JP2024519058A - 機能強化幹細胞を含むアトピー性皮膚炎の予防または治療用組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、プライミングされた機能強化幹細胞を含むアトピー性皮膚炎の予防、改善または治療用組成物に関する。本発明のＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αまたはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンで処理されてプライミングされた幹細胞は、上記のようなプライミング因子で処理されていない未処理幹細胞と比較して抗炎症および免疫調節能が強化され、アトピー性皮膚炎症状の予防または治療効果が優れている。従って、本発明の機能強化された幹細胞は、多様なアトピー性皮膚炎の予防、改善または治療分野において広く活用されてもよい。
Description
本発明は、プライミングされた機能強化幹細胞を含むアトピー性皮膚炎の予防、改善または治療用組成物に関する。
幹細胞は未分化細胞であって、自己再生を通じて長期間分裂することができ、特定の環境下においては、多様な種類の細胞に分化できる細胞のことを言う。幹細胞は、起源になる組織に応じて胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）と成体幹細胞（Ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）とに分けられ、胚性幹細胞を利用した治療実験が倫理的な面と腫瘍形成の可能性から難しい点があるのに対し、成体幹細胞は、多様な組織から容易に得られるという長所があることから、多様な疾患の治療に適用しようとする研究が活発に進められている。
現在まで多くの化合物免疫抑制剤または抗炎症剤が開発されており、臨床的に最もよく用いられる免疫抑制剤としては、シクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ、Ｎｅｏｒａｌ、Ｃｉｐｏｌ Ａ）、アザチオプリン（ｉｍｕｒａｎ）、プレドニゾロン（一種のステロイド）がある。前記免疫抑制剤は、抗原刺激から抗体生成に至る過程でマクロファージによる抗原の貪食、リンパ球などによる抗原認識、細胞分裂、Ｔ細胞とＢ細胞の分裂、抗体の生成などの幾つかの過程を阻害することによって、免疫抑制を惹起する。このような薬物は、大部分の抗腫瘍活性を同時に有しており、その理由は、ＤＮＡ障害、ＤＮＡ合成阻止などを媒介にして細胞分裂を阻止するためである。しかし、これに伴う代表的な副作用として、高血圧と腎毒性（腎機能が低下される）があり、その副作用の発生率が高いため、使用時に十分に経過を観察しなければならないなどの問題点がある。その他の副作用として稀に震え、発作、肝炎、胆汁うっ滞、血中尿酸の増加、筋力の低下、多毛症（ｈｙｐｅｒｔｒｉｃｈｏｓｉｓ）、歯肉肥大（ｇｉｎｇｉｖａｌ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）などがある。よく用いられる抑制剤のうち、アザチオプリンは白血球数値の減少、貧血、血小板の減少などの骨髄機能を抑制したりし、膵炎、肝炎、胆汁うっ滞と共に稀に脱毛、発熱などが見られる合併症があり得る。ステロイド製剤の一つのプレドニゾロンは免疫抑制剤の中で最も先に用いられ始めたが、動脈硬化症を促進させるだけでなく、高血圧、胃潰瘍、糖尿、成長阻害、骨粗鬆症、白内障、緑内障などを引き起こすため、注意しなければならない薬物である。従って、安全な免疫抑制剤または抗炎症剤の必要性が台頭している。
このような問題点を解決するために、最近、幹細胞を利用した治療法が炎症および免疫疾患の治療のために試みられている。特に、中間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＭＳＣ）は、炎症を抑制させるかまたは調節Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ、Ｔｒｅｇ）の生成を誘導するかまたは細胞死滅に関与する免疫細胞の死滅を誘導することが知られており、それを利用した多様な治療剤の開発が活発に行われている。
しかし、幹細胞を利用した多様な臨床試験において、効果の持続性や、長期追跡の結果、生体内の生存割合が極めて低いという問題点が報告されており、幹細胞治療剤を改善するための多様な試みがなされている。例えば、治療効果を高めるために幹細胞に特定遺伝子を挿入するか、幹細胞の機能をブースティングすることができる多様な化学物、ペプチドなどを前処理する方法、培養時の低酸素、温度、光のような刺激条件を追加する方法が試みられるか、幹細胞の生存率を高めるために支持体とともに投与する方法が研究されている。幹細胞の機能強化のための多様な研究のうち遺伝子操作を利用した機能改善の方法は効果的であるかもしれないが、導入される遺伝子の安全性などの問題点が指摘される。
従って、幹細胞自体に遺伝子を導入して機能を強化するよりは、培養中に多様なプライミング要素の処理を通じて幹細胞の内在的な機能を強化するための多様な研究が試みられている。
本発明者は、幹細胞の機能をより強化するために研究していたところ、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミン；を処理すれば、幹細胞のアトピー性皮膚炎の予防または治療効果が顕著に増進できることを確認し、本発明を完成した。
従って、本発明の目的は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミン；でプライミングされた幹細胞を含むアトピー性皮膚炎の予防、改善または治療用組成物およびその製造方法を提供することである。
前記目的を達成するために、本発明は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αで処理された幹細胞を含む、アトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンが処理された幹細胞を含むアトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、前記組成物を含むアトピー性皮膚炎の予防または治療用幹細胞治療剤を提供する。
また、本発明は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αで処理された幹細胞を含む、アトピー性皮膚炎の予防または改善用化粧料組成物を提供する。
また、本発明は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンが処理された幹細胞を含むアトピー性皮膚炎の予防または改善用化粧料組成物を提供する。
また、本発明は、１）ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αを幹細胞に処理して培養するステップ；を含む、アトピー性皮膚炎の予防または治療用組成物の製造方法を提供する。
また、本発明は、１）ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－α；およびビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミン；を幹細胞に処理して培養するステップ；を含む、アトピー性皮膚炎の予防または治療用組成物の製造方法を提供する。
また、本発明は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミン；でプライミングされた幹細胞を、それを必要とする個体に処理するステップ；を含むアトピー性皮膚炎の予防または治療方法を提供する。
本発明のＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αまたはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンで処理されてプライミングされた幹細胞は、上記のようなプライミング因子で処理されていない未処理幹細胞と比較して抗炎症および免疫調節能が強化されてアトピー性皮膚炎症状の予防または治療効果が優れている。従って、本発明の機能強化された幹細胞は、多様なアトピー性皮膚炎の予防、改善または治療分野において広く活用されてもよい。
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミン；で処理された幹細胞を含む、アトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物に関する。
本発明の幹細胞は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンで処理されていない幹細胞と比較して、抗炎症作用および免疫調節能が優れているので、アトピー性皮膚炎の予防または治療に有用に活用されてもよい。
本発明において、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンで処理された幹細胞は「プライミングされた幹細胞」または「機能強化された幹細胞」と表示してもよく、「プライミングされた幹細胞」と「機能強化された幹細胞」は相互交換的に用いられてもよい。プライミングされた幹細胞は、本発明のプライミング因子処理によって幹細胞の免疫調節および炎症調節能が顕著に増加され、優れたアトピー性皮膚炎の治療効果を示す幹細胞を意味する。
本発明における「プライミング因子」は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αの組み合わせまたは前記組み合わせにビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンをさらに含む組み合わせを意味してもよい。
前記プライミング因子の組み合わせは、それらの単一成分を幹細胞に処理することと比較してシナジー効果を示すことができ、低い処理濃度でも目的とする幹細胞の機能強化を効果的に誘導してもよい。
本発明における「機能強化」は、プライミング因子処理によって幹細胞が有している固有の性質および効果が増進されたことを意味し、特に、好ましくは、アトピー性皮膚炎の予防、改善または治療効果が改善されたことを意味してもよい。
具体的に、本発明のプライミングされた幹細胞は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αで処理された幹細胞であってもよい。より具体的に、前記ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αは、０．１～３：０．１～３：０．１～３（ｗ／ｖ）の割合で処理されるものであってもよく、好ましくは１：１：０．１乃至３（ｗ／ｖ）の割合で処理されるものであってもよく、さらに好ましくは１：１：１乃至３（ｗ／ｖ）、よりさらに好ましくは１：１：１乃至２．５（ｗ／ｖ）の割合で処理されてもよい。本発明の一具現例においては、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αを１０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌおよび２０ｎｇ／ｍｌの濃度の組み合わせで幹細胞に処理して培養し、幹細胞のアトピー性皮膚炎の治療効果を確認した。
また、本発明の幹細胞は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αの組み合わせに加えてビタミンでさらに処理された幹細胞であってもよく、具体的に、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンがさらに処理された幹細胞であってもよい。ビタミンをさらに含むプライミング因子の組み合わせを幹細胞に処理してプライミングすれば、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α処理によって誘導される幹細胞の機能強化がさらに顕著に増進されることができ、アトピー性皮膚炎の予防または治療効果も顕著に増進されることができる。前記ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンは、０．１乃至３：０．１乃至３：０．１乃至３：１００乃至１０，０００（ｗ／ｖ）、好ましくは１：１：０．１乃至３：３００乃至６，０００（ｗ／ｖ）の割合で幹細胞に処理されてもよい。より具体的に、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αにビタミンＢ２が追加される場合、０．１乃至３：０．１乃至３：０．１乃至３：３００乃至１，０００（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは１：１：０．１乃至３：３００乃至６００（ｗ／ｖ）、よりさらに好ましくは１：１：０．１乃至３：４００乃至５５０（ｗ／ｖ）、よりさらに好ましくは１：１：２：５００（ｗ／ｖ）の割合で処理されてもよく、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αにビタミンＢ３、ビタミンＢ５またはビタミンＢ６が追加される場合、０．１乃至３：０．１乃至３：０．１乃至３：１，０００乃至１０，０００（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１乃至３：０．１乃至３：０．１乃至３：１，０００乃至６，０００（ｗ／ｖ）、よりさらに好ましくは１：１：０．１乃至３：４，０００乃至６，０００（ｗ／ｖ）、さらに具体的な例として、１：１：０．１乃至３：４，０００乃至５，５００（ｗ／ｖ）の割合、さらに好ましくは１：１：２：５，０００（ｗ／ｖ）の割合で処理されてもよい。
本発明の一具現例においては、複合処理のための濃度としてＴＮＦ－α １０ｎｇ／ｍｌ、ＩＦＮ－γ １０ｎｇ／ｍｌ、ＩＦＮ－α ２０ｎｇ／ｍｌを選定し、ビタミンＢ２ ５μｇ／ｍｌ、ビタミンＢ３ ５０μｇ／ｍｌ、ビタミンＢ５ ５０μｇ／ｍｌおよびビタミンＢ６ ５０μｇ／ｍｌを選定して幹細胞に処理し、免疫調節および炎症調節機能の強化を確認した。その結果、ビタミンを添加した実験群においては、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α処理と比較してＩＤＯおよびＴＳＧ６の発現増加だけでなく、幹細胞の表面に発現する付着因子であるＩＣＡＭ１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １）とＶＣＡＭ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の発現が有意に増加されることを確認した。
本発明における「プライミング処理」または「プライミング因子処理」は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αの組み合わせまたは前記組み合わせにビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンをさらに含む組み合わせを幹細胞に１２時間乃至３６時間、好ましくは２０時間乃至２５時間にかけて処理し、幹細胞を培養することを意味してもよい。前記培養は当分野に広く知られた幹細胞の培養培地を制限なく利用してもよい。
本発明において、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミン処理によって機能が強化されるプライミングされた幹細胞は、自己複製能力を有しつつ、二つ以上の細胞に分化する能力を有する細胞のことを言い、全能性幹細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）に分類してもよい。前記幹細胞は、目的に応じて適切に制限なく選択されてもよく、ヒトを含む哺乳動物、好ましくはヒトから由来した公知になっているすべての組織、細胞などの成体細胞から由来してもよく、例えば、脂肪、骨髄、胎盤（または胎盤組織細胞）、または臍帯血由来の中間葉幹細胞であってもよい。また、前記幹細胞はクローナル幹細胞を意味してもよい。
本発明のプライミングされた幹細胞は、前記プライミング因子の組み合わせが処理されていない幹細胞と比較してＴＳＧ６（ＴＮＦα－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ－６）の発現、ＩＤＯ（Ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ ２，３－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）の発現、ＩＣＡＭ１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １）の発現およびＶＣＡＭ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の発現からなる群から選択された１種以上が増進された幹細胞であってもよく、肥満細胞の減少、総ＩｇＥの減少、ＩｇＧ２ａの生産増加およびヒスタミンの減少からなる群から選択された１種以上のアトピー性皮膚炎の治療効果を示すことができる。
本発明の幹細胞が薬学的組成物として活用される場合、薬学的組成物は、薬学的組成物の製造に通常用いる適切な担体、賦形剤および希釈剤をさらに含んでもよい。また、薬学組成物の製造には固体または液体の製剤用添加物を用いてもよい。製剤用添加物は有機または無機のいずれであってもよい。
賦形剤としては、例えば、乳糖、ショ糖、白糖、ブドウ糖、トウモロコシデンプン（ｃｏｒｎ ｓｔａｒｃｈ）、デンプン、タルク、ソルビトール、結晶セルロース、デキストリン、カオリン、炭酸カルシウム、二酸化ケイ素などが挙げられる。結合剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、メチルセルロース、アラビアゴム、トラガカント（ｔｒａｇａｃａｎｔｈ）、ゼラチン、シェラック（ｓｈｅｌｌａｃ）、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン（ｐｅｃｔｉｎ）などが挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油などが挙げられる。着色剤としては、通常医薬品に添加することが許可されているものであれば、いずれも使用してもよい。それらの錠剤、粒剤には、糖衣、ゼラチンコーティング、その他、必要に応じて適宜コーティングすることができる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤などを添加してもよい。
本発明の薬学的組成物は、当業界において通常製造されるいかなる剤形で製造されてもよく（例：文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、最新版；Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ］）、製剤の形態は、特に限定されるものではないが、好ましくは外用剤であってもよい。本発明の外用剤には、シート剤、液状塗布剤、噴霧剤、ローション剤、クリーム剤、パップ剤、粉剤、浸透パッド剤、噴霧剤、ゲル剤、パスタ剤、リニメント剤、軟膏剤、エアゾール、粉末剤、懸濁液剤、経皮吸収剤などの通常の外用剤の形態が含まれてもよい。それらの剤形は、全ての製薬化学に一般的に公知になった処方書である文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ］に記述されている。
本発明の薬学的有効量は、患者の傷の種類、適用部位、処理回収、処理時間、剤形、患者の状態、補助剤の種類などによって変わり得る。使用量は、特に限定されないが、通常、本発明の薬学組成物の１日有効量を患者に適用時、０．００００１乃至１００００μｇであってもよい。前記１日量は、１日に１回、または適当な間隔をおいて１日に２～３回に分けて投与してもよく、数日間隔で間欠投与してもよい。
しかし、本発明の薬学的組成物の前記使用量は、投与経路、患者の年齢、性別、体重、患者の重症度、傷の種類、適用部位、処理回収、処理時間、剤形、患者の状態、補助剤の種類などの様々な関連因子に照らして決定されるものであるので、前記有効量は、いかなる側面においても本発明の範囲を制限するものと理解されてはならない。
また、本発明は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンで処理された幹細胞を、これを必要とする個体に処理するステップ；を含むアトピー性皮膚炎の予防または治療方法に関する。
本発明の個体はヒトを含むすべての動物を意味してもよい。前記動物は、ヒトだけでなく前記アトピー性皮膚炎と類似した症状の治療を必要とする牛、馬、羊、豚、ヤギ、ラクダ、レイヨウ、犬、猫などの哺乳動物であってもよい。また、ヒトを除いた動物を意味してもよいが、これに制限されるものではない。
前記個体はまたアトピー性皮膚炎の治療を必要とする患者であって、アトピー性皮膚炎を治療中の患者、治療を受けたことがある患者、アトピー性皮膚炎の治療を受ける必要がある患者をすべて含んでもよい。
また、本発明のＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンで処理された幹細胞は、既存のアトピー性皮膚炎の治療のための薬物または治療方法と併用して処理されてもよい。本発明のプライミングされた幹細胞を併用処理する場合、これは、アトピー性皮膚炎の治療のための他の薬物または治療方法と同時にまたは順次に処理されてもよい。
また、本発明は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンでプライミングされた幹細胞を含むアトピー性皮膚炎の予防または治療用幹細胞治療剤を提供する。
本発明の幹細胞治療剤は、経口、経皮、皮下、静脈または筋肉を含む様々な経路を通じて投与されてもよく、活性成分の投与量は、投与経路、患者の年齢、性別、体重および患者の重症度などの様々な因子によって適切に選択されてもよい。好ましくは非経口で投与してもよく、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入および腹腔注入などで投与してもよい。
本発明の幹細胞治療剤の投与量は、好ましくは１日あたり１×１０２～１×１０１２細胞／ｋｇであってもよい。
また、本発明は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αで処理された幹細胞を含む、アトピー性皮膚炎の予防または改善用化粧料組成物を提供する。
より具体的に、前記ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αは、０．１～３：０．１～３：０．１～３（ｗ／ｖ）の割合で処理されるものであってもよく、好ましくは１：１：０．１乃至３（ｗ／ｖ）の割合で処理されるものであってもよく、さらに好ましくは１：１：１乃至３（ｗ／ｖ）、よりさらに好ましくは１：１：１乃至２．５（ｗ／ｖ）の割合で処理されてもよい。本発明の一具現例においては、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αを１０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌおよび２０ｎｇ／ｍｌの濃度の組み合わせで幹細胞に処理して培養し、幹細胞のアトピー性皮膚炎の予防または改善効果を確認した。
また、本発明の幹細胞は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αの組み合わせに加えてビタミンでさらに処理された幹細胞であってもよく、具体的に、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンがさらに処理された幹細胞であってもよい。
ビタミンをさらに含むプライミング因子の組み合わせを幹細胞に処理してプライミングすれば、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α処理を通じて誘導される幹細胞の機能強化がさらに顕著に増進されることができ、アトピー性皮膚炎の予防または改善効果も顕著に増進されることができる。前記ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンは、０．１乃至３：０．１乃至３：０．１乃至３：１００乃至１０，０００（ｗ／ｖ）、好ましくは１：１：０．１乃至３：３００乃至６，０００（ｗ／ｖ）の割合で幹細胞に処理されてもよい。より具体的に、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αにビタミンＢ２が追加される場合、０．１乃至３：０．１乃至３：０．１乃至３：３００乃至１，０００（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは１：１：０．１乃至３：３００乃至６００（ｗ／ｖ）、よりさらに好ましくは１：１：０．１乃至３：４００乃至５５０（ｗ／ｖ）、よりさらに好ましくは１：１：２：５００（ｗ／ｖ）の割合で処理されてもよく、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αにビタミンＢ３、ビタミンＢ５またはビタミンＢ６が追加される場合、０．１乃至３：０．１乃至３：０．１乃至３：１，０００乃至１０，０００（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１乃至３：０．１乃至３：０．１乃至３：１，０００乃至６，０００（ｗ／ｖ）、よりさらに好ましくは１：１：０．１乃至３：４，０００乃至６，０００（ｗ／ｖ）、さらに具体的な例として、１：１：０．１乃至３：４，０００乃至５，５００（ｗ／ｖ）の割合、さらに好ましくは１：１：２：５，０００（ｗ／ｖ）の割合で処理されてもよい。
本発明のプライミングされた幹細胞は、肥満細胞の減少、総ＩｇＥの減少、ＩｇＧ２ａの生産増加およびヒスタミンの減少からなる群から選択された１種以上のアトピー性皮膚炎の改善効果を示すものであってもよい。
また、本発明は、１）ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンを幹細胞に処理して培養するステップ；を含む、アトピー性皮膚炎の予防または治療用組成物の製造方法を提供する。前記ビタミンは、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンであってもよい。
本発明によって、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンを幹細胞に処理して培養すれば、アトピー性皮膚炎の予防、改善または治療機能が強化された幹細胞を製造することができ、特に、本発明の一具現例においては、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンＢ６の組み合わせのプライミング因子処理によってアトピー性皮膚炎の治療効果が増大された幹細胞が製造されてもよいことを確認し、これを「ｐｃＭＳＣ２（Ｐｒｉｍｅｄ ｃｌｏｎａｌ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２）」と名付けた。
また、本発明は、１）ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミン；を幹細胞に処理して培養するステップ；を含む、アトピー性皮膚炎の予防または治療用組成物の製造方法に用いるためのＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αまたはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンの用途を提供する。前記ビタミンは、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンであってもよく、より好ましくはビタミンＢ６であってもよい。
前記処理は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αの組み合わせまたは前記組み合わせにビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンをさらに含む組み合わせを幹細胞に１２時間乃至３６時間、好ましくは２０時間乃至２５時間にかけて処理し、幹細胞を培養することを意味してもよい。前記培養は当分野に広く知られた幹細胞の培養培地を制限なく利用することができる。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明しようとする。これらの実施例はひたすら本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解析されないことは、当業界における通常の知識を有した者にとって自明のことである。
実施例１．幹細胞の培養および候補物質の選定
３７℃および５％ＣＯ２インキュベーターで、貯蔵状態（ＬＮ２ ｔａｎｋ保管）の中間葉幹細胞を解凍して培養し、このとき、１０％ＦＢＳまたは４％ｈＰＬを含む培地（ＤＭＥＭ、ａｌｐｈａ－ＭＥＭ）で細胞コンフルエンスが８０％程度に増殖されるまで培養した。培養した中間葉幹細胞を１００ｍｍ ｄｉｓｈにｓｅｅｄｉｎｇした後、中間葉幹細胞の機能強化のための候補物質を２４時間にかけて処理した後、機能強化のための１次候補物質の濃度を設定した。
３７℃および５％ＣＯ２インキュベーターで、貯蔵状態（ＬＮ２ ｔａｎｋ保管）の中間葉幹細胞を解凍して培養し、このとき、１０％ＦＢＳまたは４％ｈＰＬを含む培地（ＤＭＥＭ、ａｌｐｈａ－ＭＥＭ）で細胞コンフルエンスが８０％程度に増殖されるまで培養した。培養した中間葉幹細胞を１００ｍｍ ｄｉｓｈにｓｅｅｄｉｎｇした後、中間葉幹細胞の機能強化のための候補物質を２４時間にかけて処理した後、機能強化のための１次候補物質の濃度を設定した。
１次候補物質としては、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γＩＦＮ－αを選定し、機能強化を確認するためにＴＳＧ６（ＴＮＦα－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ－６）とＩＤＯ（Ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ ２，３－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）の発現を増加させることができる最低有効濃度を確認するために、ＴＮＦ－α ５、１０、２０ｎｇ／ｍｌ、ＩＦＮ－γ ５、１０、２０ｎｇ／ｍｌ、ＩＦＮ－α １０、２０、４０ｎｇ／ｍｌをそれぞれ幹細胞に処理し、ＴＳＧ６およびＩＤＯの発現変化を確認した。
ＩＤＯはＴ細胞増殖に必須のトリプトファンをキヌレン酸（ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅ）に替えることで、Ｔ細胞のような免疫細胞の増殖を抑制する免疫調節因子と知られており、ＴＳＧ６は、中間葉幹細胞が分泌する抗炎症調節因子と知られている。幹細胞を培養した後、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して総ＲＮＡを分離した後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ（ＴａＫａＲａ）を利用して総ＲＮＡでｃＤＮＡを合成し、ｑＲＴ－ＰＣＲを行った。各候補物質の濃度別の処理によるＴＳＧ６およびＩＤＯの結果を図１、図２および図３に示した。
図１乃至図３に示したように、ＴＳＧ６およびＩＤＯの発現をすべて顕著に増加誘導することができる最低有効濃度でＴＮＦ－α １０ｎｇ／ｍｌ、ＩＦＮ－γ １０ｎｇ／ｍｌおよびＩＦＮ－α ２０ｎｇ／ｍｌを確認し、以後、実験して該当濃度を基準として処理した。
実施例２．幹細胞の機能強化のための組み合わせの選定
前記実施例１を通じて、幹細胞の機能強化を誘導することが確認された候補物質および最低有効濃度を基礎として、さらに強化された機能強化組成物を探索するために、選定された候補物質およびそれらの濃度の組み合わせを表１のように設定した。下記表１に記載されている候補の組み合わせを２４時間にかけて中間葉幹細胞に処理し、実施例１のように幹細胞を培養した後、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して総ＲＮＡを分離した。以後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ（ＴａＫａＲａ）を利用して総ＲＮＡでｃＤＮＡを合成し、ｑＲＴ－ＰＣＲを行った。
前記実施例１を通じて、幹細胞の機能強化を誘導することが確認された候補物質および最低有効濃度を基礎として、さらに強化された機能強化組成物を探索するために、選定された候補物質およびそれらの濃度の組み合わせを表１のように設定した。下記表１に記載されている候補の組み合わせを２４時間にかけて中間葉幹細胞に処理し、実施例１のように幹細胞を培養した後、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して総ＲＮＡを分離した。以後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ（ＴａＫａＲａ）を利用して総ＲＮＡでｃＤＮＡを合成し、ｑＲＴ－ＰＣＲを行った。
これによって、免疫および抗炎症調節の代表的な因子であるＩＤＯ、ＴＳＧ６の発現変化を確認し、その結果を図４に示した。
図４に示したように、未処理対照群グループ０と比較して、すべての単一候補物質ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α処理群（実験群１乃至３）において、ＩＤＯ、ＴＳＧ６の発現増加が確認されたが、それらをそれぞれ組み合わせた実験群４乃至６において、単一候補物質処理群に対比してさらに顕著な発現の増加が確認された。特に、ＴＮＦ－αにＩＦＮ－γまたはＩＦＮ－αを処理した実験群４、５は、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αのみを組み合わせた実験群６と比較して優れた効果を示し、３種類の候補物質をすべて組み合わせた処理群においては、驚くべきことに２つの組み合わせに対比して２倍以上増加された機能強化効果が確認された。
従って、前記結果によってＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＦＮ－γ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＦＮ－α（２０ｎｇ／ｍｌ）の組み合わせを幹細胞に処理すれば、非常に顕著な幹細胞の免疫および抗炎症機能強化が達成できることを確認した。
実施例３．ビタミン追加による幹細胞の機能強化効果の確認
３．１ ビタミン単独添加による幹細胞の機能強化効果の確認
ビタミンは幹細胞の培養過程中に添加するとき、幹細胞の増殖能力を改善させ、幹細胞のｓｔｅｍｎｅｓｓを維持させることが知られている。従って、多様なビタミンを幹細胞の培養過程に処理し、ビタミンが幹細胞の抗炎症および免疫機能強化効果を達成できるか否かを確認するための実験を行った。具体的に、下記表２に示した多様なビタミンの種類を実施例１に記載されている方法に応じて幹細胞に処理し、各候補物質の処理によるＩＤＯおよびＴＳＧ６の発現変化を確認した結果を図５に示した。
３．１ ビタミン単独添加による幹細胞の機能強化効果の確認
ビタミンは幹細胞の培養過程中に添加するとき、幹細胞の増殖能力を改善させ、幹細胞のｓｔｅｍｎｅｓｓを維持させることが知られている。従って、多様なビタミンを幹細胞の培養過程に処理し、ビタミンが幹細胞の抗炎症および免疫機能強化効果を達成できるか否かを確認するための実験を行った。具体的に、下記表２に示した多様なビタミンの種類を実施例１に記載されている方法に応じて幹細胞に処理し、各候補物質の処理によるＩＤＯおよびＴＳＧ６の発現変化を確認した結果を図５に示した。
図５に示したように、ビタミン処理群は、幹細胞の抗炎症および免疫調節機能に関与するＩＤＯおよびＴＳＧ６の発現変化には有意な効果を示さなかった。
３．２ ビタミンとＴＮＦ－α＋ＩＦＮ－γ＋ＩＦＮ－αの組み合わせによる幹細胞の機能強化効果の確認
上記のように単一物質としては、幹細胞の抗炎症および免疫調節機能強化の効果が示されていないビタミンを実施例２において確認した機能強化物質の組み合わせに添加する場合、シナジー効果を示すことができるか否か確認するために、下記表３のように、ＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＦＮ－γ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＦＮ－α（２０ｎｇ／ｍｌ）にそれぞれのビタミンを添加し、各組み合わせの処理によるＩＤＯおよびＴＳＧ６の発現変化を確認し、その結果を図６に示した。
上記のように単一物質としては、幹細胞の抗炎症および免疫調節機能強化の効果が示されていないビタミンを実施例２において確認した機能強化物質の組み合わせに添加する場合、シナジー効果を示すことができるか否か確認するために、下記表３のように、ＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＦＮ－γ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＦＮ－α（２０ｎｇ／ｍｌ）にそれぞれのビタミンを添加し、各組み合わせの処理によるＩＤＯおよびＴＳＧ６の発現変化を確認し、その結果を図６に示した。
図６に示したように、ビタミン未処理実験群１と比較して実験群２、３、８、９においては、ＩＤＯおよびＴＳＧ６の発現が有意に増加しておらず、実験群１０は、ＴＳＧ６の発現は増加したが、ＩＤＯにおいては、対照群に対比して発現増加が確認されていない。一方、ビタミンＢ２（実験群４）、ビタミンＢ３（実験群５）、ビタミンＢ５（実験群６）、ビタミンＢ６（実験群７）の場合には有意にＩＤＯとＴＳＧ６の発現がすべて増加されることを確認した。ＴＳＧ６の場合、ＴＮＦ－α＋ＩＦＮ－γ＋ＩＦＮ－αを処理した実験群１と比較したとき、実験群４、５ ６、７において、それぞれ４９％、３０％、３５％、４５％増加し、ＩＤＯの場合、実験群１と比較したとき、実験群４、５、６、７において、それぞれ２５％、３７％、３１％、１８％増加されることを確認した。
上記のような結果は、ビタミンを単独で幹細胞に処理する場合、幹細胞の抗炎症および免疫調節能を向上させることはできないが、ＴＮＦ－α＋ＩＦＮ－γ＋ＩＦＮ－αとビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５またはビタミンＢ６を組み合わせて処理する場合、ＴＮＦ－α＋ＩＦＮ－γ＋ＩＦＮ－αの効果をさらに高められることを示す結果である。
実施例４．ＩＣＡＭ１およびＶＣＡＭの発現変化の確認
ＩＣＡＭ１とＶＣＡＭはＴ細胞と結合を通じて、Ｔ細胞の増殖を抑制して死滅を誘導することで過度な免疫と炎症反応を減少させ、多様な免疫および炎症関連疾患に効果を示すことができる。従って、前記実施例３の表３に記載されている同一の実験群で、２４時間にかけて中間葉幹細胞に処理し、実施例１のように幹細胞を培養した後、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して総ＲＮＡを分離した。以後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ（ＴａＫａＲａ）を利用して総ＲＮＡでｃＤＮＡを合成し、ｑＲＴ－ＰＣＲを行った。
実施例４．ＩＣＡＭ１およびＶＣＡＭの発現変化の確認
ＩＣＡＭ１とＶＣＡＭはＴ細胞と結合を通じて、Ｔ細胞の増殖を抑制して死滅を誘導することで過度な免疫と炎症反応を減少させ、多様な免疫および炎症関連疾患に効果を示すことができる。従って、前記実施例３の表３に記載されている同一の実験群で、２４時間にかけて中間葉幹細胞に処理し、実施例１のように幹細胞を培養した後、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して総ＲＮＡを分離した。以後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ（ＴａＫａＲａ）を利用して総ＲＮＡでｃＤＮＡを合成し、ｑＲＴ－ＰＣＲを行った。
幹細胞の免疫疾患および炎症疾患治療効果が増進しているか否かを確認するために、幹細胞の表面に発現する付着因子であるＩＣＡＭ１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １）とＶＣＡＭ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の発現を確認し、その結果を図７に示した。
図７に示したように、ＩＣＡＭ１の場合、ＴＮＦ－α＋ＩＦＮ－γ＋ＩＦＮ－αを処理した実験群１と比較したとき、実験群４、５、６、７において、それぞれ４５％、１００％、３５％、４５％増加し、ＶＡＣＭの場合、実験群１と比較したとき、実験群４、５、６、７において、それぞれ５２％、６９％、５２％、６９％増加されることを確認した。
従って、ＴＮＦ－α＋ＩＦＮ－γＩＦＮ－αとビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５またはビタミンＢ６の組み合わせを幹細胞に処理する場合、ＩＣＡＭ１およびＶＣＡＭの発現が顕著に増加し、これによって、幹細胞の免疫調節能および抗炎症効能が促進されてもよい。
実施例５．炎症および免疫調節能力の確認
ＩＤＯ、ＴＳＧ６、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭのような免疫および炎症調節因子を強化させた、前記実施例４において確認したプライミング処理条件の組み合わせが実際に過度な免疫反応を誘発した条件で炎症および免疫反応を抑制し、機能強化されていないｃＭＳＣに対比してさらに優れた効果を示すかを確認した。以下においては、表３のうち実験群７であるＴＮＦ－α＋ＩＦＮ－γＩＦＮ－αとビタミンＢ６の組み合わせをｃＭＳＣに処理し、前記組み合わせでプライミング処理されたＭＳＣを「ｐｃＭＳＣ２（Ｐｒｉｍｅｄ ｃｌｏｎａｌ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２）」と名付けた。
ＩＤＯ、ＴＳＧ６、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭのような免疫および炎症調節因子を強化させた、前記実施例４において確認したプライミング処理条件の組み合わせが実際に過度な免疫反応を誘発した条件で炎症および免疫反応を抑制し、機能強化されていないｃＭＳＣに対比してさらに優れた効果を示すかを確認した。以下においては、表３のうち実験群７であるＴＮＦ－α＋ＩＦＮ－γＩＦＮ－αとビタミンＢ６の組み合わせをｃＭＳＣに処理し、前記組み合わせでプライミング処理されたＭＳＣを「ｐｃＭＳＣ２（Ｐｒｉｍｅｄ ｃｌｏｎａｌ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２）」と名付けた。
ＰＨＡ（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）刺激リンパ球培養実験は、リンパ球の細胞分裂促進を誘導するＰＨＡという試薬を利用する方法であって、過度な免疫活性を誘導する方法である。ＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ；末梢血液細胞）を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１ｗｅｌｌあたり２×１０５ｃｅｌｌｓに分注し、ＰＨＡ １μｇ／ｍｌで刺激して５×１０４ｃｅｌｌのｃＭＳＣまたはｐｃＭＳＣ２と４日間共培養した。培養が完了した後、上澄液を集めて炎症性サイトカインであるＩＦＮ－ｇａｍｍａと抗炎症性サイトカインであるＩＬ－１０をＥＬＩＳＡを通じて確認し、その結果を図８に示した。陰性対照群としては、ＰＨＡで刺激されていないグループを利用し、Ｐ１で示した。
図８に示したように、ＩＦＮ－ｇａｍｍａはＰＨＡで刺激した場合、１６０１３ｐｇ／ｍｌのように顕著に増加したが、ｃＭＳＣと共培養した場合、５０４８ｐｇ／ｍｌ減少し、ｐｃＭＳＣ２と共培養した場合、１７００ｐｇ／ｍｌまで有意に減少することを確認した。また、ｃＭＳＣとｐｃＭＳＣ２を比較した場合には、機能強化されたｐｃＭＳＣ２でｃＭＳＣより約６６％程度ＩＦＮ－ｇａｍｍａがさらに有意に減少することを確認した。抗炎症性サイトカインであるＩＬ－１０の場合、ｃＭＳＣとｐｃＭＳＣ２のいずれもにおいてＩＬ－１０の増加を確認することができ、特に、ｃＭＳＣより機能強化されたｐｃＭＳＣ２と共培養した条件で、約２２％多いＩＬ－１０が分泌されることを確認した。
実施例６．アトピー性皮膚炎の動物モデルにおけるｐｃＭＳＣ２の治療効果の確認
アトピー性皮膚炎の動物モデルにおいても本発明のｐｃＭＳＣ２がプライミング処理されていないｃＭＳＣより免疫調節および抗炎症効果が優れるように示されるかを確認するための実験を行った。
アトピー性皮膚炎の動物モデルにおいても本発明のｐｃＭＳＣ２がプライミング処理されていないｃＭＳＣより免疫調節および抗炎症効果が優れるように示されるかを確認するための実験を行った。
６．１ アトピー性皮膚炎の動物モデルの製造および実験方法
アトピー性皮膚炎試験に用いられた動物は、雌６週齢のＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ）ＢＡＬＢ／ｃ ｍｉｃｅ（１５～２０ｇ）でＳＬＣ，Ｉｎｃ（Ｓｈｉｚｕｏｋａ、Ｊａｐａｎ）から供給され、１週間の間動物室内で順化期間を経た後、実験を進行した。仁荷大学医科大学の生命科学研究所で温度２２～２５℃、湿度４０～６０％、昼夜１２時間交代に１５０～３００Ｌｕｘの照明でｍｏｕｓｅ用ｃａｇｅに５匹ずつ飼育し、滅菌蒸溜水と固形飼料を自由に摂取できるように飼育環境を維持して実験を行った。７週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにＯｖａｌｂｕｍｉｎ（ＯＶＡ）５０μｇ／５０μｌ（ＰＢＳ）とＡｌｕｍ Ａｄｊｕｖａｎｔ ４ｍｇ／１００μｌを混合して週に１回３週間、計３回で腹腔、皮下投与してアトピー性皮膚炎の減作を誘導した。３回すべて同じ部位に投与するとき、該当疾患と関係のない炎症を誘発することができるため、それぞれ他の部位に投与した。ＯＶＡ投与の３週間後、ＯＶＡ６０μｇ／６０μｌ（ＰＢＳ）を濡らした１．２×１．２ｃｍサイズの滅菌ガーゼを除毛した背中の皮膚に２週間にかけて週２～３回付着して局所部位にアトピーを誘導した。ＯＶＡ ｐａｔｃｈを通じたアトピー誘導後、ＰＢＳ、ｃＭＳＣ、ｐＭＳＣ２を２日間隔で計３回尾静脈を介して注入する。注入量は、１回あたり１．６６×１０５／２００μｌずつ３回、合計５．０×１０５／６００μｌ静脈投与されるようにした。投与を終え、二日後に病変部位を再び除毛した後、ＯＶＡ６０μｇ／６０μｌ（ＰＢＳ）を濡らした１．２×１．２ｃｍサイズの滅菌ガーゼを除毛した背中の皮膚に２週間にかけて週３～４回付着して局所部位にアトピーを再誘導した。アトピー性皮膚炎の誘導後の１３～１４日の時点で、実験動物をｒｅｓｔｒａｉｎｅｒに補正した後、２６ １／２ｇａｕｇｅ ｎｅｅｄｌｅが装着されたＢＤ社の１ｍｌ ｓｙｒｉｎｇｅを利用して尾静脈を介して投与した。Ｖｅｈ．グループの動物は、試験物質の代わりにＰＢＳを同一の方法で静脈内投与し、Ｎａｉｖｅ、Ｖｅｈ．グループを除いて、試験物質をＰＢＳに浮遊させた後静脈投与した。ＰＢＳおよび試験物質のいずれも２００μｌ／ｈｅａｄの同一の量で投与した。
アトピー性皮膚炎試験に用いられた動物は、雌６週齢のＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ）ＢＡＬＢ／ｃ ｍｉｃｅ（１５～２０ｇ）でＳＬＣ，Ｉｎｃ（Ｓｈｉｚｕｏｋａ、Ｊａｐａｎ）から供給され、１週間の間動物室内で順化期間を経た後、実験を進行した。仁荷大学医科大学の生命科学研究所で温度２２～２５℃、湿度４０～６０％、昼夜１２時間交代に１５０～３００Ｌｕｘの照明でｍｏｕｓｅ用ｃａｇｅに５匹ずつ飼育し、滅菌蒸溜水と固形飼料を自由に摂取できるように飼育環境を維持して実験を行った。７週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにＯｖａｌｂｕｍｉｎ（ＯＶＡ）５０μｇ／５０μｌ（ＰＢＳ）とＡｌｕｍ Ａｄｊｕｖａｎｔ ４ｍｇ／１００μｌを混合して週に１回３週間、計３回で腹腔、皮下投与してアトピー性皮膚炎の減作を誘導した。３回すべて同じ部位に投与するとき、該当疾患と関係のない炎症を誘発することができるため、それぞれ他の部位に投与した。ＯＶＡ投与の３週間後、ＯＶＡ６０μｇ／６０μｌ（ＰＢＳ）を濡らした１．２×１．２ｃｍサイズの滅菌ガーゼを除毛した背中の皮膚に２週間にかけて週２～３回付着して局所部位にアトピーを誘導した。ＯＶＡ ｐａｔｃｈを通じたアトピー誘導後、ＰＢＳ、ｃＭＳＣ、ｐＭＳＣ２を２日間隔で計３回尾静脈を介して注入する。注入量は、１回あたり１．６６×１０５／２００μｌずつ３回、合計５．０×１０５／６００μｌ静脈投与されるようにした。投与を終え、二日後に病変部位を再び除毛した後、ＯＶＡ６０μｇ／６０μｌ（ＰＢＳ）を濡らした１．２×１．２ｃｍサイズの滅菌ガーゼを除毛した背中の皮膚に２週間にかけて週３～４回付着して局所部位にアトピーを再誘導した。アトピー性皮膚炎の誘導後の１３～１４日の時点で、実験動物をｒｅｓｔｒａｉｎｅｒに補正した後、２６ １／２ｇａｕｇｅ ｎｅｅｄｌｅが装着されたＢＤ社の１ｍｌ ｓｙｒｉｎｇｅを利用して尾静脈を介して投与した。Ｖｅｈ．グループの動物は、試験物質の代わりにＰＢＳを同一の方法で静脈内投与し、Ｎａｉｖｅ、Ｖｅｈ．グループを除いて、試験物質をＰＢＳに浮遊させた後静脈投与した。ＰＢＳおよび試験物質のいずれも２００μｌ／ｈｅａｄの同一の量で投与した。
アトピー性皮膚炎に対する効果を確認するための血液サンプルは、次のような方式で得た。すべての実験動物は、細胞安定化剤または試験物質の投与後１３日目にｉｓｏｆｌｕｒａｎｅを利用して麻酔した後、腹部を切開して後大静脈を露出させた後、１ｍｌ ｓｙｒｉｎｇｅを利用して約７００μｌ採血した。採血した血液はＳｅｒｕｍ ｓｅｐａｒａｔｅ ｔｕｂｅに入れ、３，０００ｒｐｍ／１５分、４℃で遠心分離後、ｓｅｒｕｍを分離し、分離されたｓｅｒｕｍは１．５ｍｌ ｅ－ｔｕｂｅに入れて－７０℃ｄｅｅｐ ｆｒｅｅｚｅｒに保管した。
アトピー性皮膚炎に対する効果の分析のために、すべての実験動物の血清試料でＥＬＩＳＡ ｋｉｔを利用してＴｏｔａｌ ＩｇＥ、ＩｇＧ２ａ、ヒスタミンの濃度を測定し、測定方法は、ｋｉｔ内のプロトコルに準じて実施した。具体的に、血液内のＩｇＥ ｌｅｖｅｌ測定は、先ず、後大静脈を介して採血した血液は、ＥＤＴＡ ｔｕｂｅに入れて３，０００ｒｐｍ／１５分間遠心分離して上澄液のみを分離して実験前まで－７０℃に保管して行った。ＥＬＩＳＡ ｐｌａｔｅにＩｇＥを認知することができるｃａｐｔｕｒｅ ａｎｔｉｂｏｄｙをｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒとともに４℃にｏｖｅｒｎｉｇｈｔ保管し、翌日、１時間にかけてｂｌｏｃｋｉｎｇ過程を経た後、ｓｅｒｕｍを１００倍希釈して５０μｌの量で２時間の間室温で反応させた。その後、ＩｇＥを認知する２次抗体を入れた後、ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒであるＴＭＢ ｓｏｌｕｔｉｏｎを入れ、約１５分程度反応させた後、５０μｌのｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎを入れた。測定は、ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ機を利用して４５０ｎｍのｆｉｌｔｅｒで値を測定した。
実験終了時点において摘出した皮膚組織は、４％ホルマリン溶液に固定させた後、組織切片を作り、真皮内の浸潤された肥満細胞を染色するｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅ染色を行った。
６．２ ｐｃＭＳＣ２の皮膚病変緩和の確認
実施例６．１のアトピー性皮膚炎誘発動物モデルにｃＭＳＣ、ｐｃＭＳＣ２を上記のようなプロトコルで投与し、５９日後に皮膚病変の変化を確認し、その結果を図９および１０に示した。
実施例６．１のアトピー性皮膚炎誘発動物モデルにｃＭＳＣ、ｐｃＭＳＣ２を上記のようなプロトコルで投与し、５９日後に皮膚病変の変化を確認し、その結果を図９および１０に示した。
図９に示したように、ｐｃＭＳＣ２投与群でアトピー皮膚病変が肉眼でも効果的に改善されたことを確認した。特に、図１０に示したように、ｐｃＭＳＣ２投与群は、プライミング処理されていないｃＭＳＣ投与群と比較して皮膚肥厚がさらに効果的に緩和されたことを確認した。
６．３．ｐｃＭＳＣ２の肥満細胞減少効果の確認
実施例６．１のアトピー性皮膚炎誘発動物モデルにｃＭＳＣ、ｐｃＭＳＣ２を上記のようなプロトコルで投与し、Ｇｉｅｍｓａを利用した皮膚組織の染色をさらに行い、浸潤された肥満細胞の数を１００倍率のｐａｉｎｔ．ＮＥＴを利用して計数した。計数された肥満細胞数を定量化し、図１１に示した。
実施例６．１のアトピー性皮膚炎誘発動物モデルにｃＭＳＣ、ｐｃＭＳＣ２を上記のようなプロトコルで投与し、Ｇｉｅｍｓａを利用した皮膚組織の染色をさらに行い、浸潤された肥満細胞の数を１００倍率のｐａｉｎｔ．ＮＥＴを利用して計数した。計数された肥満細胞数を定量化し、図１１に示した。
図１１に示したように、正常対照群と比較してアトピー性皮膚炎モデルにおいては、炎症誘発によって肥満細胞が著しく増加し、このような増加は、ｃＭＳＣとｐｃＭＳＣ２によって減少することを確認した。特に、ｃＭＳＣとｐｃＭＳＣ２を比較した場合、有意にｐｃＭＳＣ２処理群において肥満細胞の数が減少することを確認した。
６．４．ｐｃＭＳＣ２の総ＩｇＥ抑制効果およびＩｇＧ２生産効果の確認
実施例６．１のアトピー性皮膚炎誘発動物モデルにｃＭＳＣ、ｐｃＭＳＣ２を上記のようなプロトコルで投与し、総ＩｇＥとＩｇＧ２ａを比較し、その結果を図１２および図１３に示した。
実施例６．１のアトピー性皮膚炎誘発動物モデルにｃＭＳＣ、ｐｃＭＳＣ２を上記のようなプロトコルで投与し、総ＩｇＥとＩｇＧ２ａを比較し、その結果を図１２および図１３に示した。
図１２に示したように、アトピー患者の血清に高濃度で存在することが知られている総ＩｇＥは、ｃＭＳＣおよびｐｃＭＳＣ２投与群で減少し、特に、ｃＭＳＣよりｐｃＭＳＣ２投与群において有意に減少されることを確認した。また、図１３に示したように、Ｔｈ１ ｓｈｉｆｔｉｎｇ、ｉｍｍｕｎｅ ｂａｌｎｃｅを調節してアトピー症状を緩和させることができるＩｇＧ２ａの生産もまたｃＭＳＣよりｐｃＭＳＣ２で有意に優れていることが示され、アトピー性皮膚炎モデル群（ｖｅｈｉｃｌｅ）に対して約２倍が増加することを確認した。
６．５．ｐｃＭＳＣ２のヒスタミン減少効果の確認
ヒスタミンは血管を拡張させ、かゆみを感じる神経線維を刺激してかゆみを誘発することが知られている。実施例６．１のアトピー性皮膚炎誘発動物モデルにｃＭＳＣ、ｐｃＭＳＣ２を上記のようなプロトコルで投与し、ヒスタミンを比較してその結果を図１４に示した。
ヒスタミンは血管を拡張させ、かゆみを感じる神経線維を刺激してかゆみを誘発することが知られている。実施例６．１のアトピー性皮膚炎誘発動物モデルにｃＭＳＣ、ｐｃＭＳＣ２を上記のようなプロトコルで投与し、ヒスタミンを比較してその結果を図１４に示した。
図１４に示したように、ｃＭＳＣ処理群はｖｅｈｉｃｌｅと比較したとき、ヒスタミンが有意に変化してはいないが、プライミング処理されたｐｃＭＳＣ２投与群においては有意な減少効果を確認した。
上記のような内容を通じて、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α＋ＩＦＮ－γ＋ＩＦＮ－αとビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５またはビタミンＢ６の組み合わせを幹細胞に処理すれば、幹細胞をプライミングして幹細胞が有している免疫調節および炎症調節能を増進させ得ることを確認し、特に、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンＢ６の組み合わせを含むプライミング組成物で処理された幹細胞は、このようなプライミング処理が行われていない幹細胞と比較して優れたアトピー性皮膚炎の治療効果があることを確認した。
以上、本発明内容の特定の部分を詳しく記述したところ、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術は、単に好ましい実施形態であるだけであり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかなものである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物によって定義されると言えるものである。
Claims (16)
- ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αで処理された幹細胞を含む、アトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物。
- 前記ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αは、０．１乃至３：０．１乃至３：０．１乃至３（ｗ／ｖ）の割合で処理されるものである、請求項１に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物。
- 前記幹細胞は、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンでさらに処理された幹細胞である、請求項１に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物。
- ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンは、０．１乃至３：０．１乃至３：０．１乃至３：１００乃至１０，０００（ｗ／ｖ）の割合で処理されるものである、請求項３に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物。
- 前記幹細胞は、脂肪、骨髄、胎盤または臍帯血由来の中間葉幹細胞である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物。
- 前記幹細胞は、ＴＳＧ６（ＴＮＦα－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ－６）の発現、ＩＤＯ（Ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ ２，３－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）の発現、ＩＣＡＭ１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １）の発現およびＶＣＡＭ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の発現からなる群から選択された１種以上が増進されたものである、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物。
- 前記幹細胞は、肥満細胞の減少、総ＩｇＥの減少、ＩｇＧ２ａの生産増加およびヒスタミンの減少からなる群から選択された１種以上のアトピー性皮膚炎の治療効果を示すものである、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物。
- 請求項１乃至４のいずれか一項に記載の組成物を含む、アトピー性皮膚炎の予防または治療用幹細胞治療剤。
- ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αで処理された幹細胞を含む、アトピー性皮膚炎の予防または改善用化粧料組成物。
- 前記ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αは、０．１乃至３：０．１乃至３：０．１乃至３（ｗ／ｖ）の割合で処理されるものである、請求項９に記載のアトピー性皮膚炎の予防または改善用化粧料組成物。
- 前記幹細胞は、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンでさらに処理された幹細胞である、請求項９に記載のアトピー性皮膚炎の予防または改善用化粧料組成物。
- ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンは、０．１乃至３：０．１乃至３：０．１乃至３：１００乃至１０，０００（ｗ／ｖ）の割合で処理されるものである、請求項９に記載のアトピー性皮膚炎の予防または改善用化粧料組成物。
- 前記幹細胞は、肥満細胞の減少、総ＩｇＥの減少、ＩｇＧ２ａの生産増加およびヒスタミンの減少からなる群から選択された１種以上のアトピー性皮膚炎の改善効果を示すものである、請求項９乃至１２のいずれか一項に記載のアトピー性皮膚炎の予防または改善用化粧料組成物。
- １）ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αを幹細胞に処理して培養するステップ；を含む、アトピー性皮膚炎の予防または治療用組成物の製造方法。
- 前記１）ステップにおいて、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンをともに処理するものである、請求項１４に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用組成物の製造方法。
- ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミン；でプライミングされた幹細胞を、これを必要とする個体に処理するステップ；を含むアトピー性皮膚炎の予防または治療方法。
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