CN117778451A - 转OmpU基因工程微藻免疫罗非鱼溶藻弧菌病的方法 - Google Patents
转OmpU基因工程微藻免疫罗非鱼溶藻弧菌病的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117778451A CN117778451A CN202311799527.0A CN202311799527A CN117778451A CN 117778451 A CN117778451 A CN 117778451A CN 202311799527 A CN202311799527 A CN 202311799527A CN 117778451 A CN117778451 A CN 117778451A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ompu
- gene
- ang
- alg
- tilapia
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 119
- 241000276707 Tilapia Species 0.000 title claims abstract description 50
- 206010047400 Vibrio infections Diseases 0.000 title claims abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 title claims description 7
- 101150055431 ompU gene Proteins 0.000 title description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 title description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 22
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 18
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000001018 virulence Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000007938 immune gene expression Effects 0.000 claims abstract description 6
- 241000607594 Vibrio alginolyticus Species 0.000 claims description 29
- 241000544286 Vibrio anguillarum Species 0.000 claims description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 17
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 4
- XJOTXKZIRSHZQV-RXHOOSIZSA-N (3S)-3-amino-4-[[(2S,3R)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S,3S)-1-[[(1R,6R,12R,17R,20S,23S,26R,31R,34R,39R,42S,45S,48S,51S,59S)-51-(4-aminobutyl)-31-[[(2S)-6-amino-1-[[(1S,2R)-1-carboxy-2-hydroxypropyl]amino]-1-oxohexan-2-yl]carbamoyl]-20-benzyl-23-[(2S)-butan-2-yl]-45-(3-carbamimidamidopropyl)-48-(hydroxymethyl)-42-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-59-(2-methylsulfanylethyl)-7,10,19,22,25,33,40,43,46,49,52,54,57,60,63,64-hexadecaoxo-3,4,14,15,28,29,36,37-octathia-8,11,18,21,24,32,41,44,47,50,53,55,58,61,62,65-hexadecazatetracyclo[32.19.8.26,17.212,39]pentahexacontan-26-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](Cc1cnc[nH]1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@@H]4CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](Cc5ccccc5)NC(=O)[C@@H](NC1=O)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](Cc1cnc[nH]1)NC3=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N2)C(=O)NCC(=O)N4)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XJOTXKZIRSHZQV-RXHOOSIZSA-N 0.000 claims description 3
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims description 3
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 3
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 claims description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 claims description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 3
- 102000018511 hepcidin Human genes 0.000 claims description 3
- 108060003558 hepcidin Proteins 0.000 claims description 3
- 229940066919 hepcidin Drugs 0.000 claims description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 claims description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 3
- 101150021331 toxR gene Proteins 0.000 claims description 3
- GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethyl-3-[[methyl-[2-[methyl-[[1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]indol-3-yl]methyl]amino]ethyl]amino]methyl]chromen-4-one;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1OC2=CC(C)=C(C)C=C2C(=O)C=1CN(C)CCN(C)CC(C1=CC=CC=C11)=CN1C1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 abstract description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 8
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 abstract description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 abstract description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 abstract description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 3
- 241000195649 Chlorella <Chlorellales> Species 0.000 description 48
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 3
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 3
- 241000195585 Chlamydomonas Species 0.000 description 2
- 241000195597 Chlamydomonas reinhardtii Species 0.000 description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 2
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 2
- 241000195663 Scenedesmus Species 0.000 description 2
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 2
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 101150007902 ASPA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000143060 Americamysis bahia Species 0.000 description 1
- 241000195652 Auxenochlorella pyrenoidosa Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241001474374 Blennius Species 0.000 description 1
- 101100281119 Brachyspira hyodysenteriae flaA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000007091 Chlorella pyrenoidosa Nutrition 0.000 description 1
- 240000009108 Chlorella vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000007089 Chlorella vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930188224 Cryptophycin Natural products 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000276701 Oreochromis mossambicus Species 0.000 description 1
- 101100120228 Pseudomonas aeruginosa fliC gene Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 description 1
- 241000376029 Tachysurus fulvidraco Species 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 108010006226 cryptophycin Proteins 0.000 description 1
- PSNOPSMXOBPNNV-VVCTWANISA-N cryptophycin 1 Chemical compound C1=C(Cl)C(OC)=CC=C1C[C@@H]1C(=O)NC[C@@H](C)C(=O)O[C@@H](CC(C)C)C(=O)O[C@H]([C@H](C)[C@@H]2[C@H](O2)C=2C=CC=CC=2)C/C=C/C(=O)N1 PSNOPSMXOBPNNV-VVCTWANISA-N 0.000 description 1
- PSNOPSMXOBPNNV-UHFFFAOYSA-N cryptophycin-327 Natural products C1=C(Cl)C(OC)=CC=C1CC1C(=O)NCC(C)C(=O)OC(CC(C)C)C(=O)OC(C(C)C2C(O2)C=2C=CC=CC=2)CC=CC(=O)N1 PSNOPSMXOBPNNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 208000010824 fish disease Diseases 0.000 description 1
- 101150071682 flaA gene Proteins 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000009364 mariculture Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 101150057202 ompW gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 1
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种表达载体，其含有V.alg‑OMPU基因编码区或V.ang‑OMPU基因编码区。本发明采用V.alg‑OMPU基因、V.ang‑OMPU基因等作为抗原免疫基因，提供抗原表达载体转化微藻，喂养水产动物，能够有效免疫溶藻弧菌病，提高机体免疫力，促进生长和饲料转化，同时具备环境友好和生物生态安全性，减少抗生素用量。例如将含有V.alg‑OMPU基因或V.ang‑OMPU基因的转基因微藻喂养罗非鱼，能够有效提高罗非鱼对溶藻弧菌病的免疫力，提高罗非鱼体内免疫基因表达，降低毒力基因表达，而且还能促进罗非鱼生长，提高罗非鱼饲料转化率。
Description
技术领域
本发明涉及鱼类疾病防控领域，具体涉及转OmpU基因工程微藻免疫罗非鱼溶藻弧菌病的方法。
背景技术
溶藻弧菌是水产养殖中最常见的细菌性疾病，其常爆发于海水养殖、半咸水养殖中，甚至在淡水养殖中亦常检测到溶藻弧菌的存在，在温度适宜时即会大量繁殖，会感染鱼类、贝类、虾类等水产动物的体表及肠道，水产动物感染后发病快、死亡率高，是养殖中危害最严重的疾病之一。
水产养殖业对于溶藻弧菌的治疗多用抗生素、消毒剂等，这些药剂的大量使用会导致环境污染、导致菌株产生耐药性以及危害食品安全。目前养殖中对于溶藻弧菌所用的免疫预防手段多为灭活疫苗及口服疫苗，灭活疫苗的注射并不适用于幼鱼，也不方便大规模接种。口服疫苗载体不同，常用的益生菌、真菌，并不便于长期的储存。因此需要一种方便大规模使用并且便于生产储存的口服疫苗。
微藻本身则具有大量的蛋白质、色素、多种脂肪酸和淀粉，其脂肪含量远高于一些大型藻类，是鱼虾蟹幼体开口阶段最好的饵料之一。饲料中添加适量微藻，对多种水产动物均有促生长、增强抗病力、提高幼体成活率及改善体色、肉色等效果，有助于水产动物生长发育。
本发明将V.alg-OMPU基因和V.ang-OMPU基因等作为抗原免疫基因，可用于免疫水产动物溶藻弧菌病，具有环境友好的特色和较高的商业应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供转OmpU基因工程微藻免疫罗非鱼溶藻弧菌病的方法。
本发明的第一个方面是提供一种表达载体，所表达载体含有V.alg-OMPU基因编码区或V.ang-OMPU基因编码区。
所述V.alg-OMPU基因为溶藻弧菌V.alg-OMPU基因(GenBank登录号：FJ176404.1)或与溶藻弧菌V.alg-OMPU基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
所述V.ang-OMPU基因为鳗弧菌V.ang-OMPU基因(GenBank登录号：CP031492.1)或与鳗弧菌V.ang-OMPU基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
其中，所述原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体采用PCAMBIA1302载体，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒、或者病毒等。
优选地，所述原始载体为PCAMBIA1302载体，V.alg-OMPU基因编码区或V.ang-OMPU基因编码区位于PCAMBIA1302载体的NcoⅠ和SpeⅠ两限制性内切酶位点之间。
本发明第二个方面是提供一种转基因微藻，其由本发明第一个方面所述的表达载体转化微藻制备而成，且所述微藻为水产动物可食用的微藻。
优选地，所述微藻为衣藻(例如莱茵衣藻等)、小球藻(例如核蛋白小球藻、普通小球藻等)、栅藻或团藻等。
优选地，所述水产动物为罗非鱼。
本发明第三个方面是提供添加有本发明第二个方面所述的转基因微藻的饲料。
所述饲料为水产动物可食用的饲料。
本发明的第四个方面是提供V.alg-OMPU基因和/或V.ang-OMPU基因、或者本发明第一个方面所述表达载体、或者本发明第二个方面所述转基因微藻、或者本发明第三个方面所述饲料在制备防治水产动物中溶藻弧菌所致病害的制剂中的应用。
所述V.alg-OMPU基因为溶藻弧菌V.alg-OMPU基因或与溶藻弧菌V.alg-OMPU基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
所述V.ang-OMPU基因为鳗弧菌V.ang-OMPU基因或与鳗弧菌V.ang-OMPU基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
优选地，所述水产动物为罗非鱼。
本发明的第五个方面是提供V.alg-OMPU基因和/或V.ang-OMPU基因、或者本发明第一个方面所述表达载体、或者本发明第二个方面所述转基因微藻、或者本发明第三个方面所述饲料在提高罗非鱼体内免疫基因表达和/或降低罗非鱼体内毒力基因表达中的应用。
所述免疫基因包括IgM和/或MHCⅡ和/或C type lysozyme和/或Hepcidin和/或IL-1β和/或IFN-γ和/或TNF-α和/或IL-6和/或IL-8。
所述毒力基因包括Tlh和/或toxR和/或Collagenase和/或AspA和/或FlaA和/或OmpW。
所述V.alg-OMPU基因为溶藻弧菌V.alg-OMPU基因或与溶藻弧菌V.alg-OMPU基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
所述V.ang-OMPU基因为鳗弧菌V.ang-OMPU基因或与鳗弧菌V.ang-OMPU基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
本发明的第六个方面是提供V.alg-OMPU基因和/或V.ang-OMPU基因、或者本发明第一个方面所述表达载体、或者本发明第二个方面所述转基因微藻、或者本发明第三个方面所述饲料在促进罗非鱼生长和/或提高罗非鱼饲料转化率中的应用。
所述V.alg-OMPU基因为溶藻弧菌V.alg-OMPU基因或与溶藻弧菌V.alg-OMPU基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
所述V.ang-OMPU基因为鳗弧菌V.ang-OMPU基因或与鳗弧菌V.ang-OMPU基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
本发明的第七个方面是提供一种转基因工程微藻免疫罗非鱼溶藻弧菌病的方法，采用本发明第二个方面所述转基因微藻或本发明第三个方面所述的饲料喂食罗非鱼。
本发明采用V.alg-OMPU基因、V.ang-OMPU基因等作为抗原免疫基因，提供PCAMBIA1302/V.alg-OMPU、PCAMBIA1302/V.ang-OMPU等抗原表达载体转化微藻，喂养水产动物，能够有效免疫溶藻弧菌病，提高机体免疫力，促进生长和饲料转化，同时具备环境友好和生物生态安全性，减少抗生素用量。例如将含有V.alg-OMPU基因或V.ang-OMPU基因的微藻喂养罗非鱼，能够有效提高罗非鱼对溶藻弧菌病的免疫力，提高罗非鱼体内免疫基因表达，降低毒力基因表达，而且还能促进罗非鱼生长，提高罗非鱼饲料转化率。
附图说明
图1为PCAMBIA1302/V.alg-OMPU、PCAMBIA1302/V.ang-OMPU表达载体的构建。
图2为重组藻株PCR鉴定。Lane1：PCAMBIA1302/V.alg-OMPU表达载体质粒；Lane2：转PCAMBIA1302/V.alg-OMPU小球藻；Lane3：PCAMBIA1302/V.ang-OMPU表达载体质粒；Lane4：转PCAMBIA1302/V.ang-OMPU小球藻。
图3为喂食重组小球藻的罗非鱼存活率。(+)control：饲喂普通饲料注射生理盐水；(-)control：饲喂普通饲料；Hoc5：饲喂hoc5混合饲料；1302：饲喂转PCAMBIA1302 hoc5混合饲料；V.alg-OMPU：饲喂转PCAMBIA1302/V.alg-OMPU重组小球藻混合饲料；V.ang-OMPU：饲喂转PCAMBIA1302/V.ang-OMPU重组小球藻混合饲料。
图4-图12为饲喂7、14天后罗非鱼体内免疫基因表达。control：饲喂普通饲料；Hoc5：饲喂hoc5混合饲料；1302：饲喂转PCAMBIA1302 hoc5混合饲料；V.alg-OMPU：饲喂转PCAMBIA1302/V.alg-OMPU重组小球藻混合饲料；V.ang-OMPU：饲喂转PCAMBIA1302/V.ang-OMPU重组小球藻混合饲料。
图13为攻毒后第3天罗非鱼体内毒力基因表达。control：饲喂普通饲料；Hoc5：饲喂hoc5混合饲料；1302：饲喂转PCAMBIA1302 hoc5混合饲料；V.alg-OMPU：饲喂转PCAMBIA1302/V.alg-OMPU重组小球藻混合饲料；V.ang-OMPU：饲喂转PCAMBIA1302/V.ang-OMPU重组小球藻混合饲料。
图14为喂食不同饲料后罗非鱼的生长状况。control：饲喂普通饲料；1302：饲喂转PCAMBIA1302 hoc5混合饲料；V.alg-OMPU：饲喂转PCAMBIA1302/V.alg-OMPU重组小球藻混合饲料；V.ang-OMPU：饲喂转PCAMBIA1302/V.ang-OMPU重组小球藻混合饲料。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
供试罗非鱼：中国热带农业科学院生物技术研究所B402微藻实验室饲养，培养环境为40L玻璃水箱、温度26(±1)℃、12小时的黑暗/12小时的光照周期，包括每个周期开始和结束时的1小时黄昏期。
实施例1抗原表达载体PCAMBIA1302/V.alg-OMPU、PCAMBIA1302/V.ang-OMPU构建方法
生工生物工程(上海)股份有限公司人工合成两端分别带有NcoⅠ酶切位点和SpeⅠ酶切位点的溶藻弧菌V.alg-OMPU基因序列(如SEQ ID NO.1所示)和鳗弧菌V.ang-OMPU基因序列(如SEQ ID NO.2所示)，并将合成的序列经NcoⅠ、SpeⅠ两个酶切位点克隆进质粒PCAMBIA1302，得到抗原表达载体PCAMBIA1302/V.alg-OMPU、PCAMBIA1302/V.ang-OMPU，结果见图1。
实施例2表达载体PCAMBIA1302/V.alg-OMPU、PCAMBIA1302/V.ang-OMPU转化小球藻
通过电击转化法(电击条件：MODE为HV，VOLTAGE为0905V，PLENGTH为0.22MS，PULSES为90，INTERVAL为200ms，POLARITY为UNIPOLAR)将表达载体PCAMBIA1302/V.alg-OMPU、PCAMBIA1302/V.ang-OMPU分别转化小球藻，采用含潮霉素的TAP培养进行筛选。共得到53株转PCAMBIA1302/V.alg-OMPU小球藻藻株，72株转PCAMBIA1302/V.ang-OMPU小球藻藻株。
提取重组小球藻DNA，针对PCAMBIA1302载体设计引物，经PCR扩增条带符合预期的阳性藻株多株，表明获得PCAMBIA1302/V.alg-OMPU、PCAMBIA1302/V.ang-OMPU重组小球藻。部分结果见图2。
值得注意的是，除了本实施例中的小球藻外，还可以选用其他水产动物可食用藻类，比如衣藻(例如莱茵衣藻等)、小球藻(例如核蛋白小球藻，普通小球藻等)、隐藻、栅藻、团藻等，本发明此处仅以小球藻进行举例说明，并不起限定作用。根据实施方式的记载采用其他水产动物可食用藻类均可以实现和小球藻相同的效果，本发明在此不作赘述。
实施例3罗非鱼喂食实验
(1)喂食重组小球藻后罗非鱼对溶藻弧菌的免疫效果
为了检测口服PCAMBIA1302/V.alg-OMPU、PCAMBIA1302/V.ang-OMPU重组小球藻对罗非鱼溶藻弧菌是否具有免疫效果，以腹腔0.2ml溶藻弧菌(2.0×10^7CFU/ml)的罗非鱼为实验对象((+)control组腹腔注射生理盐水)，进行为期14天的饲喂实验，分别设立如下组别，每组35只罗非鱼：
(+)control：饲喂普通饲料，腹腔注射生理盐水；
(-)control：饲喂普通饲料；
Hoc5：饲喂hoc5小球藻混合饲料(普通饲料和hoc5小球藻比例：1：1)；
1302：饲喂转PCAMBIA1302 hoc5混合饲料(普通饲料和转PCAMBIA1302空载体hoc5小球藻比例：1：1)；
V.alg-OMPU：饲喂转PCAMBIA1302/V.alg-OMPU重组小球藻混合饲料(普通饲料和转PCAMBIA1302/V.alg-OMPU重组小球藻比例：1：1)；
V.ang-OMPU：饲喂转PCAMBIA1302/V.ang-OMPU重组小球藻混合饲料(普通饲料和转PCAMBIA1302/V.ang-OMP重组小球藻比例：1：1)
在同样的饲养环境下饲喂，与普通饲料、野生小球藻和转PCAMBIA1302空载体小球藻的对照组相比，饲喂PCAMBIA1302/V.alg-OMPU重组小球藻最终保护率(即存活率)为36.19％，饲喂PCAMBIA1302/V.ang-OMPU重组小球藻最终保护率为28.57％，而饲喂对照组(普通饲料、野生小球藻和转PCAMBIA1302载体小球藻)的保护率分别为0.00％、0.95％、2.86％。说明饲喂不同转基因小球藻对罗非鱼溶藻弧菌病有免疫作用(图3)。
(2)喂食重组小球藻后对罗非鱼免疫基因表达量的影响
为了检测饲喂抗原表达重组小球藻是否会提升罗非鱼免疫基因的表达水平，本实验取饲喂后第7、14天的罗非鱼的鳃部、肝脏、肠道、脾脏四个部位的总RNA，测定其免疫基因(IgM、MHCⅡ、C type lysozyme、Hepcidin、IL-1β、IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-8)(傅妤.黄颡鱼拟态弧菌OmpU亚单位疫苗免疫效果评价[D].华中农业大学,2021；杨洪帅.无乳链球菌浓度与水温对罗非鱼免疫相关基因转录水平的影响[D].广东海洋大学,2015；单丹.铜对吉富罗非鱼生理毒性及免疫相关基因表达影响的研究[D].上海海洋大学,2016)表达的差异。结果发现，与对照组相比饲喂PCAMBIA1302/V.ang-OMPU、PCAMBIA1302/V.ang-OMPU重组小球藻的罗非鱼免疫基因明显提升(图4-图12)。取攻毒后第3天罗非鱼内脏的总RNA，测定其毒力基因(Tlh、toxR、CollagenaseVA、AspA、FlaA、OmpW)(魏霜.溶藻弧菌及其毒力相关基因的检测[D].暨南大学,2014.)表达的差异。结果发现，与对照组相比饲喂PCAMBIA1302/V.ang-OMPU、PCAMBIA1302/V.ang-OMPU重组小球藻的罗非鱼毒力基因明显降低(图13)。说明PCAMBIA1302/V.ang-OMPU、PCAMBIA1302/V.ang-OMPU重组小球藻饲喂罗非鱼有效诱导免疫基因的表达，并抑制毒力基因的表达，呈正相关。统计有显著性差异*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。
(2)喂食重组小球藻后对罗非鱼生长的影响
免疫饲喂的第0天及第14天分别两次测量鱼的体重，每组随机选择5只罗非鱼，并测量他们的体重。根据下列方程，使用它们的平均值分析体重增加百分比(PWG)和料肉比(FCR)。PWG(％)＝(最终重量g-初始重量g)/初始重量g×100；FCR＝饲喂总量g/增重g。V.alg-OMPU组与V.ang-OMPU组的PWG(增重百分比)分别比对照组提高了8.35％、11.36％，饲料转化率也有所提升，V.alg-OMPU组与V.ang-OMPU组的料肉比分别为3.75、3.49(图14)。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (10)
1.一种表达载体，其特征在于，所表达载体含有V.alg-OMPU基因编码区或V.ang-OMPU基因编码区；
所述V.alg-OMPU基因为溶藻弧菌V.alg-OMPU基因或与溶藻弧菌V.alg-OMPU基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
所述V.ang-OMPU基因为鳗弧菌V.ang-OMPU基因或与鳗弧菌V.ang-OMPU基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的表达载体，所述表达载体的原始载体为PCAMBIA1302载体，V.alg-OMPU基因编码区或V.ang-OMPU基因编码区位于PCAMBIA1302载体的NcoⅠ和SpeⅠ两限制性内切酶位点之间。
3.一种转基因微藻，其特征在于，其由权利要求1或2所述的表达载体转化微藻制备而成，且所述微藻为水产动物可食用的微藻。
4.根据权利要求3所述的转基因微藻，其特征在于，所述水产动物为罗非鱼。
5.添加有权利要求3或4所述的转基因微藻的饲料。
6.V.alg-OMPU基因和/或V.ang-OMPU基因、或者权利要求1或2所述表达载体、或者权利要求3或4所述转基因微藻、或者权利要求5所述饲料在制备防治水产动物中溶藻弧菌所致病害的制剂中的应用；
所述V.alg-OMPU基因为溶藻弧菌V.alg-OMPU基因或与溶藻弧菌V.alg-OMPU基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列；所述V.ang-OMPU基因为鳗弧菌V.ang-OMPU基因或与鳗弧菌V.ang-OMPU基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述水产动物为罗非鱼。
8.V.alg-OMPU基因和/或V.ang-OMPU基因、或者权利要求1或2所述表达载体、或者权利要求3或4所述转基因微藻、或者权利要求5所述饲料在提高罗非鱼体内免疫基因表达和/或降低罗非鱼体内毒力基因表达中的应用；
所述免疫基因包括IgM和/或MHCⅡ和/或C type lysozyme和/或Hepcidin和/或IL-1β和/或IFN-γ和/或TNF-α和/或IL-6和/或IL-8；
所述毒力基因包括Tlh和/或toxR和/或Collagenase和/或AspA和/或FlaA和/或OmpW；
所述V.alg-OMPU基因为溶藻弧菌V.alg-OMPU基因或与溶藻弧菌V.alg-OMPU基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
所述V.ang-OMPU基因为鳗弧菌V.ang-OMPU基因或与鳗弧菌V.ang-OMPU基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
9.V.alg-OMPU基因和/或V.ang-OMPU基因、或者权利要求1或2所述表达载体、或者权利要求3或4所述转基因微藻、或者权利要求5所述饲料在促进罗非鱼生长和/或提高罗非鱼饲料转化率中的应用；
所述V.alg-OMPU基因为溶藻弧菌V.alg-OMPU基因或与溶藻弧菌V.alg-OMPU基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列；所述V.ang-OMPU基因为鳗弧菌V.ang-OMPU基因或与鳗弧菌V.ang-OMPU基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
10.一种转基因工程微藻免疫罗非鱼溶藻弧菌病的方法，其特征在于，采用权利要求3或4所述转基因微藻或权利要求5所述的饲料喂食罗非鱼。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311799527.0A CN117778451A (zh) | 2023-12-26 | 2023-12-26 | 转OmpU基因工程微藻免疫罗非鱼溶藻弧菌病的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311799527.0A CN117778451A (zh) | 2023-12-26 | 2023-12-26 | 转OmpU基因工程微藻免疫罗非鱼溶藻弧菌病的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117778451A true CN117778451A (zh) | 2024-03-29 |
Family
ID=90390184
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311799527.0A Pending CN117778451A (zh) | 2023-12-26 | 2023-12-26 | 转OmpU基因工程微藻免疫罗非鱼溶藻弧菌病的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117778451A (zh) |
-
2023
- 2023-12-26 CN CN202311799527.0A patent/CN117778451A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kibenge et al. | Countermeasures against viral diseases of farmed fish | |
| US20110158946A1 (en) | Methods and Compositions for control of disease in aquaculture | |
| Vinay et al. | Vibrio harveyi biofilm as immunostimulant candidate for high-health pacific white shrimp, Penaeus vannamei farming | |
| CN109689106A (zh) | 治疗虾类病毒感染的组合物和方法 | |
| Deachamag et al. | Expression of a phagocytosis activating protein (PAP) gene in immunized black tiger shrimp | |
| US20200063152A1 (en) | Algal based edible vaccines | |
| TR201814868T4 (tr) | Transgenik mikroalgler ve bunların, proteinlerin oral yolla alımına yönelik kullanımı. | |
| Ting et al. | Nile tilapia fry fed on antimicrobial peptide Epinecidin-1-expressing Artemia cyst exhibit enhanced immunity against acute bacterial infection | |
| Chen et al. | An oral nervous necrosis virus vaccine using Vibrio anguillarum as an expression host provides early protection | |
| Lanh et al. | Generation of microalga Chlamydomonas reinhardtii expressing VP28 protein as oral vaccine candidate for shrimps against White Spot Syndrome Virus (WSSV) infection | |
| CN102161974A (zh) | 哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的制备方法、应用以及表达该抗原的菌株 | |
| CN102776222B (zh) | 一种禽用融合型口服干扰素表达藻体的制备及其应用 | |
| CN102206257B (zh) | 迟钝爱德华氏菌免疫保护性抗原、相关表达载体、疫苗和应用 | |
| CN117778451A (zh) | 转OmpU基因工程微藻免疫罗非鱼溶藻弧菌病的方法 | |
| CN106047763A (zh) | 鳗弧菌o3血清型菌株及其应用 | |
| CN113667005B (zh) | 太平洋鳕干扰素-γ蛋白、基因、重组质粒、重组酵母工程菌及其应用 | |
| Wu et al. | Protection of a CpG-adjuvanted DNA vaccine against infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) nature infection in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) | |
| CN103589693B (zh) | 一种表达ibdv vp2和法氏囊素三肽嵌合蛋白重组火鸡疱疹病毒 | |
| CN109675024B (zh) | 一种草鱼细菌性败血症及赤皮病联合疫苗及其制备方法 | |
| CN114980750A (zh) | 用于抑制细菌毒素以治疗水生动物早期死亡综合征的系统、方法和组合物 | |
| CN101659958A (zh) | 一种多效价活疫苗、其制备方法及应用 | |
| Durvasula et al. | Paratransgenic approaches to the control of infections of shrimp: prospects for use of Dunaliella | |
| CN102274494A (zh) | 副溶血性弧菌类毒素疫苗的制备方法与用途 | |
| CN101525378B (zh) | 鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与应用 | |
| WO2012064181A1 (en) | A method for producing bio-active agent for the prevention of disease caused by white spot syndrome baculovirus complex and a bio-active agent derived thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |