CN117805384A - 一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法 - Google Patents

一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法，属于免疫分析技术领域。该方法通过利用对孕酮小分子衍生物的活化和透析纯化，再配以吖啶酯标记后的透析纯化，与现有的直接偶联不纯化的技术相比，能够达到有效对游离吖啶酯进行纯化，减少非特异性吸附，有更高信噪比，且更简易生产，性价比高。

Description

一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法。
背景技术
吖啶酯化学发光体系发光体系简单，不需要催化剂，在有H2O2的稀碱性溶液中即能发光，无需增强剂，背景低，灵敏度高且干扰较小，光释放快速、集中。吖啶酯与蛋白质能通过化学键紧密连接，稳定性好，且吖啶酯分子量小，对联结后的抗体构象影响小。吖啶酯与大分子抗原/抗体连接后，可通过透析、脱盐等方法进行纯化，减少非特异性吸附，但吖啶酯与小分子偶联，如孕酮衍生物，还存在纯化困难的问题。
现市面上，若直接得到吖啶酯-孕酮的高纯度合成物，需定做，价格贵；采用交联剂偶联，标记过程中常常吖啶酯过量，游离吖啶酯可能导致非特异性吸附，导致信噪比低，虽然现可用层析柱对小分子进行分离纯化，但分离工艺复杂、所耗时间长、所需溶剂量大，在实际生产中，很难工业化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法，该方法通过利用对孕酮小分子衍生物的活化和透析纯化，再配以吖啶酯标记后的透析纯化，能够达到有效对游离吖啶酯进行纯化，减少非特异性吸附，有更高信噪比，且更简易生产，性价比高。
本发明通过以下技术方案实现：
一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法，包括如下步骤：
S1、孕酮小分子衍生物的活化和透析纯化：
选取孕酮小分子衍生物并溶解后，加入活化剂活化处理，活化处理完成后加入牛血清白蛋白溶液，进行室温避光混匀反应，然后进行透析纯化处理，获得混合液I；
所述孕酮小分子衍生物与牛血清白蛋白的摩尔浓度比为1:1-2:1；
S2、吖啶酯标记和透析纯化：
在获得的混合液I中加入吖啶酯溶液，室温避光反应后进行透析纯化处理，获得混合液II，完成标记。
上述吖啶酯为常用的吖啶酯，NSP-SA-NHS，
上述牛血清白蛋白，为大分子蛋白，与小分子的吖啶酯偶联后，在透析过程中可以留在透析袋内，而没有偶联上牛血清白蛋白的吖啶酯，转移到透析袋外，可有效除去过量的吖啶酯小分子，起到减少非特异性吸附的作用。
透析原理：是通过小分子经过半透膜扩散到水(或缓冲液)的原理，将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。
作为优选地，所述S1中，选用质量浓度为20mg/mL的N,N-二甲基甲酰胺溶解孕酮小分子衍生物。
上述N,N-二甲基甲酰胺是作为溶剂溶解孕酮小分子衍生物。
作为优选地，所述S1中，活化剂为二环己基碳二亚胺溶液与N-羟基琥珀酰亚胺溶液的混合液；
所述二环己基碳二亚胺溶液与N-羟基琥珀酰亚胺溶液的混合体积比为1:1；
所述二环己基碳二亚胺溶液的质量浓度为40mg/mL，与N-羟基琥珀酰亚胺溶液的质量浓度为40mg/mL。
上述二环己基碳二亚胺是与羧基反应的交联剂；N-羟基琥珀酰亚胺是与二环己基碳二亚胺、羧基反应后产生的中间产物反应的交联剂，可使中间产物更稳定。
作为优选地，所述S1中，活化处理为在孕酮小分子衍生物溶液中加入活化剂混匀后，室温滚动混匀反应12-18h的处理过程。
作为优选地，所述S1中，牛血清白蛋白溶液是由牛血清白蛋白与pH 7.2-pH7.6的磷酸盐缓冲液涡旋混匀溶解得到；
所述牛血清白蛋白溶液的质量浓度为2.5mg/mL；
所述室温避光混匀反应时长为0.5-2h。
作为优选地，所述S1中，所述透析纯化处理为在2-8℃环境下，pH 7.2-pH7.6的磷酸盐缓冲液搅拌透析6-12h，其中3-6h时替换一次pH 7.2-pH 7.6的磷酸盐缓冲液。
作为优选地，所述S2中，吖啶酯溶液质量浓度为5mg/mL；
所述孕酮小分子衍生物与吖啶酯摩的摩尔浓度比为1:10-1:20。
作为优选地，所述S2中，室温避光反应1h；
所述S2中透析纯化处理为在2-8℃环境下，pH 7.2-pH 7.6的磷酸盐缓冲液搅拌透析6-12h，其中3-6h时替换一次pH 7.2-pH 7.6的磷酸盐缓冲液。
上述透析纯化与不进行纯化的技术相比，透析纯化可以除去多余吖啶酯，减少非特异性吸附，有更高信噪比；与层析柱纯化工艺比，分离工艺更简单，成本更低，更易工业化。
作为优选地，还包括在获得混合液II后，加入50％的甘油，混匀后，在-20℃避光保存。
上述加入甘油的目的是：避免产物在-20℃保存时反复冻融，影响反应性。
与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：
本发明提供了一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法，该方法通过利用对孕酮小分子衍生物的活化和透析纯化，再配以吖啶酯标记后的透析纯化，与现有的直接偶联不纯化的技术相比，能够达到有效对游离吖啶酯进行纯化，减少非特异性吸附，有更高信噪比，且更简易生产，性价比高。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，实施例中未注明的具体条件，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明的一种具体实施方式的技术方案为：
一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法，包括如下步骤：
S1、孕酮小分子衍生物的活化和透析纯化：
选取孕酮小分子衍生物并溶解后，加入活化剂活化处理，活化处理完成后加入牛血清白蛋白溶液，进行室温避光混匀反应，然后进行透析纯化处理，获得混合液I；
所述孕酮小分子衍生物与牛血清白蛋白的摩尔浓度比为1:1-2:1；
S2、吖啶酯标记和透析纯化：
在获得的混合液I中加入吖啶酯溶液，室温避光反应后进行透析纯化处理，获得混合液II，完成标记。
作为优选地，所述S1中，选用质量浓度为20mg/mL的N,N-二甲基甲酰胺溶解孕酮小分子衍生物。
作为优选地，所述S1中，活化剂为二环己基碳二亚胺溶液与N-羟基琥珀酰亚胺溶液的混合液；
所述二环己基碳二亚胺溶液与N-羟基琥珀酰亚胺溶液的混合体积比为1:1；
所述二环己基碳二亚胺溶液的质量浓度为40mg/mL，与N-羟基琥珀酰亚胺溶液的质量浓度为40mg/mL。
作为优选地，所述S1中，活化处理为在孕酮小分子衍生物溶液中加入活化剂混匀后，室温滚动混匀反应12-18h的处理过程。
作为优选地，所述S1中，牛血清白蛋白溶液是由牛血清白蛋白与pH 7.2-pH7.6的磷酸盐缓冲液涡旋混匀溶解得到；
所述牛血清白蛋白溶液的质量浓度为2.5mg/mL；
所述室温避光混匀反应时长为0.5-2h。
作为优选地，所述S1中，所述透析纯化处理为在2-8℃环境下，pH 7.2-pH7.6的磷酸盐缓冲液搅拌透析6-12h，其中3-6h时替换一次pH 7.2-pH 7.6的磷酸盐缓冲液。
作为优选地，所述S2中，吖啶酯溶液质量浓度为5mg/mL；
所述孕酮小分子衍生物与吖啶酯摩的摩尔浓度比为1:10-1:20。
作为优选地，所述S2中，室温避光反应1h；
所述S2中透析纯化处理为在2-8℃环境下，pH 7.2-pH 7.6的磷酸盐缓冲液搅拌透析6-12h，其中3-6h时替换一次pH 7.2-pH 7.6的磷酸盐缓冲液。
作为优选地，还包括在获得混合液II后，加入50％的甘油，混匀后，在-20℃避光保存。
孕酮小分子衍生物结构图如下所示：
实施例1：
一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法，包括如下步骤：
S1：孕酮小分子衍生物活化，生成溶液A；
具体流程为：称取孕酮小分子衍生物，加入DMF(N,N-二甲基甲酰胺)涡旋混匀溶解，质量浓度为20mg/mL。
加入DCC(二环己基碳二亚胺)与NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)混合液充分溶解，DCC溶液与NHS溶液的体积比为1:1，溶剂均为DMF，质量浓度均为40mg/mL，孕酮小分子衍生物溶液与DCC+NHS混合液体积比为1:1。
混匀后室温滚动混匀反应12小时，得到溶液A。
S2：向牛血清白蛋白(BSA)溶液中加入溶液A，并混匀反应，生成溶液B；
具体流程为：称取牛血清白蛋白(BSA)，加入pH 7.2-pH 7.6的磷酸盐缓冲液涡旋混匀溶解，质量浓度为2.5mg/mL。
向BSA溶液中加入溶液A，室温避光反应0.5h。
孕酮小分子衍生物与BSA的摩尔浓度比为1:1。
S3：对溶液B进行透析纯化，生成溶液C(即混合液I)；
具体流程为：将溶液B在2～8℃环境下，用pH 7.2-pH 7.6的磷酸盐缓冲液搅拌透析6小时，中间换液一次。
S4：在溶液C中加入吖啶酯溶液，并混匀反应，生成溶液D；
具体流程为：加入吖啶酯溶液，与溶液C混匀后，室温避光反应1h。吖啶酯溶液的质量浓度5mg/mL，溶剂为DMF。
孕酮小分子衍生物与吖啶酯摩尔浓度比为1:10。
S5：对溶液D进行透析纯化，生成溶液E(即混合液II)；
具体流程为：将溶液D在2～8℃环境下用pH 7.2-pH 7.6的磷酸盐缓冲液搅拌透析8小时，中间换液一次。
S6：在溶液E中加入50％甘油，混匀后-20℃避光保存。
实施例2：
S4中的，孕酮小分子衍生物与吖啶酯摩尔浓度比为1:20，其他步骤同实施例1。
实施例3：
S2中的孕酮小分子衍生物与BSA的摩尔浓度比为2:1；其他步骤同实施例1。
实施例4：
S2中的孕酮小分子衍生物与BSA的摩尔浓度比为2:1；
S4中孕酮小分子衍生物与吖啶酯摩尔浓度比为1:20；
其他步骤同实施例1。
实施例5：
S2中，向BSA溶液中加入溶液A，室温避光反应2h，
其他步骤同实施例1。
实施例6：
S2中，向BSA溶液中加入溶液A，室温避光反应2h；
S4中的，孕酮小分子衍生物与吖啶酯摩尔浓度比为1:20；
其他步骤同实施例1。
实施例7：
S2中的孕酮小分子衍生物与BSA的摩尔浓度比为2:1；
S2中，向BSA溶液中加入溶液A，室温避光反应2h；
其他步骤同实施例1。
实施例8：
S2中的孕酮小分子衍生物与BSA的摩尔浓度比为2:1；
S2中，向BSA溶液中加入溶液A，室温避光反应2h；
S4中孕酮小分子衍生物与吖啶酯摩尔浓度比为1:20；
其他步骤同实施例1。
实验验证：
验证一：实施例1-8对比结果：
验证二：优选上述实施例6作为实验组；
对照组为现有标记工艺，直接偶联不纯化法。现有标记中使用的吖啶酯为：NSP-SA-ADH(与醛基反应)。
具体步骤：称取孕酮小分子衍生物，加入DMF(N,N-二甲基甲酰胺)涡旋混匀溶解，质量浓度为20mg/mL。对孕酮小分子衍生物溶液进行稀释，生成溶液A，稀释液为pH 7.2-pH7.6的磷酸盐缓冲液，稀释至1mg/mL。
在溶液A中加入吖啶酯溶液，室温避光反应1h，生成溶液B。吖啶酯溶液的质量浓度5mg/mL，溶剂为DMF。
孕酮小分子衍生物与吖啶酯摩尔浓度比为1:20。
在溶液B中加入50％甘油，混匀后-20℃避光保存。
实验方法：使用磁微粒化学发光法，检测罗氏赋值过的样本，进行对比。
信噪比的计算方式：线性低值/线性高值，即样本最低浓度的发光值/最高浓度的发光值。
样本测试数据：
上述表格结果显示，实验组信噪比更好。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、孕酮小分子衍生物的活化和透析纯化：
选取孕酮小分子衍生物并溶解后，加入活化剂活化处理，活化处理完成后加入牛血清白蛋白溶液，进行室温避光混匀反应，然后进行透析纯化处理，获得混合液I；
所述孕酮小分子衍生物与牛血清白蛋白的摩尔浓度比为1:1-2:1；
S2、吖啶酯标记和透析纯化：
在获得的混合液I中加入吖啶酯溶液，室温避光反应后进行透析纯化处理，获得混合液II，完成标记。
2.根据权利要求1所述的一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法，其特征在于，所述S1中，选用质量浓度为20mg/mL的N,N-二甲基甲酰胺溶解孕酮小分子衍生物。
3.根据权利要求1所述的一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法，其特征在于，所述S1中，活化剂为二环己基碳二亚胺溶液与N-羟基琥珀酰亚胺溶液的混合液；
所述二环己基碳二亚胺溶液与N-羟基琥珀酰亚胺溶液的混合体积比为1:1；
所述二环己基碳二亚胺溶液的质量浓度为40mg/mL，与N-羟基琥珀酰亚胺溶液的质量浓度为40mg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法，其特征在于，所述S1中，活化处理为在孕酮小分子衍生物溶液中加入活化剂混匀后，室温滚动混匀反应12-18h的处理过程。
5.根据权利要求1所述的一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法，其特征在于，所述S1中，牛血清白蛋白溶液是由牛血清白蛋白与pH 7.2-pH7.6的磷酸盐缓冲液涡旋混匀溶解得到；
所述牛血清白蛋白溶液的质量浓度为2.5mg/mL；
所述室温避光混匀反应时长为0.5-2h。
6.根据权利要求1所述的一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法，其特征在于，所述S1中，所述透析纯化处理为在2-8℃环境下，pH 7.2-pH 7.6的磷酸盐缓冲液搅拌透析6-12h，其中3-6h时替换一次pH 7.2-pH 7.6的磷酸盐缓冲液。
7.根据权利要求1所述的一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法，其特征在于，所述S2中，吖啶酯溶液质量浓度为5mg/mL；
所述孕酮小分子衍生物与吖啶酯摩的摩尔浓度比为1:10-1:20。
8.根据权利要求7所述的一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法，其特征在于，所述S2中，室温避光反应1h；
所述S2中透析纯化处理为在2-8℃环境下，pH 7.2-pH 7.6的磷酸盐缓冲液搅拌透析6-12h，其中3-6h时替换一次pH 7.2-pH 7.6的磷酸盐缓冲液。
9.根据权利要求1所述的一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法，其特征在于，还包括在获得混合液II后，加入50％的甘油，混匀后，在-20℃避光保存。
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