CN117771377A - 一种中药含药血清结合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中药含药血清结合物及其制备方法和应用，涉及中药技术、组织工程等领域，由中药含药血清和多糖生物材料构成。中药含药血清指动物灌胃中药制剂后，采取一定时间的血液并分离血清，则含有一定量该药成分的血清为含药血清，含药血清经真空冻干制成粉剂，其成分包括但不限于苷类或生物碱类；多糖生物材料是具有一定生理功能，能够调节细胞生长，促进组织修复愈合并易被吸收降解的一类高分子材料。所述方法详细阐述了该中药含药血清结合物的制备方法和应用，其用于制备治疗骨软骨疾病的药品中，尤其是关节内注射制剂，扩大了中药含药血清的治疗效果，借助多糖生物材料对软骨的促进作用，能够提高软骨细胞的增殖活性，促进软骨糖胺聚糖分泌，降低关节内炎症反应，共同起到营养、再生、修复受损软骨组织等作用，克服了单一应用关节内注射制剂的局限性，多糖生物材料能够黏附趋集于软骨损伤处，可大大降低不良反应的发生，增大了中药含药血清注射制剂的疗效和应用范围。

Description

一种中药含药血清结合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及中药技术、组织工程等领域，具体涉及一种中药含药血清结合物及其制备方法和应用。

背景技术

骨性关节炎是骨科中的常见病，主要是指关节软骨随着年龄的增长，因劳损、活动量过多引起关节软骨退变、磨损，逐渐出现软骨下骨裸露，关节边缘骨质增生，其中关节软骨损伤是该病发生发展中最关键的始动因素。目前治疗骨性关节炎方法大多只能缓解临床症状，不能有效阻止疾病的进展，故很难针对软骨本身进行修复治疗。

多糖生物材料在生物医学领域具有广阔的应用前景，可在组织工程、支架材料、药物递送和伤口敷料等方面发挥作用，壳聚糖作为一种天然聚阳离子多糖，具有良好的生物相容性、可降解性及广谱抗菌性，有利于细胞的附着、繁殖和分化生长，现已广泛应用于软骨组织工程中。组织工程软骨材料需要考虑其软骨诱导性和软骨传导性，壳聚糖虽然具有软骨传导性，但存在溶解度低、吸附性差等问题导致成软骨效率不高，因此需要对其进行改性以增强生物活性，壳聚糖中存在的氨基和羟基基团为其改性提供了可能性，例如可进行巯基化、羧甲基、酰化及烷基化等改性。巯基化后能增强壳聚糖的溶解性和吸附性，并且含有丰富的羧基和氨基，可进一步与其他活性基团或药物反应，使巯基壳聚糖成为壳聚糖化学改性的热门领域之一。巯基壳聚糖利用二硫键的形成，以共价键黏附于损伤软骨表面，可延长药物在损伤软骨处的滞留时间，有利于药物分子的充分吸收。此外巯基壳聚糖良好的生物相容性，能够调节软骨细胞表型和发育，对软骨细胞增殖和分化起到促进作用。

中药含药血清是指动物灌胃中药或中药单体制剂后，采取一定时间的血液并分离血清，则含有一定量该药成分的血清为含药血清；由于含药血清是经过消化道吸收并经生物转化后形成的，因此其药理活性更强，组成成分更明确，可防止中药制剂本身理化性质对实验反应体系的影响，同时能够达到去除杂质，纯化药物的目的，更适用于体外细胞实验研究和在体研究。

淫羊藿苷是中药淫羊藿的主要有效活性单体，为8-异戊烯基黄酮苷类化合物，呈淡黄色针状结晶粉末，溶于乙醇、乙酸乙酯，难溶于水，不溶于醚、苯、氯仿，现代药理学研究发现淫羊藿苷具有多种功效，能够增加心脑血管血流量、促进造血、抗炎抗肿瘤、调节免疫功能及骨代谢等。尤其是在骨骼系统的作用显著，不仅可以促进软骨细胞增殖，增加Ⅱ型胶原和糖胺聚糖分泌含量，而且能够抑制细胞外基质降解，促进骨髓间充质干细胞成软骨转化，有望对受损软骨组织进行再生修复。然而，淫羊藿苷难溶于水的特性限制了其体内外实验研究，淫羊藿苷含药血清则正好可以解决这一问题，含药血清中含有淫羊藿苷单体的主要成分，可直接用于软骨细胞实验研究，有利于观察其对软骨细胞增殖和分泌的影响；同时，关节内注射淫羊藿苷含药血清治疗膝骨关节炎比单独注射淫羊藿苷单体更容易被吸收利用，含药血清修复软骨损伤作用更好，且新生软骨和正常软骨组织能近乎融合，这一点课题组前期实验研究中也得到初步验证。

综上，淫羊藿苷含药血清和巯基壳聚糖在软骨组织工程中均具有积极作用，都可促进软骨细胞增殖，提高软骨组织糖胺聚糖分泌量，降低炎症反应及修复软骨损伤，而两者作用的信号通路有所不同，若将两者结合在一起，有望起到协同治疗的作用，发挥更好的软骨修复功效。

发明内容

本发明的目的是提供一种中药含药血清结合物，该结合物是将制备的中药含药血清和多糖生物材料结合，形成中药含药血清结合物；其主要用于制备治疗软骨损伤性疾病的药品中，以期具有显著的协同治疗作用。

本发明的技术方案是：

一种中药含药血清结合物，主要由中药含药血清和多糖生物材料构成，所述中药含药血清指动物灌胃中药制剂后，采取一定时间的血液并分离血清，则含有一定量该药成分的血清为含药血清，其成分包括但不限于淫羊藿苷、补骨脂素、姜黄素、青蒿素、薯蓣皂苷、大黄素等；所述多糖生物材料是具有一定生理功能，能够调节细胞生长，促进组织修复愈合并易被吸收降解的一类高分子材料，包括但不限于壳聚糖、琼脂糖、透明质酸、海藻酸、纤维素及相应衍生物等。

所述中药含药血清结合物，其干燥物为晶体或结晶性粉末，溶液状态呈真溶液或胶体状态或离子状态，溶于水或有机溶质，其相对分子量在D200至D5000范围内。

所述中药含药血清由中药及其提取物灌胃后制得，包括但不限于淫羊藿、补骨脂、姜黄、薯蓣、青蒿等。

本发明还提供所述制备中药含药血清结合物的方法，包括以下步骤：

(a)制备中药含药血清：中药主要成分提取物溶于生理盐水并进行灌胃，末次灌胃2h后麻醉取血并静置2h，离心取上清即得血清，最后进行热灭活及过滤除菌，所述中药含药血清的主要成分可与多糖生物材料相结合；

(b)制备多糖生物材料的水溶液体系；

(c)在经过化学改性及搅拌下将两种液体融合，使两者发生反应结合；

(d)将反应得到的产物进行分离纯化，即得到中药含药血清结合物；

进一步的，一种制备中药含药血清结合物的方法，以淫羊藿苷含药血清和巯基壳聚糖反应为例，两者通过下述反应步骤结合：

(a)将25mg淫羊藿苷溶于100mL生理盐水中制成混悬液并进行灌胃，一次/d，连续7d，灌胃前禁食12h，灌胃量为10mL/kg，末次灌胃2h后麻醉取血并静置2h，离心取上清即得含药血清，将所得血清进行热灭活及过滤除菌，最后经真空冻干制成粉剂；

(b)将300mg巯基壳聚糖溶于50mL生理盐水中，制备巯基壳聚糖水溶液，并调节溶液的pH值＜6.0；

(c)将淫羊藿苷含药血清冻干粉溶于生理盐水中，经过氨基化改性得到氨基淫羊藿苷，再将含有氨基淫羊藿苷含药血清的溶液和巯基壳聚糖溶液混合(质量比1：12)，氨基淫羊藿苷含药血清稍过量，加入少量1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺缓冲液(EDC,浓度为10mg/mL)，调节pH值到4.5，室温搅拌20min，再调节pH值为5.5，加入与EDC等量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,10mg/mL)，室温搅拌24h；

(d)过滤收集反应中的产物，用无水乙醇多次洗涤并冷冻干燥，即得淫羊藿苷含药血清结合物；

在制备过程中，申请人发现，反应速率与反应体系pH值和反应温度有关，需严格控制反应体系pH值的变化，尽量增大反应温度，反应物产量与中药含药血清有效成分浓度、多糖生物材料的溶解度及反应时间成正相关。

本发明还提供该结合物的应用，尤其是用于制备药品的应用，进一步的，本发明提供该结合物用于制备治疗软骨损伤性疾病药品的应用，所述药品剂型为但不限于注射剂、外用剂、口服剂等。

本发明的结合物主要用于制备中药含药血清关节内注射剂，即常说的“关节营养剂”中药含药血清注射剂是传统医药理论与现代生产工艺相结合的产物，突破了传统的中药给药方式，具有生物利用度高、疗效确切、作用迅速等特点，但临床上使用含有中药含药血清的关节内注射剂报道较少，因此，亟需加强这方面的研究。关节注射是将药物直接注射入机体关节腔内，使药物直达病灶，在损伤局部迅速起效，减少全身用药的副作用，提高了药物的利用度。

本发明的中药含药血清结合物，其干燥物为晶体或结晶性粉末，由中药含药血清和多糖生物材料构成，在软骨组织工程中具有广阔的应用前景，其中药含药血清具有增强软骨细胞增殖活性，提高糖胺聚糖分泌，维持细胞表型和分化，增加细胞外基质合成，促进骨髓间充质干细胞成软骨转化等作用，其多糖生物材料具有良好的生物相容性、可降解性和广谱抗菌性，有利于细胞的附着、繁殖和分化生长，对调节软骨细胞表型和分化起到重要作用。

本发明具有的优点和积极效果是：通过化学手段获得中药含药血清结合物，以关节内注射方式增加了药物的利用度和功效，克服了单一应用中药含药血清的局限性，扩大了治疗效果。借助多糖生物材料对软骨细胞的积极作用，能够趋集于损伤软骨表面，延长药物在病灶处的作用时间，提高疗效，同时改善关节内微环境，降低炎症反应，最终达到保护和修复受损软骨的目的，真正做到中西医结合治疗疾病。此外，本发明扩大了中药含药血清的使用范围，中药含药血清和多糖生物材料在发挥各自功能的基础上，还可产生协同治疗作用，在制备治疗软骨损伤性疾病的药品中，尤其是关节内注射制剂，将有广泛的应用前景。

附图说明

图1是不同干预措施对软骨细胞增殖活性的影响(n＝5,Mean±SD)

图2是不同干预措施对关节软骨糖胺聚糖分泌的影响(n＝5,Mean±SD)

图3是不同干预措施下家兔OARSI骨关节炎评分(n＝5,Mean±SD)

图4是不同干预措施下家兔改良Mankin软骨修复评分(n＝5,Mean±SD)

具体实施方式

实施例1

淫羊藿苷含药血清和巯基壳聚糖结合物的制备

(a)将25mg淫羊藿苷溶于100mL生理盐水中制成混悬液并进行灌胃，一次/d，连续7d，灌胃前禁食12h，灌胃量为10mL/kg，末次灌胃2h后麻醉取血并静置2h，离心取上清即得含药血清，将所得血清进行热灭活及过滤除菌，最后经真空冻干制成粉剂；

(b)将300mg巯基壳聚糖溶于50mL生理盐水中，制备巯基壳聚糖水溶液，并调节溶液的pH值＜6.0；

(c)将淫羊藿苷含药血清冻干粉溶于生理盐水中，经过氨基化改性得到氨基淫羊藿苷，再将含有氨基淫羊藿苷含药血清的溶液和巯基壳聚糖溶液混合(质量比1：12)，氨基淫羊藿苷含药血清稍过量，加入少量1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺缓冲液(EDC,浓度为10mg/mL)，调节pH值到4.5，室温搅拌20min，再调节pH值为5.5，加入与EDC等量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,10mg/mL)，室温搅拌24h；

(d)过滤收集反应中的产物，用无水乙醇多次洗涤并冷冻干燥，即得淫羊藿苷含药血清结合物；

效果验证：

为了验证该结合物对软骨细胞增殖活性和体内受损软骨组织修复作用，申请人分别使用淫羊藿苷含药血清、巯基壳聚糖、淫羊藿苷含药血清结合物分别体外作用于软骨细胞和体内注射家兔膝关节软骨损伤模型，同时设置对照组，观察不同干预措施对软骨细胞增殖率、软骨糖胺聚糖分泌量、关节内炎症反应及软骨损伤修复能力的影响。

实验步骤和方法如下：

一、实验动物

健康8月龄家兔，雄性，2.0-2.2kg

二、实验仪器、药品与试剂试剂：淫羊藿苷含药血清、巯基壳聚糖溶液、淫羊藿苷含药血清结合物、NS实验仪器：动物细胞提取和关节造模手术器械、胎牛血清、DMEM培养基、PBS、双抗、Ⅱ型胶原酶、15和50mL离心管、T25培养瓶、注射器、离心机、显微镜、酶标仪

三、实验步骤

1.淫羊藿苷含药血清结合物的合成：见前述实施例1的描述

2.实验分组

体外验证采用分离、扩增培养至第3代的软骨细胞用于实验，每组设置5个复孔；体内验证将家兔适应性饲养3d，行右膝关节股骨髁软骨缺损手术进行造模，缺损直径为4mm，深度为3mm，每组5只。

(1)对照组(Control)：NS

(2)淫羊藿苷含药血清组(ICS)：0.5mL

(3)巯基壳聚糖组(CSSH)：0.5mL

(4)淫羊藿苷含药血清结合物组(ICS-CSSH)：0.5mL

3.实验方法

细胞实验Control组采用正常完全培养基进行培养，ICS组、CSSH组和ICS-CSSH组则在Control组基础之上分别加上ICS、CSSH和ICS-CSSH进行培养，24h和48h后进行指标检测；动物实验Control组采用0.5mL生理盐水行关节腔注射，ICS组、CSSH组和ICS-CSSH组则分别采用同等体积的ICS、CSSH和ICS-CSSH进行注射，各组于造模后第3周开始给药，每周注射3次，持续5周，于术后12周收集关节腔内关节液，并麻醉处死分离股骨髁组织进行骨关节炎分级和软骨修复的组织学评估。

4.检测指标

(1)细胞实验取第3代软骨细胞，各组在不同干预措施下培养24h和48h后进行CCK-8法检测软骨细胞增殖率，每组设置5个复孔，用酶标仪测定各组在450nm波长处的吸光度。

(2)动物实验各组于术后12周进行戊巴比妥钠麻醉，抽取关节腔内关节液用于糖胺聚糖含量检测，兔耳缘静脉行空气针处死，分离后部右侧下肢，保留完整的股骨髁组织，并对其进行固定、脱水、包埋、切片后染色，采用OARSI评分和改良Mankin评分对各组家兔骨关节炎进展分级和缺损区域软骨修复状况进行评估。

四、结果

1.淫羊藿苷含药血清结合物对软骨细胞增殖活性的影响

与对照组相比，ICS组、CSSH组和ICS-CSSH组的吸光度值均明显增加，其中以ICS-CSSH组的反应体系颜色最深，吸光度值最高，ICS组和CSSH组并无明显差异，而ICS-CSSH组与ICS组及CSSH组之间具有差异，见图1。

2.淫羊藿苷含药血清结合物对家兔糖胺聚糖分泌的影响

收集各组关节腔内液体进行糖胺聚糖检测，结果显示，ICS组、CSSH组和ICS-CSSH组的糖胺聚糖含量均显著高于NS组，其中ICS-CSSH组含量高于ICS组和CSSH组，促软骨分泌效果最好，见图2；

3.淫羊藿苷含药血清结合物对家兔骨关节炎分级和软骨缺损修复的影响

股骨髁软骨缺损大体观察可见，NS组软骨修复效果较差，可见软骨缺损仍然存在，而ICS-CSSH组修复效果较好，可见新生软骨组织覆盖缺损处，软骨表面光滑，ICS组和CSSH组修复效果处在中间；OARSI评分结果显示，ICS-CSSH组评分最低，且明显低于其他组，NS组评分最高，表明ICS-CSSH组骨关节炎症状较轻，ICS-CSSH能够有效降低关节炎症反应，见图3；改良Mankin评分结果显示，与NS组评分相比，ICS组、CSSH组和ICS-CSSH组评分均显著降低，其中以ICS-CSSH组评分降低最明显，表明ICS-CSSH组软骨缺损修复效果最好，ICS-CSSH能够有效促进关节软骨修复,见图4。

综上可见，淫羊藿苷含药血清结合物对增强软骨细胞增殖活性、提高软骨糖胺聚糖分泌、降低关节炎症反应及促进受损软骨再生修复等方面均发挥了积极功效，证明其具有阻止骨关节炎进展和软骨保护及修复的作用。而且，实验证实，关节内注射淫羊藿苷含药血清结合物的实验组比单独注射淫羊藿苷含药血清、巯基壳聚糖的实验组效果更好，且差异具有统计学意义。

以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (9)

1.一种中药含药血清结合物，其特征在于：由中药含药血清和多糖生物材料构成。

2.根据权利要求1所述的一种中药含药血清结合物，其特征在于：中药含药血清指动物灌胃中药制剂后，采取一定时间的血液并分离血清，则含有一定量该药成分的血清为含药血清，含药血清经真空冻干制成粉剂，-80℃贮存备用，其成分包括但不限于苷类或生物碱类；多糖生物材料是具有一定生理功能，能够调节细胞生长，促进组织修复愈合并易被吸收降解的一类高分子材料。

3.根据权利要求1所述的一种中药含药血清结合物，其特征在于：所述中药含药血清的中药成分包括但不限于淫羊藿苷、补骨脂素、姜黄素、青蒿素、薯蓣皂苷、大黄素等；所述多糖生物材料包括但不限于壳聚糖、琼脂糖、透明质酸、海藻酸、纤维素及相应衍生物等。

4.根据权利要求1所述的一种中药含药血清结合物，其特征在于：所述中药含药血清的中药成分为淫羊藿苷，所述多糖生物材料为巯基壳聚糖。

5.根据权利要求1-4任一项所述的一种中药含药血清结合物的制备方法，包括以下步骤：

(a)制备中药含药血清：中药主要成分提取物溶于生理盐水并进行灌胃，末次灌胃2h后麻醉取血并静置2h，离心取上清即得血清，最后进行热灭活及过滤除菌，含药血清经真空冻干制成粉剂，-80℃贮存备用，所述中药含药血清的主要成分可与多糖生物材料相结合；

(b)制备多糖生物材料的水溶液体系；

(c)在经过化学改性及搅拌下将两种液体融合，使两者发生反应结合；

(d)将反应(c)中得到的产物进行分离纯化，即得到中药含药血清结合物。

6.根据权利要求5所述的一种中药含药血清结合物的制备方法，具体的，优选淫羊藿苷含药血清和巯基壳聚糖，包括以下步骤：

(a)将25mg淫羊藿苷溶于100mL生理盐水中制成混悬液并进行灌胃，一次/d，连续7d，灌胃前禁食12h，灌胃量为10mL/kg，末次灌胃2h后麻醉取血并静置2h，离心取上清即得含药血清，将所得血清进行热灭活及过滤除菌，最后经真空冻干制成粉剂；

(b)将300mg巯基壳聚糖溶于50mL生理盐水中，制备巯基壳聚糖水溶液，并调节溶液的pH值＜6.0；

(c)将淫羊藿苷含药血清冻干粉溶于生理盐水中，经过氨基化改性得到氨基淫羊藿苷，再将含有氨基淫羊藿苷含药血清的溶液和巯基壳聚糖溶液混合(质量比1：12)，氨基淫羊藿苷含药血清稍过量，加入少量1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺缓冲液(EDC,浓度为10mg/mL)，调节pH值到4.5，室温搅拌20min，再调节pH值为5.5，加入与EDC等量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,10mg/mL)，室温搅拌24h；

(d)过滤收集(c)反应中的产物，用无水乙醇多次洗涤并冷冻干燥，即得淫羊藿苷含药血清结合物。

7.根据权利要求1-4任一项所述的一种中药含药血清结合物的应用。

8.根据权利要求1-4任一项所述的一种中药含药血清结合物用于制备药品的应用，所述药品为但不限于注射剂、外用剂、口服剂等，其特征在于：优选用于制备关节内注射剂。

9.根据权利要求4所述的一种中药含药血清结合物用于制备治疗软骨损伤药品中的应用。