CN117795094A

CN117795094A - 引物

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Publication number: CN117795094A
Application number: CN202280047117.8A
Authority: CN
Inventors: 亨里克·埃里克森; 乔恩·阿蒙·埃里克森
Original assignee: Shubo Treatment Co ltd
Current assignee: Shubo Treatment Co ltd
Priority date: 2021-07-09
Filing date: 2022-07-11
Publication date: 2024-03-29
Also published as: GB202205105D0

Abstract

用于检测双链DNA分子的靶序列中所含的微卫星中的突变的引物，其中所述突变是与相应的野生型微卫星序列相比的微卫星的移码。除了引物包括与含有微卫星中突变的靶序列错配并且也与含有野生型微卫星的相应序列错配的1个至4个，或1至3个核苷酸外，引物包含至少10个核苷酸的区域，所述区域与含有具有移码突变的微卫星的DNA分子的反义链或有义链的靶序列互补。

Description

引物

技术领域

本发明涉及引物，更具体地，涉及用于检测多核苷酸序列中的突变的引物。本发明还涉及包含该引物的试剂盒和检测微卫星序列中的突变的方法。

背景技术

移码突变可通过破坏正常的蛋白质翻译而导致疾病。在其他病理学中，移码突变与癌症有关，特别是与微卫星不稳定性有关的癌症。微卫星不稳定性(MSI)是由DNA错配修复(MMR)受损引起的细胞的超突变状态。换句话说，受MSI影响的细胞没有适当的功能修复机制，因此在DNA复制过程中会产生自发突变，从而导致移码突变。这些错误尤其会在微卫星中积累，微卫星是DNA的重复序列(最常见的是核苷酸C和A的二核苷酸重复)。因此，MSI会导致这些称为微卫星的重复序列中发生插入和缺失突变。

MSI与许多癌症有关，包括结肠癌、胃癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肝胆道癌、泌尿道癌、脑癌和皮肤癌(Cortes-Ciriano等人，2017)。在ASTE1、TAF1B、KIAA2018和SLC22A9中发现了移码突变。特别是，TGFBR2的移码突变存在于大量由微卫星不稳定性(MSI)引起的结直肠癌(CRC)和胃癌(GC)中。TGFBR2的移码突变也已知与Lynch综合征相关。MSI由整个基因组中多段短串联DNA重复序列(微卫星)中的插入和缺失突变组成。据报道，CRC中超过95％的移码突变是单核苷酸缺失(Maby等人2015)。

鉴于上述情况，移码突变为治疗与此类突变相关的疾病(包括许多癌症)提供了治疗靶点。然而，并非所有患有此类疾病的患者都会出现这种突变，特别是对于已知该疾病具有高度异质性的癌症患者。因此，重要的是能够检测疾病人群中具有移码突变的患者子集，以便找到对靶向移码突变的治疗有反应的患者。

例如，由突变免疫原性肽组成的癌症疫苗FMPV-1靶向移码突变体TGFBR2，如WO/2020239937中所述。并非所有MSI-CRC(约75％)和MSI-GC(约80％)患者都具有移码突变的TGFBR2。为了确保仅招募符合条件的患者参加FMPV-1的临床研究，筛选患者以检测此类突变体TGFBR2以找到将从此类治疗中受益的患者将非常有用。换句话说，移码突变的检测可能有助于为可能存在或不存在这种突变的疾病提供个性化的医疗方法。此外，检测此类突变可以帮助招募合适的候选者进行临床试验，以测试靶向此类移码突变的疗法。

这种筛查和个性化医疗方法对于ASTE1基因中存在单核苷酸缺失的患者也很有用。具体地，癌症疫苗FMPV-2(也称为“fsp8”)是靶向移码突变体ASTE1的突变体免疫原性肽，如WO2021/239980中所述。该基因中的单核苷酸缺失是最主要的移码突变，但并非发生在所有MSI-H癌症中。因此，如上文关于TGFβR2所提到的，筛选患者检测此类突变体ASTE1，以找到将从此类疗法中受益的患者将是有用的。

目前，要么需要对患者的基因组进行测序以了解其TGFBR2和ASTE1状态，要么依靠DNA扩增然后测序来检测是否存在移码突变。这些测序方法大约需要2天才能完成，通常必须由外部实验室进行，因为医院通常没有可用于进行此类测序的设备。因此，这需要将样品运送到这样的测试实验室。因此，需要提供一种更简单的测定来特异性检测移码突变，特别是为了个性化医疗的目的。

聚合酶链式反应(PCR)是一种成熟的DNA序列分析技术。PCR测试的DNA特异性由设计用于与靶标DNA序列相互作用的引物决定。然而，PCR引物通常无法靶向具有四个以上核苷酸重复的区域，这意味着使用引物检测微卫星区域的变化并非易事。

因此，需要开发一种在肿瘤活检组织中特异性检测可能与疾病相关的移码突变的技术，特别是在TGFBR2和ASTE1中。实体瘤活检组织并不代表整个肿瘤，因为肿瘤往往是异质的，因此肿瘤活检组织仅代表活检组织所取自的肿瘤部分。相比之下，液体活检组织更能代表整个癌症，并且更容易进行。因此，希望该技术适用于检测液体活检组织(例如血浆)中的游离于细胞DNA(cfDNA)。

发明内容

本发明通过引物的设计以及使用此类引物的DNA扩增测定来解决上述需要和目标，其能够区分具有移码突变的微卫星和不具有移码突变的微卫星(即野生型微卫星)。特别是，这些引物允许使用PCR来区分移码突变和野生型微卫星，即使它们仅相差一个核苷酸，例如通过在次优条件下进行PCR。这些次优条件增加了反应的严格性，使得移码突变体与野生型微卫星之间的扩增效率差异被放大，为移码突变体微卫星提供了更灵敏的测试。这些次优条件可以通过多种不同的方式来实现。因此，这在检测移码突变、诊断MSI相关疾病和/或筛选受试者是否适合针对此类移码突变的治疗方面是有用的发明。

在本发明的一个方面，提供了用于检测双链DNA分子的靶序列中包含的微卫星中的突变的引物，其中所述突变是与相应的野生型微卫星序列相比微卫星的移码，并且其中所述引物包含与含有具有移码突变的微卫星的DNA分子的反义链或有义链的靶序列互补的至少10个核苷酸的区域，除了引物包括与含有微卫星中突变的靶序列错配并且也与含有野生型微卫星的相应序列错配的1个至4个，或1至3个核苷酸。在一些实施方案中，引物包括1至3个核苷酸，其与含有微卫星中的突变的靶序列错配，并且也与含有野生型微卫星的相应序列错配。

在一些实施方案中，引物被配置成在具有移码突变的微卫星的长度退火，并且与具有移码突变的微卫星的5'端侧翼的至少一个核苷酸或至少两个核苷酸和/或3'端侧翼的至少一个核苷酸退火。在一些实施方案中，引物被配置成在具有移码突变的微卫星的长度退火，并且与具有移码突变的微卫星的5'端侧翼的至少两个核苷酸和/或3'端侧翼的至少两个核苷酸退火。

在一些实施方案中，引物由16至30个核苷酸组成。

在一些实施方案中，至少一个错配的核苷酸位于被配置为在微卫星的3'下游或微卫星内退火的引物的位置。

在一些实施方案中，至少一个错配的核苷酸位于微卫星3'端的5'上游或3'下游的三个或四个核苷酸内。

在一些实施方案中，至少一个错配的核苷酸是胸腺嘧啶(T)被腺嘌呤(A)置换、腺嘌呤(A)被鸟嘌呤(G)置换、胸腺嘧啶(T)被胞嘧啶(C)置换或胞嘧啶(C)被鸟嘌呤(G)置换。

在本发明的另一个方面，提供了用于检测双链DNA分子的靶序列中包含的微卫星中的突变的试剂盒，其中所述突变是与相应的野生型微卫星序列相比微卫星的移码，并且其中所述试剂盒包含本发明的第一引物和第二引物，其中所述第二引物被配置为在DNA分子的与第一引物被配置为在其上退火的链相反的链上微卫星下游3'处的靶序列退火。

应当理解，当提到“3'下游”时，这是相对于(第一)引物而言的，即沿(第一)引物的DNA聚合酶延伸的方向。换句话说，术语“3'下游”是指引物中的位置3'，其对应于模板序列中的位置5'。例如，上面的表述“至少一个错配的核苷酸位于被配置成在微卫星的3'下游退火的引物的位置”，意味着在引物中，至少一个错配的核苷酸位于微卫星的3'下游，即在模板序列中，微卫星的5'上游。类似地，应当理解，当提及“具有移码突变的微卫星的3'端”时，这是相对于(第一)引物而言的。换句话说，术语“3'端”是指引物中的3'端，其对应于模板序列中的5'端。

类似地，应当理解，当提及“5'上游”时，这是相对于(第一)引物而言的。例如，上述表述“引物被配置为在具有移码突变的微卫星的长度上退火，并与具有移码突变的微卫星5'端侧翼的至少两个核苷酸和/或3'端侧翼的至少两个核酸退火”，意味着引物可以相对于引物与微卫星5'端侧翼的至少两个核苷酸退火，即相对于模板与微卫星3'端侧翼的至少两个核酸退火。类似地，应当理解，当提及“具有移码突变的微卫星的5'端”时，这是相对于(第一)引物而言的。换句话说，术语“5'端”是指引物中的5'端，其对应于模板序列中的3'端。

在一些实施方案中，移码突变位于TGFBR2基因中的微卫星中并且包含根据SEQ IDNO:20的残基270至278的序列，并且其中第一引物包含由SEQ ID NO:3、4、5或7中任一项定义的序列，和/或第二引物包含SEQ ID NO:2定义的序列。

在一些实施方案中，移码突变位于ASTE1基因中的微卫星中并且包含根据SEQ IDNO:32的残基328至337的序列，并且其中第一引物包含由SEQ ID NO:15或31定义的序列，和/或第二引物包含SEQ ID NO:10定义的序列。

在一些实施方案中，该试剂盒还包括：

第三引物或另一对照引物对，其中第三引物被配置为在第二引物被配置为退火的区域的5'上游退火，并且其中第三引物被配置为与与第一引物相同的链和与第二引物相反的链退火。

在一些实施方案中，含有野生型微卫星的序列包含SEQ ID NO:19中定义的序列，并且优选地第三引物包含由SEQ ID NO:1定义的序列。

在一些实施方案中，含有野生型微卫星的序列包含SEQ ID NO:32中定义的序列，并且优选地第三引物包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:38中定义的序列。

在一些实施方案中，试剂盒进一步包含用于进行DNA扩增的组分，优选地其中所述组分包含以下中的至少一种：缓冲液、dNTP和Taq聚合酶。

在本发明的另一个方面，提供了用于DNA扩增的引物，其包含SEQ ID NO:3、4、5、7、15、31、39、40或41中任一项所定义的序列，优选SEQ ID NO:3、15、31、39、40或41中的一项，更优选SEQ ID NO：3、15和31中的一项。

在本发明的另一方面，提供了用于检测双链DNA分子的靶序列中所含的微卫星中的突变的方法，其中所述突变是与相应的野生型微卫星序列相比微卫星的移码，并且该方法包括：

a)提供包含人DNA的第一等分样品，

b)向第一等分试样中添加DNA扩增所需的组分、第一引物和第二引物；其中第一引物适合于检测双链DNA分子的靶序列中包含的微卫星中的突变，并且包含与含有具有移码突变的微卫星的靶序列互补的核苷酸区域，除了一到四个或一到三个核苷酸，这些核苷酸与含有具有移码突变的微卫星的靶序列错配，并且也与含有野生型微卫星的相应序列错配，并且其中第一引物被配置成在具有移码突变的微卫星的整个长度上退火，并且与具有移码突变的微卫星的3'端侧翼的至少一个核苷酸和具有移码突变的微卫星的5'端侧翼的至少一个核苷酸退火；第二引物被配置为与微卫星3'下游的靶序列退火，以形成第一反应混合物；

其中第一引物被配置成与DNA分子的有义链退火，并且第二引物被配置为与DNA分子的反义链退火，或者第一引物被配置成与DNA分子的反义链退火，并且第二引物被配置为与DNA分子的有义链退火，

c)对第一反应混合物进行DNA扩增，

d)当第一反应混合物的DNA扩增产生扩增产物时，检测样品中移码突变的存在。在一些实施方案中，引物包含1至3个核苷酸，其与含有具有移码突变的微卫星的靶序列错配，并且也与含有野生型微卫星的相应序列错配。

在一些实施方案中，该方法还包括：

a)还向第一等分试样中添加：

I)第二引物和第三引物，其中第三引物被配置为在第二引物被配置为退火的区域的5'上游退火，并且其中第三引物被配置为与与第一引物相同的链和第二引物的相反链退火或

II)对照引物对，形成第一反应混合物或

b)提供包含人DNA的第二等分样品并向第二等分样品中添加用于DNA扩增的必要组分以及：

II)对照引物对，形成第二反应混合物

对反应混合物进行DNA扩增，当第二反应混合物的DNA扩增产生扩增产物时，检测DNA扩增已成功进行。

在一些实施方案中，DNA扩增是聚合酶链式反应(PCR)，其中PCR包括变性、退火和延伸的多个循环。

在一些实施方案中，反应混合物包含1x或0.5x缓冲液、0.4mM dNTP、0.2μM正向引物和0.2μM反向引物。在一些实施方案中，反应混合物包含终浓度为200μM的dNTP。在一些实施方案中，反应混合物包含作为终浓度的1x或0.5x缓冲液、200μM dNTP、0.2μM正向引物和0.2μM反向引物。

在一些实施方案中，步骤d)还包括在凝胶上运行PCR反应的产物并显示条带以确认DNA扩增已成功。

在一些实施方案中，该方法还包括步骤f)切出条带用于DNA测序。

在一些实施方案中，移码突变位于TGFBR2基因中的微卫星中，并且靶序列包含根据SEQ ID NO:20的残基270至278的序列，并且其中第一引物包含由SEQ ID NO：3、4、5、7或39中的任一项定义的序列和/或第二引物包含由SEQ ID NO：2定义的序列；或者移码突变位于ASTE1基因的微卫星中，并且靶序列包含根据SEQ ID NO:33的残基328-337的序列，并且其中第一引物包含SEQ ID NO:15、31、40或41所定义的序列，和/或第二引物包含SEQ IDNO:10定义的序列。

在一些实施方案中，所述微卫星位于TGFBR2基因中，包含野生型微卫星的序列由根据SEQ ID NO:19的序列组成，并且其中第三引物包含由SEQ ID NO:1定义的序列；或者，所述微卫星位于ASTE1基因中，包含野生型微卫星的序列包含根据SEQ ID NO:32的序列，并且其中第三引物包含由SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:38定义的序列。

在本发明的另一个方面，提供了一种诊断与微卫星移码突变相关的疾病的方法，包括实施根据本发明的检测微卫星突变的方法。

在一些实施方案中，该方法还包括如果在步骤d)中在来自患者的样品中检测到移码突变，则确定患有与移码突变相关的疾病或病症的患者适合靶向所述移码突变的治疗。

在一些实施方案中，与移码突变相关的疾病或病症是癌症。

在一些实施方案中，所述疾病或病症是结直肠癌或胃癌，并且靶向移码突变的治疗是FMPV-1，其中移码突变位于TGFBR2基因的微卫星中并且包含根据SEQ ID NO：20的残基270至278的序列；或者，所述疾病或病症是子宫内膜癌或胃癌，并且靶向移码突变的治疗是FMPV-2，并且移码突变位于ASTE1基因的微卫星中并且包含根据SEQ ID NO:33的残基328至337的序列。

在一些实施方案中，该方法还包括用FMPV-1或FMPV-2治疗患者的步骤e)。

在一些实施方案中，微卫星位于TGFBR2基因中，包含野生型微卫星的序列包含根据SEQ ID NO:19的序列，并且第三引物包含由SEQ ID NO:1定义的序列。

在一些实施方案中，微卫星位于ASTE1基因中，包含野生型微卫星的序列包含根据SEQ ID NO:32的序列，并且第三引物包含由SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:38定义的序列。

在一些实施方案中，第一引物包含SEQ ID NO:3、4、5、7或39中任一项定义的序列，和/或第二引物包含SEQ ID NO:2定义的序列；或者，第一引物包含SEQ ID NO:15、31、40或41所定义的序列，和/或第二引物包含SEQ ID NO:10所定义的序列。

在一些实施方案中，样品是包含游离于细胞DNA的液体活检组织，优选地其中液体活检组织是血浆。

在一些实施方案中，DNA扩增是PCR，并且PCR在高严格条件下进行，任选地其中高严格条件包括以下至少之一：

a)在比推荐的反应退火温度高至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃的温度下进行PCR的退火步骤；

b)每个循环仅进行PCR的退火步骤30秒，优选15秒；

c)在小于0.1X、0.2X、0.3X、0.4X、0.5X、0.6X或0.75X的缓冲液浓度下进行DNA扩增；

d)在包含铵离子的缓冲液中进行DNA扩增；和

e)进行25、20、15或10个循环的PCR，或少于25个、少于20个、少于15个或少于10个循环的PCR。

在一些实施方案中，缓冲液包含铵(NH₄ ⁺)离子。

在一些实施方案中，缓冲液包含铵(NH₄ ⁺)离子并且浓度为1×。

在一些实施方案中，缓冲液是1×Key缓冲液。

定义

在本说明书中，下列术语可以如下理解：

术语“基因”、“多核苷酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用，是指多个核苷酸的聚合物。核酸分子可包含天然存在的核酸(即DNA或RNA)或可包含人工核酸例如肽核酸、吗啉和锁核酸以及二醇核酸和苏糖核酸。

本文使用的术语“核苷酸”是指被细胞酶识别的天然存在的核苷酸和合成的核苷酸类似物。

短语“高严格条件”是指仅允许成功进行DNA扩增且与靶序列具有非常高水平的匹配的条件。换句话说，DNA扩增的条件是次优的，因此与靶序列匹配度较低的引物无法退火。这种次优条件可以通过改变温度、循环数、离子强度和允许核酸序列配对的某些有机溶剂的存在中的一项或多项来产生。下面提供了有关高严格条件的更多详细信息。特别地，高严格条件可以包括其中PCR的退火步骤在比反应的推荐退火温度高至少2％、5％或10％的温度下进行。或者，PCR的退火步骤在比推荐的反应退火温度高至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃的温度下进行。在一些实施方案中，PCR的退火步骤在比反应的推荐退火温度高4℃的温度下进行。例如，退火步骤可以在44℃和61℃或62℃之间进行，如下文进一步详述。另外或替代地，退火步骤可以进行比反应推荐的更短的时间，例如，退火步骤可以从45秒减少到30秒或15秒。另外或替代地，高严格条件可包括使用比反应推荐浓度更低的缓冲液浓度，例如反应中缓冲液推荐浓度的10％、20％、30％、40％、50％、60％或75％，特别是缓冲液浓度可以小于0.1X、0.2X、0.3X、0.4X、0.5X、0.6X或0.75X。另外或替代地，高严格条件可以包括在反应中使用更严格的缓冲液，例如包含铵离子(NH₄ ⁺)的缓冲液，例如Key缓冲液。可以使用1X浓度的更严格的缓冲液。在一些实施方案中，使用1×Key缓冲液。另外或替代地，高严格条件可包括减少PCR中的循环数，例如与30、35或40个循环相比，进行25个循环、20个循环、15个循环或甚至10个循环。在一些实施方案中，进行30个或更少、25个或更少、20个或更少、15个或更少、或10个或更少循环的PCR。可以使用上述条件中的任何一种或多种。

术语“移码”是指由DNA序列中的缺失或插入引起的基因突变，导致序列移位，这意味着核苷酸被分组为不同系列的密码子，导致从该序列翻译出不同的蛋白质。在许多情况下，移码可能会导致蛋白质序列中出现过早的终止密码子，从而导致截短的蛋白质序列。例如，TGFBR2中的一个此类移码突变是单个腺嘌呤的缺失，这意味着10个腺嘌呤的序列(a10；其是微卫星)减少为9个腺嘌呤(a9)。野生型TGFBR2的序列如SEQ ID NO:34所示，a9 TGFBR2的序列如SEQ ID NO:35所示。另一种这样的移码是ASTE1中单个腺嘌呤的缺失，意味着11个腺嘌呤的序列(a11；其是微卫星)减少为10个腺嘌呤(a10)。野生型ASTE1的序列如SEQ IDNO:36所示，a10 ASTE1的序列如SEQ ID NO:37所示。

术语“微卫星”是指序列重复(通常重复5至50次)的DNA区域。微卫星也可能特别容易发生突变。微卫星也被称为“短串联重复序列(STR)”。微卫星可以是单核苷酸(例如A、G、C或T)的重复系列，或者可以是较长基序(例如TA(二核苷酸重复)或GTC(三核苷酸重复))的重复系列。

正如分子生物学中众所周知的，鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)以及腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)是互补的核苷酸，因此将在例如DNA复制期间配对。在本发明中，“错配”或“错配的”核苷酸可以是互补核苷酸的缺失、核苷酸的添加、或互补核苷酸对非互补(即错配)核苷酸的置换。例如，与靶鸟嘌呤(G)的错配可以是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或另一种鸟嘌呤(G)，但不是胞嘧啶(C)。具体地，当移码突变导致微卫星长度增加时，则核苷酸的添加对于区分移码突变的微卫星与野生型微卫星特别有用。相反，当移码突变导致微卫星长度减少时，则核苷酸的缺失对于区分移码突变的微卫星与野生型微卫星特别有用。在一个实例中，这种缺失是从微卫星序列中缺失单个核苷酸。

再次，如分子生物学领域众所周知的，在人类中，DNA是由双链DNA螺旋形成的，该双链DNA螺旋由两条链、一条有义链和一条反义链形成。因此，术语“有义链”将被技术人员已知为编码链，其在5'至3'方向上携带可转录的核苷酸，术语“反义链”对于技术人员来说是已知的，是指在5'至3'方向上与编码链具有反向互补序列的链，并且是mRNA转录的模板。

术语“引物”是指用于启动靶向的DNA扩增的短单链DNA序列。其长度通常在18至24个碱基之间，但在一些实施方案中比该典型长度更短或更长。“引物对”是两个这样的引物，其引起位于这两个引物的退火位点之间的特定靶序列的DNA扩增。

术语“治疗”是指任何部分或完全治疗，并且包括：抑制疾病或症状，即阻止其发展；和缓解疾病或症状，即引起疾病或症状的消退。

附图说明

图1显示了使用不同量的模板DNA，使用引物对P1和P2对10a微卫星TGFBR2模板DNA(即野生型)进行PCR反应的产物的两个电泳凝胶。图1A显示了以纳克(ng)为单位的模板DNA量增加的结果，图1B显示了以皮克(pg)为单位的模板DNA量增加的结果。

图2显示了引物P1和P4与引物P2的组合在更严格的条件下，使用53℃的退火温度和减少的循环次数(25)，在9a微卫星TGFBR2模板DNA(即突变体)和10a微卫星TGFBR2模板DNA(即野生型)上进行的PCR反应产物的电泳凝胶。

图3显示了引物对P4和P2在更严格的条件下使用55℃的退火温度对9a微卫星TGFBR2模板DNA(即突变体)和10a微卫星TGFBR2模板DNA(即野生型)进行的PCR反应产物的电泳凝胶。

图4显示了引物P6和P10与引物P2的组合在9a微卫星TGFBR2模板DNA(即突变体)和10a微卫星TGFBR2模板DNA(即野生型)上进行的PCR反应产物的电泳凝胶。特别地，那些用星号(*)表示的泳道是在低缓冲液浓度下进行的PCR反应的产物的那些泳道。

图5显示了在越来越严格的PCR条件下，引物P4、P6和P10与引物P2的组合(以及引物P1与引物P2的组合作为阳性对照)在9a微卫星TGFBR2模板DNA(即突变体)上进行的PCR反应的产物的三种电泳凝胶。图5A中的反应在55℃的退火温度下进行30个循环。图5B中的反应在56℃的退火温度下进行25个循环。图5C中的反应在58℃的退火温度下进行25个循环。同样，那些用星号(*)表示的泳道是在低缓冲液浓度下进行的PCR反应的产物。

图6显示了引物P1、P6和P10与引物P2的组合在9a微卫星TGFBR2模板DNA(即突变体)和10a微卫星TGFBR2模板DNA(即野生型)上进行的PCR反应产物的两个电泳凝胶。特别地，那些用星号(*)表示的泳道是在低缓冲液浓度下进行的PCR反应的产物的那些泳道。图6A中的反应是用引物对进行的，图6B中的反应是用三条引物进行的。

图7显示了引物P1、P4和P10与引物P2的组合在9a微卫星TGFBR2模板DNA(即突变型)和10a微卫星TGFBR2模板DNA(即野生型)上进行的PCR反应产物的电泳凝胶。这包括三个引物反应，其包括引物P1和P2两者以及引物P4或P10。

图8显示了所列每种引物组合在9a微卫星TGFBR2模板DNA(即突变体)和10aTGFBR2微卫星模板DNA(即野生型)进行的PCR反应产物的电泳凝胶，表明所有这些引物都是功能性的。

图9显示了引物P1、P4.1、P4.2和P10.1在9a微卫星TGFBR2模板DNA(即突变体)DNA上进行的PCR反应产物的两个电泳凝胶，其中PCR反应是在标准Taq(KCl)缓冲液或Key缓冲液(含有铵离子，NH₄ ⁺)中进行。图9A中的反应在56℃的退火温度下进行，图9B中的反应在58℃的退火温度下进行。

图10显示了引物P4、P4.1、P4.2和P6与引物P2的组合在9a微卫星模板TGFBR2 DNA(即突变体)和10a微卫星TGFBR2模板DNA(即野生型)上进行的PCR反应的凝胶电泳。图10A中的反应使用标准Taq缓冲液进行，图10B中的反应使用Key缓冲液(包含铵，NH₄ ⁺)进行。

图11显示了引物P4、P4.1、P4.2和P6与引物P2的组合在9a微卫星TGFBR2模板DNA(即突变体)和10a微卫星TGFBR2模板DNA(即野生型)上进行的PCR反应的凝胶电泳。图11A中的反应使用标准Taq缓冲液(其不包含铵)进行，并且图11B中的反应使用Key缓冲液(包含铵，NH₄ ⁺)进行。

图12显示使用定义包含a10/a9微卫星的TGFBR2片段的引物检测来自MSI-CRC和微卫星稳定CRC(MSS-CRC)患者的TGFBR2 cfDNA的结果。¹引物，被设计用于检测TGFbR2 a9(突变体)微卫星；²对照引物，用于检测a9和a10 TGFbR2微卫星两者。

图13显示使用引物P2和P4在不同退火温度下对9a微卫星TGFBR2模板DNA(即突变体，F1)和10a微卫星TGFBR2模板DNA(即野生型，F2)进行PCR反应的产物的电泳凝胶。

图14显示使用引物P2和P4在不同退火温度下对(A)9a微卫星TGFBR2模板DNA(即突变体，F1)和(B)10a微卫星TGFBR2模板DNA(即野生型，F2)进行PCR反应的产物的电泳凝胶。

图15显示了使用标准Taq(KCl)缓冲液，退火温度为57℃，使用引物P4在9a微卫星TGFBR2模板DNA(即突变体，F1)和10a微卫星TGFBR2模板DNA(即野生型，F2)上进行的PCR反应产物的电泳凝胶。引物P2是所有反应的正向引物，引物P1是阳性对照反向引物。

图16显示了使用一定范围的退火温度，使用引物P11和P16在(A)10a微卫星ASTE1模板DNA(即突变体，F3)和(B)11a微卫星ASTE1模板DNA上(即野生型，F4)进行的PCR反应的产物的电泳凝胶。

图17显示了使用一系列退火温度，使用引物P24对(A)10微卫星ASTE1模板DNA(即突变体，F3，在凝胶中称为“M”)和(B)11a微卫星ASTE1模板DNA(即野生型，F4，在凝胶中称为“Wt”)进行PCR反应的产物的电泳凝胶。

图18显示了使用一系列退火温度，使用引物P12对(A)10微卫星ASTE1模板DNA(即突变体，F3，在凝胶中称为“M”)和(B)11a微卫星ASTE1模板DNA(即野生型，F4，在凝胶中称为“Wt”)进行PCR反应的产物的电泳凝胶。

发明详述

鉴于上述情况，需要开发一种工具来特异性检测可能与疾病相关的移码突变，例如TGFBR2或ASTE1的微卫星中的移码突变。还需要该工具适合检测液体活检组织(例如血浆)中的游离于细胞的DNA(cfDNA)。

因此，在本发明的第一方面，提供了用于检测双链DNA分子的靶序列中包含的微卫星中的突变的引物，其中所述突变是与相应的野生型微卫星序列相比微卫星的移码，并且其中引物包含与含有具有移码突变的微卫星的DNA分子的反义链或有义链的靶序列互补的至少10个核苷酸的区域，除了引物包括1个至4个，或1至3个与含有微卫星中突变的靶序列错配并且也与含有野生型微卫星的相应序列错配的核苷酸。在一些实施方案中，引物包括1至3个核苷酸，其与含有微卫星中的突变的靶序列错配，并且也与含有野生型微卫星的相应序列错配。

如本文所公开的，存在许多其中可能发生疾病相关移码突变的微卫星。例如，移码可以在选自ASTE1、ACVR22、TAF1B、KIAA2018、SLC22A9和TGFBR2的任何基因中的微卫星中。在一些实施方案中，移码发生在TGFBR2或ASTE1中的微卫星中。

在一些实施方案中，引物被配置成在具有移码突变的微卫星的长度退火，并且与微卫星的5'端侧翼的至少一个核苷酸或至少两个核苷酸和/或具有移码突变的微卫星的3'端侧翼的至少一个核苷酸退火。在一些实施方案中，引物被配置成在具有移码突变的微卫星的长度退火，并且与具有移码突变的微卫星的5'端侧翼的至少两个核苷酸和/或具有移码突变的微卫星的3'端侧翼的至少两个核苷酸退火。引物可以与具有移码突变的微卫星一端或两端侧翼的至少三个、四个或五个核苷酸退火。

应当理解，当提到“在具有移码突变的微卫星的长度上退火”时，这意味着引物至少在靶序列中的微卫星(其有移码突变)的全长上与靶序列退火。例如，当靶序列是a9TGFBR2时，引物与靶序列退火a9微卫星的全长。当靶序列是a10 ASTE1时，引物与靶序列退火a10微卫星的全长。

在一些实施方案中，引物不在相应野生型微卫星序列的长度上退火，并且引物的3'端不与含有野生型微卫星的相应序列退火。这提供了以下优点：引物与含有具有移码突变的微卫星的序列退火，但不与具有野生型微卫星的相应序列退火。

在一些实施方案中，引物与具有移码突变的微卫星3'端侧翼的1至15个、优选1至13个核苷酸退火(即，引物包含相对于引物微卫星的3'的1至15个、优选1至13个核苷酸，其与包含具有移码突变的微卫星的相应序列退火)。在一些实施方案中，引物与具有移码突变的微卫星3'端侧翼的1个、2个、3个、5个或13个、优选1个、2个或13个核苷酸退火(即，相对于引物，引物包含微卫星3'的1个、2个、3个、5个或13个，优选1个、2个或13个核苷酸，该引物与包含具有移码突变的微卫星的相应序列退火)。在一些实施方案中，引物与具有移码突变的微卫星3'端侧翼的两个或三个核苷酸退火，并且在一些实施方案中，这两个或三个核苷酸形成GC夹。在一些实施方案中，引物在具有移码突变的微卫星的长度上退火，并且相对于引物，在具有移码突变的微卫星的3'，所述引物包含或由2个、3个、5个或13个，优选1个、2个、5个或13个核苷酸组成，所述核苷酸与具有移码突变的微卫星侧翼的核苷酸退火。这提供了以下优点：与含有具有移码突变的微卫星的序列退火的引物可以在5'至3'方向延伸，从而允许复制含有具有移码突变的微卫星的序列。在一些实施方案中，引物与具有移码突变的微卫星3'端侧翼的1个、2个、3个或5个核苷酸退火，并且移码突变位于TGFBR2的微卫星中。在一些实施方案中，引物与具有移码突变的微卫星3'端侧翼的2个、3个或13个、优选2个或13个核苷酸退火，并且移码突变位于ASTE1的微卫星中。

在一些实施方案中，相对于引物，引物与具有移码突变的微卫星5'端侧翼的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个核苷酸退火。在一些实施方案中，相对于引物，引物与具有移码突变的微卫星的5'端侧翼的1、8或12个核苷酸退火。引物可以与具有移码突变的微卫星3'端侧翼的任何上述详细数量的核苷酸退火。

在一些实施方案中，引物被配置为与具有移码突变的微卫星5'端侧翼的至少1、至少2、至少3、至少5或至少12个核苷酸，并且与具有移码突变的微卫星3'端侧翼的至少2个、至少3个或至少13个核苷酸退火。在一些实施方案中，引物被配置为与具有移码突变的微卫星的5'端侧翼的1、8或12个核苷酸退火，并与具有移码突变的微卫星的3'端侧翼至少2、至少3或至少13个，优选2、3、5或13个核苷酸退火。在一些实施方案中，引物被配置成与具有移码突变的微卫星5'端侧翼的12个核苷酸和具有移码突变的微卫星3'端侧翼的2个核苷酸，具有移码突变的微卫星5'端侧翼的8个核苷酸，以及具有移码突变的微卫星3'端侧翼的5个核苷酸，具有移码突变的微卫星5'端侧翼的12个核苷酸，以及具有移码突变的微卫星3'端侧翼的1个核苷酸，或具有移码突变的微卫星5'端侧翼的1个核苷酸和具有移码突变的微卫星3'端侧翼的13个核苷酸退火。

在一些实施方案中，相对于引物，引物的至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％的核苷酸与具有移码突变的微卫星5'端侧翼的核苷酸退火。换句话说，相对于引物，构成引物的至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％的核苷酸与具有移码突变的微卫星5'端侧翼的多个核苷酸退火(即，相对于靶序列具有移码突变的微卫星的3'端侧翼)。在一些实施方案中，相对于引物，与具有移码突变的微卫星5'端侧翼的核苷酸退火的引物部分也与含有野生型微卫星的相应序列退火。这提供了引物对所需靶序列具有特异性的优点。在一些实施方案中，相对于引物，引物的至少50％的核苷酸与具有移码突变的微卫星5'端侧翼的核苷酸退火(即，相对于靶序列，与具有移码突变的微卫星3'端侧翼的核苷酸退火)。

在一些实施方案中，相对于引物，与具有移码突变的微卫星5'端侧翼的核苷酸退火的引物的一个或多个核苷酸，与微卫星中具有移码突变的靶序列中的相应的一个或多个核苷酸100％互补。这提供了引物对靶序列具有特异性的优点。

在一些实施方案中，引物由16至30个核苷酸组成。优选地，引物由16至25个核苷酸或16至24个核苷酸组成。还优选地，引物由17至24个、或17至23个核苷酸组成。

在一些实施方案中，引物是分离的或重组的。在一些实施方案中，引物的长度小于50、30或20个核苷酸。

在一些实施方案中，引物由22、23或24个核苷酸组成。

在一些实施方案中，野生型微卫星序列是来自人类基因组DNA的序列。

在一些实施方案中，引物包含1、2、3或4个核苷酸，其与含有微卫星中的突变的靶序列错配，并且也与含有野生型微卫星的相应序列错配。这意味着引物包含1到4个这样的错配，但不超过4个这样的错配。在一些实施方案中，至少一个错配的核苷酸位于在微卫星的3'下游或微卫星内退火的引物的位置。在一些实施方案中，相对于引物，至少一个错配的核苷酸位于微卫星3'下游退火的引物的位置，并且至少一个错配的核苷酸位于微卫星内。在一些实施方案中，引物仅具有一个错配的核苷酸，其位于微卫星的3'下游退火的引物的位置。在一些实施方案中，引物具有位于微卫星3'下游退火的引物的位置的一个错配核苷酸和位于微卫星内的两个错配核苷酸。在一些实施方案中，相对于引物，引物具有位于微卫星3'下游退火的引物的位置的一个错配核苷酸和位于微卫星内的一个错配核苷酸。在一些实施方案中，引物具有相对于引物而言位于微卫星内的三个错配核苷酸。在一些实施方案中，引物具有位于微卫星内的一个错配核苷酸和位于相对于引物在微卫星3'下游退火的引物的位置的两个错配核苷酸。在一些实施方案中，所有错配的核苷酸均位于在微卫星3'下游或微卫星内退火的引物的位置。在一些实施方案中，所有错配的核苷酸都位于在微卫星内退火的引物的位置。

在一些实施方案中，相对于引物，至少一个错配的核苷酸在微卫星3’端的5'上游或3'下游的三个核苷酸内。在一些实施方案中，相对于引物，至少一个错配的核苷酸在微卫星3'端的3'下游的五个核苷酸内。优选地，相对于引物，所有错配的核苷酸都在微卫星3'端的5'上游或3'下游的三个核苷酸内。

引物中的每个错配可以是对与靶序列和野生型序列中的相应核苷酸错配的任何核苷酸(例如A、T、C或G)的核苷酸置换。在一些实施方案中，至少一个错配的核苷酸是胸腺嘧啶(T)被腺嘌呤(A)置换、腺嘌呤(A)被鸟嘌呤(G)置换、胸腺嘧啶(T)被胞嘧啶(C)置换或胞嘧啶(C)被鸟嘌呤(G)置换。

在一些实施方案中，相对于引物，引物在微卫星3'端的3'下游的第二核苷酸处具有错配的核苷酸。错配是对与靶序列和野生型序列中的相应核苷酸错配的任何核苷酸的置换，并且在一些实施方案中，错配的核苷酸是G、A或T，优选G。在一些实施方案中，相对于引物，引物在微卫星3'端的3'下游的第二核苷酸处和微卫星3'端的5'上游的第一核苷酸处具有错配的核苷酸。在这些实施方案中，微卫星3'端的3'下游的第二核苷酸可以是G、A或T，优选G，并且微卫星3'端的5'上游的第一核苷酸可以是G、C或A，优选C或A。在一些实施方案中，相对于微卫星，引物在微卫星3'端的3'下游的第二核苷酸处、在微卫星3'端的5'上游的第一核苷酸处和在微卫星3'端的5'上游第二核苷酸处具有错配的核苷酸。在这些实施方案中，微卫星3'端的3'下游的第二核苷酸可以是G、A或T，优选G，微卫星3'端的5'上游的第一核苷酸可以是G、C或A，优选C，并且微卫星3'端的5'上游的第二核苷酸可以是G、C或A，优选A。在一些实施方案中，相对于引物，引物在微卫星3'端的3'下游的第二核苷酸处、在微卫星3'端的5'上游的第二核苷酸处具有错配的核苷酸。在这些实施方案中，微卫星3'端的3'下游的第二核苷酸可以是G、A或T，优选G，并且微卫星3'端的5'上游的第二核苷酸可以是G、C或A，优选A。在一些实施方案中，相对于引物，引物在微卫星3'端的3'下游的第二核苷酸处、在微卫星3'端的5'上游的第二核苷酸处和在微卫星3'端的3'下游的第四核苷酸处具有错配的核苷酸。在这些实施方案中，微卫星3'端的3'下游的第二核苷酸可以是G、A或T，优选G，微卫星3'端的5'上游的第二核苷酸可以是G、C或A，优选A，并且微卫星3'端的3'下游的第四核苷酸可以是A、G或C，优选C。

在一些实施方案中，引物仅具有一个错配，相对于引物，其位于微卫星3'端的3'下游的第二核苷酸处，并且优选地微卫星3'端的3'下游的第二核苷酸是G。在一些实施方案中，引物包含SEQ ID NO:39的序列或由SEQ ID NO:39的序列组成，其中X是A、G或T。在一些实施方案中，引物包含SEQ ID NO:3的序列或由SEQ ID NO:3的序列组成。

在一些实施方案中，相对于引物，引物在微卫星3'端的5'上游的第一、第三和第四核苷酸处具有错配的核苷酸。错配是对与靶序列和野生型序列中的相应核苷酸错配的任何核苷酸的置换。在一些实施方案中，引物仅具有三个错配的核苷酸，其相对于引物位于微卫星3'端的5'上游的第一、第三和第四核苷酸处。在这些实施方案中，优选微卫星3'端的5'上游的第一核苷酸是C，微卫星3'端的5'上游的第三核苷酸是A，并且微卫星3'端的5'上游的第四核苷酸是A。在一些实施方案中，引物包含SEQ ID NO:40的序列或由SEQ ID NO:40的序列组成，其中X₁、X₂和X₃中的每一个独立地是A、C或G。在一些实施方案中，引物包含SEQ IDNO:15的序列或由SEQ ID NO:15的序列组成。

在一些实施方案中，相对于引物，引物在微卫星3'端的5'上游的第二核苷酸处具有错配的核苷酸，并且相对于引物，在微卫星3'端的3'下游的第五和第十二核苷酸处具有错配的核苷酸。在一些实施方案中，引物仅具有三个错配的核苷酸，其位于微卫星3'端的5'上游的第二核苷酸处以及微卫星3'端的3'下游的第五和第十二核苷酸处。在这些实施方案中，优选微卫星3'端的5'上游的第二核苷酸是C，微卫星3'端的3'下游的第五核苷酸是G，并且微卫星3'端的3'下游的第十二核苷酸是C。在一些实施方案中，引物包含SEQ ID NO:41的序列或由SEQ ID NO:41的序列组成，其中X₄是A、C或G，X₅是A、C或G，并且X₆是C、G或T。在一些实施方案中，引物包含SEQ ID NO:31的序列或由SEQ ID NO:31的序列组成。

如上所述，引物包括一个、两个、三个或四个核苷酸，其与含有微卫星突变的靶序列错配，并且也与含有野生型微卫星的相应序列错配。这意味着引物包括至少一个但不超过四个与含有微卫星中的突变的靶序列错配并且也与含有野生型微卫星的相应序列错配的核苷酸。

如本文所公开的，在微卫星移码突变的背景下成功使用此类引物令本发明人感到惊讶。在本发明之前，人们认为由于这些区域的高度重复性质，不可能使用在靶序列中的微卫星上退火的引物来区分所述微卫星中的移码突变。人们认为此类引物不能用于区分移码突变的和野生型微卫星序列，因为被设计用于与移码的微卫星退火的引物也被认为与野生型序列退火，即使结合亲和力较低。

通过使用与含有具有移码突变的微卫星的靶序列互补的引物，除了引物与该序列有至少一个错配(最多四个错配)，以及与包含野生型微卫星的相应序列错配之外，从而使得该引物与野生型靶序列具有额外的错配，并且因此进一步降低了与野生型靶序列的亲和力，该引物方法允许区分移码突变体和野生型微卫星。换句话说，引物以包含具有移码突变的微卫星的序列为模型，使得它们包含与具有野生型微卫星的相应序列的错配。引物和具有移码突变的微卫星之间的额外错配导致引物和含有野生型微卫星的序列之间进一步不稳定和排斥。

移码的微卫星和野生型微卫星之间的这种区别提供了非常有用的检测工具，其中检测这种移码很重要，例如在癌症中，这种移码可能是疾病驱动因素和/或可能的治疗靶标。如本文所公开的，存在许多其中可能发生疾病相关移码突变的微卫星。例如，移码可以在选自ASTE1、ACVR22、TAF1B、KIAA2018、SLC22A9和TGFBR2的任何基因中的微卫星中。优选地，移码发生在ASTE1或TGFBR2的微卫星中。

在本发明的另一个方面，提供了用于检测双链DNA分子的靶序列中包含的微卫星中的突变的试剂盒，其中所述突变是与相应的野生型微卫星序列相比微卫星的移码，并且其中所述试剂盒包含本发明的第一引物和第二引物，其中第二引物被配置为在DNA分子的与第一引物被配置为在其上退火的链相反的链上微卫星3'下游处的靶序列退火。

换句话说，这提供了用于本发明的检测方法的引物对。

在一些实施方案中，移码突变位于TGFBR2基因中的微卫星中并且包含根据SEQ IDNO:20的残基270至278的序列，其中第一引物包含由SEQ ID NO:3、4、5、7或39中任一项定义的序列，和/或第二引物包含SEQ ID NO:2定义的序列。应当理解，术语“包含”的使用还包括由上面列出的序列组成的引物。本文公开的数据证明这些引物在本发明的范围内特别可用于检测TGFBR2内的微卫星(也称为a9，其中a10是野生型微卫星)中的移码突变。然而，可选地，移码突变可以在ASTE1基因的微卫星中，并且第一引物则可以包含由SEQ ID NO:11至16中任一项定义的序列和/或第二引物包含由SEQ ID NO:10定义的序列。在一些实施方案中，移码突变位于ASTE1基因的微卫星中并且包含根据SEQ ID NO:33的残基328至337的序列，其中第一引物包含由SEQ ID NO:15、31、40或41定义的序列，和/或第二引物包含SEQ IDNO:10定义的序列。

在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含第三引物，其中第三引物被配置为在第二引物被配置为退火的区域的5'上游退火，并且其中第三引物被配置为与与第一引物相同的链和与第二引物相反的链退火或所述试剂盒包含另一对照引物对。例如，在移码突变位于TGFBR2基因的微卫星中并且包含根据SEQ ID NO:19的残基270至278的序列的实例中，则第三引物可包含根据SEQ ID NO:1的序列。在其中移码突变位于ASTE1基因的微卫星中的实例中，则第三引物可包含根据SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:38的序列。

对照引物对可以理解为用试剂盒进行的任何DNA扩增的阳性对照，以确定DNA扩增已成功进行，使得例如用本发明的引物检测不到移码突变可以确认样品中不存在移码，而不是DNA扩增本身的错误或失败。对照引物对可以是能够扩增已知存在于样品中的靶序列(例如移码突变和野生型序列之间的保守序列)的任何引物对。代替单独的对照引物对，第三引物可以与本发明的第二引物一起用于相同目的(即阳性对照)。

优选地，含有野生型微卫星的序列包含SEQ ID NO:19中定义的序列。如上所述，这是TGFBR2中的微卫星，其中可以发生与疾病相关的突变，例如胃癌(GC)和结直肠癌(CRC)。在一些实施方案中，含有野生型微卫星的序列包含SEQ ID NO:32中定义的序列。这是ASTE1中的微卫星，其中可以发生与疾病例如子宫内膜癌和胃癌相关的突变。

还优选地，第三引物包含由SEQ ID NO：1定义的序列。同样，应当理解，术语“包含”的使用还包括由该序列组成的引物。如本文所述，这是引物的合适实例，其可用作用于检测TGFBR2中的a10微卫星的阳性对照引物对的一部分，并且根据下文公开的实验数据证明其成功发挥作用。在一些实施方案中，引物包含由SEQ ID NO:11定义的序列。这是一个合适的引物示例，其可用作阳性对照引物对的一部分，用于检测ASTE1中的a11微卫星，并在图18中证明其可以成功发挥作用。

在一些实施方案中，包含具有移码突变的微卫星的靶序列包含根据SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的残基270至278的序列。如上所述，这是TGFBR2中的移码微卫星，其可以是与胃癌(GC)和结直肠癌(CRC)等疾病有关。在一些实施方案中，包含具有移码突变的微卫星的靶序列包含根据SEQ ID NO:33的残基328至337的序列。如上所述，这是ASTE1中的移码的微卫星，其可以与疾病相关，例如胃癌(GC)和子宫内膜癌。

优选地，该试剂盒进一步包括使用说明书。

在一些实施方案中，试剂盒进一步包含用于进行DNA扩增的组分。这些组分对于熟悉DNA扩增技术的技术人员来说是众所周知的，包括聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温应用(LAMP)、基于核酸序列的扩增(NASBA或3SR)、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)和连接酶链式反应(LCR)。技术人员将知道，这样的组分可以单独提供，或者可以作为所需组分的“预混物”作为商业产品购买。

任选地，这些组分可以包括缓冲液、dNTP和/或Taq聚合酶。例如，该缓冲液可以作为10×缓冲液提供，并且dNTP可以以10mM浓度提供。在一些实施方案中，缓冲液包含铵(NH₄ ⁺)离子并且任选地可以作为1×缓冲液提供。在一些实施方案中，缓冲液是Key缓冲液，任选地是1×Key缓冲液。

在本发明的另一个方面，提供了用于DNA扩增的引物，其包含SEQ ID NO:3、4、5、7、15、31、39、40或41中任一项所定义的序列。再次，应当理解，术语“包含”的使用还包括由上面列出的序列组成的引物。如上所述，本文公开的数据证明这些引物在本发明的范围内特别可用于检测TGFBR2内的微卫星(也称为a9，其中a10是野生型微卫星)中和ASTE1内的微卫星(也称为a10，其中a11是野生型微卫星)中的移码突变。或者，引物可包含由SEQ ID NO:11至16、31、40和41中任一项定义的序列。再次，应当理解，术语“包含”的使用还包括由上面列出的序列组成的引物。

在本发明的进一步的方面，提供了使用上述详述引物中的任一项用于检测双链DNA分子的靶序列中所含的微卫星中的突变的方法，其中所述突变是与相应的野生型微卫星序列相比微卫星的移码。该方法包括：

a)提供包含人DNA的第一等分样品，

b)向第一等分试样中加入DNA扩增所需的组分、第一引物和第二引物以形成第一反应混合物；其中除了一到四个或一到三个与含有具有移码突变的微卫星的靶序列错配，并且也与含有野生型微卫星的相应序列错配的核苷酸外，所述第一引物适合于检测包含在双链DNA分子的靶序列中的微卫星中的突变并且包含与含有具有移码突变的微卫星的靶序列互补的核苷酸区域；并且第二引物被配置为与微卫星3’下游的靶序列退火；

其中第一引物被配置成与DNA分子的有义链退火，并且第二引物被配置为与DNA分子的反义链退火，或者第一引物被配置为与DNA分子的反义链退火，并且第二引物被配置为与DNA分子的有义链退火，

c)对第一反应混合物进行DNA扩增，

如上所述，DNA扩增可以包括聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温应用(LAMP)、基于核酸序列的扩增(NASBA或3SR)、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)和连接酶链式反应(LCR)。然而，优选使用的DNA扩增是PCR。

优选地，DNA扩增在高严格条件下进行。如上所述，高严格性条件是扩增次优的条件，使得反应仅允许与靶序列具有非常高水平匹配的成功DNA扩增。换句话说，DNA扩增的条件是次优的，因此与靶序列匹配度较低的引物无法退火。这种次优条件可以通过改变温度、循环数、离子强度和允许核酸序列配对的某些有机溶剂的存在中的一项或多项来产生。特别地，这可以包括其中PCR的退火步骤在比反应的推荐退火温度高至少2％、5％或10％的温度下进行。或者，PCR的退火步骤在比推荐的反应退火温度高至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃的温度下进行。在一些实施方案中，PCR的退火步骤在比反应的推荐退火温度高4℃的温度下进行。在一些实施方案中,退火步骤在温度44℃,44.5℃,45℃,45.5℃,46℃,46.5℃,47℃,47.5℃,48℃,48.5℃,49℃,49.5℃,50℃,50.5℃,51℃,51.5℃,52℃,52.5℃,53℃,53.5℃,54℃,54.5℃,55℃,55.5℃,56℃,56.5℃,57℃,57.5℃,58℃,58.5℃,59℃,59.5℃,60℃,60.5℃或61℃下进行。在一些实施方案中，退火步骤在54℃和61℃之间的温度下进行，优选在56℃和60℃之间，更优选在56℃和59℃之间或在56°和58℃之间进行，并且优选其中移码在TGFBR2基因的微卫星中。在一些实施方案中,退火步骤在温度56.0℃,56.1℃,56.2℃,56.3℃,56.4℃,56.5℃,56.7℃,56.8℃,56.9℃,57.0℃,57.1℃,57.2℃,57.3℃,57.4℃,57.5℃,57/6℃,57.7℃,57.8℃,57.9℃或58.0℃下进行，并且优选地移码在TGFBR2基因的微卫星中。在一些实施方案中，退火步骤在57℃的温度下进行，并且优选移码在TGFBR2基因的微卫星中。在一些实施方案中，退火步骤在44℃和58℃之间的温度下进行，优选在45℃和58℃之间或在45℃和56℃之间，更优选在45℃和54.5℃之间，并且优选地其中移码在ASTE1基因的微卫星中。在一些实施方案中,退火步骤是在温度48℃,48.5℃,49℃,49.5℃,50℃,50.5℃,51℃,51.5℃,52℃,52.5℃,53℃,53.5℃,54℃,54.5℃,55℃,55.5℃,56℃,56.5℃,57℃,57.5℃或58℃下进行的，并且优选地其中移码在ASTE1基因的微卫星中。在一些实施方案中，退火步骤是在温度44.5℃,45℃,45.5℃,46℃,46.5℃,47℃,47.5℃,48℃,48.5℃,49℃,49.5℃,50.0℃,50.5℃,51.0℃,51.5℃,52.0℃,52.5℃,53.0℃,53.5℃,54.0℃,54.5℃,55.0℃,55.5℃,56.0℃,56.5℃,57.0℃或57.5℃下进行的，并且优选地其中移码在ASTE1基因的微卫星中。

在一些实施方案中,退火步骤是在温度56.0℃,56.1℃,56.2℃,56.3℃,56.4℃,56.5℃,56.7℃,56.8℃,56.9℃,57.0℃,57.1℃,57.2℃,57.3℃,57.4℃,57.5℃,57.6℃,57.7℃.57.8℃.57.9℃或58.0℃下进行的，并且第一引物包含由SEQ ID NO:3、4、5、7或39，优选SEQ ID NO:3或39定义的序列。在这些实施方案中的一些实施方案中，退火步骤在57℃的温度下进行。

在一些实施方案中,退火步骤是在温度48℃,48.5℃,49℃,49.5℃,50℃,50.5℃,51℃,51.5℃,52℃,52.5℃,53℃,53.5℃,54℃,54.5℃,55℃,55.5℃或56℃下进行的，并且第一引物包含由SEQ ID NO:15或40定义的序列。优选地，退火步骤是在温度50℃,50.5℃,51℃,51.5℃,52℃,52.5℃或53℃下进行的。

在一些实施方案中,退火步骤是在温度44.5℃,45℃,45.5℃,46℃,46.5℃,47℃,47.5℃,48℃,48.5℃,49℃,49.5℃,50.0℃,50.5℃,51.0℃,51.5℃,52.0℃,52.5℃,53.0℃,53.5℃,54.0℃,54.5℃,55.0℃,55.5℃,56.0℃,56.5℃,57.0℃,57.2℃或57.5℃下进行的，并且第一引物包含由SEQ ID NO:31或41定义的序列。优选地，退火步骤是在温度45℃,45.5℃,46℃,46.5℃,47℃,47.5℃或48℃下进行的。

另外或替代地，高严格条件可包括使用比反应推荐浓度更低的缓冲液浓度，例如反应中缓冲液推荐浓度的10％、20％、30％、40％、50％、60％或75％。在一些实施方案中，低于推荐缓冲液浓度的缓冲液浓度可以小于0.1×、0.2×、0.3×、0.4×、0.5×、0.6×或0.75×。在一些实施方案中，一个或多个反应混合物中缓冲液的最终浓度为0.1×至2×、0.1×至1.5×、0.1×至1×、0.2×至1×、0.3×至1×、0.4×至1×或0.5×至1×之间。在一些实施方案中，一个或多个反应混合物中缓冲液的终浓度是0.5×、0.6×、0.7×、0.8×、0.9×、1×、1.5×或2×。

另外或替代地，高严格条件可以包括在反应中使用更严格的缓冲液，例如包含铵离子(NH₄ ⁺)的缓冲液。在一些实施方案中，以标准浓度例如1×使用包含铵(NH₄ ⁺)离子的缓冲液。在一些实施方案中，以最终浓度1×至2×，优选1×使用包含铵(NH₄ ⁺)离子的缓冲液(即，在一个或多个反应混合物中)。在一些实施方案中，包含铵(NH₄ ⁺)离子的缓冲液是Key缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液是1×Key缓冲液。

在一些实施方案中，缓冲液包含钾离子(K⁺)。在一些实施方案中，包含钾(K⁺)离子的缓冲液以0.5×至1×、优选0.5×或1×的终浓度使用。在一些实施方案中，缓冲液是标准Taq缓冲液(KCl)。

在一些实施方案中，一个或多个反应混合物中正向引物和反向引物中的每一个的最终浓度独立地在0.1μM和1μM之间、在0.1μM和0.5μM之间、在0.1μM和0.4μM之间、在0.1μM和0.4μM之间、或在0.1μM和0.3μM之间。在一些实施方案中，一个或多个反应混合物中正向引物和反向引物中的每一个的终浓度独立地为0.1μM、0.2μM或0.3μM，优选0.2μM。

在一些实施方案中，一个或多个反应混合物中dNTP的最终浓度为50μM至500μM、50μM至400μM、50μM至300μM、100μM至300μM、100μM至200μM、150μM至300μM或150μM至250μM。在一些实施方案中，一个或多个反应混合物中dNTP的终浓度为100μM、150μM、200μM、250μM或300μM，优选200μM。

高严格条件可另外或替代地包括减少PCR中的循环数，例如与30、35或40个循环相比，进行25个循环、20个循环、15个循环或甚至10个循环。在一些实施方案中，进行30个或更少、25个或更少、20个或更少、15个或更少、或10个或更少的PCR循环。在一些实施方案中，使用这些高严格条件中的一种以上。优选地，进行30或25个PCR循环。

在一些实施方案中，推荐的退火温度由市售获得的引物的制造商提供。技术人员知道许多公开可用的工具用于计算给定引物的推荐退火温度。技术人员还知道，可以通过从针对特定引物给出的T_m(熔化温度)减去3、4、5或6℃来计算推荐的退火温度。在一个实施方案中，引物的推荐退火温度比反应条件下引物的T_m低4℃。例如，T_m计算器由New England(可在http://tmcalculator.neb.com/#！/main找到)或Thermo Fisher(可在https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/tm-calculator.html找到)。根据Allawi和SantaLucia，1997，Thermo Fischer/>提供的T_m计算器也称为改进的Allawi和SantaLucia方法。

反应混合物的推荐缓冲液浓度为1×。例如，在一些实施方案中，将5μl的10×缓冲液添加至反应混合物中至50μl的最终体积。在一些实施方案中，缓冲液包含铵(NH₄ ⁺)离子。在一些实施方案中，缓冲液是Key缓冲液。

在一些实施方案中，退火温度为至少57℃并且缓冲液包含钾(K⁺)离子。优选地，缓冲液是标准Taq(KCl)缓冲液。在这些实施方案中，微卫星中的移码突变优选在TGFBR2基因中(即，靶序列是在微卫星中具有移码突变的TGFBR2)。

包含人DNA的样品可以是可从患者获得的任何样品，例如，样品可以是体液、组织或细胞。样品也可以是液体活检组织，例如含有游离于细胞DNA的血浆。

在一些实施方案中，该方法还包括：

a)还向在该方法的步骤b)的第一等分试样中添加：

II)对照引物对，形成第一反应混合物，

当使用第二和第三引物或对照引物对进行DNA扩增产生扩增产物时，检测DNA扩增已成功进行；或者

b)提供包含人DNA的第二等分样品，向第二等分样品中添加用于DNA扩增的必要组分以及：

I)第一引物和第三引物，其中第三引物，其中第三引物被配置为在第二引物被配置为退火的区域的5'上游退火，并且其中第三引物被配置为与与第一引物相同的链和第二引物的相反链退火或

II)对照引物对，和

对第二反应混合物进行DNA扩增，当第二反应混合物的DNA扩增产生扩增产物时，检测DNA扩增已成功进行。

在一些实施方案中，第一引物是上述本发明的引物，因此具有上述任何特征。例如，在一些实施方案中，第一引物被配置为在具有移码突变的微卫星的长度退火，并且与具有移码突变的微卫星5'端侧翼的至少两个核苷酸和/或3'端侧翼的至少两个核苷酸退火。第一引物可以与具有移码突变的微卫星一端或两端侧翼的至少三个、四个或五个核苷酸退火。在一些实施方案中，第一引物不在相应野生型微卫星序列的长度上退火，并且第一引物的3'端不与含有野生型微卫星的相应序列退火。这提供了以下优点：第一引物与含有具有移码突变的微卫星的序列退火，但不与具有野生型微卫星的相应序列退火。在一些实施方案中，第一引物与具有移码突变的微卫星3'端侧翼的1个、2个或3个、优选2个或3个核苷酸退火(即，相对于第一引物，第一引物包含微卫星3'的2个或3个核苷酸，该引物与包含具有移码突变的微卫星的对应序列退火)。在一些实施方案中，这两个或三个核苷酸形成GC夹。在一些实施方案中，第一引物在具有移码突变的微卫星的长度上，并且在具有移码突变的微卫星的3'退火，相对于第一引物，第一引物由两个或三个核苷酸组成，该核苷酸与具有移码突变的微卫星侧翼的核苷酸退火。这提供了以下优点：与含有具有移码突变的微卫星的序列退火的第一引物可以在5'至3'方向延伸，从而允许含有具有移码突变的微卫星的序列的复制。具有移码突变的微卫星3'端侧翼的核苷酸如上所述。

在一些实施方案中，相对于第一引物，第一引物与具有移码突变的微卫星5'端侧翼的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个核苷酸退火。在一些实施方案中，相对于第一引物，第一引物的至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％的核苷酸与具有移码突变的微卫星5'端侧翼的核苷酸退火。在一些实施方案中，相对于第一引物，与具有移码突变的微卫星5'端侧翼的核苷酸退火的第一引物部分也与含有野生型微卫星的相应序列退火。这提供了第一引物对所需靶序列具有特异性的优点。具有移码突变的微卫星5'端侧翼的核苷酸进一步如上所述。

在一些实施方案中，引物中的每一个由16至30个核苷酸组成。优选地，引物由16至25个核苷酸组成。还优选地，引物由17至24个、或17至23个核苷酸组成。也就是说，引物中的每一个独立地由16至30个核苷酸组成。优选地，引物中的每一个独立地由1至25个核苷酸组成。还优选地，引物中的每一个独立地由17至24个核苷酸组成。引物的其他优选的长度如上所述。

在一些实施方案中，至少一个错配的核苷酸位于在微卫星的3'下游或微卫星内退火的第一引物的位置。优选地，所有错配的核苷酸均位于在微卫星3'下游或微卫星内退火的第一引物的位置。在一些实施方案中，所有错配的核苷酸都位于在微卫星内退火的第一引物的位置。至少一种错配的其他优选位置如上所述。

在一些实施方案中，第一引物中的至少一个错配的核苷酸位于微卫星3'端的5'上游或3'下游的三个核苷酸内。优选地，第一引物中的所有错配的核苷酸位于微卫星3'端的5'上游或3'下游的三个核苷酸内。

在一些实施方案中，第一引物中的至少一个错配的核苷酸是胸腺嘧啶(T)被腺嘌呤(A)置换、腺嘌呤(A)被鸟嘌呤(G)置换、胸腺嘧啶(T)被胞嘧啶(C)置换或胞嘧啶(C)被鸟嘌呤(G)置换。

在一些实施方案中，该DNA扩增是聚合酶链式反应(PCR)，其中PCR包括变性、退火和延伸的多个循环。

在一些实施方案中，一个或多个反应混合物包含1x缓冲液(或0.5x缓冲液)、0.4mMdNTP、0.2μM正向引物和0.2μM反向引物。在一些实施方案中，缓冲液包含铵(NH₄ ⁺)离子，并且优选是Key缓冲液。

在一些实施方案中，所述方法还包括步骤d)，其还包括在凝胶上运行PCR反应的产物并显示条带以确认DNA扩增已成功。

这种方法可以目视确认PCR反应是否已成功生成扩增子(即从样品中扩增目标序列)。技术人员熟知如何运行这样的凝胶，并且这通常涉及将PCR反应物与染料混合，将其加载到基于琼脂糖的凝胶上，在凝胶上进行电泳，使得染色的PCR反应物向凝胶的正端迁移，形成一条可见的带。与可能需要几天才能提供结果的常规测序方法相比，这提供了优点，因为该PCR方法可以在几个小时甚至不到一个小时内进行。因此，该方法具有以下优点：可以以更快的速度向临床医生或患者提供临床相关的发现(即给定疾病中相关突变的存在)。

在进一步的实施方案中，该方法还包括步骤f)切出条带用于DNA测序。如上所述在凝胶上进行PCR反应物的优点是可以从凝胶上切下条带并根据技术人员已知的技术进行处理，从而可以对其进行测序。测序不是必需的，但这可以进一步确认移码突变确实存在于样品中。

如本文所公开的，存在许多其中可能发生疾病相关移码突变的微卫星。例如，移码可以在选自ASTE1、ACVR22、TAF1B、KIAA2018、SLC22A9和TGFBR2的任何基因中的微卫星中。在一些实施方案中，移码突变发生在TGFBR2或ASTE1的微卫星中。

在一些实施方案中，移码突变位于TGFBR2基因的微卫星中并且靶序列包含根据SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的残基270至278的序列，并且第一引物包含由SEQ ID NO:3、4、5、7或39中任一项定义的序列，和/或第二引物包含SEQ ID NO:2定义的序列。在一些实施方案中，移码突变位于ASTE1基因的微卫星中并且靶序列包含根据SEQ ID NO:33的残基328至337的序列，并且第一引物包含由SEQ ID NO:15、33、40或41定义的序列，和/或第二引物包含SEQ ID NO:10定义的序列。

在一些实施方案中，微卫星位于TGFBR2基因中，包含野生型微卫星的序列包含根据SEQ ID NO:19的序列，并且第三引物包含由SEQ ID NO:1定义的序列。在一些实施方案中，微卫星位于ASTE1基因中，包含野生型微卫星的序列包含根据SEQ ID NO:32的序列，并且第三引物包含由SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:38定义的序列。如上所述，本文公开的数据证明这些引物在本发明的范围内特别可用于检测TGFBR2内的微卫星(也称为a9，其中a10是野生型微卫星)或ASTE1内的微卫星中的移码突变。

在一些实施方案中，样品是包含游离于细胞DNA的液体活检组织，优选地其中液体活检组织是血浆或血清。或者，样品是活检组织。优选地，样品获自人类。来自液体活检组织的检测是特别有利的，因为这样的活检组织很容易从患者获得并且通常比例如肿瘤活检组织更容易提取DNA，肿瘤活检组织可能是坏死的和/或具有可变的DNA含量，使得分析更加困难。如前所述，肿瘤通常是异质的，因此肿瘤活组织可能不能代表整个肿瘤，而只能代表取样的部分。液体活检组织通过提供代表性样品克服了这个问题。

在一些实施方案中，该方法还包括如果在步骤d)中在来自患者的样品中检测到移码突变，则确定患有与移码突变相关的疾病或病症的患者适合靶向所述移码突变的治疗。优选地，与移码突变相关的疾病或病症是癌症。

在一些实施方案中，所述疾病或病症是结直肠癌(CRC)、胃癌(GC)或Lynch综合征，并且靶向移码突变的治疗是FMPV-1，其中移码突变位于TGFBR2基因的微卫星中并且包含根据SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的残基270至278的序列。在一些实施方案中，所述疾病或病症是子宫内膜癌或胃癌并且靶向移码突变的治疗是FMPV-2，其中移码突变突变位于ASTE1基因的微卫星中并且包含根据SEQ ID NO:33的残基328至337的序列。

优选地，该方法还包括用FMPV-1或FMPV-2治疗患者的步骤e)。FMPV-1是如WO2020/239937A1中描述的肽疫苗，其通过引用并入本文。FPMV-1也称为fsp2。FMPV-2是如WO2021/239980中描述的肽疫苗，其通过引用并入本文。FMPV-2也称为fsp8。

任选地，第三引物或另一对照引物对也可以用于从样品中扩增DNA，以便为本发明的检测方法提供阳性对照。在一些实施方案中，微卫星位于TGFBR2基因中，包含野生型微卫星的序列包含根据SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:34的序列或由其组成，并且其中第三引物包含由SEQ ID NO:1定义的序列。在一些实施方案中，微卫星位于ASTE1基因中，包含野生型微卫星的序列包含根据SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:36的序列或由其组成，并且第三引物包含由SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:38定义的序列。

在一些实施方案中，第一引物包含SEQ ID NO:3、4、5、7、15、31、39或40中任一项定义的序列，和/或第二引物包含SEQ ID NO:2或10定义的序列。

在本发明的另一个方面，提供了诊断与微卫星移码突变相关的疾病的方法，包括实施根据本发明的方法中的任一个。如上所述，微卫星移码突变与许多疾病有关，包括但不限于：Lynch综合征、囊性纤维化、克罗恩病和癌症，所述癌症包括结肠癌、胃癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肝胆道癌、泌尿道癌、脑癌和皮肤癌。特别地，可以在许多基因中检测到与癌症相关的微卫星移码突变，包括但不限于：ASTE1、ACVR22、TAF1B、KIAA2018、SLC22A9和TGFBR2。

在上述方法的任一项中，优选样品是包含游离于细胞DNA的液体活检组织，优选地其中液体活检组织是血浆。

在上述方法的任一项中，优选DNA扩增是PCR，并且PCR在高严格条件下进行，任选地其中高严格条件包括以下中的至少一个：

a)在比推荐的反应退火温度高至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃的温度下进行PCR的退火步骤，优选地在53℃和60℃之间的温度下；

b)每个循环仅进行PCR的退火步骤30秒，优选15秒；

c)在小于0.1×、0.2×、0.3×、0.4×、0.5×、0.6×或0.75×的缓冲液浓度下进行DNA扩增；

d)在包含铵离子的缓冲液中进行DNA扩增；

e)将PCR的循环数减少至25、20、15或10个循环，任选地30个或更少、25个或更少、20个或更少、15个或更少、或者10个或更少的循环。高严格条件可以是上述那些中的任一项。

例如，在一些实施方案中，高严格条件包括在比推荐退火温度高至少4℃的温度下进行退火步骤，和/或在包含铵(NH₄ ⁺)离子的缓冲液中进行DNA扩增，和/或进行每个循环15秒的PCR退火步骤，和/或将PCR的循环数减少至25或更少。在一些实施方案中，高严格条件包括在比推荐退火温度高至少4℃的温度下、优选在比推荐退火温度高4℃的温度下进行退火步骤，在包含1×浓度的铵(NH₄ ⁺)离子的缓冲液中进行DNA扩增，优选地，其中缓冲液是Key缓冲液，进行PCR的退火步骤15秒，和将PCR的循环数减少至25。

在一些实施方案中，高严格条件包括在包含钾(K⁺)离子的缓冲液、优选标准Taq(KCl)缓冲液中在58℃的温度下进行退火步骤。在这些实施方案中，优选微卫星中的移码突变位于TGFBR2中。

现在将在以下非限制性实验实施例中展示本发明。

实施例I-设计用于检测移码突变的TGFBR2的引物

引物设计通常遵循特定规则，以确保单个、特定扩增子(片段)的理想产量。大多数时候，即使在区分高度相似的序列时，这些规则也很容易遵循。然而，在区分微卫星中的移码的情况下，由于唯一的差异是微卫星的长度(一个核苷酸差异)，因此这是不适用的。卫星的侧翼区域在两种DNA变体中具有完全相同的序列，使得它们之间的引物亲和力接近相等。反过来，这单独地是定义检测测试时需要克服的最大障碍，因为引物设计被锁定到这个精确的序列/区域-不可能过多地改变参数。因此，设计突变体检测引物时使用的策略是与野生型序列产生错配，并以这种方式诱导足够的排斥力并阻止引物与野生型DNA退火。

在一系列14项实验中，设计并测试了一组用于检测移码突变的TGFBR2的PCR引物(表1)。最初设计并测试了第一组引物用于TGFBR2DNA的扩增。根据之前实验的结果，对引物进行了优化并重新测试。将分别包含野生型和突变体微卫星a10和a9的合成TGFBR2 DNA片段用于PCR设置(分别为SEQ ID NO：19和20)。

表1

实施例II–测试引物的功能性

前两个引物(P1和P2)充当检测测试的阳性对照，以确保结果可靠并满足运行PCR的所有标准(对照中没有信号＝PCR不成功)。此外，阳性对照确保存在执行TGFbR2变体检测/测定所需的cfDNA(循环游离DNA)的正确长度和序列。P1–P2衍生的扩增子(249bp)包含所有其他设计的引物靶标(相应序列)，并且不是突变体特异性的。

突变体引物(P4、P5、P6和P10)以TGFbR2突变体变体为主要靶标进行设计，并包含9A微卫星序列。仅通过使用较短的9A序列而不是10A，野生型和引物的3'端之间就会存在错配。通过在引物P4、P6和P10的这一端引入单核苷酸置换(随机选择)，可以增强错配排斥。扩增子(102bp–169bp)与对照引物之一在结合中产生。

为了确定PCR反应所需的模板DNA量，使用NEB(New England BioLabs)的方案和计算的温度，使用不同量的模板DNA，在标准PCR条件下进行PCR测试。这些测试运行的结果可以在图1所示的电泳凝胶中看到。

特别是，我们发现，即使是非常少量的模板(少于2pg，如图1B所示)，也能在凝胶中实现良好的产率和高分辨率条带。此外，扩增子具有正确的预期长度，显示出高特异性。

结果发现，所有引物均具有功能，在标准PCR条件下成功扩增9a微卫星(突变体)和10a微卫星(野生型)模板DNA(见表2)，将每个引物与P2(或本例中P2与P1配对)。这些PCR反应的产物用DNA染色，并在预制的琼脂糖-TAE混合物(2％)上运行，在100V下进行电泳约20至30分钟，直到运行前沿到达凝胶末端。电泳结果表明，两种模板DNA类型均成功扩增，所有泳道中均可见强条带。然而，引物不能区分包含移码突变(9a)的微卫星(突变体)和不包含移码突变的微卫星(10a)(野生型)。

实施例III-在次优条件下测试P4(高度严格)

因此，使用更严格的PCR条件重复了该实验方法，使用略高的53℃退火温度，以及仅25个较少的循环(参见表2)。这种条件变化的结果是，不含移码突变的微卫星(10a)(野生型)扩增较少，这在图2中可以通过引物P4的带大小减小而清楚地看到，其中10a模板中的信号明显减少。

然后使用P2和P4引物在比图2所示的实验更严格的条件下重复实验，将退火温度进一步提高至55℃，并将退火和延伸步骤分别缩短15秒和20秒。这些条件如下表2所示。这些条件进一步改善了10a模板(野生型)和9a模板(突变体)之间的区别，野生型模板的条带极弱，几乎看不见，如图所示3。P5没有发现同样的情况，即使在严格条件下，使用该引物也没有发现10a模板(野生型)和9a模板(突变体)之间的区别(数据未显示)。

表2

实施例IV-在次优条件下测试P4、P6和P10(更严格)

同样，为了使用引物区分突变体(9a)和野生型(10a)模板DNA，按照表3使用更严格的PCR条件，并使用更高的退火温度和更短的退火步骤。另外，每个引物对进行两次PCR反应，一次以标准缓冲液浓度进行，一次以低缓冲液浓度(降低至标准浓度的50％)进行。在此特定实验中仅检查使用P6和P10的引物对。如图4所示，其中低缓冲液浓度的样品用星号(*)标记，这导致仅在突变体中使用P10引物的低缓冲液溶液浓度的样品中产生清晰的强带，而不是在野生型模板中。

表3

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为了优化突变模板中设计的引物的扩增，使用突变模板DNA(9a)在许多不同条件下使用P4、P6和P10(以及P1作为阳性对照)进行了进一步的实验。

特别是，在图5A-C所示的实验中，分别使用了55℃、56℃和58℃的退火温度，如下表4所示。同样，在图5A-6C所示的实验中，“低”缓冲液浓度(用星号*表示)包含约为标准缓冲液浓度50％的缓冲液浓度。可以看出，在图5B和5C中看到了更强的信号，特别是在低缓冲液浓度下。值得注意的是，P6引物在此显示出扩增，证实了先前实验中缺乏扩增是由于人为错误造成的假设。

表4

/>

使用引物对在60℃的更高退火温度(见下表5)和在标准缓冲液浓度和低缓冲液浓度下进行进一步的PCR反应(图6)。在标准缓冲液浓度和低缓冲液浓度下，在对照(P1)中均观察到强信号。

这种较高的退火温度允许引物P6与引物P2组合选择性扩增突变体模板，而没有检测到野生型模板的扩增，这可以在图6A中看到。

此外，在相同条件下也进行了三个引物反应，如图6B所示。三个引物反应包含P1、P2以及P4、P6或P10，预计会在249bp和102bp处看到两条带。在低缓冲液浓度反应中没有看到信号，并且在标准缓冲液浓度反应中仅看到单个条带。

再次使用相同的条件(根据表5)进行进一步的PCR反应，但还包括引物P4(图7)。在这些实验中，发现在标准缓冲液浓度中看到来自阳性对照(P1)的强条带，而在低缓冲液浓度中看到较弱的条带。在标准缓冲液浓度下，在突变体和野生型模板中都可以看到P10的扩增，但是在低缓冲液浓度下，突变体模板中可以看到P10的扩增，而野生型模板中则看不到(图7)。因此，发现低缓冲液浓度下的P10对野生型序列没有亲和力。

同样，在相同条件下进行三个引物反应，并且在该实验中，虽然在低缓冲液浓度下仅检测到一条弱带，但在标准缓冲液浓度中看到两条带(一强一弱)。

表5

实施例V-测试引物P4.1、P4.2和P10.1的功能性

按照上述实施例，还通过与引物P2配对并进行PCR(条件详述于下面的表6中)然后进行凝胶电泳(如图8所示)也来测试由引物P4和P10进一步修饰的其他引物P4.1、P4.2和P10.1。该实验表明，所有这三种引物均具有功能，因为它们针对突变体(9a)和野生型(10a)模板均显示出扩增，如图8所示，显示了很强的条带。相对于野生型模板中的等效条带，可以看到突变体模板中P4.1的条带显著减少。

表6

实施例VI-在更严格的PCR条件下测试候选引物

为了使用引物区分突变体(9a)和野生型(10a)模板，使用两种不同类型的缓冲液进行PCR反应：不含铵离子的标准Taq缓冲液和包含铵离子(NH₄ ⁺)的Key缓冲液)。

首先，使用Taq缓冲液或Key缓冲液对突变体模板进行PCR反应，条件如表7所示，并在电泳凝胶上进行，如图9A所示。结果发现，无论使用哪种缓冲液，都可以看到相对均匀的信号强度，但引物P4.2除外，其中Key缓冲液中的反应显示出最小的信号。

然后以稍高的退火温度重复这些反应(再次如表7所示)，并在电泳凝胶上运行，如图9B所示。该实验显示的结果与图9A中所见的结果相当，但与Key缓冲液中的引物P10.1反应产生的信号显著降低。在本实验中，与引物P4.2反应产生的信号更加明显。

一些含有Key缓冲液和Taq缓冲液的PCR样品产生的信号之间的直接差异表明引物/模板相互作用的稳定性受到很大影响。设计的引物和野生型DNA之间存在大量错配可能会导致消除这些样品使用Key缓冲液产生的扩增子。从结果可以明显看出，无论缓冲液变体如何，几种突变体模板DNA和引物样品都具有相同的信号强度，并且预计这些样品中仍然存在相互作用并且产生扩增子，而野生型模板具有减少的引物退火。对照引物似乎不受缓冲液变体和测试温度的影响。由于两次实验中含有P4.2和Key缓冲液的样品不一致，表明P4.2原液(stock)是较差的条件。

表7

在与表7中所示的图9A相同的条件下，使用引物P4、P4.1、P4.2和P6与P2组合对突变体和野生型模板DNA两者进行进一步的实验。这些反应也在电泳凝胶上进行，如图10所示。图10A中的反应在标准Taq缓冲液中进行，图10B中的反应在含有铵离子(NH₄ ⁺)的Key缓冲液中进行。

在含有标准Taq缓冲液的样品中，有足够的扩增子产生，以通过各种引物和模板产生强条带(图10A)。含有Key缓冲液的样品显示缺乏引物退火，因此产物产量如某些引物/模板组合中的弱/消失条带所示(图10B)。对于突变体模板DNA，P6的功能性大大降低。至于野生型模板DNA，P4、P6中存在功能丧失，P4.2中存在片段化/性能降低。

然后在略高的59℃退火温度下重复实验，并在电泳凝胶上运行，如图11所示，标准Taq缓冲液中的反应如图11A所示，Key缓冲液中的反应如图11B所示。正如之前的实验所示，无论模板DNA是什么，所有样品都在凝胶上产生了强信号。观察以突变DNA作为模板和Key缓冲液的样品，在该组合中唯一不产生扩增子(或产生少量)的引物是P6。使用野生型DNA模板和Key缓冲液，在使用P4.2和P6的样品中观察到弱/消失的条带。

从图10和11的结果来看，很明显Key缓冲液(铵，NH₄ ⁺)具有显著的去稳定作用，可防止(选定的)引物与模板DNA退火。此外，温度的轻微变化对(退火中)功能的丧失或增强起着重要作用。由于与突变体序列相比，设计的引物与野生型序列作为模板DNA组合时固有地会存在更多错配，因此Key缓冲液的影响明显更高。引物/模板退火在更广泛的参数范围内对突变体TGFβR2序列保持功能。

实施例VII-来自MSI-结直肠癌患者的液体活检组织的游离于细胞DNA(cfDNA)中TGFbR2a10→a9移码突变的检测

方法

使用cfDNA提取试剂盒(Plasma/Serum Cell-Free Circulating DNAPurification Mini Kit，货号55100，www.norgenbiotek.com)从患者血浆样品中提取cfDNA。患者样品购自Indivumed GmbH(www.indivumed.com)，并且均在个体患者-T0(基线)治疗的同一时间点采集。患者患有结直肠癌(CRC)、MSI-H或MSS，年龄在42-73岁之间。

i)cfDNA测序

通过使用高保真聚合酶(OneTaq DNA聚合酶，New England Biolabs，www.international.neb.com)和标准条件，使用1×OneTaq缓冲液(KCl)进行PCR，对血浆样品中存在的cfDNA片段进行测序。高保真聚合酶具有3'-5'核酸外切酶活性，并确保正确合成微卫星的序列，其中聚合酶由于单核苷酸重复次数较多而容易“滑动”。使用合成的TGFβR2模板DNA作为对照(野生型(与SEQ ID NO:19相同的序列)和9a突变体变体(与SEQ ID NO:20相同的序列))，以验证微卫星的测序数据是正确的并且电泳凝胶的读出与已知序列相比是一致的。用于测序目的的PCR中使用的引物是P1和P2。

PCR条件如表8所示。

表8热循环条件(OneTaq)

使用凝胶电泳纯化PCR产物。从凝胶上切下具有正确长度的片段\扩增子的条带，并使用凝胶提取试剂盒(VWR peqGOLD Gel Extraction Kit，货号13-2500-01，www.vwr.com)进行提取。然后将提取的PCR产物送去测序，由Eurofins Genomics(www.eurofinsgenomics.eu)进行测序。

ii)突变的TGFβR2 cfDNA的检测

使用表10中的条件，通过PCR扩增来自患者血浆样品的cfDNA以及作为对照的合成的野生型和a9突变体TGFβR2(SEQ ID NO:19和20)。引物P1和P2用于阳性对照，引物P2和P4用于突变的TGFβR2的检测，如表9所示。在表9中，“引物”栏仅表示使用P1还是P4，因为所有管中都使用引物P2。在“样品”一栏，“synth”表示使用合成的DNA而不是从患者血浆样品中获得的cfDNA用作模板(即对照样品)。使用的缓冲液是1×Key缓冲液((NH ₄)₂SO₄)。PCR产物进行凝胶电泳，然后测序。

表9

表10热循环条件

步骤	温度	时间
			初始变性	95℃	30秒
变性(25个循环)	95℃	15秒
			退火(25个循环)	56℃	15秒
延伸(25个循环)	68℃	45秒。
			最终延伸	68℃	5分钟
保持	4℃	-

结果

TGFbR2 DNA存在于所有测试的CRC患者(10/10)的cfDNA中。使用引物进行PCR扩增，然后进行凝胶电泳，结果表明所有(5/5)MSI-CRC患者中均存在TGFbR2 a10→a9移码，而测试的MSS-CRC患者中则没有(0/5)(图12)。通过对从电泳凝胶中提取的正确大小的PCR产物进行测序证实了这些结果。测序的PCR产物包含整个a9/a10微卫星(如相关)，并且测序数据显示与PCR结果相对应。

使用选定的a9建模引物(P4)进行PCR产生的PCR产物仅可在电泳凝胶上清楚地检测到来自MSI-CRC患者的cfDNA(5/5)。TGFbR2cfDNA片段足够长，可以包含微卫星和对照引物对退火的区域(250bp)。

结果表明，TGFbR2 a10→a9移码DNA存在于MSI-CRC患者的液体活检组织的cfDNA中，这建立了游离于细胞的TFGbR2移码DNA，作为早期检测遗传性CRC(Lynch综合征)以及监测癌症进展和散发性MSI-CRC缓解的潜在生物标志物。

从电泳凝胶中提取的每位患者的cfDNA序列如表11所示，微卫星的长度显示在每个序列末端的括号中。

表11

/>

实施例VIII-不同退火温度下TGFbR2 a10→a9移码突变的检测

i)温度梯度PCR 1(参数调整)

该实验的目的是建立引物对仅对突变体DNA模板而非野生型DNA模板有效退火的温度范围。

使用合成的DNA(突变体(F1)和野生型(F2))作为PCR模板，引物为P2和P4。PCR条件如表12-14所示，每管的PCR管布局和退火温度如表15所示。退火温度范围为54℃至60℃。

表12-管1-8PCR主混合物

表13-管9-16PCR主混合物

表14-热循环条件

表15-PCR管布局和退火温度

图13显示了PCR产物的电泳凝胶。很明显，与引物-突变体模板相比，引物-野生型模板相互作用在约57.8℃及以上的温度范围内最弱。此外，在大约59℃时，引物-野生型模板相互作用或多或少完全被破坏。引物-突变体模板相互作用仍然很强，即使在高温下引物仍然具有高亲和力。

ii)温度梯度PCR 2(参数调整)

进行该实验是为了进一步建立引物对仅对突变体DNA模板有效退火的温度范围。

与上述部分i)一样，合成的DNA(突变体(F1；SEQ ID NO：20)和野生型(F2；SEQ IDNO：19))用作PCR模板，采用引物P2和P4。PCR条件如表16-18所示，每管的PCR管布局和退火温度如表19所示。退火温度范围为57℃至62℃。

表16-管1-8PCR主混合物

表17-管1-9PCR主混合物

表18-热循环条件

表19-PCR管布局和退火温度

图14显示了PCR产物的电泳凝胶，并且显示即使在低于上文i)部分中提到的57.8℃的温度下，引物-野生型模板相互作用被破坏，并且引物的亲和力接近不存在。特别地，图14显示引物-野生型模板相互作用在57℃下被破坏。然而，与相同条件下相比，引物对突变体模板的亲和力仍然很强。

实施例IX-使用标准Taq(KCl)缓冲液检测TGFbR2 a10→a9移码突变

进行该实验是为了评估包含标准Taq缓冲液(KCl)的PCR混合物中引物的功效。合成的DNA(突变体(F1)和野生型(F2))用作PCR模板。引物P1和P4各自与引物P2一起使用。表20和21列出了PCR条件，每管使用的引物和缓冲液列于表22中。

表20-标准Taq缓冲液的PCR条件

表21-热循环条件

表22-管设置

管	引物	模板	体积	缓冲液
					1	P1	F1	1μL	Taq
2	P4	F1	1μL	Taq
					3	P1	F2	1μt	Taq
4	P4	F2	1μL	Taq

图15显示了PCR产物的电泳凝胶，并表明，对于在整个热循环仪的高、均匀、温度下，标准Taq缓冲液是稳定的，产生了保留了引物突变体模板亲和力的条件。引物-野生型模板亲和力丧失，相互作用被破坏至产生最少量片段的程度。

实施例X-ASTE1 a11→a10移码突变的检测

以与实施例I的TGFβR2引物类似的方式设计用于检测突变的ASTE1的一组PCR引物。

引物P11和P12分别是阳性对照正向和反向引物，它们与野生型和突变体ASTE1序列两者退火。这些引物可检测ASTE1的存在，无论是否存在a11至a10移码突变(即P11和P12不是突变体特异性的)，并确保结果可靠并满足运行PCR的所有标准(无来自对照的信号＝PCR不成功)。

ASTE1突变体引物以突变体ASTE1为主要靶标设计，每个引物都含有a10微卫星序列。与实施例I和II中的TGFβR2引物一样，较短的10a序列而不是野生型11a序列在野生型ASTE1和引物的3'端之间引入错配。通过在微卫星的3'引物中引入一至四个错配(随机选择的核苷酸置换)，引物和野生型ASTE1序列之间的错配排斥得到加强。

使用与实施例VIII类似的方案测试ASTE1引物P16和P24，以建立引物仅对突变体DNA模板而非野生型DNA模板有效退火的温度范围。阳性对照反向引物P12也在一定温度范围内使用。所有实验中均使用引物P11作为阳性引物。包含野生型(a11)或突变体(a10)微卫星的合成的ASTE1DNA片段用于PCR设置(分别称为F4和F3；分别为SEQ ID NO：32和33)。

用于每个PCR的PCR主混合物示于下表23中，而PCR条件示于表24中。每个PCR使用不同的退火温度，如表25-27和图16-18中所示。所有PCR均使用标准(KCl)缓冲液。P11用作所有PCR的正向引物。

表23-PCR主混合物

表24-热循环条件

表25-引物P16的PCR退火温度

P16-突变体(F3)孔数	P16-WT(F4)孔数	退火温度(℃)
			1	1	48
2	2	48.7
			3	3	50
4	4	51.9
			5	5	54.3
6	6	56.3
			7	7	57.4
8	8	58

表26-引物P24的PCR退火温度

表27-引物P12的PCR退火温度

P12-F3孔数	P12-F4孔数	退火温度(℃)
			1	1	49
2	2	49.2
			3	3	49.6
4	4	50.2
			5	5	50.9
6	6	51.5
			7	7	51.8
8	8	52

结果

图16-18显示了使用不同退火温度的这些PCR的结果。特别地，这些图显示基于a10突变体ASTE1设计的引物(即P16和P24)对a10突变体ASTE1具有特异性，并且当ASTE1野生型为模板时产生低得多的PCR产物或不产生PCR产物。图18显示P12可用于扩增野生型和a10突变体ASTE1两者，使得其可用作阳性对照引物。

参考文献

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Allawi HT,SantaLucia J(1997)Thermodynamics and NMR of internal G-Tmismatches in DNA.Biochemistry 36(34),p10581-10594.

表28-序列

(粗体下划线碱基表示与靶序列错配)

SEQ ID NO：19-野生型TGFbR2(a10)片段；F2

SEQ ID NO：20-突变体TGFbR2(a9)片段；F1

SEQ ID NO：32-野生型ASTE1(a11)片段；F4

/>

SEQ ID NO：33-突变体ASTE1(a10)；F3

SEQ ID NO：34-野生型(a10)TGFBR2(全长)

/>

SEQ ID NO：35-a9 TGFBR2(全长)

/>

SEQ ID NO：36-野生型(A11)ASTE1(全长)

/>

SEQ ID NO：37-a10 ASTE1(全长)

/>

Claims

1.用于检测双链DNA分子的靶序列中所含微卫星突变的引物，其中所述突变是与相应野生型微卫星序列相比的所述微卫星的移码，并且其中除了所述引物包括1至4个、或1至3个与微卫星中包含所述突变的靶序列错配并且也与包含野生型微卫星的相应序列错配的核苷酸外，所述引物包含至少10个核苷酸的区域，所述区域与含有具有移码突变的微卫星的DNA分子的反义链或有义链的靶序列互补，并且其中引物被配置为在具有移码突变的微卫星的长度上退火并且与具有移码突变的微卫星的5'端侧翼的至少一个核苷酸或至少两个核苷酸，和具有移码突变的微卫星的3'端侧翼的至少一个核苷酸退火。

2.权利要求1的所述引物，其中所述引物由16至30个核苷酸组成。

3.权利要求1或2的所述引物，其中至少一个错配的核苷酸位于被配置为在所述微卫星的3'下游或所述微卫星内退火的引物中的位置，优选地其中至少一个错配的核苷酸在微卫星3'端的5'上游或3'下游的四个核苷酸内。

4.用于检测双链DNA分子的靶序列中所含微卫星突变的试剂盒，其中所述突变是与相应野生型微卫星序列相比的所述微卫星的移码，并且其中所述试剂盒包含第一引物以及第二引物，所述第一引物为根据权利要求1至3中任一项所述，其中所述第二引物被配置为在DNA分子的与第一引物被配置为在其上退火的链相反的链上的微卫星3'下游处的靶序列退火。

5.权利要求4的所述试剂盒，其中所述试剂盒还包括：

第三引物，其中所述第三引物被配置为在第二引物被配置为退火的区域的5'上游退火，并且其中所述第三引物被配置为与与第一引物相同的链和与第二引物相反的链退火，或

另一对照引物对，优选地，其中含有野生型微卫星的序列由SEQ ID NO:19或SEQ IDNO:32中定义的序列组成，并且优选地，所述第三引物包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:38定义的序列。

6.用于DNA扩增的引物，其包含SEQ ID NO:3、4、5、7、15、31、39、40或41中任一项定义的序列。

7.用于检测双链DNA分子的靶序列中所含的微卫星中的突变的方法，其中所述突变是与相应的野生型微卫星序列相比的所述微卫星的移码，并且所述方法包括：

a)提供包含人DNA的第一等分样品，

b)向第一等分样品中添加DNA扩增所需的组分、第一引物和第二引物，以形成第一反应混合物；

其中所述第一引物适合于检测双链DNA分子的靶序列中包含的微卫星中的突变，并且除了与含有具有移码突变的微卫星的靶序列错配，并且也与含有野生型微卫星的相应序列错配的一至四个或一至三个核苷酸外，包含与含有具有移码突变的微卫星的靶序列互补的核苷酸的区域，并且其中所述第一引物被配置为在具有移码突变的微卫星的长度上退火，并且与具有移码突变的微卫星的3'端侧翼的至少一个核苷酸和具有移码突变的微卫星的5'端侧翼的至少一个核苷酸或至少两个核苷酸退火；

并且其中所述第二引物被配置为与微卫星3'下游的靶序列退火；

其中所述第一引物被配置为与DNA分子的有义链退火，并且所述第二引物被配置为与DNA分子的反义链退火，或者所述第一引物被配置为与DNA分子的反义链退火，并且所述第二引物被配置为与DNA分子的有义链退火，

c)对第一反应混合物进行DNA扩增，

d)当第一反应混合物的DNA扩增产生扩增产物时，检测样品中移码突变的存在。

8.权利要求7的所述方法，其进一步包括:

a)还向在所述方法的步骤b)的第一等分样品中添加：

I)第二引物和第三引物，其中所述第三引物被配置为在第二引物被配置为退火的区域的5'上游退火，并且其中所述第三引物被配置为与与第一引物相同的链和与第二引物的相反链退火，或

II)对照引物对，以形成第一反应混合物，

b)提供包含人DNA的第二等分样品并向所述第二等分样品中添加用于DNA扩增的必要组分以及：

II)对照引物对，以形成第二反应混合物，和

对第二反应混合物进行DNA扩增，当第二反应混合物的DNA扩增产生扩增产物时，检测到DNA扩增已成功进行。

9.权利要求7或8的所述方法，其中所述DNA扩增是聚合酶链式反应(PCR)，其中所述PCR包括变性、退火和延伸的多个循环。

10.权利要求9的所述方法，其中步骤d)还包括在凝胶上运行PCR反应的产物并显示条带以确认DNA扩增已经成功，优选地其中所述方法还包括步骤f)切掉条带用于DNA测序。

11.权利要求4或5的所述试剂盒，或权利要求7至10中任一项的所述方法，其中：

所述移码突变位于TGFBR2基因的微卫星中并且靶序列包含根据SEQ ID NO:19的残基270至278的序列，并且其中所述第一引物包含由SEQ ID NO:3、4、5、7或39中任一项定义的序列，和/或第二引物包含SEQ ID NO:2定义的序列；或

移码突变位于ASTE1基因的微卫星中并且靶序列包含根据SEQ ID NO:33的残基328至337的序列，并且其中所述第一引物包含由SEQ ID NO:15、31、40或41定义的序列，和/或所述第二引物包含SEQ ID NO:10定义的序列。

12.权利要求8的所述方法，其中：

微卫星位于TGFBR2基因中，包含野生型微卫星的序列包含根据SEQ ID NO:19的序列，并且其中所述第三引物包含由SEQ ID NO:1定义的序列；或

微卫星位于ASTE1基因中，包含野生型微卫星的序列包含根据SEQ ID NO:32的序列，并且其中所述第三引物包含由SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:38定义的序列。

13.诊断与微卫星中移码突变相关的疾病的方法，包括实施权利要求7至12中任一项的方法。

14.权利要求7的所述方法，进一步包括如果在步骤d)中在来自患者的样品中检测到移码突变，则确定患有与移码突变相关的疾病或病症的患者适合靶向所述移码突变的治疗，优选地，其中与移码突变相关的疾病或病症是癌症，并且更优选地，其中所述癌症是结直肠癌或胃癌，并且靶向移码突变的治疗是FMPV-1，并且移码突变位于TGFBR2基因的微卫星中并且包含根据SEQ ID NO:19的残基270至278的序列，或者所述癌症是子宫内膜癌或胃癌并且靶向所述移码突变的治疗是FMPV-2，并且所述移码突变位于ASTE1基因的微卫星中并且包含根据SEQ ID NO:33的残基328至337的序列。

15.权利要求14的所述方法，其中：

所述微卫星位于TGFBR2基因中，包含野生型微卫星的序列包含根据SEQ ID NO:19的序列，并且其中所述第三引物包含SEQ ID NO:1定义的序列，优选地其中所述第一引物包含SEQ ID NO:3、4、5、7或39中任一项定义的序列，和/或所述第二引物包含SEQ ID NO:2定义的序列；或者

所述微卫星位于ASTE1基因中，包含野生型微卫星的序列包含根据SEQ ID NO:32的序列，并且其中所述第三引物包含由SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:38定义的序列，优选地其中所述第一引物包含由SEQ ID NO:15、31、40或41定义的序列，和/或所述第二引物包含SEQID NO:10定义的序列。

16.权利要求7至15中任一项的方法，其中，所述样品是包含游离于细胞DNA的液体活检组织，优选地其中所述液体活检组织是血浆。

17.权利要求7至16中任一项的所述方法，其中所述DNA扩增是PCR，并且所述PCR在高严格条件下进行，任选地其中所述高严格条件包括以下中的至少一项：

b)每个循环仅进行PCR的退火步骤30秒，优选15秒；

d)在包含铵离子的缓冲液中进行DNA扩增；和

e)进行30个或更少、25个或更少、20个或更少、15个或更少、或10个或更少的PCR循环。