). 두 시험 도중 다음의 더 높은 용량으로의 상승을 막는 용량 제한 독성 또는 유의한 AE는 발생하지 않았다. 연구 약물과 관련이 없는 단 하나의 심각한 AE가 ION-03에서, 치료가 필요한 추운 날씨로 인해 상태가 악화된 기존 천식이 있는 여성에서 보고되었다.

[0494] 모두 5000μg URO-902 용량 그룹에 있는 ION-02의 3명의 참가자는 연구 치료와 관련이 있거나 아마도 관련이 있을 것으로 여겨지는 TEAE를 가졌다. 1명은 치료 후 170일에 Mobitz 타입 11 2도 AV 차단이었고, 1일만에 해결되었다. 그녀는 투여 후 0주부터 1주까지 1도 AV 차단 사전 투여를 받았다.

[0495] 어느 연구에도 부작용으로 인해 철회한 참가자는 없었다. 연구 중 사망은 발생하지 않았다. 보고된 AE의 대부분은 중증도가 경미하고 치료와 관련이 없었다. 연구 후 18개월의 장기간 추적 동안 의학적 문제는 보고되지 않았다. 활성 치료의 모든 참가자에서 요페는 관찰되지 않았다. 또한, 활성 치료에서 일지, KHQ로 측정한 OAB 증상의 악화 또는 요역학의 악화를 동반한 참가자는 없었다.

ION-02에서의 효능

[0496] 이들은 상승-용량 안전성 연구였지만, 2차 효능 종말점을 평가하였다. ION-02에서, 이 유전자 치료가 효과적일 수 있음을 시사하는 몇 가지 긍정적인 발견이 있었다. 요역학적 평가에 의해 측정된 바와 같이, 전달 후 24주에 기준선으로부터 감소된 배뇨근 수축 수의 전체 평균 차이에는 거의 유의한 경향이 있었다(P<0.0508). 8주에, 5000μg 용량 그룹에서도 기준선으로부터 절박 요실금 에피소드의 >40% 평균 감소가 관찰되는 경향이 있었다(P=0.0812).

ION-03에서의 효능

[0497] OAB에 대한 실행 가능한 치료로서 URO-902의 유용성은 플라스미드가 배뇨근에 직접 주사되었을 때 더욱 분명해졌다. 등록된 집단이 작았음에도 불구하고, ION-03 연구는 OAB를 갖는 참가자의 다중 2차 효능 종말점에서 빠르고 지속적인 개선을 보여주었다. 플라시보와 URO-902 주사 1주일 후를 비교해 보면, 배뇨 횟수/24시간의 평균 감소에서도 상당한 개선이 관찰되었다(플라시보, 1주일 평균: 11.27, 기준선으로부터의 평균 변화: +1.45; 16000μg, 1주일 평균: 7.89, 기준선으로부터의 평균 변화: -2.31, P=0.036; 24000μg, 1주일 평균: 14.46, 기준선으로부터의 평균 변화: -2.73, P=0.046)(도 22). 이러한 개선은 일반적으로 투여 후 2, 4, 12 및 24주에 적어도 하나의 용량 그룹에서 현저한 개선과 함께 24주 연구 내내 유지되었다.

[0498] 플라시보와 비교해 볼 때 둘 모두의 활성 용량에 대해 주사 1주 후 평균 배뇨 횟수/24시간의 상당한 개선이 관찰되었다(플라시보, 평균: 1주일에 11.59, 기준선으로부터의 평균 변화: +1.41; 16000μg, 평균: 1주일에 9.10, 기준선으로부터의 평균 변화: -2.16, P=0.044; 24000μg, 평균: 1주일에 14.46, 기준선으로부터의 평균 변화: -2.73, P=0.047)(도 23). 이들 개선은 일반적으로 주사 후 최대 24주까지 유지되었고, 8주를 제외한 모든 시험 주에서 현저한 개선이 관찰되었다. 절박 에피소드와 배뇨 둘 모두에 대해, URO-902의 2개의 활성 치료(16000μg 및 24000μg) 사이에 유의한 차이가 없었는데, 이는 아마도 참가자 수가 적기 때문일 것이다. 그러나, 24000μg 용량 그룹에서 더 긴 효과 지속을 향한 경향이 있었다(도 22 및 도 23).

[0499] 플라시보에 비해 활성 치료 그룹에서 절박 요실금 에피소드 수의 현저한 감소는 관찰되지 않았다. 그러나, 2, 4, 8 및 12주에 활성 치료 용량(16000μg 또는 24000μg) 중 적어도 하나에서 기준선으로부터의 상당한 감소가 관찰되었고, 24주에 두 활성 용량 모두에서 절박성 요실금 에피소드가 기준선으로부터 상당히 감소되었다(16000μg, -1.29, P=0.015; 24000μg, -2.29, P=0.005). 플라시보 그룹에서, 어떤 시점에서도 기준선으로부터 절박 요실금 에피소드의 유의한 감소는 관찰되지 않았다.

[0500] 치료에 대한 반응의 참가자 지각은 또한 치료 후 1주(P=0.019) 및 4주(P=0.0126)에 플라시보에 비해 조합된 활성 치료 용량 그룹에서 유의하게 개선되었다. 1주에, URO-902가 투여된 참가자의 약 44%가 약간의 이익을 보고하였고, 다른 44%는 매우 큰 이익을 보고하였다. 플라시보가 투여된 참가자의 25%만이 1주에 약간의 이익을 보고하였고, 누구도 매우 큰 이익은 보고하지 않았다.

[0501] KHQ로 평가된 QOL 파라미터는 많은 도메인에서 기준선에 비해 그리고 플라시보에 비해 개별 활성 치료 그룹 및 조합된 활성 치료 그룹에 대해 통계적으로 유의한 평균 개선을 나타내었다(도메인 2: 삶에 미치는 영향, 도메인 3: 역할 제한, 도메인 4: 신체적 제한, 도메인 5: 사회적 제한 및 도메인 8: 수면 에너지 포함). 연구 전반에 걸쳐 일관되고 지속적인 개선이 특히 두 활성 용량 모두에서 KHQ의 도메인 3에서 관찰되었다. 평가된 모든 시점(4, 8, 12 및 24주)에 기준선으로부터의 역할 제한 점수의 현저한 개선 및 플라시보에 비해 상당한 개선이 관찰되었다.

III. 논의

[0502] OAB에 대한 현재의 치료 옵션은 제한되어 있으므로, 이러한 광범위한 질환의 치료에 대한 새로운 접근법이 필요하다. BK 채널은 배뇨근 세포 흥분성의 중요한 조절자이며, 유전자 요법을 사용하여 이 채널의 활성을 조절하는 것이 그러한 새로운 접근법 중 하나이다. 기계적으로 매력적이지만, 칼륨 채널의 약리학적 활성화 시도는 OAB의 치료에서 임상적으로 성공하지 못했다. Chapple et al., Eur Urol. 2006;49(5):879-886.

[0503] URO-902는 OAB/절박 요실금의 양성 방광 질환을 치료하기 위한 국소화된 유전자 치료 접근법을 나타낸다. BK 채널을 과발현하도록 설계된 벡터의 점적주입은 래트 모델의 방광의 과수축성을 현저하게 감소시키며, 전임상 연구는 조직 과발현이 최대 6개월 동안 지속됨을 나타내었다. Christ et al., Urology. 2001;57(6 Suppl 1):111. URO-902로 BK 채널의 발현 수준을 조절하면 배뇨근 평활근의 흥분성을 감소시킴으로써 OAB/DO를 치료할 수 있다. 이는 URO-902를 사용한 hSlo 유전자 전달을 OAB에 대한 잠재적으로 매력적인 유전자 치료 옵션으로 만든다.

[0504] 이들 연구의 안전성 결과와 관련하여, 연속 소변, 혈액 및 EKG 연구에 의해 측정된 바와 같이 URO-902에 대한 전신 노출은 최소였으며, 이는 전신 영향의 위험이 거의 없는 국소 장기 효과를 뒷받침한다. 또한, URO-902에는 요폐와 같은 기관 특이적 안전성 신호가 없었다. 요폐 및 후속 요도 카테터 삽입의 필요성은 OAB의 치료에서 화학적 신경차단과 같은 다른 요법의 적용을 제한할 수 있다.

[0505] 2차 효능 결과의 경우, ION-03에서, URO-902를 배뇨근에 직접 주사했을 때 배뇨 및 절박 에피소드의 수에서 통계적으로 유의한 감소가 분명하게 관찰되었다. 더 낮은 용량의 방광내 점적주입(ION-02)으로 더 적은 효능이 관찰되었다. 이러한 차이는 용량과 관련될 수 있거나 직접 주사와 비교하여 방광내 점적주입으로 요로상피 장벽을 가로지르는데 있어 상대적 어려움 때문일 수 있다.

[0506] 방광 점적주입에 비해 방광벽으로의 직접 주사는 최적의 효과를 위해 유전자 전달 생성물을 전달하는 보다 확실한 방법인 것으로 보인다.

[0507] 전반적으로, 16,000μg 및 24,000μg 용량 사이에 유의한 차이는 관찰되지 않았는데, 이는 아마도 24,000μg 그룹의 참가자 수가 적기 때문일 것이다. 그럼에도 불구하고, 효과의 지속 기간은 16,000μg 그룹보다 24,000μg 그룹에서 더 긴 것으로 나타났다.

[0508] 참가자들에게 KHQ를 사용하여 치료에 대한 반응에 대해 그들의 의견을 물었을 때, 일지 변수로부터의 효능 결과가 반영되었고, 연구 전반에 걸쳐 다수의 용량 후 방문은 QOL 파라미터를 평가하는 많은 도메인에서 통계적으로 유의한 개선을 보고하였다(삶에 미치는 영향, 역할 제한, 신체적 제한, 사회적 제한 및 수면).

[0509] 플라스미드의 유전자 전달로 인한 BK 채널 유전자 발현의 수준은 결정되지 않았지만, 이 연구와 다른 연구의 데이터는 평활근의 긴장도를 조절하기에 충분한 유전자가 발현되었고 최대 6개월 동안 지속된다는 것을 나타내었다. Melman et al., Isr. Med. Assoc. J. 2007;9(3):143-146; Melman et al., Hum. Gene Ther. 2006;17(12):1165-1176; Christ et al., Am. J. Physiol. 1998;275(2):H600-H608; Melman et al., J. Urol. 2003;170(1):285-290.

[0510] 방광 평활근 세포를 연결하는 갭 접합부(connexin 43)는 배뇨근 전체에 융합체를 생성하여 전체 구조를 따라 이온 및 제2 메신저 신호의 신속한 통과를 가능하게 하며, 따라서 BK 발현 수준의 비교적 작은 변화에도 기능적 효과를 가능하게 할 수 있었다. 이와 같이, 방광 세포의 일부로의 URO-902의 제한된 흡수조차도 전체 방광 기능에 강력한 영향을 미칠 것으로 예상된다.

IV. 결론

[0511] 이러한 2개의 예비 1 상 연구에서 입증된 안전성 및 효능은 유전자 전달을 사용한 BK 채널 발현 수준의 조절이 OAB 및 다른 평활근 기능장애-관련 질병 또는 질환을 치료하기 위한 요법으로 사용될 수 있음을 제안하였다. 방광내 유전자 요법은 오랜 활성 기간의 잠재력을 갖고, 신체의 다른 곳에서 뜻밖의 부수적인 영향의 위험이 거의 없는 최소 침습적 기관 특이적 접근법이다.

실시예 13

과활동성 방광 및 절박 요실금 대상체에서 URO-902의 효능 및 안전성을 평가하는 2A 상 연구

I. 배경

[0512] URO-902(pVAX-hSlo)는 OAB의 치료를 위한 GMP 제조된 이중 가닥 데옥시리보핵산(DNA)-플라스미드 벡터 기반 유전자 치료 생성물이다. URO-902는 인간 평활근 Maxi-K 채널의 기공-형성 α 서브유닛, hSlo를 인코딩하는 cDNA 삽입물을 함유하는 GMP 제조된 DNA-플라스미드(pVAX 벡터)이다. Maxi-K 채널은 평활근 이완에 수반되는 유명하고 잘 연구된 K 채널 서브타입이다. 고조된 평활근 긴장도는 DO와 함께 OAB의 원인이 될 수 있기 때문에, 효과적인 URO-902 치료와 관련된 방광 배뇨근 평활근 세포에서 증가된 수의 Maxi-K 채널은 이 상태를 개선시킬 수 있다.

[0513] URO-902로 처리하면 세포막에서 Maxi-K 채널의 수가 증가하여, 정상 자극에 의해 세포가 활성화된 후 세포로부터 K⁺가 더 많이 유출된다. 유리 세포내 칼슘 농도는 평활근 세포 긴장도의 중요한 결정인자이다. 세포내 칼슘 수준의 증가는 평활근 긴장도의 증가(수축)와 관련이 있고, 세포내 칼슘 수준의 감소는 평활근 긴장도의 감소(이완)와 관련이 있다.

[0514] 평활근에서, K⁺의 밖을 향한 움직임은 세포 밖으로 양전하의 순 움직임을 일으켜, 세포 내부를 외부에 비해 더 음성으로 만든다. 이것은 두 가지 주요 효과를 갖는다. 첫째, 증가된 막 전위는 칼슘 채널이 개방된 것보다 폐쇄된 시간을 더 많이 보낼 것을 보장한다. 둘째, 칼슘 채널이 폐쇄될 가능성이 더 높기 때문에, 세포로의 Ca²⁺의 순 플럭스가 감소하고 상응하는 세포내 칼슘 수준이 감소한다. 감소된 세포내 칼슘은 평활근 이완으로 이어진다. 세포막에 더 많은 Maxi-K 채널이 있으면 평활근 세포 이완이 더 커진다. Maxi-K 채널 및 OAB 증후군에서 이의 역할에 대한 자세한 정보는 또한 실시예 14에 제공된다.

[0515] RO-902의 활성 및 안전성을 평가하는 광범위한 일련의 시험관내 및 생체내 비임상 연구가 수행되었다. 완료된 URO-902 비임상 연구로부터의 데이터는 실시예 14 및 상기 실시예에 요약되어 있다. 이러한 연구는 OAB뿐만 아니라 발기 부전(ED) 동물 모델 둘 모두를 포함하였다. 세포를 트랜스펙션시키고, hSlo를 발현하고, Maxi-K 채널을 세포막에 국소화하는 pcDNA/hSlo의 능력은 293 인간 배아 신장 세포(HEK293) 및 Xenopus 난모세포를 사용한 시험관내 실험에서 입증되었다. 생체내 약리학 연구에서, 0.1, 0.3 및 1 mg URO-902의 래트 방광으로의 경복막 점적주입에 의한 단일 투여는 부분 요도 출구(PUO) 폐쇄 래트 모델의 대조군과 비교하여 DO의 거의 완전한 제거를 초래하였다.

[0516] ED 동물 모델(래트 및 원숭이)에서, 대조군과 비교하여 hSlo에서 발기 반응의 증가가 관찰되었다. 래트에서 해면체내 주사를 통한 0.01 mg, 0.1 mg 또는 1 mg pcDNA/hSlo의 단일 투여는 잘 관용되었고, 어떤 용량에서도 주요 기관 조직의 조직병리학적 변화와 관련이 없었다. 0.1 mg pcDNA/hSlo의 해면체내 반복 투여는 해면체내 압력/혈압(ICP/BP) 비율을 단일 0.1 mg 용량 이상으로 증가시키지 않았고 임상 심혈관 파라미터에 대한 검출 가능한 부작용과 관련이 없었다.

[0517] 경복막 방광내 투여에 의해 0.01 내지 1 mg 범위의 해면체내 URO-902 및 0.1 내지 1 mg 범위의 URO-902의 용량을 투여한 래트에서 10개 복사체 pVAX-hSlo 수준에서 광범위한 생체분포 연구를 수행하였다. 주요 기관은 전달 후 1, 4, 8 및 24시간 및 1, 2 및 4주에 검사되었다. 경복막 방광내 연구에서, 총 DNA의 마이크로그램당 약 1,300만 개 복사체의 플라스미드가 방광에서 1주에 검출되었다. URO-902 투여 후 심장 조직 또는 고환 조직에서 어느 시점에서도 유전자 전달 신호는 검출되지 않았다.

[0518] 다른 연구에서, 슈퍼코일 pVAX-hSlo는 전혈에서 30분 이내에 닉 개방형 원형 플라스미드 DNA가 되었다. 따라서, URO-902가 전신 순환에 들어가면 활성 유전자 발현이 제한될 것이다.

[0519] 현재까지, 총 80명의 대상체(OAB를 갖는 여성 34명 및 ED를 갖는 남성 46명)에서 4개의 임상 연구가 이전 스폰서에 의해 완료되었다. OAB를 갖는 여성 대상체에서 URO-902의 단일 투여를 평가하는 2개의 1 상 연구가 완료되었다; 연구 ION-02는 방광내 점적주입을 평가하고 연구 ION-03은 (방광경검사를 통해) 배뇨근내 주사를 평가하였다.

[0520] 방광내 점적주입을 통한 5 mg/90 mL 및 10 mg/90 mL의 URO-902의 단일 투여(연구 ION-02) 및 방광으로의 배뇨근내 주사를 통한 16 mg 및 24 mg의 URO-902의 단일 투여는 중등도 OAB 및 DO를 갖는 여성 대상체에서 잘 관용되었다. 치료-응급 부작용(TEAE)의 대부분은 연구 치료와 관련이 없었다. 연구 ION-02에서는 심각한 부작용(SAE)이 보고되지 않았고 연구 ION-03에서 보고된 하나의 SAE는 연구자에 의한 치료와 관련이 없는 것으로 간주되었다. 치료-관련 사망은 보고되지 않았으며 TEAE로 인한 연구 중단도 없었다. 두 연구 모두의 예비 효능 결과는 각 연구의 적은 수의 대상체에도 불구하고 긍정적인 효능 결과를 나타내었다.

[0521] 방광벽/배뇨근에 직접 주사하여 투여된 2개의 증가하는 용량의 URO-902(16 mg 및 24 mg)를 평가하는 연구 ION-03, 1 상, 다기관, 이중 맹검, 플라시보 대조된 설계 연구에서, 대상체 일지 변수 중 2개에 대해 16 및 24 mg의 용량에서 플라시보 및 기준선에 비해 통계적으로 유의한 변화가 관찰되었다: 24시간당 배뇨 및 절박 에피소드 수. 또한, 절박 요실금 에피소드는 플라시보는 아니지만 기준선에 비해 상당한 변화를 보였다. 이러한 변화는 치료 후 최종 24주 추적 방문까지 여러 번의 방문에 걸쳐 발생하였다.

[0522] 또한, ED을 갖는 남성 대상체에서 URO-902의 단일 해면체내 주사를 평가하는 1 상(연구 ION-301) 및 2 상(연구 ION-04-ED) 연구가 완료되었다. 0.5 mg 내지 16 mg 범위의 용량의 URO-902의 단일 해면체내 주사가 ED를 갖는 남성 대상체에서 잘 관용되었다(연구 ION-301 및 ION-04 ED). 보고된 부작용의 대부분은 중증도에 있어 경증 내지 중등도였으며 치료와 관련이 없었다. 각 연구에서 단지 2개의 SAE가 보고되었으며 모두는 연구 치료와 관련이 없었다. 두 연구 도중 사망은 발생하지 않았다. 완료된 URO-902 임상 연구로부터의 데이터는 실시예 14에 요약되어 있다.

II. 목표 및 종말점

[0523] 이 연구의 목적은 (1) 투여 후 48주까지 OAB 및 UUI를 갖는 대상체에서, 플라시보와 비교하여, 24 mg 및 48 mg의 단일 용량의 URO-902(배뇨근내 주사를 통해 투여됨)의 효능을 평가하고, (2) 투여 후 48주까지 OAB 및 UUI를 갖는 대상체에서, 플라시보와 비교하여, 24 mg 및 48 mg의 단일 용량의 URO-902(배뇨근내 주사를 통해 투여됨)의 안전성 및 관용성을 평가하기 위한 것이다. 이 연구는 공식적인 통계 1차 종말점 가설을 갖지 않는다.

[0524] 연구 종말점은 효능 종말점, 안전성 종말점(예를 들어, 부작용) 및 다른 종말점(예를 들어, 혈액 또는 소변에서 hSlo cDNA 농도)을 포함한다. 효능 종말점은, 예를 들어, 12주에 기준선으로부터의 일일 평균 UUI 에피소드 수의 변화; 12주에 기준선으로부터의 일일 평균 배뇨 횟수의 변화; 12주에 기준선으로부터의 일일 평균 요실금(UI) 에피소드 수의 변화; 12주에 기준선으로부터의 일일 평균 절박 에피소드 수의 변화; 12주에 기준선으로부터 일일 UUI 에피소드의 ≥ 50%, ≥ 75% 및 100% 감소를 달성한 대상체의 비율; 12주에 기준선으로부터의 배뇨당 평균 배뇨 부피의 변화; 건강 결과 파라미터(예를 들어, 12주에 기준선으로부터의 요실금-특이적 삶의 질 도구(I-QOL)의 총 요약 점수의 변화, 12주에 기준선으로부터의 OAB 설문지(OAB-q) 점수의 변화 또는 12주에 전반적 환자 개선 지수(PGI-C) 척도 점수에 기초한 방광 증상의 전체적인 변화), 요역학적 파라미터(예를 들어, 배뇨에 대한 1차 감각에서의 방광내압측정 부피(CV1^stsen), 최대 방광내압측정 용량(MCC), 저장 단계 동안 최대 배뇨근 압력(P_detmax), 첫 번째 불수의 배뇨근 수축(IDC)의 존재/부재 및 존재하는 경우, (i) 첫 번째 IDC의 부피(V_PmaxIDC), (ii) 첫 번째 IDC 동안의 최대 배뇨근 압력(P_maxIDC)을 포함한다.

III. 전반적인 연구 설계

[0525] 연구 치료 그룹: URO-902(24 mg 또는 48 mg)는 방광경검사를 통해 배뇨근내 주사로 투여될 것이다. URO-902 24 mg의 단일 치료가 코호트 1의 대상체에게 투여될 것이다. 독립적인 데이터 및 안전 모니터링 위원회(DSMB)는 코호트 1의 모든 대상체로부터 6주까지의 안전성 데이터를 비맹검 검토한 후에만 용량 증가에 관해 권고할 것이다. 고용량(URO-902 48 mg)의 연구 치료는 DSMB가 코호트 2로 진행하는 것이 안전하다고 권고한 후에만 시작될 것이다.

[0526] 대조군: 코호트 1 및 코호트 2에서 매칭되는 플라시보(20% 수크로스[PBS-20%]을 갖는 포스페이트 완충 염수).

[0527] 투여량/투여 요법: 코호트 1 또는 코호트 2의 각 대상체에 대해, 단일 치료가 "치료 기준일"의 충족 후 1일에 투여될 것이다.

[0528] 무작위화/계층화: 총 78명으로 추정되는 대상체가 2개의 코호트에 등록될 것이며, 대략 39명의 대상체가 각 코호트에 무작위화된다. 둘 모두의 코호트에서, 대상체는 URO-902(24 mg 또는 48 mg) 또는 플라시보를 수용하기 위해 2:1 비로 무작위화될 것이다. 각 코호트는 개별적으로 무작위화되며, 등록은 코호트 1(URO-902 24 mg[n=26] 및 플라시보[n=13])부터 시작하여 코호트 2(URO-902 48 mg[n=26] 및 플라시보[n=13])로 순차적으로 진행될 것이다. 무작위화 방문시에, 코호트 1과 코호트 2 둘 모두의 대상체는 URO-902의 단일 치료 또는 매칭되는 플라시보를 수용하기 위해 중앙에서 무작위화될 것이다. 무작위화는 일일 기준선 UUI 에피소드 및 DO의 존재 또는 부재에 의해 계층화될 것이다.

[0529] 방문 일정: 연구 방문은 코호트 1과 2에 대해 동일할 것이다. 대상체는 2주 스크리닝 기간 동안 적격성에 대해 평가될 것이다(-35일 내지 -21일). 적격 대상체는 각 코호트 내에서 무작위화 방문(-14일 내지 -7일)시에 치료에 무작위화될 것이다; 그러나, 대상체는 1일에 방광경검사를 통해 연구 치료를 투여받을 것이다. 모든 대상체는 예정된 치료 후 클리닉 방문에서 2, 6, 12, 18 및 24주에, 또는 대상체가 연구를 종료할 때까지 평가될 것이다. 그 후, 36주 및 48주에 2회의 추적 전화 방문이 수행될 것이다.

[0530] 추가 OAB 치료: 24주에 시작하여, 대상체는 연구자의 임상 재량에 따라 추가 OAB 치료(들)를 요청하고 처방받을 수 있다. 24주 또는 그 이후에 추가 OAB 치료(들)를 받은 대상체는 모든 앞으로의 전화 방문(36주 및/또는 48주)에서 부작용을 평가하기 위해서만 추적될 것이다. 대상체가 추가 OAB 치료를 처방받으면 효능 평가는 수행되지 않을 것이다.

[0531] 대상체 수: 약 78명의 성인 여성 대상체가 2개의 코호트에 무작위화되며, 대략 39명의 대상체가 각 코호트에 무작위화될 것이다.

[0532] 통계적 방법: 다음 분석 집단이 평가될 것이다: 안전성, 치료 의도 노출(ITT-E) 및 ITT-E(수정됨). 안전성 집단은 연구 약물을 수용한 모든 대상체로 구성될 것이며, 실제 받은 치료에 기초하여 치료 응급 부작용 및 다른 안전성 평가를 받는데 사용될 것이다. ITT-E는 최대 24주까지 인구 통계학, 기준선 특성 및 효능 분석에 사용될 것이다.

[0533] ITT-E 집단은 무작위화된 모든 대상체 및 코호트 1 및 2로부터의 치료된 대상체로 구성될 것이다. 24주 후에 추가 OAB 치료(들)를 받지 않은 ITT-E의 대상체로 구성되는 ITT-E(수정됨)를 사용하여 24주 후에 효능을 평가할 것이다. 중간 분석은 코호트 1의 대상체의 ≥ 50% 및/또는 코호트 2의 대상체의 ≥ 50%가 적어도 12주의 무작위화 후 추적을 완료했을 때(또는 12주 이전에 연구를 조기에 종료했을 때) 향후 계획 목적으로 수행될 수 있다.

[0534] 계획된 중간 분석은 코호트 1 및 2의 모든 대상체가 12주 방문을 완료한 후(또는 12주 이전에 연구를 조기에 종료한 후), 12주에 프로토콜의 목적을 평가하기 위해 수행될 것이다. 최종 분석은 모든 대상체가 연구를 완료한 후에 수행될 것이다. 중간 분석 및 최종 분석에 대한 자세한 내용은 통계 분석 계획에 설명되어 있다.

[0535] 연구는 공식적인 통계 1차 종말점 가설을 갖지 않는다. 기술 통계는 효능 및 안전성 종말점을 평가하는데 사용될 것이다. 연속 효능 종말점의 경우, 각 치료 그룹에 대해 최소 제곱 평균의 추정치, 표준 오차 및 95% 신뢰 구간(CI)이 제공될 것이다. 플라시보에 대한 비교로부터 명목상 p-값은 설명 목적으로 제공될 수 있다. 플라시보에 비해 각 연속 효능 변수에 대한 각 방문에서 기준선으로부터의 변화에 대한 치료 차이의 포인트 추정치 및 95% 신뢰 구간은 반복 측정(MMRM) 방법을 위한 혼합 효과 모델을 사용하여 분석될 것이다.

[0536] 분석 모델은 치료, 방문, 및 방문 상호작용에 의한 치료에 대한 용어 외에도, 공변량으로 기준선 값에 대한 용어를 포함할 것이다. 평가된 요역학적 변수의 경우, 독립적인 중앙 검토자의 해석만 분석될 것이다. 12주에 기준선 UUI 에피소드로부터 ≥ 50% 감소를 달성한 대상체의 비율이 각 치료 그룹에 대해 계산될 것이다. 또한, 반응자 분석은 기준선에 비해 12주에 UUI 에피소드의 ≥ 75% 및 100% 감소를 달성한 대상체에 대해서도 계산될 것이다.

[0537] Cochran-Mantel-Haenszel(CMH) 방법은 계층화 인자를 조정하여 2개의 치료 그룹 사이의 반응자 비율을 비교하는데 사용될 것이다. 모든 방문에 대한 데이터도 제시될 것이다. 안전성 변수의 경우, 연구 약물을 수용한 2개 코호트의 모든 대상체로부터의 데이터가 포함될 것이다. 부작용의 발생률이 요약될 것이다. 기준선으로부터 PVR 소변 부피의 변화가 분석될 것이다.

[0538] 연구의 개략도는 도 24에 제공된다.

IV. 상세한 연구 설계

[0539] 이는 40 내지 76세 여성 대상체의 OAB 및 UUI의 치료에서 URO-902(24 mg 또는 48 mg)의 효능 및 안전성을 평가하는 다기관, 무작위화, 이중 맹검, 플라시보 대조, 단일 치료, 2 코호트, 용량-상승 연구이다. 대상체는 모든 스크리닝 절차를 완료해야 하며 등록 및 무작위화에 대한 자격을 갖추기 위해 모든 자격 요건을 충족해야 한다. 연구의 총 기간은 2주 스크리닝 기간(-35일 내지 21일), 무작위화(14일 내지 7일), 1일차 치료 및 48주 치료 후 이중 맹검/추적 기간을 포함하여 53주이다. 연구 방문은 코호트 1과 2에 대해 동일할 것이다. 대상체는 스크리닝 기간 동안 적격성에 대해 평가될 것이다.

[0540] 적격 대상체는 무작위화 방문에서 각 코호트 내의 치료에 무작위화될 것이다; 그러나, 대상체는 1일에 방광경검사를 통해 연구 치료를 투여받을 것이다. 모든 대상체는 예정된 치료 후 클리닉 방문에서 2, 6, 12, 18 및 24주에, 또는 대상체가 연구를 종료할 때까지 평가될 것이다. 그 후, 안전성 평가를 위한 2회의 추적 전화 방문이 36주 및 48주에 수행될 것이다. 총 78명으로 추정되는 대상체가 2개의 코호트에 등록될 것이며, 대략 39명의 대상체가 각 코호트로 무작위화된다. 둘 모두의 코호트에서, 대상체는 URO-902(24 mg 또는 48 mg) 또는 플라시보를 수용하기 위해 2:1 비로 무작위화될 것이다.

[0541] 각 코호트는 개별적으로 무작위화되며, 등록은 코호트 1(URO-902 24 mg[n=26] 및 플라시보[n=13])부터 시작하여 코호트 2(URO-902 48 mg[n=26] 및 플라시보[n=13])로 순차적으로 진행될 것이다. 코호트 1 및 코호트 2 둘 모두의 대상체는 URO-902의 단일 치료 또는 매칭되는 플라시보를 수용하기 위해 중앙에서 무작위화될 것이다(14일 내지 7일). 무작위화는 일일 기준선 UUI 에피소드 및 DO의 존재 또는 부재에 의해 계층화될 것이다.

[0542] 코호트 1에서, 모든 대상체가 6주에 도달한 후 DSMB에 의한 안전성 데이터의 비맹검 검토가 수행될 것이다. 고용량의 URO-902 48 mg의 연구 치료는 DSMB가 코호트 2로 진행하는 것이 안전하다고 권고한 후에만 시작될 것이다. 작업 및 책임과 안전성 파라미터의 평가에 대한 자세한 내용은 DSMB 차터에 제공될 것이다. 독립적인 DSMB는 전체 연구를 통틀어 안전성 데이터를 검토할 것이다.

[0543] 코호트 1 또는 코호트 2의 각 대상체에 대해, 단일 치료가 "치료 기준일"의 충족 후 1일에 투여될 것이다. 대상체는 방광경검사를 통해 배뇨근내 주사에 의해 투여되는 URO-902 또는 플라시보의 단일 치료를 받을 것이다.

[0544] 대상체는 연구 치료의 투여 후 48시간 이내에 발생하는 모든 부작용을 보고하기 위해 연구 현장에 연락하도록 지시받을 것이다. 3일 방광 일지를 사용하여 하루에 UUI, 배뇨, 절박 및 UI 에피소드의 수 뿐만 아니라 하나의 24시간 소변의 배뇨 부피와 관련된 탐색적 효능 종말점을 평가하기 위한 정보를 수집할 것이다.

[0545] 용량의 타당성: URO-902의 활성 및 안전성을 평가하는 광범위한 일련의 시험관내 및 생체내 비임상 연구가 최대 1 mg의 용량으로 OAB 및 ED 동물 모델에서 수행되었다. 비임상 평가의 결과는 URO-902 임상 연구의 시작을 뒷받침하였다. ED 래트 모델에서의 다중 투여를 포함하여, 현재까지 수행된 연구에서 임의의 용량의 임의의 전임상 연구에서 독성은 어느 용량 수준에서도 관찰되지 않았다.

[0546] ED 및 OAB 동물 모델의 광범위한 데이터는 임의의 시점에 평가된 임의의 40개 기관에서 조직병리학적 이상을 나타내지 않았고, 전달된 기관 이외의 임의의 다른 기관에서 그 전달 후 1주일 넘게 유전자의 발현을 나타내지 않았으며, 전달한지 최대 1개월 후에 수행된 ED 연구에서도 유전자의 발현을 나타내지 않았다. 방광 전임상 연구는 12.56 cm²의 폐쇄된 방광 표면적 및 4 mL의 평균 대략적인 방광 부피를 기준으로 0.01, 0.03, 0.1, 0.3 및 1 mg의 단일 용량을 평가하였다. 표면적의 공식은 4πr²이다. 따라서, 인간 방광 표면적(400 mL의 평균 방광 부피)은 263.5 cm²이다. 따라서, 인간 대 래트 방광의 대략적인 용량 관계는 20:1이다.

[0547] 완료된 OAB 임상 연구에서, 방광벽/배뇨근에 직접 주사함에 의한 최대 25 mg의 용량은 잘 관용되었다. 완료된 URO-902 비임상 및 임상 연구로부터의 데이터는 실시예 14에 요약되어 있다. 1 상 개념 증명 OAB 연구(ION-03)에서, 래트에서의 등가 용량은 배뇨근에 다중 직접 방광 주사에 의한 단일 투여로서 제공된 24 mg의 최고 인간 용량에 대해 0.222 내지 0.480 mg였고 16 mg의 보다 낮은 인간 용량에 대해 0.148 내지 0.240 mg였다. 연구 ION-03에서 16 mg 또는 24 mg 용량에서 임상적으로 유의한 안전성 신호는 확인되지 않았다.

[0548] 24 mg의 시작 용량은 OAB 및 UUI를 갖는 대상체에서 URO-902의 안전성 및 효능을 평가하기 위해 계획된 2a 상 임상 연구 URO-902-2001에서 초기에 시험될 것이다. 연구 URO-902-2001은 용량-상승 설계를 갖는다. 코호트 1(URO-902 24 mg)에서 6주까지 모든 대상체로부터 관찰된 안전성 데이터의 비맹검 검토에 기반하여, DSMB는 코호트 2를 진행하도록 권장할 것이다.

[0549] 고용량 코호트(URO-902 48 mg)의 연구 치료는 DSMB가 코호트 2로 진행하는 것이 안전하다고 권고한 후에만 시작될 것이다. 래트에서 인간 용량 24 mg 및 인간 용량 48 mg에 상응하는 용량은 각각 0.480 mg 및 0.960 mg 이하이다. 전술한 바와 같이, 래트에서 폐쇄된 방광 전임상 연구는 방광의 표면적을 기준으로 최대 1 mg의 단일 용량을 평가하였다. 래트 ED 모델에서, 최대 1 mg의 용량이 해면체내 주사에 의해 투여되었다. 따라서, 계획된 임상 연구에서 평가될 최고 용량(48 mg)뿐만 아니라 24 mg의 URO-902의 시작 용량 농도는 전임상 연구에서 조사된 용량 범위 내에 있다.

[0550] 연구 종료의 정의: 연구의 종료는 연구의 마지막 대상체에 대한 활동 일정에 표시된 마지막 방문 또는 마지막 예정된 절차(48주)로 정의된다. 대상체는 치료를 받았고, 어떤 이유로든 중단하지 않았으며, 그녀가 등록된 코호트의 예정된 최종 방문에 참석하고, 연구에서 적절하게 나온 경우 연구를 완료한 것으로 간주된다.

[0551] 연구 집단 : 연구는 OAB 및 UUI를 갖는 여성 대상체에서 수행 중이다. 구체적인 포함 및 제외 기준은 아래에 명시되어 있다. 프로토콜 포기 또는 면제로도 알려진 모집 및 등록 기준에 대한 프로토콜 편차의 전향적 승인은 허용되지 않는다.

[0552] 포함 기준: 대상체가 이 연구에 참여할 자격이 있으려면 다음 포함 기준을 모두 충족해야 한다.

1. 동의서 양식에 나열된 요구 사항 및 제한 사항을 준수하는 것을 포함하는 사전 서면 동의서를 제공할 수 있다.

2. 대상체는 스크리닝시 40세 내지 76세의 여성이다.

3. 대상체는 문서화된 대상체 병력에 의해 결정된, 스크리닝 전 적어도 6개월의 기간 동안 UUI와 함께 OAB(빈뇨 및 절박)의 증상을 갖는다.

4. 대상체는 하루에 ≥ 1회의 UUI 에피소드를 경험한다(즉, 스크리닝 기간 동안 완료된 3일 대상체 방광 일지 상에 총 ≥ 3회의 UUI 에피소드).

5. 대상체는 하루에 평균 ≥ 8회 배뇨(화장실 배뇨)(즉, 스크리닝 기간 동안 완료된 3일 대상체 방광 일지 상에 총 ≥ 24회 배뇨)로 정의되는 배뇨 빈도를 경험한다.

6. 연구자의 견해에 따르면, 대상체는 OAB 증상의 치료를 위한 ≥ 1회의 경구 또는 경피 약리 요법(예를 들어, 항콜린성제, 베타-3 효능제 등)으로 적절하게 관리되지 않았다. 적절하게 관리되지 않음은 다음 중 하나를 충족하는 것으로 정의된다:

- 미국식품의약국(FDA) 승인 용량(들)에 대한 약리 요법의 적어도 4주 기간 후 부적절한 반응(즉, 약리 요법에도 불구하고 대상체가 여전히 실금 상태였다), 또는

- FDA 승인 용량(들)에 대해 적어도 2주 기간의 약리 요법 후 부작용 제한

7. 대상체는 연구자에 의해 필요하다고 결정되는 경우, 연구 치료를 받은 후 언제든지 방광을 비우기 위해 깨끗한 간헐적 카테터 삽입(CIC)을 사용하고자 한다.

8. 대상체는 임신 가능성이 없다.

9. 연구자의 견해에 따르면, 대상체는 다음을 수행할 수 있다: 도움 없이 화장실 사용; 24시간 기간 동안 배뇨 측정당 배뇨된 소변 부피 수집; 방광 일지 및 설문지 완료; 및 모든 연구 방문에 참석을 포함하는 연구 요구 사항 완료.

[0553] 제외 기준: 대상체는 스크리닝 기간 동안 및 무작위 방문에서 평가된 다음 기준 중 어느 하나에 대해 연구의 참여로부터 제외될 것이다:

1. 대상체는 임의의 공지된 신경학적 이유(예를 들어, 척수 손상, 다발성 경화증, 뇌혈관 사고, 알츠하이머병, 파킨슨병 등)로 인해 OAB의 증상을 갖는다.

2. 대상체는 연구자의 견해에 따르면, 대상체의 병력에 의해 결정된 스트레스 요실금이 우세하다.

3. 대상체는 현재 야뇨증을 포함하는 OAB의 증상을 치료하기 위해 약물 또는 요법을 사용하거나 사용할 계획이다. 이전에 이러한 약물을 수용한 대상체는 스크리닝 방문을 시작하기 전에 다음과 같이 사용을 중단해야 한다:

- 데스모프레신의 경우, 적어도 하루 전

- 항콜린성 요법의 경우, 적어도 14일 전

- 방광내 항콜린성 요법의 경우, 적어도 4주 전

- β₃ 효능제의 경우, 적어도 14일 전

4. 비뇨기과 적응증에 대해 이전에 오나보툴리눔독소A(또는 임의의 다른 독소)로 치료받은 대상체. 비-비뇨기과 적응증에 대해 오나보툴리눔독소A(또는 다른 독소)로 치료받은 대상체는 적격이다.

5. 대상체는 요실금을 관리하기 위해 CIC 또는 유치 카테터를 사용한다.

6. 대상체는 무작위화 12개월 이내에 임의의 방광내 약리학적 제제(예를 들어, 캡사이신, 레지니페라톡신, 오나보툴리눔독소A 또는 다른 독소)로 치료되었다.

7. 대상체는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는 방광 기능에 영향을 미칠 수 있는 OAB 이외의 임의의 골반 또는 비뇨기과 이상, 방광 수술 또는 질병의 병력 또는 증거를 갖는다:

- 스크리닝시 또는 스크리닝 전 6개월 이내에 방광 결석 및/또는 방광 결석 수술.

- 스크리닝 1년 이내의 수술(최소 침습 수술 포함): 스트레스 요실금, 자궁 탈출증, 직장탈출 또는 방광탈출.

- 연구 기간 동안 요실금 치료를 위해 이식된 전기자극/신경조절 장치의 현재 또는 계획된 사용)

- 연구 기간 동안 다른 이식 불가능한 전기자극 장치의 사용.

8. 대상체는 연구자의 견해에 따르면, 간질성 방광염/통증성 방광 증후군의 병력이 있다.

9. 대상체는 동시에 또는 스크리닝 전 4주 이내에 생식기 사마귀 이외의 활성 생식기 감염을 갖는다.

10. 대상체는 3등급 이상의 자궁 탈출증을 갖는다(즉, 자궁경부가 질구 밖으로 내려감)

11. 대상체는 방광암 또는 다른 요로상피 악성종양의 병력 또는 현재 진단을 가지며/거나 조사되지 않은 의심스러운 소변 세포학 결과를 갖는다. 의심스러운 소변 세포학 이상은 요로상피 악성종양이 현지 현장 관행에 따라 연구자가 만족할 정도로 배제될 것을 요구한다.

12. 대상체는 연구자의 견해에 따르면, 스크리닝 또는 무작위화시 방광 출구 폐쇄의 증거를 갖는다.

13. 대상체는 연구자의 견해에 따르면, 스크리닝 또는 무작위화시 요도 출구 폐쇄 또는 요도 손상 또는 협착의 증거를 갖는다.

14. 대상체는 스크리닝시 > 100 mL의 PVR 소변 부피를 갖는다. PVR 측정은 같은 날에 한 번 반복될 수 있다; 반복 측정이 100 mL를 초과하는 경우 대상체는 제외되어야 한다.

15. 대상체는 스크리닝 6개월 이내에 중재(예를 들어, 카테터 삽입)로 치료된 요폐 또는 증가된 PVR 소변 부피를 가졌다. 참고: 24시간 이내에 해결된 수술 절차의 결과로 인한 배뇨 문제는 제외 사항이 아니다.

16. 대상체는 무작위화 전 3일 방광 일지 수집 기간 동안 24시간 동안 연속적으로 수집된 > 3000 mL의 배뇨된 소변의 24시간 총 부피를 갖는다.

17. 대상체는 스크리닝 6개월 이내에 3개 이상의 UTI 병력이 있거나 만성 UTI를 예방하기 위해 예방 항생제를 복용하고 있다. 스크리닝 동안 현재 급성 UTI를 갖는 대상체는 적절하게 치료될 수 있고 자격이 있다.

18. 대상체는 스크리닝시 정상 상한의 > 2배의 혈청 크레아티닌 수준을 갖는다.

19. 대상체는 현재 또는 이전에 조사되지 않은 혈뇨를 갖는다. 비뇨기과/신장 병리학이 연구자가 만족할 정도로 배제된 경우, 조사된 혈뇨를 갖는 대상체는 연구에 들어갈 수 있다.

20. 대상체는 연구 동안 사용될 URO-902, 마취제 또는 항생제에 대해 알려진 알레르기 또는 민감도를 갖는다.

21. 대상체는 영구적으로 보행 보조기를 필요로 한다.

22. 대상체는 현재 다른 치료 연구에 참여하고 있거나 이전에 스크리닝 30일 이내에(또는 현지 요구 사항이 지정하는 경우 더 길게) 참여한 적이 있다.

대상체는 연구자의 견해에 따르면, 연구의 결과를 혼동시키거나, 연구 절차를 준수하는 대상체의 능력을 방해하거나, 대상체의 최선의 이익이 아닌 연구에 참여할 수 있는 임의의 상태, 요법, 실험실 이상 또는 다른 상황의 이력 또는 현재 증거를 갖는다.

[0554] 투여되는 연구 약물: 연구에 등록된 모든 적격 대상체는 이들이 등록된 코호트에 기초하여 URO-902 또는 플라시보의 단일 이중 맹검 치료를 받을 것이다. URO-902(24 mg 또는 48 mg) 또는 매칭되는 플라시보는 방광경검사를 통해 배뇨근내 주사로 투여될 것이다. 코호트 1의 경우, URO-902 24 mg 또는 플라시보의 단일 치료가 투여될 것이다. 코호트 1에서 6주까지 모든 대상체로부터 관찰된 안전성 데이터의 비맹검 검토에 기반하여, DSMB는 코호트 2를 진행하도록 권장할 것이다. 고용량(URO-902 48 mg)의 연구 치료는 DSMB가 코호트 2로 진행하는 것이 안전하다고 권고한 후에만 시작될 것이다. 코호트 1: URO-902 24 mg 또는 매칭되는 플라시보(20% 수크로스를 갖는 포스페이트 완충 염수[PBS-20%]). 코호트 2: URO-902 48 mg 또는 매칭되는 플라시보(PBS-20%). 표 19는 연구 약물에 대한 요약을 제공한다.

표 19. 연구 약물 요약

[0555] 치료 기준일: 코호트 1 또는 코호트 2의 각 대상체에 대해, 단일 치료가 다음 "치료 기준일"의 충족 후 1일에 투여될 것이다:

(a) 음성 소변 딥스틱 시약 스트립 시험(니트레이트 및 백혈구 에스테라제에 대해),

(b) 평가되는 경우, 가능한 UTI에 대한 음성 소변검사/소변 배양/민감도 결과가 검토되었다,

(c) 대상체는 연구자의 견해에 따르면, UTI에 대해 무증상이다,

(d) 방광경검사 전 또는 검사시 방광 결석이 없음,

(e) 연구자는 연구자의 견해에 따라, 대상체가 URO-902를 수용함으로써 현저한 위험에 처하게 되는 조건 또는 상황이 존재하지 않음을 계속 판단한다.

[0556] 치료 투여: 대상체가 항응고제 또는 항혈소판 약물을 복용하고 있는 경우, 대상체가 배뇨근내 주사 치료 2-3일 전 및 치료 당일에 이러한 약물을 중단할 수 있다면, 연구자가 임상적으로 필요하다고 간주하는 경우, 대상체의 주치의(또는 내과 의사, 심장 전문의 등)와 상의한다. 항응고제 및/또는 항혈소판 요법을 받는 대상체는 연구자의 임상적 판단에 따라, 출혈의 위험을 감소시키기 위해 적절하게 관리되어야 한다.

[0557] 모든 대상체는 치료 투여 1일 전 및 치료 후 추가 1일 동안 예방 항생제를 수용해야 한다. 연구 치료를 투여하기 전에, 대상체는 방광을 비운 다음 누운 자세를 취하도록 지시받을 것이다. 치료 투여 동안, 마취제의 사용은 연구자에 의해 결정될 것이다. 모든 연구 절차는 방광경검사를 위한 현지 현장 관행에 따라 적절한 소독 기술을 사용하여 수행되어야 한다. 요도구의 소독 후, 현지 현장 관행에 따라 멸균된 단일 사용 경요도 카테터의 삽입을 용이하게 하는 윤활 젤이, 국소 마취제를 사용하거나 사용하지 않으며, 허용된다.

[0558] 모든 대상체에 대해, 방광에서 국소 마취제 점적주입은 다음과 같이 진행될 것이다:

(1) 절차 전에 1% 내지 4% 리도카인(또는 유사하게 작용하는 국소 마취제)을 방광에 점적주입,

(2) 점적주입 용액은 충분한 마취를 달성하기 위해 적어도 15분 동안 방광에 남아 있어야 한다;

그 후, 방광에서 리도카인을 배출하고, 염수로 헹구고, 다시 배출시킨다.

[0559] 연구 치료의 투여를 위해 유연하거나 단단한 방광경이 사용될 것이다. 현지 현장 관행에 따라 방광경을 삽입하기 위해 윤활 젤이 사용될 것이다. 방광에는 연구 주사를 시각화하기에 충분한 양의 염수가 점적주입될 것이다. 12 mL의 연구 약물로 미리 채워진 12 mL 주사기 1개와 PBS-20%로 미리 채워진 1 mL 주사기 1개를 준비하여 치료 투여 준비가 완료된다. 주사 바늘은 약 0.5 mL의 연구 약물로 프라이밍될 것이다. 12 mL의 연구 약물은 각각 약 0.6 mL의 20회 주사로 투여될 것이다. 방광경을 통한 직접 시각화 하에서, 주사는 배뇨근 벽에 고르게 분포되고, 방광 돔과 삼각부를 피하면서 약 1 cm 간격으로 배치될 것이다.

[0560] 연구 약물을 투여하려면(12 mL 주사기로부터), 각 주사에 대해 바늘을 배뇨근에 약 2 mm 삽입해야 한다. 최종 주사 부위의 경우, 충분한 양의 PBS-20%(1 mL 주사기로부터)가 주사 바늘을 통해 밀려 나와 남은 양의 연구 약물의 전달을 보장할 것이다.

[0561] 주사가 투여된 후, 시각화에 사용된 염수는 대상체가 클리닉을 떠나기 전에 배뇨 능력을 입증할 수 있도록 방광에서 배출되어서는 안된다. 대상체는 관찰을 위해, 그리고 자발적인 배뇨가 발생할 때까지 적어도 30분 동안 클리닉에 머물러야 한다.

[0562] 대상체는 연구 치료의 투여 후 48시간 이내에 발생하는 모든 부작용을 보고하기 위해 연구 현장에 연락하도록 지시받을 것이다.

[0563] 준비/취급/저장: URO-902 및 플라시보가 임상 현장으로 운송될 때, 현장은 두 생성물을 모두 -20℃에 저장해야 한다. 투여 전날, 생성물을 해동하고 2 내지 8℃에서 밤새 냉장고에 저장한다. 생성물은 해동 후 재냉동되지 않아야 한다. 연구 약물(URO-902 또는 플라시보)은 최대 14일 동안 냉장고(원래 바이알에서 2 내지 8℃)에 보관할 수 있다.

[0564] 편견을 최소화하기 위한 측정(무작위화 및 맹검): 둘 모두의 코호트에서, 대상체는 URO-902(24 mg 또는 48 mg) 또는 플라시보를 수용하기 위해 2:1 비로 무작위화될 것이다. 각 코호트는 개별적으로 무작위화되며, 등록은 코호트 1부터 시작하여 코호트 2로 순차적으로 진행된다. 무작위화 방문시에, 코호트 1과 코호트 2 둘 모두의 대상체는 URO-902의 단일 치료 또는 매칭되는 플라시보를 수용하도록 중앙에서 무작위화될 것이다. 무작위화는 일일 기준선 UUI 에피소드 및 DO의 존재 또는 부재에 의해 계층화될 것이다. 대상체는 대화형 웹 응답 시스템(IWRS) 및 스폰서 또는 피지명자에 의해 생성된 무작위화 일정을 사용하여 무작위화된 연구 약물에 중앙에서 할당될 것이다.

[0565] 요역학적 파라미터: 요역학적 평가는 무작위화 방문 동안 또는 1일(치료 투여 전)에 대상체 적격성을 확인한 후 기준선에서만 수행될 것이다. 스크리닝 첫날 전 90일 이내에 수행된 과거 요역학적 연구는 아래에 설명된 기준이 충족되는 경우 기준선 요역학적 평가가 될 수 있다. 12주에, 모든 대상체는 두 번째 요역학적 평가를 받을 것이다.

[0566] 다음의 3가지 기준이 충족되는 경우, 과거 요역학적 연구는 기준선 요역학적 평가를 대신할 수 있다: (1) 스크리닝 첫날 전 90일 이내에 과거 요역학적 연구를 획득함, (2) 과거 요역학적 결과를 중앙 판독가가 평가에 이용할 수 있음, 및 (3) 대상체가 어떤 OAB 약물로도 치료받지 않았거나 OAB 치료를 중단함.

[0567] 다음의 요역학적 파라미터가 측정된다: (a) 배뇨에 대한 1차 감각에서의 방광내압측정 부피(CV1^stsen), (b) 최대 방광내압측정 용량(MCC), (c) 저장 단계 동안의 최대 배뇨근 압력(P_detmax), (d) 첫 번째 불수의 배뇨근 수축(IDC)의 존재/부재 및 존재하는 경우: 첫 번째 IDC에서의 부피(V_PmaxIDC) 및 첫 번째 IDC 동안의 최대 배뇨근 압력(P_maxIDC). 추가 관련 지침은 연구 매뉴얼에 제공될 것이다.

[0568] 약동학적 평가: hSlo cDNA 평가를 위한 소변 및 혈액 샘플은 1일(치료 투여), 6주 추적 클리닉 방문 및 24주 추적 클리닉/최종 방문에 대상체로부터 전처리 수집될 것이다.

[0569] 효능, 건강 결과 및 요역학적 종말점: 이 연구의 목적을 위해, UUI 에피소드의 수는 방광 일지에 표시된 바와 같이 대상체가 누출의 주요 이유로서 "절박"을 표시한 횟수로 정의될 것이다; "절박"에 추가하여 하나 초과의 누출 이유가 확인되었는지 여부와 무관함. 평균 일일 UUI 에피소드의 수는 각 연구 방문 전에 완료되는 방광 일지의 일일 항목을 사용하여 계산된다. 평균 일일 UUI 에피소드의 수는 일지 날(Diary Days)에 발생한 총 UUI 에피소드 수를 방광 일지의 일지 날의 수로 나눈 값으로 계산될 것이다. 배뇨는 "화장실에서의 소변"으로 정의된다. 각 연구 방문에서 평균 일일 배뇨는 UUI 에피소드에 대해 위에서 설명한 것과 동일한 방식으로 계산될 것이다. 요실금은 누출 또는 "우발적 소변 누출"의 어떤 원인이 있는 것으로 정의된다. 절박 에피소드는 "즉시 소변을 볼 필요가 있음"으로 정의된다.

[0570] 효능 분석을 위한 통계적 방법: 기준선은 모든 일지 관련 효능 종말점에 대해 스크리닝 기간 동안 수집된 일지 평가 및 모든 건강 결과 종말점에 대해 1일 방문에서 수집된 설문지 결과로 정의될 것이다. 기준선 종말점으로부터 지속적인 변화의 분석을 위해(예를 들어, 기준선으로부터의 평균 일일 UUI 에피소드 수의 변화, 기준선으로부터의 평균 일일 배뇨 횟수의 변화, 기준선으로부터의 평균 일일 UI 에피소드 수의 변화, 기준선으로부터의 평균 일일 절박 에피소드 수의 변화, 기준선으로부터의 배뇨당 평균 배뇨 부피의 변화, 기준선으로부터의 평균 I-QOL 총 요약 점수의 변화, 기준선으로부터의 OAB-q 점수의 변화, 및 기준선으로부터의 PGI-C 점수의 변화), 최대 가능성 추정이 제한된 반복 측정에 대한 혼합 모델(MMRM)이 사용될 것이다. 상기 모델은 중도 탈락 없는 집단에 대한 치료 효과의 추정치를 도출하기 위해 동일한 공변량 세트 내의 대상체에 대해 사용 가능한 모든 정보를 사용함으로써, 중도 탈락을 수정하고 시간이 지남에 따라 동일한 대상체에 대해 수행된 측정이 서로 관련되는 경향이 있다는 사실을 설명한다.

[0571] 12주에 UUI 에피소드가 기준선으로부터 ≥ 50% 감소한 대상체의 비율이 각 치료 그룹에 대해 계산될 것이다. 또한, 반응자 분석은 기준선에 비해 12주에 UUI 에피소드의 ≥ 75% 및 100% 감소를 달성한 대상체에 대해서도 계산될 것이다. Cochran-Mantel-Haenszel(CMH) 방법을 활용하여 활성 및 플라시보 그룹 간의 반응자 비율을 비교할 것이다.

실시예 14

URO-902 약물 생성물

[0572] 물리적 및 화학적 특성: URO-902(pVAX-hSlo로도 알려짐) 약물 물질은 인간 평활근 채널 hSlo의 알파 또는 기공 형성 서브유닛을 인코딩하는 인간 cDNA를 운반하는 이중 가닥 네이키드 플라스미드 DNA 분자이다. hSlo는 트랜스진의 업스트림에 위치한 CMV 프로모터의 제어하에 있으며, 작제물은 또한 소 성장 호르몬 폴리 A 부위, 카나마이신 내성 유전자 및 pUC 복제 기점을 함유한다. 도 8 참조.

[0573] URO-902 약물 물질은 플라스미드 중량, 제한 효소, 순도(수퍼코일 %), 잔류 리보핵산(RNA), 이소프로판올, 에탄올, 잔류 카나마이신, 외관, 농도, 내독소 및 바이오버든에 대해 시험되었다. URO-902 약물 물질의 일반적인 물리적 및 화학적 특성은 방출시 안정한 것으로 결정되었다.

[0574] 제형: URO-902는 투명하고 무색의 멸균된 약물 생성물 용액이며 방광내 주사를 위해 공급된다. URO-902는 20% 수크로스를 함유하는 포스페이트 완충 염수(PBS)에 용해된다(PBS-20%). 이후 용액을 여과하고 멸균된 바이알에 채우고 멸균된 회색 마개로 캡핑한다. 각 바이알은 4 mg/mL의 농도로 2 mL를 포함하며, 이는 바이알당 8 mg의 URO-902에 해당한다. URO-920 약물 생성물은 플라스미드 중량, 제한 효소, 순도(수퍼코일 %), 잔류 RNA, 외관, 농도, 내독소, 멸균성, 미립자 물질 및 생물활성에 대해 시험된다. 생성물은 방출 및 안정성에 있어 안정적이다. 매칭되는 플라시보는 2 mL/바이알에 PBS-20%를 함유하였다.

[0575] URO-902 플라스미드 작제물의 생물학적 활성: 역사적으로, URO-902 플라스미드 작제물의 생물활성은 연령-관련 발기 부전을 갖는 은퇴한 브리더 Sprague-Dawley 래트에서 생체내 발기 기능 생물검정을 사용하여 평가되었다. 상기 검정은 이전에 기술되었다(Christ, 1998; Melman, 2003 참조). URO-902 생성물은 해면체내 주사된다. 주사 후 1주 후, 래트를 마취시키고 직접 해면 신경 자극을 허용하기 위해 수술 절차를 거친다. 해면 신경 자극은 4.0 mA 수준에서 수행되고, 증가된 해면체내(음경해면체내) 압력 대 혈압 비율(즉, ICP/BP)은 발기 부전의 개선을 나타내기 위해 사용된다. URO-902 처리된 동물은 0.6-0.8의 ICP/BP 비율을 나타내며, 이들은 눈에 보이는 발기 반응과 관련이 있다. URO-902 생물활성에 대한 과거 사양은 URO-902 플라스미드로 처리된 동물이 0.6 내지 0.8의 평균 ICP/BP 비율을 달성하고 대조군 동물이 4 mA 수준에서 자극되었을 때 <0.6의 ICP/BP 비율을 가질 것을 요구하였다. 도 25 및 도 26은 URO-902 플라스미드의 생물활성을 나타내는 검정의 능력을 보여준다.

[0576] 시험관내 세포-기반 패치 클램프 모델: URO-902 플라스미드의 생물학적 활성은 대안적으로 URO-902-매개 이온 채널 전류를 보여주는 세포-기반 검정에서 평가될 수 있다. 이 방법에서, URO-902 플라스미드는 인간 배아 신장(HEK) 세포로 일시적으로 트랜스펙션된다. 플라스미드의 효과적인 트랜스펙션, hSlo cDNA의 전사, hSlo 단백질의 번역 및 hSlo 단백질의 HEK 세포막으로의 삽입은 패치 클램프 기술을 사용하여 측정 가능한 칼륨(K+)-이온 유출에 의해 반영된다. hSlo에 특이적인 이온 흐름은 칼륨(K+) 채널 차단제, 테트라에틸암모늄 클로라이드(TEACl)를 사용하여 확인된다. 시험관내 패치 클램프 검정으로부터의 데이터는 URO-902 채널 활성을 입증한다. 도 27, 28 및 29는 TEACl 억제에 민감한 일련의 상이한 인가 전압 및 내부 Ca++ 농도에서 URO-902 관련 이온 전류를 보여준다.

[0577] 소변에서의 플라스미드 반감기: 인간 소변에서 플라스미드의 반감기는 남성 및 여성 대상체로부터의 1 mL 소변에서 또는 PBS에서 20 ng/μL URO-902를 인큐베이션함으로써 결정되었다. 체온에서 실행되는 소변에서의 플라스미드의 반감기는 혈액 내 플라스미드의 약 30분 반감기와 비교하여 약 3.5분인 것으로 결정되었다(도 30 참조). 유사한 결과가 남성 및 여성 소변 샘플 둘 모두에서 발견되었다. 도 30에 제시된 결과에서, 20 ng/mL URO-902가 인간 소변 또는 PBS 중 하나에서 37℃에서 인큐베이션되었음에 유의한다. 표시된 시간에, 샘플을 0.6% 아가로스 겔 상에서 실행시키고 DNA를 에티듐 브로마이드로 시각화하였다. DNA는 약 3.5분의 반감기로 빠르게 분해되었다.

[0578] 조직 내 URO-902 농도의 결정: 박테리아 카나마이신 내성 서열을 인식하는 프라이머를 사용하여, 조직 내 URO-902 플라스미드 수준을 PCR을 사용하여 결정하였다. 각 실험에서, 표준 곡선을 작성하기 위해 실시간 PCR에 의해 결정된 교차 임계값에 대해 알려진 양의 URO-902(10^-16 내지 10^-9g, 약 12-12x10⁷ 복사체를 나타냄)를 플롯팅하였다. 이 농도 범위에서, 교차 임계값과 URO-902 농도 사이의 관계는 선형이다. 따라서, 검정의 민감도(검정당 총 500 ng DNA 사용)는 적어도 6개 복사체/μg 게놈 DNA가 될 것이다. 표준 곡선은 조직으로부터 얻은 교차 임계값의 비교에 의해 조직에서 URO-902의 농도를 도출하는데 사용되었다. 이들 값은 2개 조직의 값이 평균화된 성별-특이적 조직을 제외하고, 4개 조직에 대해 평균화되었다.

[0579] 첨가된 DNA의 구조 및 DNA의 유형(통합 또는 염색체외) 모니터링: 주사 후 생체내에서 재분리될 수 있는 플라스미드의 양이 URO-902 플라스미드의 직접 분석에 충분하지 않다; 따라서, 카나마이신 유전자의 RT-PCR을 사용하여 플라스미드의 존재를 검출하였다. 플라스미드가 래트 혈액과 함께 인큐베이션된 관련 시험관내 연구에서, 아가로스 겔 전기영동을 수행하고 온전, 슈퍼코일 및 닉 원형 플라스미드 DNA의 수준을 결정하기에 충분한 플라스미드를 재분리하는 것이 가능하였다. 이들 실험은 혈액에서 네이키드 슈퍼코일 플라스미드 DNA가 2시간의 반감기로 분해되고, 0.5시간 미만의 반감기로 슈퍼코일에서 닉 원형 DNA로의 전환이 발생한다는 것을 입증하였다. 약 1,300만 개 복사체 플라스미드/μg 총 DNA가 1주에 방광에서 검출되었다.

[0580] 세포당 존재하는 복사체 수 및 첨가된 DNA의 안정성: URO-902의 해면체내 주사 후, 플라스미드가 해면체에서 1주 후에 1 복사체/μg 총 DNA 수준으로 검출될 수 없었다. 방광 생체분포 연구는 1주에 1,300만 개 복사체 플라스미드/μg 총 DNA가 검출될 수 있음을 보여준다. 전사체는 래트 해면체 평활근에 주사 후 6개월까지 측정될 수 있다.

[0581] 인간에게 미치는 영향: URO-902는 현재 OAB의 치료제로 개발되고 있다. 현재까지, 총 80명의 대상체(34명의 여성과 46명의 남성)에서 4개의 임상 연구가 완료되었다. OAB를 갖는 대상체에서 URO-902의 단일 투여를 평가하는 2개의 1 상 연구가 완료되었다; 연구 ION-02는 방광내 점적주입을 평가하고 연구 ION-03은 (방광경검사를 통해) 배뇨근내 주사를 평가하였다. 방광내 점적주입을 통한 5 mg/90 mL 및 10 mg/90 mL의 URO-902의 단일 투여(연구 ION-02) 및 방광으로의 배뇨근내 직접 주사를 통한 16 mg 및 24 mg의 URO-902의 단일 투여(연구 ION-03)는 중등도 OAB 및 DO를 갖는 여성 대상체에서 잘 관용되었다. 대부분의 TEAE는 연구 치료와 관련이 없었다. 연구 ION-02에서 SAE는 보고되지 않았고 연구 ION-03에서 보고된 하나의 SAE는 연구자에 의해 치료와 관련이 없는 것으로 간주되었다. 치료-관련 사망은 보고되지 않았으며 TEAE로 인한 연구 중단도 없었다. 두 연구 모두의 효능 결과는 OAB 증상의 임상적 개선 및 건강 결과의 측정에 반영된 바와 같이 긍정적인 효능 결과를 나타내었다.

[0582] 또한, ED을 갖는 남성 대상체에서 URO-902의 단일 해면체내 주사를 평가하는 1 상(연구 ION-301) 및 2 상(연구 ION-04-ED) 연구가 완료되었다. 0.5 mg 내지 16 mg 범위의 용량의 URO-902의 단일 해면체내 주사는 또한 ED를 갖는 남성 대상체에서 잘 관용되었다. 보고된 부작용의 대부분은 중증도에 있어 경증 내지 중등도였으며 치료와 관련이 없었다. 각 연구에서 2개의 SAE가 보고되었으며 모두는 연구 치료와 관련이 없는 것으로 간주되었다. 두 연구 도중 사망은 발생하지 않았다.

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[0583] 본원에 인용된 모든 미국 특허 및 공개되거나 공개되지 않은 미국 특허 출원은 참조로 포함된다. 본원에 인용된 모든 공개된 외국 특허 및 특허 출원은 본원에 참조로 포함된다. 본원에 인용된 수탁 번호로 표시된 Genbank 및 NCBI 제출물은 본원에 참조로 포함된다. 본원에 인용된 다른 모든 출판된 참고문헌, 문서, 원고 및 과학 문헌은 본원에 참조로 포함된다.

[0584] 개요 및 요약서 섹션이 아닌 상세한 설명 섹션은 청구 범위를 해석하는데 사용하기 위한 것임이 이해되어야 한다. 개요 및 요약서 섹션은 본 발명자(들)에 의해 고려되는 바와 같이 본 발명의 전부가 아닌 하나 이상의 예시적인 구체예를 제시할 수 있으며, 따라서 이는 본 발명 및 첨부된 청구 범위를 어떤 식으로든 제한하려는 의도가 아니다.

[0585] 본 발명은 특정 기능 및 그 관계의 구현을 예시하는 기능적 빌딩 블록의 도움으로 위에서 설명되었다. 이러한 기능적 빌딩 블록의 경계는 설명의 편의를 위해 본원에서 임의로 정의되었다. 명시된 기능 및 그 관계가 적절하게 수행되는 한 대체 경계가 정의될 수 있다.

[0586] 특정 구체예에 대한 전술한 설명은 다른 사람들이, 당 분야의 기술 내의 지식을 적용하여, 본 발명의 일반적인 개념으로부터 벗어나지 않고, 과도한 실험 없이, 그러한 특정 구체예와 같은 다양한 응용에 대해 용이하게 수정 및/또는 적응시킬 수 있는 본 발명의 일반적인 특성을 완전히 드러낼 것이다. 따라서, 그러한 적응 및 수정은 본원에 제시된 교시 및 지침에 기초하여, 개시된 구체예의 등가물의 의미 및 범위 내에 있도록 의도된다. 본원의 어법 또는 용어는 제한이 아닌 설명을 위한 것이므로, 본 명세서의 용어 또는 어법은 교시 및 지침의 관점에서 당업자에 의해 해석되어야 한다는 것이 이해되어야 한다.

[0587] 본 발명의 폭넓음 및 범위는 전술한 예시적인 구체예 중 어느 것에 의해 제한되어서는 안 되며, 다음의 청구 범위 및 그 등가물에 따라서만 정의되어야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> UROVANT SCIENCES GMBH <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF SMOOTH MUSCLE DYSFUNCTION <130> 3987.026PC02 <150> US62/767,457 <151> 2018-11-14 <150> US62/873,064 <151> 2019-07-11 <160> 56 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 508 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human cytomegalovirus <400> 1 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300 catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 360 atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 420 ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 480 acggtgggag gtctatataa gcagagct 508 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 priming site <400> 2 taatacgact cactataggg 20 <210> 3 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BGH polyA <400> 3 agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc 60 cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc 120 gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg 180 ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta gtgggctct 239 <210> 4 <211> 679 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pUC origin of replication <400> 4 ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct 60 tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa 120 ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag 180 tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc 240 tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg 300 actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca 360 cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat 420 gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg 480 tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc 540 ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc 600 ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctgggc ttttgctggc 660 cttttgctca catgttctt 679 <210> 5 <211> 800 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kanamycin resistance marker <400> 5 ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc 60 tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc 120 tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg 180 aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag 240 ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg 300 ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg 360 caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac 420 atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg 480 acgaagagca 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tgaaaaagag gaggcagtgg ccgccgaggt cggctggatg 480 acctccgtga aggactgggc gggggtgatg atatccgccc agacactgac tggcagagtc 540 ctggttgtct tagtctttgc tctcagcatc ggtgcacttg taatatactt catagattca 600 tcaaacccaa tagaatcctg ccagaatttc tacaaagatt tcacattaca gatcgacatg 660 gctttcaacg tgttcttcct tctctacttt ggcttgcggt ttattgcagc caacgataaa 720 ttgtggttct ggctggaagt gaactctgta gtggatttct tcacggtgcc ccccgtgttt 780 gtgtctgtgt acttaaacag aagttggctt ggtttgagat ttttaagagc tctgagactg 840 atacagtttt cagaaatttt gcagtttctg aatattctta aaacaagtaa ttccatcaag 900 ctggtgaatc tgctctccat atttatcagc acgtggctga ctgcagctgg gttcatccat 960 ttggtggaga attcagggga cccatgggaa aatttccaaa acaaccaggc tctcacctac 1020 tgggaatgtg tcatttactc atggtcacaa tgtccaccgt tggttatggg gatgtttatg 1080 caaaaaccac acttcggcgc ctcttcatgg tcttcttcat cctcggggga ctggccatgt 1140 ttgccagcta cgtccctgaa atcatagagt taataggaaa ccgcaagaaa tacgggggct 1200 cctatagtgc ggttagtgga agaaagcaca ttgtggtctg cggacacatc actctggaga 1260 gtgtttccaa cttcctgaag gactttctgc acaaggaccg ggatgacgtc aatgtggaga 1320 tcgtttttct tcacaacatc tcccccaacc tggagcttga agctctgttc aaacgacatt 1380 ttactcaggt ggaattttat cagggttccg tcctcaatcc acatgatctt gcaagagtca 1440 agatagagtc agcagatgca tgcctgatcc ttgccaacaa gtactgcgct gacccggatg 1500 cggaggatgc ctcgaatatc atgagagtaa tctccataaa gaactaccat ccgaagataa 1560 gaatcatcac tcaaatgctg cagtatcaca acaaggccca tctgctaaac atccgagctg 1620 gaattggaaa gaaggtgatg acgcaatctg cctcgcagag ttgaagttgg gcttcatagc 1680 ccagagctgc ctggctcaag gcctctccac catgcttgcc aaccttctcc atgaggtcat 1740 tcataaagat tgaggaagac acatggcaga aatactactt ggaaggagtc tcaaatcaaa 1800 tgtacacaga atatctctcc agtgccttcg tgggtctgtc cttccctact gtttgtgagc 1860 tgtgttttgt gaagctcaag ctcctaatga tagccattga gtacaagtct gccaaccgag 1920 agagccgtat attaattaat cctggaaacc attttaagat ccaagaaggt actttaggat 1980 ttttcatcgc aagtgatgcc aaagaagtta aaagggcatt tttttactgc aaggcctgtc 2040 atgatgacat cacagatccc aaaagaataa aaaaatgtgg ctgcaaacgg cttgaagatg 2100 agcagccgtc aacactatca ccaaaaaaaa 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cgacgtactt caatgacaat atcctcaccc 3000 tgatacggac cctggtgacc ggaggagcca cgccggagct ggaggctctg attgctgagg 3060 aaaacgccct tagaggtggc tacagcaccc cgcagacact ggccaatagg gaccgctgcc 3120 gcgtggccca gttagctctg ctcgatgggc catttgcgga cttaggggat ggtggttgtt 3180 atggtgatct gttctgcaaa gctctgaaaa catataatat gctttgtttt ggaatttacc 3240 ggctgagaga tgctcacctc agcaccccca gtcagtgcac aaagaggtat gtcatcacca 3300 acccgcccta tgagtttgag ctcgtgccga cggacctgat cttctgctta atgcagtttg 3360 accacaatgc cggccagtcc cgggccagcc tgtcccattc ctcccactcg tcgcagtcct 3420 ccagcaagaa gagctcctct gttcactcca tcccatccac agcaaaccga cagaaccggc 3480 ccaagtccag ggagtcccgg gacaaacaga agtacgtgca ggaagagcgg ctttgatatg 3540 tgtatccacc gccactgtgt gaaactgtat ctgccactca tttccccagt tggtgtttcc 3600 aacaaagtaa ctttccctgt tttcccctgt agtccccccc ttttttttta cacatatttg 3660 catatgtatg atagtgtgca tgtggttgtc atttttattt caccaccata aaacccttga 3720 gcacaacagc aaataagcag acgggctccg gaattcctgc agcccggggg atccactag 3779 <210> 7 <211> 3533 <212> DNA <213> 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ttgtgggctc tattgagtac ctcaagcggg aatgggagac gcttcataac ttccccaaag 2520 tgtccatatt gcctggtacg ccattaagtc gggctgattt aagggctgtc aacatcaacc 2580 tctgtgacat gtgcgttatc ctgtcagcca atcagaataa tattgatgat acttcgctgc 2640 aggacaagga atgcatcttg gcgtcactca acatcaaatc tatgcagttt gatgacagca 2700 tcggagtctt gcaggctaat tcccaagggt tcacacctcc aggaatggat agatcctctc 2760 cagataacag cccagtgcac gggatgttac gtcaaccatc catcacaact ggggtcaaca 2820 tccccatcat cactgaacta gtgaacgata ctaatgttca gtttttggac caagacgatg 2880 atgatgaccc tgatacagaa ctgtacctca cgcagccctt tgcctgtggg acagcatttg 2940 ccgtcagtgt cctggactca ctcatgagcg cgacgtactt caatgacaat atcctcaccc 3000 tgatacggac cctggtgacc ggaggagcca cgccggagct ggaggctctg attgctgagg 3060 aaaacgccct tagaggtggc tacagcaccc cgcagacact ggccaatagg gaccgctgcc 3120 gcgtggccca gttagctctg ctcgatgggc catttgcgga cttaggggat ggtggttgtt 3180 atggtgatct gttctgcaaa gctctgaaaa catataatat gctttgtttt ggaatttacc 3240 ggctgagaga tgctcacctc agcaccccca gtcagtgcac aaagaggtat gtcatcacca 3300 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ccagcataaa aaagtttaag gagactcgaa gtgaagctgc catgaccgtc 2460 ctgagtggcc atgtcgtggt ctgcatcttt ggcgacgtca gctcagccct gatcggcctc 2520 cggaacctgg tgatgccgct ccgtgccagc aactttcatt accatgagct caagcacatt 2580 gtgtttgtgg gctctattga gtacctcaag cgggaatggg agacgcttca taacttcccc 2640 aaagtgtcca tattgcctgg tacgccatta agtcgggctg atttaagggc tgtcaacatc 2700 aacctctgtg acatgtgcgt tatcctgtca gccaatcaga ataatattga tgatacttcg 2760 ctgcaggaca aggaatgcat cttggcgtca ctcaacatca aatctatgca gtttgatgac 2820 agcatcggag tcttgcaggc taattcccaa gggttcacac ctccaggaat ggatagatcc 2880 tctccagata acagcccagt gcacgggatg ttacgtcaac catccatcac aactggggtc 2940 aacatcccca tcatcactga actagtgaac gatactaatg ttcagttttt ggaccaagac 3000 gatgatgatg accctgatac agaactgtac ctcacgcagc cctttgcctg tgggacagca 3060 tttgccgtca gtgtcctgga ctcactcatg agcgcgacgt acttcaatga caatatcctc 3120 accctgatac ggaccctggt gaccggagga gccacgccgg agctggaggc tctgattgct 3180 gaggaaaacg cccttagagg tggctacagc accccgcaga cactggccaa tagggaccgc 3240 tgccgcgtgg 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Ser Ile Gly Val Leu Gln Ala Asn Ser Gln Gly Phe 900 905 910 Thr Pro Pro Gly Met Asp Arg Ser Ser Pro Asp Asn Ser Pro Val His 915 920 925 Gly Met Leu Arg Gln Pro Ser Ile Thr Thr Gly Val Asn Ile Pro Ile 930 935 940 Ile Thr Glu Leu Val Asn Asp Thr Asn Val Gln Phe Leu Asp Gln Asp 945 950 955 960 Asp Asp Asp Asp Pro Asp Thr Glu Leu Tyr Leu Thr Gln Pro Phe Ala 965 970 975 Cys Gly Thr Ala Phe Ala Val Ser Val Leu Asp Ser Leu Met Ser Ala 980 985 990 Thr Tyr Phe Asn Asp Asn Ile Leu Thr Leu Ile Arg Thr Leu Val Thr 995 1000 1005 Gly Gly Ala Thr Pro Glu Leu Glu Ala Leu Ile Ala Glu Glu Asn 1010 1015 1020 Ala Leu Arg Gly Gly Tyr Ser Thr Pro Gln Thr Leu Ala Asn Arg 1025 1030 1035 Asp Arg Cys Arg Val Ala Gln Leu Ala Leu Leu Asp Gly Pro Phe 1040 1045 1050 Ala Asp Leu Gly Asp Gly Gly Cys Tyr Gly Asp Leu Phe Cys Lys 1055 1060 1065 Ala Leu Lys Thr Tyr Asn Met Leu Cys Phe Gly Ile Tyr Arg Leu 1070 1075 1080 Arg Asp Ala His Leu Ser Thr Pro Ser Gln Cys Thr Lys Arg Tyr 1085 1090 1095 Val Ile Thr Asn Pro Pro Tyr 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Lys Ala His Leu Leu Asn Ile Pro Ser Trp Asn Trp Lys 530 535 540 Glu Gly Asp Asp Ala Ile Cys Leu Ala Glu Leu Lys Leu Gly Phe Ile 545 550 555 560 Ala Gln Ser Cys Leu Ala Gln Gly Leu Ser Thr Met Leu Ala Asn Leu 565 570 575 Phe Ser Met Arg Ser Phe Ile Lys Ile Glu Glu Asp Thr Trp Gln Lys 580 585 590 Tyr Tyr Leu Glu Gly Val Ser Asn Glu Met Tyr Thr Glu Tyr Leu Ser 595 600 605 Ser Ala Phe Val Gly Leu Ser Phe Pro Thr Val Cys Glu Leu Cys Phe 610 615 620 Val Lys Leu Lys Leu Leu Met Ile Ala Ile Glu Tyr Lys Ser Ala Asn 625 630 635 640 Arg Glu Ser Arg Ile Leu Ile Asn Pro Gly Asn His Leu Lys Ile Gln 645 650 655 Glu Gly Thr Leu Gly Phe Phe Ile Ala Ser Asp Ala Lys Glu Val Lys 660 665 670 Arg Ala Phe Phe Tyr Cys Lys Ala Cys His Asp Asp Ile Thr Asp Pro 675 680 685 Lys Arg Ile Lys Lys Cys Gly Cys Lys Arg Leu Glu Asp Glu Gln Pro 690 695 700 Ser Thr Leu Ser Pro Lys Lys Lys Gln Arg Asn Gly Gly Met Arg Asn 705 710 715 720 Ser Pro Asn Thr Ser Pro Lys Leu Met Arg His Asp Pro Leu Leu Ile 725 730 735 Pro Gly Asn 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Ser Val Lys Asp Trp Ala Gly Val Met Ile Ser Ala Gln Thr Leu 165 170 175 Thr Gly Arg Val Leu Val Val Leu Val Phe Ala Leu Ser Ile Gly Ala 180 185 190 Leu Val Ile Tyr Phe Ile Asp Ser Ser Asn Pro Ile Glu Ser Cys Gln 195 200 205 Asn Phe Tyr Lys Asp Phe Thr Leu Gln Ile Asp Met Ala Phe Asn Val 210 215 220 Phe Phe Leu Leu Tyr Phe Gly Leu Arg Phe Ile Ala Ala Asn Asp Lys 225 230 235 240 Leu Trp Phe Trp Leu Glu Val Asn Ser Val Val Asp Phe Phe Thr Val 245 250 255 Pro Pro Val Phe Val Ser Val Tyr Leu Asn Arg Ser Trp Leu Gly Leu 260 265 270 Arg Phe Leu Arg Ala Leu Arg Leu Ile Gln Phe Ser Glu Ile Leu Gln 275 280 285 Phe Leu Asn Ile Leu Lys Thr Ser Asn Ser Ile Lys Leu Val Asn Leu 290 295 300 Leu Ser Ile Phe Ile Ser Thr Trp Leu Thr Ala Ala Gly Phe Ile His 305 310 315 320 Leu Val Glu Asn Ser Gly Asp Pro Trp Glu Asn Phe Gln Asn Asn Gln 325 330 335 Ala Leu Thr Tyr Trp Glu Cys Val Tyr Leu Leu Met Val Thr Met Ser 340 345 350 Thr Val Gly Tyr Gly Asp Val Tyr Ala Lys Thr Thr Leu Gly Arg Leu 355 360 365 Phe Met Val Phe Phe Ile Leu Gly Gly Leu Ala Met Phe Ala Ser Tyr 370 375 380 Val Pro Glu Ile Ile Glu Leu Ile Gly Asn Arg Lys Lys Tyr Gly Gly 385 390 395 400 Ser Tyr Ser Ala Val Ser Gly Arg Lys His Ile Val Val Cys Gly His 405 410 415 Ile Thr Leu Glu Ser Val Ser Asn Phe Leu Lys Asp Phe Leu His Lys 420 425 430 Asp Arg Asp Asp Val Asn Val Glu Ile Val Phe Leu His Asn Ile Ser 435 440 445 Pro Asn Leu Glu Leu Glu Ala Leu Phe Lys Arg His Phe Thr Gln Val 450 455 460 Glu Phe Tyr Gln Gly Ser Val Leu Asn Pro His Asp Leu Ala Arg Val 465 470 475 480 Lys Ile Glu Ser Ala Asp Ala Cys Leu Ile Leu Ala Asn Lys Tyr Cys 485 490 495 Ala Asp Pro Asp Ala Glu Asp Ala Ser Asn Ile Met Arg Val Ile Ser 500 505 510 Ile Lys Asn Tyr His Pro Lys Ile Arg Ile Ile Thr Gln Met Leu Gln 515 520 525 Tyr His Asn Lys Ala His Leu Leu Asn Ile Pro Ser Trp Asn Trp Lys 530 535 540 Glu Gly Asp Asp Ala Ile Cys Leu Ala Glu Leu Lys Leu Gly Phe Ile 545 550 555 560 Ala Gln Ser Cys Leu Ala Gln Gly Leu Ser Thr Met Leu Ala Asn Leu 565 570 575 Phe Ser 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Cys Ile Phe Gly Asp Val Ser Ser Ala Leu Ile Gly Leu 785 790 795 800 Arg Asn Leu Val Met Pro Leu Arg Ala Ser Asn Phe His Tyr His Glu 805 810 815 Leu Lys His Ile Val Phe Val Gly Ser Ile Glu Tyr Leu Lys Arg Glu 820 825 830 Trp Glu Thr Leu His Asn Phe Pro Lys Val Ser Ile Leu Pro Gly Thr 835 840 845 Pro Leu Ser Arg Ala Asp Leu Arg Ala Val Asn Ile Asn Leu Cys Asp 850 855 860 Met Cys Val Ile Leu Ser Ala Asn Gln Asn Asn Ile Asp Asp Thr Ser 865 870 875 880 Leu Gln Asp Lys Glu Cys Ile Leu Ala Ser Leu Asn Ile Lys Ser Met 885 890 895 Gln Phe Asp Asp Ser Ile Gly Val Leu Gln Ala Asn Ser Gln Gly Phe 900 905 910 Thr Pro Pro Gly Met Asp Arg Ser Ser Pro Asp Asn Ser Pro Val His 915 920 925 Gly Met Leu Arg Gln Pro Ser Ile Thr Thr Gly Val Asn Ile Pro Ile 930 935 940 Ile Thr Glu Leu Val Asn Asp Thr Asn Val Gln Phe Leu Asp Gln Asp 945 950 955 960 Asp Asp Asp Asp Pro Asp Thr Glu Leu Tyr Leu Thr Gln Pro Phe Ala 965 970 975 Cys Gly Thr Ala Phe Ala Val Ser Val Leu Asp Ser Leu Met Ser Ala 980 985 990 Thr Tyr Phe 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Claims

Maxi-K 칼륨 채널 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 핵산을 포함하는 조성물의 적어도 1회 용량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 평활근 기능장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 평활근 기능장애를 치료하는 방법으로서, 여기서 대상체의 평활근 세포에서 Maxi-K 칼륨 채널 폴리펩티드의 발현이 평활근 수축성을 조절하는, 방법.
제1항에 있어서, Maxi-K 칼륨 채널 폴리펩티드가
(i) Maxi-K 알파 서브유닛(Slo)을 인코딩하는 폴리펩티드 또는 이의 단편, 변이체, 돌연변이체 또는 유도체;
(ii) Maxi-K 베타 서브유닛을 인코딩하는 폴리펩티드 또는 이의 단편, 변이체, 돌연변이체 또는 유도체로서, 여기서 Maxi-K 베타 서브유닛이 베타1 서브유닛, 베타2 서브유닛, 베타3 서브유닛, 베타4 서브유닛 또는 이들의 조합인, 폴리펩티드 또는 이의 단편, 변이체, 돌연변이체 또는 유도체; 또는
(iii) 이들의 조합을 포함하는 방법.
제2항에 있어서, 단편이 기능성 단편인 방법.
제2항에 있어서, 변이체가 스플라이스 변이체인 방법.
제2항에 있어서, 변이체가 대립유전자 (다형성) 변이체인 방법.
제2항에 있어서, 돌연변이체가 점 돌연변이체인 방법.
제2항에 있어서, 돌연변이체가 결실 및/또는 삽입 돌연변이체인 방법.
제2항에 있어서, 돌연변이체가 기능-획득 돌연변이체인 방법.
제8항에 있어서, 돌연변이체가 기능-상실 돌연변이체인 방법.
제1항에 있어서, Maxi-K 칼륨 채널 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 핵산 또는 Maxi-K 칼륨 채널 폴리펩티드가 표 1에 개시된 서열을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, Maxi-K 칼륨 채널 폴리펩티드가 표 2에 개시된 돌연변이를 포함하는 방법.
제2항에 있어서, 유도체가 융합 단백질인 방법.
제2항에 있어서, 유도체가 키메라인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 평활근 수축성의 조절이 수축성의 증가를 포함하는 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 평활근 수축성의 조절이 수축성의 감소를 포함하는 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 평활근 기능장애가 과활동성 방광(OAB); 발기 부전(ED); 천식; 양성 전립선 비대(BPH); 관상 동맥 질환; 방광, 내골반 근막, 전립선, 요관, 요도, 요로 및 정관의 비뇨생식기 기능장애; 과민성 대장 증후군; 편두통; 조기 진통; 레이노 증후군; 배뇨근 과다활동; 녹내장; 안구 고혈압; 및 폐쇄혈전혈관염 또는 이들의 증상 또는 후유증으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 평활근 기능장애가 특발성인 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 평활근 기능장애가 신경원성인 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 평활근 기능장애가 비신경원성인 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 핵산이 DNA인 방법.
제20항에 있어서, DNA가 네이키드 DNA인 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 핵산이 RNA인 방법.
제22항에 있어서, RNA가 mRNA인 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 핵산이 적어도 하나의 화학적으로 변형된 핵염기, 당, 백본 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 방법.
제24항에 있어서, 적어도 하나의 화학적으로 변형된 핵염기가 슈도우라실(ψ), N1-메틸슈도우라실(m1ψ), 2-티오우라실(s2U), 4'-티오우라실, 5-메틸시토신, 5-메틸우라실 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 핵산이 적어도 하나의 핵염기를 치환함으로써 변형되고, 여기서 치환이 동의(synonymous) 치환인 방법.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 핵산이 코돈 최적화되는 방법.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 핵산이 벡터인 방법.
제28항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터인 방법.
제29항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터인 방법.
제30항에 있어서, 아데노바이러스 벡터가 3세대 아데노바이러스 벡터인 방법.
제30항에 있어서, 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터인 방법.
제32항에 있어서, 레트로바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인 방법.
제33항에 있어서, 렌티바이러스 벡터가 3세대 또는 4세대 렌티바이러스 벡터인 방법.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 핵산 또는 벡터가 전달제와 함께 투여되는 방법.
제35항에 있어서, 전달제가 리피도이드, 리포좀, 리포플렉스, 지질 나노입자, 중합체 화합물, 펩티드, 단백질, 세포, 나노입자 모방체, 나노튜브 또는 컨쥬게이트를 포함하는 방법.
제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 핵산 또는 벡터가 생체내, 시험관내 또는 생체외 세포 내로 혼입되는 방법.
제36항 또는 제37항에 있어서, 세포가 줄기 세포, 근육 세포 또는 섬유모세포인 방법.
제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 국소적으로 또는 비경구적으로 투여되는 방법.
제39항에 있어서, 비경구 투여가 주사에 의한 것인 방법.
제40항에 있어서, 주사가 근육내 주사인 방법.
제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 주사가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 주사 부위에서 투여되는 방법.
제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 주사 부위가 대상체의 방광에 있는 방법.
제43항에 있어서, 주사 부위가 방광벽 상에 있는 방법.
제43항 또는 제44항에 있어서, 주사 부위가 방광 배뇨근에 있는 방법.
제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 주사 부위가 방광 삼각부에 있는 방법.
제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 주사 부위가 방광 기저 상에 있는 방법.
제40항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 각 주사의 부피가 약 0.5 ml, 약 1 ml, 약 1.5 ml 또는 약 2 ml인 방법.
제40항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 주사 부위가 약 0.5 cm, 약 1 cm, 약 1.5 cm 또는 약 2 cm 떨어져 있는 방법.
제40항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 주사가 약 2 mm, 2.5 mm, 3 mm, 3.5 mm 또는 4 mm의 주사 깊이로 투여되는 방법.
제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 기관의 내강으로의 점적주입에 의해 투여되는 방법.
제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 용량이 단일 단위 용량인 방법.
제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 용량이 5,000 내지 100,000 mcg인 방법.
제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 용량이 적어도 10,000 mcg인 방법.
제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 용량이 16,000 mcg, 24,000 mcg 또는 48,000 mcg인 방법.
제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물의 투여가 평활근 기능장애의 적어도 하나의 증상을 완화시키는 방법.