CN117777316B - 一种虎斑乌贼内脏多糖的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于虎斑乌贼内脏多糖提取技术领域，具体涉及一种虎斑乌贼内脏多糖的制备方法及其应用。本发明通过斑乌贼内脏预处理、碱法提取、乙醇醇沉、脱蛋白、透析、干燥等步骤，最后得到虎斑乌贼内脏多糖粉末，原料来源丰富，生产成本低，制备工艺简单；并且所得多糖具有较好的降血脂和提高免疫的功效，能为海洋新型药品或功能性食品的研发提供理论依据和物质基础。
Description
技术领域
本发明属于虎斑乌贼内脏多糖提取技术领域。更具体地，涉及一种虎斑乌贼内脏多糖的制备方法及其应用。
背景技术
虎斑乌贼(Sepia pharaonis)隶属软体动物门(Mollusca)、头足纲(Cephalopoda)、十腕目(Decapoda)、乌贼科(Sepiidae)、乌贼属(Sepia)，主要分布在印度洋、西太平洋及我国的南海海域，常栖息于水深15～100m的地方，个体大，雄体可达5kg，因其营养丰富，口感良好，其已成为我国主要的水产加工原料。据统计，全国每年加工虎斑乌贼40～50万吨。虎斑乌贼内脏约占其体重的30％左右，并且其中含有大量蛋白质、脂质，牛磺酸、软骨素、多糖等活性物质，但是在虎斑乌贼产品加工过程中其内脏往往作为废弃物扔掉，造成极大的资源浪费。
现有研究表明乌贼多糖具有免疫增强、抗氧化、抗肿瘤以及抗菌防腐等生物活性。因此，将虎斑乌贼内脏进行综合利用，提取活性多糖，变废为宝，可以极大地提高虎斑乌贼的经济附加值。目前对于虎斑乌贼内脏多糖的研究较少，孙玉林等通过盐法提取虎斑乌贼内脏多糖，最终多糖得率为1.08％，且具有优异的抗氧化及吸吸湿保湿性能(孙玉林,罗琴琴,冯梓欣,文菁,赵娟,田丽,许乐乐,李永芹,李锐,陈道海.响应面法优化虎斑乌贼内脏多糖提取工艺及抗氧化活性、吸湿保湿性能研究[J].食品工业科技,2018,39(10):182-189.)，但其得率和活性均有限，有待开发更多活性，拓宽其应用渠道，增强经济效益。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术对虎斑乌贼内脏多糖得提取得率和活性有限的缺陷和不足，提供一种虎斑乌贼内脏多糖的制备方法，利用本发明所述制备方法制备得到的多糖得率较高，且免疫调节和降血脂活性较好。
本发明的目的是提供一种虎斑乌贼内脏多糖或本发明所述制备方法所得虎斑乌贼内脏多糖在制备具有降血脂作用药物中的应用。
本发明的另一目的是提供一种本发明所述制备方法所得虎斑乌贼内脏多糖在制备具有免疫调节作用药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种虎斑乌贼内脏多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.虎斑乌贼内脏除去脂溶性物质后，干燥，得虎斑乌贼内脏干粉；
S2.取步骤S1虎斑乌贼内脏干粉，在30～70℃下用0.1～0.5mol/L NaOH溶液浸提，沉淀过滤，浓缩，浓缩液醇沉，脱蛋白，透析，干燥，得虎斑乌贼内脏多糖。
优选地，步骤S2中，所述NaOH溶液的浓度为0.1～0.2mol/L；更优选地，所述NaOH溶液的浓度为0.2mol/L。
进一步地，步骤S2中，所述虎斑乌贼内脏干粉与NaOH溶液的质量体积比为1:10～30g/mL。
优选地，步骤S2中，所述虎斑乌贼内脏干粉与NaOH溶液的质量体积比为1:15～25g/mL；更优选地，所述虎斑乌贼内脏干粉与NaOH溶液的质量体积比为1:20g/mL。
优选地，步骤S2中，所述浸提温度为40～60℃；更优选地，所述浸提温度为50℃。
进一步地，步骤S2中，所述浸提的时间为1.5～3.5h。
优选地，所述浸提的时间为2～3h；更优选地，所述浸提的时间为2.5h。
进一步地，步骤S2中，所述醇沉的具体条件是：浓缩液中加乙醇至乙醇体积分数为70～80％，于4～8℃沉淀24～48h，离心，沉淀加水复溶。
优选地，步骤S2中，所述醇沉的具体条件是：浓缩液中加乙醇至乙醇体积分数为75％，于4沉淀24h，离心，沉淀加水复溶。
进一步地，步骤S2中，所述脱蛋白方法为Sevage试剂法、等电点法或三氯乙酸法。
优选地，所述脱蛋白方法为Sevage试剂法；具体地，取醇沉后的溶液与Sevage试剂按体积比为1:1混合，震荡，离心，取上清液，重复处理5次，即得脱蛋白溶液；其中，Sevag试剂为氯仿:正丁醇＝4:1(v/v)的混合溶液。
优选地，步骤S2中，所述透析为在4℃透析48h，期间每6h换一次水；所述透析袋的规格是截留分子量为3500Da。
进一步地，步骤S1中，除去脂溶性物质的具体步骤为：取虎斑乌贼内脏，加水打成匀浆状，依次用乙醇、丙酮和石油醚浸提，最后过滤取沉淀。
优选地，除去脂溶性物质的具体步骤为：将虎斑乌贼内脏的匀浆先用无水乙醇(V无水乙醇:V脂溶物＝3:1)浸提3次，过滤除去无水乙醇，将沉淀再用丙酮(V丙酮:V脂溶物＝3:1)浸提3次，过滤除去丙酮；最后用石油醚(V石油醚:V脂溶物＝3:1)浸提3次，过滤除去石油醚，置于通风橱过夜挥干溶剂后，采用冷冻干燥机进行冷冻干燥，最后用中草药粉碎机进行粉碎，得到虎斑乌贼内脏干粉。
另外地，本发明保护虎斑乌贼内脏多糖或本发明所述虎斑乌贼内脏多糖的制备方法在制备具有降血脂作用药物中的应用。
同时，本发明保护所述虎斑乌贼内脏多糖的制备方法在制备具有免疫调节作用药物中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种虎斑乌贼内脏多糖的制备方法及其应用，本发明依次将虎斑乌贼内脏预处理、碱法提取、乙醇醇沉、脱蛋白、透析等步骤，最后得到虎斑乌贼内脏多糖粉末。动物实验表明，虎斑乌贼内脏多糖能降低甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL-C)水平，升高高密度脂蛋白(HDL-C)水平，从而改善高血脂症状；并且能在细胞水平上促进免疫因子的分泌，调节免疫功能。可见，本发明制备得到的虎斑乌贼内脏多糖具有较好的降血脂和提高免疫的功效，能为海洋新型药品或功能性食品的研发提供理论依据和物质基础。
附图说明
图1为不同提取方法下的虎斑乌贼内脏多糖得率的数据统计图。
图2为虎斑乌贼内脏多糖的红外光谱图。
图3为虎斑乌贼内脏多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7免疫因子影响的数据统计图，其中a为TNF α含量，b为IL 6含量，c为NO分泌量；图中*表示与control组相比差异显著(p<0.05),**表示与control组相比差异极显著(p<0.01)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1不同提取方法对虎斑乌贼内脏多糖提取率的影响
1.盐提法：准确称取虎斑乌贼内脏干粉1g，按1:30(g/mL)的比例加3％(w/v)的NaCl溶液，80℃水浴3h，离心(4000rpm，30min)，取上清液定容至50mL，测多糖含量。
2.水提法：准确称取虎斑乌贼内脏干粉1g，按1:30(g/mL)的比例加蒸馏水，在80℃水浴3h，离心(4000rpm，30min)，取上清液定容至50mL，测多糖含量。
3.酸提法：准确称取虎斑乌贼内脏干粉1g，按1:30(g/mL)的比例加0.2mol/L的HCl提取液，80℃水浴3h，离心(4000rpm，30min)，取上清液定容至50mL，测多糖含量。
4.碱提法：准确称取虎斑乌贼内脏干粉1g，按1:30(g/mL)的比例加3％(w/v)的NaOH溶液，80℃水浴3h，离心(4000rpm，30min)，取上清液定容至50mL，测多糖含量。
5.缓冲液提法：准确称取虎斑乌贼内脏干粉1g，按1:30(g/mL)的比例加pH＝7，浓度为3％的磷酸盐缓冲液，80℃水浴3h，离心(4000rpm，30min)，取上清液定容至50mL，测多糖含量。
实验结果如图1所示，结果表明5种方法提取虎斑乌贼内脏多糖的得率由高到低依次为：碱提(1.641％)>酸提(0.966％)>水提(0.937％)>盐提(0.522％)>缓冲液提(0.477％)，碱提法提取得率最高。原因可能碱提能够更好的破坏内脏细胞，有利于多糖的溶出，或是因为碱提有利于酸性多糖的提取，而虎斑乌贼内脏多糖里含有较多酸性多糖，所以碱提更有力于虎斑乌贼内脏多糖的溶出。
基于上述研究，本发明采用碱提取虎斑乌贼内脏多糖。
实施例2一种虎斑乌贼内脏多糖的制备方法
本实施例提供一种虎斑乌贼内脏多糖的制备方法，包括如下步骤：
虎斑乌贼内脏预处理：虎斑乌贼解剖，获得肝脏，加蒸馏水(V蒸馏水:V内脏＝2:1)用组织捣碎机打成匀浆状；然后将匀浆先用无水乙醇(V无水乙醇:V脂溶物＝3:1)浸提3次，过滤除去无水乙醇，将沉淀再用丙酮(V丙酮:V脂溶物＝3:1)浸提3次，过滤除去丙酮；最后用石油醚(V石油醚:V脂溶物＝3:1)浸提3次，过滤除去石油醚；将沉淀置于通风橱过夜挥干溶剂后，采用冷冻干燥机进行冷冻干燥，最后用中草药粉碎机进行粉碎，得到虎斑乌贼内脏干粉；
碱法提取：将上述得到的虎斑乌贼内脏干粉，进行碱液提取，按照提取时间2.5h、提取温度50℃、料液比1:20g/mL和NaOH浓度0.2mol/L，反复提取3次，合并提取液，离心取上清液，浓缩至原体积的1/5，得浓缩液；
乙醇醇沉：将上述收集的浓缩液，加入3倍体积的无水乙醇，在4℃下沉淀24h，离心收集沉淀，加水复溶，得到虎斑乌贼内脏粗多糖溶液；
脱蛋白：将上述虎斑乌贼粗多糖溶液中加入Sevage试剂，磁力搅拌充分混匀，离心收集上清液，重复处理5次，直至中间蛋白层消失，得脱蛋白溶液；其中，Sevage试剂与糖液的体积比为1:1，Sevage溶剂为氯仿 正丁醇(4:1，v/v)的混合溶液；
透析：将上述脱蛋白溶液置于透析袋中，4℃下透析48h，期间每6h换一次水，透析完毕收集透析袋中的糖液，干燥，得到虎斑乌贼内脏多糖干粉；其中，透析袋的规格是截留分子量为3500Da。
多糖得率多糖得率R/％＝A/B×100
式中：R为多糖得率/％；A为虎斑乌贼内脏多糖干粉/g；B为虎斑乌贼内脏干粉质量/g。
经计算，本实施例的虎斑乌贼内脏多糖提取率为1.817％。
实施例3一种虎斑乌贼内脏多糖的制备方法
与实施例1的区别在于：步骤S2中提取时间3.0h、提取温度40℃、料液比1:20g/mL和NaOH浓度0.2mol/L，其余均与实施例1相同。
经计算，本实施例的虎斑乌贼内脏多糖提取率为1.763％。
实施例4一种虎斑乌贼内脏多糖的制备方法
与实施例1的区别在于：步骤S2中提取时间2.5h、提取温度50℃、料液比1:15g/mL和NaOH浓度0.1mol/L，其余均与实施例1相同。
经计算，本实施例的虎斑乌贼内脏多糖提取率为1.694％。
实施例5一种虎斑乌贼内脏多糖的制备方法
与实施例1的区别在于：步骤S2中提取时间2.0h、提取温度50℃、料液比1:25g/mL和NaOH浓度0.2mol/L，其余均与实施例1相同。
经计算，本实施例的虎斑乌贼内脏多糖提取率为1.663％。
实施例6一种虎斑乌贼内脏多糖的制备方法
与实施例1的区别在于：步骤S2中提取时间2.0h、提取温度60℃、料液比1:20g/mL和NaOH浓度0.2mol/L，其余均与实施例1相同。
经计算，本实施例的虎斑乌贼内脏多糖提取率为1.689％。
实验例1虎斑乌贼内脏多糖的红外光谱分析
实验材料：实施例1制备得到的多糖。
取2mg冷冻干燥后的虎斑乌贼内脏多糖粉末，与少量干燥KBr粉末(100mg左右)混合，放进玛瑙研钵内充分研磨成均匀的粉末，再用压片机压成透明薄片，置于Nicolet 6700傅里叶红外光谱分析仪在4000cm-1～400cm-1区间扫描分析。
波数为3600-3200cm-1的吸收峰是-OH的伸缩振动吸收峰，这个区域的吸收峰是糖类的特征峰。如图2所示，在3419.67cm-1出现了一宽峰，为O-H的伸缩振动吸收峰；在2926.11cm-1处较强的吸收峰，是多糖分子C-H伸缩振动引起的；在1642.97cm-1有1个吸收峰，属于C＝O非对称伸缩振动；在1409.45cm-1区域有吸收峰，是C-H变角振动所引起的吸收峰；在1071.82cm-1处可能是醚键(C-O-C)的伸缩振动导致的吸收峰，说明此糖可能含有吡喃环，结果表示，虎斑乌贼内脏多糖具有多糖特征官能团，属于典型吡喃型多糖。
实验例2虎斑乌贼内脏多糖对小鼠降脂的活性测定
实验材料：实施例1制备得到的多糖；高脂饲料(1％胆固醇、10％猪油、0.2％甲基硫氧嘧啶、0.5％胆酸钠、5％蔗糖、83.3％基础饲料)。
60只C57BL/6J小鼠，适应性喂养3天，雌雄各半随机分为6组，每组10只。
各组给药剂量及喂养方式：
正常组(空白对照)：以普通饲料喂养，并持续灌胃给0.9％生理盐水，灌胃体积为0.1mL/10g.bw，即每10g小鼠体重灌胃0.1mL水；
模型组：以高脂饲料喂养，并持续灌胃给0.9％生理盐水，灌胃体积为0.1mL/10g.bw，即每10g小鼠体重灌胃0.1mL水；
虎斑乌贼内脏多糖低剂量组：以高脂饲料喂养，并持续灌胃给虎斑乌贼内脏多糖100mg/kg.bw，灌胃体积为0.1mL/10g.bw，即每10g小鼠体重灌胃0.1mL水；
虎斑乌贼内脏多糖中剂量组：以高脂饲料喂养，并持续灌胃给虎斑乌贼内脏多糖200mg/kg.bw，灌胃体积为0.1mL/10g.bw，即每10g小鼠体重灌胃0.1mL水；
虎斑乌贼内脏多糖高剂量组：以高脂饲料喂养，并持续灌胃给虎斑乌贼内脏多糖400mg/kg.bw，灌胃体积为0.1mL/10g.bw，即每10g小鼠体重灌胃0.1mL水；
阳性药组：以高脂饲料喂养，并持续灌胃给辛伐他汀180mg/kg.bw，灌胃体积为0.1mL/10g.bw，即每10g小鼠体重灌胃0.1mL水。
以上各组持续灌胃给药(每日1次)，并饲养21天。各组最后一次给药后禁食12h，自由饮水，于第二天早晨空腹取材，眼底穿刺采血5mL，4℃下3000rpm离心10min后，取上清液测定各指标。
由表1结果可知：与正常组比较，模型组小鼠的TC、TG、LDL-C均有明显降低(p<0.01)，HDL-C也有明显升高(p<0.01)，即本实验模型组造模成功。从表1结果可以看出，高血脂症小鼠连续饲以虎斑乌贼内脏多糖，血脂值出现改变，并且其TC、TG、LDL-C值的降低和HDL-C值的升高，均呈现剂量依赖性，即说明虎斑乌贼内脏多糖的降血脂活性随着其浓度增加而增加，其中，400mg/kg.bw多糖降血脂效果最佳，其对TC、TG、LDL-C值的降低和HDL-C值的升高效果与阳性药物辛伐他汀无显著差异。综上实验结果表明，利用本发明碱法提取的虎斑乌贼内脏多糖能较好的改善高血脂症小鼠的血脂水平，从而发挥降血脂功效。
表1虎斑乌贼内脏多糖对高脂血症小鼠血脂蛋白含量的影响(n＝10，x±s)
表1中，a P<0.01，与正常对照组比较；b P<0.05，c P<0.01,与模型组比较；d P<0.01，与辛伐他汀组比较。
实验例3虎斑乌贼内脏多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7免疫功能的评价
实验材料：实施例1制备得到的多糖。
实验方法：
1、铺板：当RAW264.7细胞生长至对数增长期时，弃去上清液，用经过37℃预热的磷酸盐缓冲液即PBS对瓶底进行润洗，而后加入2mL同样预热好的完全培养基，轻轻将瓶底的细胞吹下来，移到离心管中800rpm离心5min，弃去上清，加入1mL新的完全培养基，混匀，取100μL于900μL的PBS中混匀，利用血球计数板进行计数，最后调整细胞密度至5×105个/mL。在96孔板中，每孔加入100μL进行培养(四周加入每孔100μL的PBS补充水分)，置于二氧化碳培养箱中培养(37℃，5％ CO2)24h。
2、加样：24h后弃去上清液，空白组(control)每孔加入100μL的DMEM基础培养基；阳性组每孔加入100μL的1μg/mL LPS溶液；虎斑乌贼内脏多糖组分为4个不同浓度的组，每孔加入100μL的不同浓度多糖溶液(100、250、500、1000μg/mL的虎斑乌贼内脏多糖)，每组设置3个复孔，继续放入二氧化碳培养箱中培养(37℃，5％ CO2)24h。
3、检测：收集每孔的加样后的上清液，根据碧云天生产的一氧化氮(NO)检测试剂盒说明书，使用Griess Reagent检测做出标准曲线，计算出细胞释放NO含量。根据小鼠白细胞介素6(IL-6)酶联免疫检测试剂盒以及小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫检测试剂盒说明书，在酶标板上加入酶标试剂温育，经过洗涤、显色、终止后做出标准曲线，计算细胞分泌IL-6、TNF-α的含量。
如图3所示，在100～1000μg/mL浓度范围内，与空白组(control)相比较，虎斑乌贼内脏多糖(SPVP)均能明显刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7释放NO、TNF-α和IL-6(p<0.05)。对TNF-α而言，在100和250μg/mL的浓度下，SPVP的效果优于阳性组(LPS)；对IL-6而言，在500μg/mL的浓度下，SPVP的效果优于LPS；对NO而言，在100～1000μg/mL浓度范围内，SPVP的效果呈现剂量依赖的特性。从实验结果可知，SPVP对3种细胞免疫因子均有不同的促进作用，即SPVP具有免疫调节活性，适合用在机体抗炎因子分泌过多导致免疫过度这类病症上。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种虎斑乌贼内脏多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.虎斑乌贼内脏除去脂溶性物质后，干燥，得虎斑乌贼内脏干粉；
S2.取步骤S1虎斑乌贼内脏干粉，在30～70℃下用0.1～0.5mol/L NaOH溶液浸提，沉淀过滤，浓缩，浓缩液醇沉，脱蛋白，透析，干燥，得虎斑乌贼内脏多糖。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述NaOH溶液的浓度为0.1～0.2mol/L。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述虎斑乌贼内脏干粉与NaOH溶液的质量体积比为1:10～30g/mL。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述浸提温度为40～60℃。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述浸提的时间为1.5～3.5h。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述醇沉的具体条件是：浓缩液中加乙醇至乙醇体积分数为70～80％，于4～8℃沉淀24～48h，离心，沉淀加水复溶。
7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述脱蛋白方法为Sevage试剂法、等电点法或三氯乙酸法。
8.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S1中，除去脂溶性物质的具体步骤为：取虎斑乌贼肝脏，加水打成匀浆状，依次用乙醇、丙酮和石油醚浸提，最后过滤取沉淀。
9.虎斑乌贼内脏多糖或权利要求1～8任一所述制备方法所得虎斑乌贼内脏多糖在制备具有降血脂作用药物中的应用。
10.权利要求1～8任一所述制备方法所得虎斑乌贼内脏多糖在制备具有免疫调节作用药物中的应用。
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