CN117813103A - 包含功能增强干细胞的用于预防或治疗特应性皮炎的组合物 - Google Patents

包含功能增强干细胞的用于预防或治疗特应性皮炎的组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN117813103A
CN117813103A CN202280035957.2A CN202280035957A CN117813103A CN 117813103 A CN117813103 A CN 117813103A CN 202280035957 A CN202280035957 A CN 202280035957A CN 117813103 A CN117813103 A CN 117813103A
Authority
CN
China
Prior art keywords
interferon
vitamin
stem cells
atopic dermatitis
tumor necrosis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280035957.2A
Other languages
English (en)
Inventor
宋淳旭
金时那
崔辰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SCM Lifescience Co Ltd
Original Assignee
SCM Lifescience Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SCM Lifescience Co Ltd filed Critical SCM Lifescience Co Ltd
Publication of CN117813103A publication Critical patent/CN117813103A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/98—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/98—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin
    • A61K8/981—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin of mammals or bird
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/24—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/25—Tumour necrosing factors [TNF]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及包含启动的功能增强干细胞的用于预防、改善或治疗特应性皮炎的组合物。本发明的通过处理肿瘤坏死因子α、γ‑干扰素及α‑干扰素或肿瘤坏死因子α、γ‑干扰素、α‑干扰素及维生素来启动的干细胞与未处理上述启动因子的未处理干细胞相比，抗炎及免疫调节能力得到增强而使预防或治疗特应性皮炎症状的效果优秀。因此，本发明的功能增强的干细胞可以在多种特应性皮炎的预防、改善或治疗领域中广泛使用。

Description

包含功能增强干细胞的用于预防或治疗特应性皮炎的组合物
技术领域
本发明涉及包含启动的功能增强干细胞的用于预防、改善或治疗特应性皮炎的组合物。
背景技术
干细胞作为未分化的细胞，是指可以通过自我再生来长期分裂，在特定环境下可以分化为多种细胞的细胞。根据起源的组织，干细胞可以分为胚胎干细胞(Embryonic stemcell)和成体干细胞(Adult stemcell)，利用胚胎干细胞的治疗实验在伦理方面以及肿瘤形成可能性方面存在难点，与之相反，成体干细胞具有能够从多种组织轻易获得的优点，因此正活跃地进行着将其应用于多种疾病治疗中的研究。
迄今已开发出许多化合物免疫抑制剂或抗炎剂，临床上最常用的免疫抑制剂有环孢菌素(cyclosporine，新出地明(Neoral)，Cipol A)、硫唑嘌呤(imuran)、泼尼松龙(一种类固醇)。上述免疫抑制剂通过抑制在抗原刺激中形成抗体生成的过程中通过巨噬细胞的抗原的吞噬、淋巴细胞等的抗原识别、细胞分裂、T细胞与B细胞的分裂、抗体生成等几种过程来引起免疫抑制。这样的药物大部分同时具有抗肿瘤活性，其原因为通过介导脱氧核糖核酸(DNA)障碍、脱氧核糖核酸合成抑制等来抑制细胞分裂。然而，随之而来的代表性的副作用有高血压和肾毒性(肾脏功能下降)，由于这样的副作用的发生率高，因此存在应充分观察治疗过程等问题。此外，还偶尔出现震颤、癫痫发作、肝炎、胆汁潴留、血液中尿酸升高、肌肉力量下降、多毛症(hypertrichosis)、牙龈肥大(gingival hypertrophy)等副作用。常用的抑制剂中，硫唑嘌呤引起白细胞的减少、贫血、血小板减少等骨髓功能的抑制，还可能与胰腺炎、肝炎、胆汁潴留一同偶尔并发表现出脱发、发热等并发症。作为类固醇制剂之一的泼尼松龙为最先开始使用的免疫抑制剂，但该药物的使用不仅促进动脉硬化症，还应留意引发高血压、胰腺炎、糖尿病、生长抑制、骨质疏松症、白内障、青光眼等疾病。因此，对于安全的免疫抑制剂或抗炎剂的需求正日益抬头。
为了解决上述问题，近来正在炎症及免疫疾病的治疗中尝试利用干细胞的治疗方法。尤其，已知间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)抑制炎症，或者诱导调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)的生成，或者诱导与细胞凋亡相关的免疫细胞的凋亡，因此利用其的多种治疗剂的开发正活跃地进行着。
然而，在利用干细胞的多种临床试验中，报告有效果的持续性或长期追踪的结果在生物体内存活的比例急剧下降的问题，因此正在进行用来改善干细胞治疗剂的多种尝试。例如，尝试向干细胞插入特定基因来提高治疗效果，或者预处理能够提高干细胞功能的多种化合物、肽等的方法，或者培养时追加低氧、温度、光等刺激条件的方法，或者为了干细胞的存活率而研究与支撑体一同给药的方法等。在用来增强干细胞功能的多种研究中，利用基因修饰的功能改善方法可能有效，但却被指出导入基因的安全性等问题。
因此，与其向干细胞自身导入基因来增强功能，不如尝试通过在培养中处理多种启动因素来增强干细胞的内在功能的研究。
发明内容
技术问题
本发明人在为进一步增强干细胞的研究中，确认到处理肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)及α-干扰素(IFN-α)或者肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素及维生素时，可以显著增加干细胞预防或治疗特应性皮炎的效果，从而完成本发明。
因此，本发明的目的在于，提供包含使用肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素或者使用肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素及维生素启动的干细胞的用于预防、改善或治疗特应性皮炎的组合物及其制备方法。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供包含使用肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素处理的干细胞的用于预防或治疗特应性皮炎的药物组合物。
并且，本发明提供包含使用肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素以及选自由维生素B2、维生素B3、维生素B5及维生素B6组成的组中的一种以上维生素处理的干细胞的用于预防或治疗特应性皮炎的药物组合物。
并且，本发明提供包含上述组合物的用于预防或治疗特应性皮炎的干细胞治疗剂。
并且，本发明提供包含使用肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素处理的干细胞的用于预防或改善特应性皮炎的化妆品组合物。
并且，本发明提供包含使用肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素以及选自由维生素B2、维生素B3、维生素B5及维生素B6组成的组中的一种以上维生素处理的干细胞的用于预防或改善特应性皮炎的化妆品组合物。
并且，本发明提供用于预防或治疗特应性皮炎的组合物的制备方法，包括：步骤1)，使用肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素处理干细胞并培养。
并且，本发明提供用于预防或治疗特应性皮炎的组合物的制备方法，包括：步骤1)，使用肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素以及选自由维生素B2、维生素B3、维生素B5及维生素B6组成的组中的一种以上维生素处理干细胞并培养的步骤。
并且，本发明提供预防或治疗特应性皮炎的方法，包括向有需要的个体给药使用肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素或者使用肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素及维生素启动的干细胞的步骤。
发明的效果
与未处理的干细胞相比，本发明的通过处理肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素或肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素及维生素来启动的干细胞的抗炎剂免疫调节能力得到增强，因此预防或治疗特应性皮炎症状的效果优秀。因此，本发明的功能得到增强的干细胞可以在多种特应性皮炎的预防、改善或治疗领域中广泛使用。
附图说明
图1为示出确认吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)和肿瘤坏死因子α刺激基因6(TSG6)的表达随肿瘤坏死因子α的处理浓度而增加的结果的图(***P＜0.001，****P＜0.0001，与对照组(0ng/ml)相比(compared to the control))。
图2为示出确认吲哚胺2,3-双加氧酶和肿瘤坏死因子α刺激基因6的表达随γ-干扰素的处理浓度而增加的结果的图(*P＜0.05，****P＜0.0001，与对照组(0ng/ml)相比).
图3为示出确认吲哚胺2,3-双加氧酶和肿瘤坏死因子α刺激基因6的表达随α-干扰素的处理浓度而增加的结果的图(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001，与对照组(0ng/ml)相比)。
图4为示出吲哚胺2,3-双加氧酶和肿瘤坏死因子α刺激基因6的表达随表一所示的组合物增加的结果的图(****P＜0.0001)(0：无处理对照组；1：肿瘤坏死因子α(10ng/ml)；2：γ-干扰素(10ng/ml)；3：α-干扰素(20ng/ml)；4：肿瘤坏死因子α(10ng/ml)+γ-干扰素(10ng/ml)；5：肿瘤坏死因子α(10ng/ml)+α-干扰素(20ng/ml)；6：γ-干扰素(10ng/ml)+α-干扰素(20ng/ml)；7：肿瘤坏死因子α(10ng/ml)+γ-干扰素(10ng/ml)+α-干扰素(20ng/ml))。
图5为示出确认吲哚胺2,3-双加氧酶和肿瘤坏死因子α刺激基因6的表达随单独处理表2所示的维生素而增加的结果的图(0：无处理对照组；1：维生素A(10μg/ml)；2：维生素B1(50μg/ml)；3：维生素B2(5μg/ml)；4：维生素B3(50μg/ml)；5：维生素B5(50μg/ml)；6：维生素B6(50μg/ml)；7：维生素B12(50μg/ml)；8：维生素D2(10μg/ml)；9：维生素D3(10μg/ml))。
图6为示出确认吲哚胺2,3-双加氧酶和肿瘤坏死因子α刺激基因6的表达随表3所示的在肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素中分别追加维生素的组合物的处理而增加的结果的图(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001，与组1相比(compared togroup 1))(0：无处理对照组；1：肿瘤坏死因子α+γ-干扰素+α-干扰素；2：向实验组1加入维生素A；3：向实验组1加入维生素B1；4：向实验组1加入维生素B2；5：向实验组1加入维生素B3；6：向实验组1加入维生素B5；7：向实验组1加入维生素B6；8：向实验组1加入维生素B12；9：向实验组1加入维生素D2；10：向实验组1加入维生素D3)。
图7为示出确认细胞间粘附分子1(ICAM1)和血管细胞粘附分子(VCAM)的表达随表3所示的在肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素中分别追加维生素的组合物的处理而增加的结果的图(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001，与组1相比)(0：无处理对照组；1：肿瘤坏死因子α+γ-干扰素+α-干扰素；2：向实验组1加入维生素A；3：向实验组1加入维生素B1；4：向实验组1加入维生素B2；5：向实验组1加入维生素B3；6：向实验组1加入维生素B5；7：向实验组1加入维生素B6；8：向实验组1加入维生素B12；9：向实验组1加入维生素D2；10：向实验组1加入维生素D3)。
图8为示出为了确认处理肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素及维生素B6的干细胞(pcMSC2)的免疫调节能力，将植物血凝素(PHA)刺激的外周血单个核细胞(PBMC)与pcMSC2或未处理的cMSC共培养后，确认炎性细胞因子γ-干扰素及抗炎细胞因子白细胞介素10(IL-10)的结果的图(***P＜0.001，****P＜0.0001，与cMSC相比(compared to cMSC)，P1：未使用植物血凝素刺激，阴性对照组)。
图9为示出在特应性皮炎动物模型中确认皮肤病变随着给药无处理组(naive)、对照组(细胞溶剂：磷酸盐缓冲溶液(Cell Vehicle：PBS))、cMSC、pcMSC2而变化的结果的图。
图10为示出通过甲苯胺蓝染色在特应性皮炎动物模型中确认皮肤病变随着给药无处理组(naive)、对照组(细胞溶剂：磷酸盐缓冲溶液)、cMSC、pcMSC2而变化的结果的图。
图11为示出在特应性皮炎动物模型中确认肥大细胞(Mast cell)减少数量随着给药无处理组(naive)、对照组(细胞溶剂：磷酸盐缓冲溶液)、cMSC、pcMSC2而变化的结果的图。(*P＜0.05，与cMSC相比，##P＜0.001，与溶剂相比(compared to vehicle))。
图12为通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析在特应性皮炎动物模型中确认总免疫球蛋白E(IgE)生成量随着给药无处理组(naive)、对照组(细胞溶剂：磷酸盐缓冲溶液)、cMSC、pcMSC2而变化的结果的图。(*P＜0.05，**P＜0.01，****P＜0.0001)(*P＜0.05，与cMSC相比，##P＜0.001，与溶剂相比)。
图13为通过酶联免疫吸附测定分析在特应性皮炎动物模型中确认总免疫球蛋白G2a(IgG2a)生成量随着给药无处理组(naive)、对照组(细胞溶剂：磷酸盐缓冲溶液)、cMSC、pcMSC2而变化的结果的图(*P＜0.05，***P＜0.001)。
图14为通过酶联免疫吸附测定分析在特应性皮炎动物模型中确认组胺随着给药无处理组(naive)、对照组(细胞溶剂：磷酸盐缓冲溶液)、cMSC、pcMSC2而变化的结果的图(***P＜0.001，****P＜0.0001)。
具体实施方式
以下，详细说明本发明。
本发明涉及包含使用肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素或者使用肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素及选自由维生素B2、维生素B3、维生素B5及维生素B6组成的组中的一种以上维生素处理的干细胞的用于预防或治疗特应性皮炎的药物组合物。
与未使用肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素或者未使用肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素及选自由维生素B2、维生素B3、维生素B5及维生素B6组成的组中的一种以上维生素处理的干细胞相比，本发明的干细胞的抗炎作用及免疫调节能力更为优秀，因此可以在特应性皮炎的预防或治疗中有效使用。
在本发明中，使用肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素或者使用肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素及选自由维生素B2、维生素B3、维生素B5及维生素B6组成的组中的一种以上维生素处理的干细胞可以表示为“启动的干细胞”或“功能增强的干细胞”，“启动的干细胞”与“功能增强的干细胞”可以相互交换来使用。启动的干细胞是指通过本发明的启动因子的处理显著增加干细胞的免疫调节及炎症调节能力，从而表现出优秀的特应性皮炎治疗效果的干细胞。
在本发明中，“启动因子”可以指肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素的组合或者在上述组合中还包含选自由维生素B2、维生素B3、维生素B5及维生素B6组成的组中的一种以上维生素的组合。
与上述启动因子的组合中的单独成分相比，上述启动因子的组合可以表现出协同效应，即使以低的处理浓度也可以有效诱导所目标的干细胞的功能增强。
在本发明中，“功能增强”是指通过处理启动因子来增加干细胞所具有的固有性质及效果，尤其优选的是，可以是指改善特应性皮炎的预防、改善或治疗效果。
具体地，本发明的启动的干细胞可以为使用肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素处理的干细胞。更具体地，能够以0.1-3∶0.1-3∶0.1-3(w/v)的比例处理上述肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素，优选地，能够以1∶1∶0.1至3(w/v)的比例处理，更优选地，能够以1∶1∶1至3(w/v)的比例处理，更加优选地，能够以1∶1∶1至2.5(w/v)的比例处理。在本发明的一实例中，通过以10ng/ml、10ng/ml及20ng/ml的浓度组合向干细胞处理肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素并培养来确认干细胞的特应性皮炎治疗效果。
并且，本发明的干细胞可以为在肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素组合的基础上还处理维生素的干细胞，具体地，可以为还处理选自由维生素B2、素B3、维生素B5及维生素B6组成的组中的一种以上维生素的干细胞。在还使用维生素的启动因子组合处理干细胞来启动的情况下，可以更为显著地增加通过处理肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素来诱导的干细胞功能增强，还可以显著增加预防或治疗特应性皮炎的效果。能够以0.1至3∶0.1至3∶0.1至3∶100至10000(w/v)的比例向干细胞处理上述肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素及维生素，优选地，能够以1∶1∶0.1至3∶300至6000(w/v)的比例处理干细胞。更具体地，在肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素中追加维生素B2时，能够以0.1至3∶0.1至3∶0.1至3∶300至1000(w/v)的比例处理，更优选地，能够以1∶1∶0.1至3∶300至600(w/v)的比例处理，更加优选地，能够以1∶1∶0.1至3∶400至550(w/v)的比例处理，进而优选地，能够以1∶1∶2∶500(w/v)的比例处理，在肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素中追加维生素B3、维生素B5或维生素B6时，能够以0.1至3∶0.1至3∶0.1至3∶1000至10000(w/v)的比例处理，优选地，能够以0.1至3∶0.1至3∶0.1至3∶1000至6000(w/v)的比例处理，更加优选地，能够以1∶1∶0.1至3∶4000至6000(w/v)的比例处理，作为更具体的例，能够以1∶1∶0.1至3∶4000至5500(w/v)的比例处理，进而优选地，能够以1∶1∶2∶5000(w/v)的比例处理。
在本发明的一实例中，选定肿瘤坏死因子α为10ng/ml，γ-干扰素为10ng/ml，α-干扰素为20ng/ml并选定维生素B2为5μg/ml，维生素B3为50μg/ml，维生素B5为50μg/ml及维生素B6为50μg/ml作为复合处理的浓度处理干细胞来确认免疫调节及炎症调节功能的增强。结果，确认到与处理肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素相比，添加维生素的实验组中不仅吲哚胺2,3-双加氧酶及肿瘤坏死因子α刺激基因6的表达增加，作为在干细胞表面表达的粘附因子的细胞间粘附分子1(ICAM1，Intercellular adhesion molecule 1)和血管细胞粘附分子(Vascular cell adhesion molecule)的表达也显著增加。
在本发明中，“启动处理”或“启动因子处理”可以是指向干细胞处理肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素的组合或在上述组合中包含选自由维生素B2、维生素B3、维生素B5及维生素B6组成的组中的一种以上维生素的组合12小时至36小时，优选地，处理20小时至25小时并培养干细胞。上述培养可以不受限制地使用本发明所属技术领域中众所周知的干细胞培养基。
在本发明中，通过处理肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素或者肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素及维生素来增强功能的启动的干细胞是指在具有自我复制能力的同时具有能够分化为两个以上细胞的能力的细胞，可以分为万能干细胞(totipotent stemcell)、全能干细胞(pluripotent stem cell)、多能干细胞(multipotent stem cell)。上述干细胞可以根据目的适当且不受限制地选择，可以源自包括人类的哺乳动物，优选地，可以源自来源于人类的公知的所有组织、细胞等的成体细胞，例如，可以为来源于脂肪、骨髓、胎盘(或胎盘组织细胞)或脐带血的间充质干细胞。并且，上述干细胞可以是指克隆干细胞。
与为处理启动因子组合的干细胞相比，本发明的启动的干细胞可以为选自由肿瘤坏死因子α刺激基因6(TNFα-stimulated gene-6)的表达、吲哚胺2,3-双加氧酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase)的表达、细胞间粘附分子1的表达及血管细胞粘附分子的表达组成的组中的一种以上得到增加的干细胞，可以表现出选自由肥大细胞减少、总IgE减少、IgG2a的生成增加及组胺减少组成的组中的一种以上特应性皮炎治疗效果。
在将本发明的干细胞用作药物组合物的情况下，药物组合物还可以包含药物组合物的制备中通常使用的适当的载体、赋形剂及稀释剂。并且，药物组合物的制备中可以使用固体或液体的制剂用添加物。制剂用添加物可以任意为无机物或有机物。
例如，赋形剂可以为乳糖、蔗糖、白糖、葡萄糖、玉米淀粉(corn starch)、淀粉、滑石粉、山梨糖醇、结晶纤维素、糊精、高岭土、碳酸钙、二氧化硅等。结合剂可以为例如聚乙烯醇、聚乙烯醚、乙基纤维素、甲基纤维素、阿拉伯胶、黄芪胶(tragacanth)、明胶、虫胶(shellac)、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、柠檬酸钙、果胶(pectin)等。滑泽剂可以为例如硬脂酸镁、滑石粉、聚乙二醇、二氧化硅、氢化植物油等。着色剂只要是通常可接受向药品中添加的就都可以适用。它们的片剂、颗粒剂可以包糖衣、明胶包衣、其他根据需要适当地包衣。并且，还可以根据需要添加防腐剂、抗氧化剂等。
本发明的药物组合物可以制备为本发明所属技术领域中通常制备的任意剂型(例如，文献[Remington's Pharmaceutical Science，最新版；Mack Publishing Company,Easton PA])，制剂的形态不受特别限制，优选地，可以为外用剂。本发明的外用剂可以包括敷片剂、液体涂敷剂、乳剂、霜剂、凝胶膏剂、粉剂、渗透垫剂、喷雾剂、凝胶剂、糊剂、搽剂、软膏剂、气雾剂、粉末剂、悬混液剂、经皮吸收剂等通常的外用剂的形态。这些剂型都在制药化学中通常公知的处方书的文献[Remington's Pharmaceutical Science]中记述。
本发明的药学有效量可以根据患者的伤口种类、应用部位、处理次数、处理时间、剂型、患者的状态、辅助剂的种类等的不同而变化。使用量不受特别限制，通常本发明的药物组合物的每日有效量在向患者使用时可以为0.00001μg至10000μg。上述1日剂量可以一次或以适当间隔分为2～3次来给药，也可以间歇数日来给药。
然而，本发明的药物组合物的上述使用量应参照给药途径、患者的年龄、性别、体重、患者的疾病严重程度、伤口种类、应用部位、处理次数、处理时间、剂型、患者的状态、辅助剂的种类等多种相关因素来决定，上述有效量无论从任何方面都不应理解为限制本发明的范围。
并且，本发明涉及预防或治疗特应性皮炎的方法，包括对有需要的个体处理使用肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素或肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素及维生素处理的干细胞的步骤。
本发明的个体可以是指包括人类在内的所有动物。上述动物不仅为人类，还可以为需要治疗与上述特应性皮炎相似症状的牛、马、羊、猪、山羊、骆驼、羚羊、狗、猫等哺乳动物。并且，还可以是指除人类以外的动物，但不限定于此。
并且，上述个体作为需要治疗特应性皮炎的患者，包括正在治疗特应性皮炎的患者、曾经接受过治疗的患者、需要接受特应性皮炎治疗的患者。
并且，本发明的使用肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素或肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素及维生素处理的干细胞可以与现有的用于治疗特应性皮炎的药物或治疗方法联合来处理。在联合本发明启动的干细胞来处理的情况下，可以与用于治疗特应性皮炎的其他药物或治疗方法同时或依次处理。
并且，本发明提供包含使用肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素或肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素及维生素启动的干细胞的用于预防或治疗特应性皮炎的干细胞治疗剂。
本发明的干细胞治疗剂可以通过包括口服、经皮、皮下、静脉或肌肉在内的多种途径来给药，活性成分的给药量可以根据给药途径、患者的年龄、性别体重及患者的疾病严重程度等多种因素来适当地选择。优选地，可以胃肠外给药，可以通过静脉内注射、皮下注射、肌肉注射及腹腔注射等来给药。
优选地，本发明的干细胞治疗剂的给药量可以为一天1×102～1×1012细胞/kg。
并且，本发明提供包含使用肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素处理的干细胞的用于预防或改善特应性皮炎的化妆品组合物。
更具体地，能够以0.1-3∶0.1-3∶0.1-3(w/v)的比例处理上述肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素，优选地，能够以1∶1∶0.1至3(w/v)的比例处理，更优选地，能够以1∶1∶1至3(w/v)的比例处理，更加优选地，能够以1∶1∶1至2.5(w/v)的比例处理。在本发明的一实例中，通过以10ng/ml、10ng/ml及20ng/ml的浓度组合向干细胞处理肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素并培养来确认预防或改善干细胞的效果。
并且，本发明的干细胞可以在肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素的组合的基础上还处理维生素的干细胞，具体地，可以为还处理选自由维生素B2、维生素B3、维生素B5及维生素B6组成的组中的一种以上维生素的干细胞。
在使用还包含维生素的启动因子组合处理干细胞来启动的情况下，可以更为显著地增加通过处理肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素来诱导的干细胞功能增强，还可以显著增加预防或改善特应性皮炎的效果。能够以0.1至3∶0.1至3∶0.1至3∶100至10000(w/v)的比例向干细胞处理上述肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素及维生素，优选地，能够以1∶1∶0.1至3∶300至6000(w/v)的比例处理干细胞。更具体地，在肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素中追加维生素B2时，能够以0.1至3∶0.1至3∶0.1至3∶300至1000(w/v)的比例处理，更优选地，能够以1∶1∶0.1至3∶300至600(w/v)的比例处理，更加优选地，能够以1∶1∶0.1至3∶400至550(w/v)的比例处理，进而优选地，能够以1∶1∶2∶500(w/v)的比例处理，在肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素中追加维生素B3、维生素B5或维生素B6时，能够以0.1至3∶0.1至3∶0.1至3∶1000至10000(w/v)的比例处理，优选地，能够以0.1至3∶0.1至3∶0.1至3∶1000至6000(w/v)的比例处理，更加优选地，能够以1∶1∶0.1至3∶4000至6000(w/v)的比例处理，作为更具体的例，能够以1∶1∶0.1至3∶4000至5500(w/v)的比例处理，进而优选地，能够以1∶1∶2∶5000(w/v)的比例处理。
本发明的启动的干细胞可以表现出选自由肥大细胞减少、总IgE减少、IgG2a的生成增加及组胺减少组成的组中的一种以上特应性皮炎改善效果。
并且，本发明提供用于预防或治疗特应性皮炎的组合物的制备方法，包括：步骤1)，使用肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素或肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素及维生素处理干细胞并培养。上述维生素可以为选自由维生素B2、维生素B3、维生素B5及维生素B6组成的组中的一种以上维生素。
在根据本发明向干细胞处理肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素或肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素及维生素并培养的情况下，可以制备特应性皮炎的预防、改善或治疗功能得到增强的干细胞，尤其在本发明的一实例中，确认到可以通过处理肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素及维生素B6组合的启动因子来制备增大治疗特应性皮炎的效果的干细胞，将其命名为“pcMSC2(启动的克隆间充质干细胞2(Primed clonal MesenchymalStem Cell 2))”。
并且，本发明提供将肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素或肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素及维生素用在用于预防或治疗特应性皮炎的组合物的制备方法中的用途，上述制备方法包括：步骤1)，使用肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素或肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素及维生素处理干细胞并培养。上述维生素可以为选自由维生素B2、维生素B3、维生素B5及维生素B6组成的组中的一种以上维生素，优选地，可以为维生素B6。
上述处理可以是指向干细胞处理肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素的组合或在上述组合中包含选自由维生素B2、维生素B3、维生素B5及维生素B6组成的组中的一种以上维生素的组合12小时至36小时，优选地，处理20小时至25小时并培养干细胞。上述培养可以不受限制地使用本发明所属技术领域中众所周知的干细胞培养基。
本发明的实施方式
以下，通过实施例更为详细地说明本发明。但这些实施例仅用于例示本发明，本发明所属技术领域的普通技术人员应该自明的是，本发明的范围不应解释为限定于这些实施例。
实施例1.干细胞培养及候选物质选定
在37℃及5％CO2的恒温箱中，解冻储存状态(LN2罐(tank)中保管)的间充质干细胞并培养，在此情况下，在包含10％的胎牛血清(FBS)或4％的hPL的培养基(杜氏改良伊戈尔培养基(DMEM)，α改良最少必需培养基(alpha-MEM))中培养直至增殖至细胞汇合为80％左右。将培养的间充质干细胞接种(seeding)到100mm的培养皿(dish)中后，处理用于增强间充质干细胞功能的候选物质24小时后，设定用于增强功能的一次候选物质的浓度。
选定肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素作为一次候选物质，为了确认功能增强，为了确认能够增加肿瘤坏死因子α刺激基因6和吲哚胺2,3-双加氧酶的表达的最佳有效浓度，分别向干细胞处理5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml的肿瘤坏死因子α、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml的γ-干扰素以及10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml的α-干扰素并确认肿瘤坏死因子α刺激基因6及吲哚胺2,3-双加氧酶的表达变化。
吲哚胺2,3-双加氧酶已知为通过将T细胞增殖所必需的色氨酸变换为犬尿氨酸(kynurenine)来抑制T细胞等免疫细胞的增殖的免疫调节因子，肿瘤坏死因子α刺激基因6已知为间充质干细胞分泌的抗炎调节因子。培养干细胞后，利用TRIzol(英杰公司(Invitrogen))分离总核糖核酸(RNA)后，利用PrimeScriptTM含基因组脱氧核糖核酸消除剂的反转录试剂盒(RT reagent Kit with gDNA Eraser)(宝日医公司(TaKaRa))通过总核糖核酸合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)来进行实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)。处理不同浓度的各候选物质的肿瘤坏死因子α刺激基因6及吲哚胺2,3-双加氧酶的结果如图1、图2及图3所示。
如图1至图3所示，确认到能够显著诱导肿瘤坏死因子α刺激基因6及吲哚胺2,3-双加氧酶的表达增加的最佳有效浓度，肿瘤坏死因子α为10ng/ml，γ-干扰素为10ng/ml，α-干扰素为20ng/ml，在之后的实验中以相关浓度为基准来处理。
实施例2.选定用于干细胞功能增强的组合
为了在通过上述实施例1确认诱导干细胞的功能增强的候选物质及最佳有效浓度的基础上探索进一步增强的功能增强组合物，如表1所示来设定选定的候选物质及它们的浓度组合。使用下述表1记载的候选组合处理间充质干细胞24小时并以与实施例相同的方式培养后，利用TRIzol(英杰公司)分离总核糖核酸。利用PrimeScriptTM含基因组脱氧核糖核酸消除剂的反转录试剂盒(宝日医公司)通过总核糖核酸合成互补脱氧核糖核酸来进行实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)。
表1
通过此确认作为免疫及抗炎调节的代表因子的吲哚胺2,3-双加氧酶、肿瘤坏死因子α刺激基因6的表达变化，结果如图4所示。
如图4所示，与无处理对照组实验组0相比，确认到所有单一候选物质肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素处理组(实验组1至实验组3)中吲哚胺2,3-双加氧酶、肿瘤坏死因子α刺激基因6的表达增加，但与单一候选物质处理组相比，确认到分别组合它们的实验组4至实验组6中更为显著地增加表达。尤其，与仅组合γ-干扰素与α-干扰素的实验组6相比，与肿瘤坏死因子α处理γ-干扰素或α-干扰素的实验组4、实验组5示出更为优秀的效果，而组合三种物质的处理组中确认到比两两组合的情况增加2倍以上的惊人的功能增强效果。
由此，通过上述结果确认，在使用肿瘤坏死因子α(10ng/ml)+γ-干扰素(10ng/ml)+α-干扰素(20ng/ml)组合处理干细胞的情况下，可以实现最为显著的干细胞的免疫及抗炎功能的增强。
实施例3.确认追加维生素的干细胞功能增强效果
3.1.确认单独添加维生素的干细胞功能增强效果
已知在干细胞培养过程中添加维生素时，改善干细胞的增殖能力并保持干细胞的干性(stemness)。因此，进行在干细胞培养过程中处理多种维生素并确认维生素是否能够实现干细胞的抗炎及免疫功能增强效果的实验。具体地，根据实施例1所示的方法使用下述表2所示的多个维生素种类处理干细胞，确认吲哚胺2,3-双加氧酶及肿瘤坏死因子α刺激基因6的表达随各候选物质处理的变化的结果如图5所示。
表2
如图5所示，维生素处理组在有关干细胞的抗炎及免疫调节功能的吲哚胺2,3-双加氧酶及肿瘤坏死因子α刺激基因6的表达变化中未表现出显著效果。
3.2.确认维生素与肿瘤坏死因子α+γ-干扰素+α-干扰素组合的干细胞功能增强效果
为了确认将如上所述的作为单一物质未示出干细胞抗炎及免疫调节功能增强效果的维生素添加到实施例2中确认的功能增强物质的组合中时是否表现出协同效应，如下述表3所示，向肿瘤坏死因子α(10ng/ml)+γ-干扰素(10ng/ml)+α-干扰素(20ng/ml)加入各维生素并确认吲哚胺2,3-双加氧酶及肿瘤坏死因子α刺激基因6的表达随各组合的处理的变化，结果如图6所示。
表3
/>
如图6所示，与维生素未处理实验组1相比，实验组2、实验组3、实验组8、实验组9中吲哚胺2,3-双加氧酶及肿瘤坏死因子α刺激基因6的表达没有显著增加，实验组10中肿瘤坏死因子α刺激基因6的表达增加，但相对于对照组，未确认到吲哚胺2,3-双加氧酶的表达显著增加。相反，在维生素B2(实验组4)、维生素B3(实验组5)、维生素B5(实验组6)、维生素B6(实验组7)的情况下，确认到吲哚胺2,3-双加氧酶和肿瘤坏死因子α刺激基因6的表达都显著增加。在肿瘤坏死因子α刺激基因6的情况下，与处理肿瘤坏死因子α+γ-干扰素+α-干扰素的实验组1比较时，确认到实验组4、实验组5、实验组6、实验组7中分别增加49％、30％、35％、45％，在吲哚胺2,3-双加氧酶的情况下，与实验组1比较时，确认到实验组4、实验组5、实验组6、实验组7中分别增加25％、37％、31％、18％。
上述结果表明，虽然向干细胞单独处理维生素时无法提高干细胞的抗炎及免疫调节能力，但在将肿瘤坏死因子α+γ-干扰素+α-干扰素与维生素B2、维生素B3、维生素B5或维生素B6组合来处理时，可以进一步提高肿瘤坏死因子α+γ-干扰素+α-干扰素的效果。
实施例4.确认细胞间粘附分子1及血管细胞粘附分子的表达变化
细胞间粘附分子1与血管细胞粘附分子通过与T细胞结合抑制T细胞的增殖并诱导凋亡来减少过度的免疫和炎症反应，从而可以在多种免疫及炎症相关疾病中示出效果。因此，以与上述实施例3的表3中记载的相同的实验组处理间充质干细胞24小时并以与实施例1相同的方式培养干细胞后，利用TRIzol(英杰公司)分离总核糖核酸。利用PrimeScriptTM含基因组脱氧核糖核酸消除剂的反转录试剂盒(宝日医公司)通过总核糖核酸合成互补脱氧核糖核酸来进行实时定量聚合酶链式反应。
为了确认是否增加干细胞的免疫疾病及炎症疾病治疗效果，确认了在干细胞表面表达的粘附因子细胞间粘附分子1和血管细胞粘附分子的表达，结果如图7所示。
如图7所示，在细胞间粘附分子1的情况下，与处理肿瘤坏死因子α+γ-干扰素+α-干扰素的实验组1比较时，确认到实验组4、实验组5、实验组6、实验组7中分别增加45％、100％、35％、45％，在血管细胞粘附分子(VACM)的情况下，与实验组1比较时，确认到实验组4、实验组5、实验组6、实验组7中分别增加52％、69％、52％、69％。
因此，在使用肿瘤坏死因子α+γ-干扰素α-干扰素与维生素B2、维生素B3、维生素B5或维生素B6的组合处理干细胞时，显著增加细胞间粘附分子1及血管细胞粘附分子的表达，通过此可以促进干细胞的免疫调节能力及抗炎功效。
实施例5.确认炎症及免疫调节能力
确认到在增强吲哚胺2,3-双加氧酶、肿瘤坏死因子α刺激基因6、细胞间粘附分子1(ICAM-1)、血管细胞粘附分子等免疫及炎症调节因子的上述实施例4中确认的启动处理条件组合在实际诱发过度免疫反应的条件下抑制炎症及免疫反应，与功能未增强的cMSC相比，确认到示出更为优秀的效果。以下，使用表3中实验组7的肿瘤坏死因子α+γ-干扰素α-干扰素与维生素B6的组合处理克隆的间充质干细胞(cMSC)，将使用上述组合启动处理的间充质干细胞(MSC)命名为“pcMSC2(启动的克隆间充质干细胞2)”。
植物血凝素(PHA，Phytochemagglutinin)刺激淋巴细胞实验为利用诱导促进淋巴细胞的细胞分裂的称为“植物血凝素”的试剂来诱导过度的免疫活性的方法。向96孔培养板(96well plate)的每孔(well)接种2×105cells的中外周血单个核细胞(PBMC，peripheralblood mononuclear cell，外周血细胞)，使用1μg/ml的植物血凝素刺激并与5×104cell的cMSC或pcMSC2共培养4天。培养结束后，收集上清液通过酶联免疫吸附测定确认作为炎性细胞因子的γ-干扰素(IFN-gamma)和作为抗炎细胞因子的白细胞介素10，结果如图8所示。使用未使用植物血凝素刺激的组作为阴性对照组，以P1来表示。
如图8所示，在使用植物血凝素刺激的情况下，γ-干扰素显著增加至16013pg/ml，但在与cMSC共培养的情况下，减少至5048pg/ml，而在与pcMSC2共培养的情况下，确认到显著减少至1700pg/ml。并且，在比较cMSC与pcMSC2时，确认到在功能增强的pcMSC2中，γ-干扰素比cMSC的情况显著减少约66％。在作为抗炎细胞因子的白细胞介素10的情况下，在cMSC和pcMSC2中都确认到白细胞介素10的增加，尤其在与功能比cMSC增强的pcMSC2共培养的条件下，确认到分泌多出约22％的白细胞介素10。
实施例6.在特应性皮炎动物模型中确认pcMSC2的治疗效果
为了确认本发明的pcMSC2的免疫调节及抗炎效果在特应性皮炎动物模型中是否也比cMSC优秀而进行实验。
6.1.特应性皮炎动物模型的制备及实验方法
特应性皮炎试验中使用的动物为6周龄的雌性无特定病原体(SPF，specificpathogen-free)BALB/c小鼠(mice)(15～20g)，从SLC.Inc公司(静冈(Shizuoka)，日本(Japan))获得，在饲养室内经过1周的驯化时间后进行实验。在仁荷大学医学院生命科学研究所的温度22～25℃、湿度40～60％、昼夜12小时交替以及150～300Lux的照明的小鼠(mouse)用饲养笼(cage)中饲养5只，保持能够自由摄取灭菌蒸馏水和固体饲料的饲养环境并进行实验。混合50μg/50μl(磷酸盐缓冲溶液(PBS))的卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)与4mg/100μl的明矾佐剂(Alum Adjuvant)并向7周龄的BALB/c小鼠每周一次腹腔、皮下给药3周共三次来来诱导特应性皮炎的致敏。由于三次都向相同部位给药时会与相关疾病无关地诱发炎症，因此分别向不同部位给药。在给药卵清蛋白(OVA)3周后，每周向去毛的背部皮肤贴附浸湿60μg/60μl(磷酸盐缓冲溶液)的卵清蛋白的1.2cm×1.2cm大小的灭菌纱布2～3次共2周来在局部诱导特应性。通过卵清蛋白敷料(OVA patch)诱导特应性后，间隔2天通过尾静脉注射磷酸盐缓冲溶液、cMSC、pMSC2共3次。注射量每次为1.66×105/200μl，3次共静脉给药5.0×105/600μl。给药结束两天后，每周向去毛的背部皮肤贴附浸湿60μg/60μl(磷酸盐缓冲溶液)的卵清蛋白的1.2×1.2cm大小的灭菌纱布3～4次共2周来在局部诱导特应性。诱导特应性皮炎后的第13～14天，使用限制器(restrainer)固定实验动物后，利用装有261/2gauge的针头(needle)的BD公司的1ml的注射器(syringe)通过尾静脉给药。溶剂组(Veh.组)为以相同的方式静脉内给药磷酸盐缓冲溶液来替代试验物质，除无处理组(Naive组)、溶剂组以外，使试验物质在磷酸盐缓冲溶液中悬浮后静脉给药。磷酸盐缓冲溶液及试验物质都以200μl/head的相同的量来给药。
以如下方式获得用于确认对于特应性皮炎的效果的血液样品。所有实验动物在给药细胞稳定剂或试验物质后第13天利用异氟醚(isoflurane)麻醉后，切开腹部露出后腔静脉后，使用1ml的注射器采血约700μl。将采集的血液放入血清分离管(Serum separatetube)在4℃的温度下以3000rpm/15分钟的条件离心分离后分离血清(serum)，将分离的血清装在1.5ml的e-tube中后在-70℃的低温冰箱(deep freezer)中保管。
为了分析对于特应性皮炎的效果，利用酶联免疫吸附测定试剂盒(ELISA kit)在所有实验动物的血清试样中测定总(Total)IgE、IgG2a、组胺的浓度，测定方法以试剂盒(kit)内的说明书为准来实施。具体地，IgE水平(level)测定首先将通过后腔静脉采集的血液装入乙二胺四乙酸试管(EDTA tube)中以3000rpm的转速离心分离15分钟后只分离上清液并在-70℃的温度下保管直至进行实验。在酶标板(ELISA plate)中将能够识别IgE的捕获抗体(capture antibody)与包被缓冲液(coating buffer)一同在4℃的温度下过夜(overnight)保管，次日经过1小时的封闭(blocking)过程后，将血清稀释100倍后使用50μl的量在室温下反应2小时。然后，放入识别IgE的二抗后，放入作为底物缓冲液(substratebuffer)的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液(TMB solution)并反应约15分钟后，放入50μl的终止液(stop solution)。利用酶标仪(ELISA reader)在450nm的滤波器(filter)中测定值。
在实验结束的时间点在4％的福尔马林溶液中固定摘出的皮肤组织后，制备组织切片并使用甲苯胺蓝(toluidine blue)染色渗透到真皮内的肥大细胞。
6.2.确认pcMSC2对皮肤病变的缓解
向实施例6.1的特应性皮炎诱发动物模型以上述方案给药cMSC、pcMSC2，59天后确认皮肤病变的变化，结果如图9及图10所示。
如图9所示，通过肉眼即可确认pcMSC2给药组中特应性皮肤病变得到有效改善。尤其，如图10所示，确认到与未启动处理的cMSC给药组相比，pcMSC2给药组的皮肤肥厚得到更为有效的缓解。
6.3.确认pcMSC2的肥大细胞减少效果
向实施例6.1的特应性皮炎诱发动物模型以上述方案给药cMSC、pcMSC2，追加进行利用吉萨姆(Giemsa)的皮肤组织染色，利用100倍率的paint.NET计数肥大细胞的数量。定量计数的肥大细胞数量如图11所示。
如图11所示，与正常对照组相比，特应性皮炎模型中通过炎症诱发的肥大细胞显著增加，确认到如此的增加在cMSC和pcMSC2的作用下减少。尤其，在比较cMSC与pcMSC2的情况下，确认到pcMSC2处理组中肥大细胞的数量显著减少。
6.4.确认pcMSC2的总IgE抑制效果及IgG2生成效果
向实施例6.1的特应性皮炎诱发动物模型以上述方案给药cMSC、pcMSC2，比较总IgE及IgG2的结果如图12及图13所示。
如图12所示，确认到已知在特应性患者的血清中以高浓度存在的总IgE在cMSC及pcMSC2给药组中减少，尤其，确认到pcMSC2给药组比cMSC给药组显著减少。并且，如图13所示，能够通过调节辅助性T细胞1转换(Th1 shifting)、免疫平衡(immune balnce)来缓解特应性症状的IgG2a的生成，在pcMSC2给药组中比cMSC给药组显著优秀，确认到与特应性皮炎模型组(vehicle)相比，增加约2倍。
6.5.确认pcMSC2的组胺减少效果
已知组胺扩张血管并刺激感受瘙痒的神经纤维来诱发瘙痒。向实施例6.1的特应性皮炎诱发动物模型以上述方案给药cMSC、pcMSC2，比较组胺的结果如图14所示。
如图14所示，当cMSC处理组与vehicle比较时，组胺没有显著变化，但在启动的pcMSC2给药组中确认到显著的减少效果。
通过上述内容，确认向干细胞处理肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素或肿瘤坏死因子α+γ-干扰素+α-干扰素与维生素B2、维生素B3、维生素B5或维生素B6的组合时，可以启动干细胞来增加干细胞所具有的免疫调节及炎症调节能力，尤其是使用包含肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素及维生素B6组合的启动组合物处理的干细胞与未进行这样的启动处理的干细胞相比，确认到优秀的特应性皮炎治疗效果。
以上，详细记述了本发明内容的特定部分，本发明所属技术领域的普通技术人员应该明白的是，这些具体的记述仅为优选的实施形态，本发明的范围限定于上述记述的内容。因此，本发明的实质范围应由随附的发明要求保护范围及其等价物来定义。

Claims (16)

1.一种用于预防或治疗特应性皮炎的药物组合物，其特征在于，包含使用肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素处理的干细胞。
2.根据权利要求1所述的用于预防或治疗特应性皮炎的药物组合物，其特征在于，以0.1至3∶0.1至3∶0.1至3(w/v)的比例处理上述肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素。
3.根据权利要求1所述的用于预防或治疗特应性皮炎的药物组合物，其特征在于，上述干细胞为还使用选自由维生素B2、维生素B3、维生素B5及维生素B6组成的组中的一种以上维生素处理的干细胞。
4.根据权利要求3所述的用于预防或治疗特应性皮炎的药物组合物，其特征在于，以0.1至3∶0.1至3∶0.1至3∶100至10000(w/v)的比例处理肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素及维生素。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的用于预防或治疗特应性皮炎的药物组合物，其特征在于，上述干细胞为源自脂肪、骨髓、胎盘或脐带血的间充质干细胞。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的用于预防或治疗特应性皮炎的药物组合物，上述干细胞增加选自由肿瘤坏死因子α刺激基因6的表达、吲哚胺2,3-双加氧酶的表达、细胞间粘附分子1的表达及血管细胞粘附分子的表达组成的组中的一种以上。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的用于预防或治疗特应性皮炎的药物组合物，上述干细胞表现出选自由肥大细胞减少、总免疫球蛋白E减少、免疫球蛋白G2a的生成增加及组胺减少组成的组中的一种以上特应性皮炎治疗效果。
8.一种用于预防或治疗特应性皮炎的干细胞治疗剂，其特征在于，包含权利要求1至4中任一项所述的用于预防或治疗特应性皮炎的药物组合物。
9.一种用于预防或改善特应性皮炎的化妆品组合物，其特征在于，包含使用肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素处理的干细胞。
10.根据权利要求9所述的用于预防或改善特应性皮炎的化妆品组合物，其特征在于，以0.1至3∶0.1至3∶0.1至3(w/v)的比例处理上述肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素。
11.根据权利要求9所述的用于预防或改善特应性皮炎的化妆品组合物，其特征在于，上述干细胞为还使用选自由维生素B2、维生素B3、维生素B5及维生素B6组成的组中的一种以上维生素处理的干细胞。
12.根据权利要求9所述的用于预防或改善特应性皮炎的化妆品组合物，其特征在于，以0.1至3∶0.1至3∶0.1至3∶100至10000(w/v)的比例处理肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素及维生素。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的用于预防或改善特应性皮炎的化妆品组合物，其特征在于，上述干细胞表现出选自由肥大细胞减少、总免疫球蛋白E减少、免疫球蛋白G2a的生成增加及组胺减少组成的组中的一种以上特应性皮炎改善效果。
14.一种用于预防或治疗特应性皮炎的组合物的制备方法，其特征在于，包括：
步骤1)，使用肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素处理干细胞并培养。
15.根据权利要求14所述的用于预防或治疗特应性皮炎的组合物的制备方法，其特征在于，在上述步骤1)中，一同处理选自由维生素B2、维生素B3、维生素B5及维生素B6组成的组中的一种以上维生素。
16.一种预防或治疗特应性皮炎的方法，其特征在于，包括对有需要的个体处理由肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及α-干扰素或者由肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、α-干扰素及维生素启动的干细胞的步骤。
CN202280035957.2A 2021-05-18 2022-05-18 包含功能增强干细胞的用于预防或治疗特应性皮炎的组合物 Pending CN117813103A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2021-0064147 2021-05-18
KR1020210064147A KR20220156297A (ko) 2021-05-18 2021-05-18 기능강화 줄기세포를 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 조성물
PCT/KR2022/007135 WO2022245138A1 (ko) 2021-05-18 2022-05-18 기능강화 줄기세포를 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117813103A true CN117813103A (zh) 2024-04-02

Family

ID=84140624

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280035957.2A Pending CN117813103A (zh) 2021-05-18 2022-05-18 包含功能增强干细胞的用于预防或治疗特应性皮炎的组合物

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP4342479A1 (zh)
JP (1) JP2024519058A (zh)
KR (1) KR20220156297A (zh)
CN (1) CN117813103A (zh)
IL (1) IL308620A (zh)
WO (1) WO2022245138A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4258410A1 (en) 2021-11-24 2023-10-11 LG Energy Solution, Ltd. Method for activating lithium secondary battery

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10046011B2 (en) * 2008-01-31 2018-08-14 Rutgers, The State University Of New Jersey Compositions for inducing or suppressing an immune response
CN110352240A (zh) * 2016-12-12 2019-10-18 北京汉氏联合生物技术股份有限公司 围产期组织衍生的间充质干细胞：其制备方法和用途

Also Published As

Publication number Publication date
EP4342479A1 (en) 2024-03-27
IL308620A (en) 2024-01-01
WO2022245138A1 (ko) 2022-11-24
KR20220156297A (ko) 2022-11-25
JP2024519058A (ja) 2024-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2620156A2 (en) Pharmaceutical composition for preventing or treating immune diseases or inflammatory diseases, containing stem cells treated with nod2 agonist or cultured product thereof
KR101512171B1 (ko) 줄기세포를 유효 성분으로 함유하는 면역 질환 또는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물
CN105073110A (zh) 通过诱导分化成调节性t细胞和促进调节性t细胞增殖来抑制免疫应答的药物组合物
CN117813103A (zh) 包含功能增强干细胞的用于预防或治疗特应性皮炎的组合物
KR101656511B1 (ko) 육모 및 탈모방지능이 개선된 지방줄기세포 배양액 및 그의 제조방법
US20200390819A1 (en) Erectile dysfunction therapeutic agent
JP7430010B2 (ja) 幹細胞の機能強化用組成物
US20170007668A1 (en) Pharmaceutical Composition Comprising Stem Cells Treated with NOD2 Agonist or Culture Thereof for Prevention and Treatment of Immune Disorders and Inflammatory Diseases
CN111214462B (zh) 烷烃类化合物降植烷作为免疫补充增强剂在制备预防和治疗实体肿瘤药物中应用
CN117355316A (zh) 癌症恶病质的改善剂和癌症恶病质的改善方法
JP2024520155A (ja) 機能強化幹細胞および調節性ｔ細胞を含むアトピー性皮膚炎の予防または治療用併用投与組成物
KR102492888B1 (ko) 줄기세포 프라이밍 조성물 및 프라이밍된 줄기세포
KR101705361B1 (ko) Ｅｇｃｇ를 유효성분으로 함유하는 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스의 예방 또는 치료용 조성물
KR20230172252A (ko) 기능강화 줄기세포를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물
KR102465432B1 (ko) 크리소파놀을 유효성분으로 포함하는 t 세포의 과활성 억제용 조성물, 및 이의 용도
KR102567813B1 (ko) 발모 촉진 또는 아토피 피부염 치료 또는 개선용 조성물
KR20120026208A (ko) Ｓｔａ-21을 유효성분으로 함유하는 암 또는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물
KR20180000977A (ko) 인간 중간엽 줄기세포를 이용한 FoxP3+ 조절 T 세포 생산 증대 기술
US20220023349A1 (en) Treatment of cachexia using fibroblast cells and products thereof
KR20150062817A (ko) 태반의 융모막 또는 와튼제대교질 유래 간엽줄기세포로부터 신경세포 및 유모세포를 분화시키는 방법
CN117883458A (zh) 一种胆固醇合成中间代谢物法尼基二磷酸的免疫效应及用途
TW202103690A (zh) 使用2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇來預防和/或治療乾癬
KR20180001525A (ko) 인간 중간엽 줄기세포를 이용한 FoxP3+ 조절 T 세포 생산 증대 기술
KR20170113279A (ko) 용해성 ｐｄ－ｌ１이 처리된 면역조절능을 갖는 골수유래억제세포 및 이의 용도
KR20120029342A (ko) 레티날을 유효성분으로 포함하는 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination