CN117770138B - 一种创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法，涉及芦笋组培领域。所述创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法，由以下步骤组成：启动培养、一次增殖培养、二次增殖培养、三次增殖培养、继代增殖培养、生根培养、转接培养。本发明的创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法，能够弥补现有技术对于耐中重度盐碱芦笋新品种选育方法方面的研究不足，克服现有的芦笋种质资源仅能够适应于低度盐碱地种植，无法耐受中重度盐碱土壤环境的问题；以及克服现有创制芦笋耐盐碱种质方法存在的育年限长、育种效率低下、创制成本高；以及创制的芦笋种质的耐盐碱性能不稳定的问题。
Description
技术领域
本发明涉及芦笋组培领域，尤其是涉及一种创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法。
背景技术
芦笋，学名石刁柏，为百合科天门冬属多年生宿根性草本植物，含有丰富的维生素B、维生素A以及叶酸、硒、铁、锰、锌等微量元素，且具有多种人体所必需的氨基酸。同时，芦笋含硒量高于一般蔬菜，与含硒丰富的蘑菇接近，甚至可与海鱼、海虾等的含硒量媲美。芦笋具有防癌、抗癌等作用，市场前景广阔，在国际上享有“蔬菜之王”的美称，是全球性贸易的蔬菜品种，是高价值蔬菜之一。现有技术中，芦笋的根系发达，适应性广，属于拒盐植物范畴，在pH值为5.5-7.8的土壤中均可栽培，是中国盐碱地开发利用的先锋植物。
但是，目前芦笋耐盐碱研究主要集中在对现有芦笋种质资源的鉴定筛选、芦笋的生态学特征分析、耐盐碱芦笋的生理生化机理研究、芦笋的盐碱地育苗及芦笋栽培技术等方面的研究，对于耐中重度盐碱芦笋新品种及种质选育方法的研究尚存在诸多空白。
同时，现有的芦笋种质资源仅能够适应于低度盐碱地种植，仅能够耐受含盐量指标约3‰、pH值为5.5-7.8的土壤环境；针对于盐量指标为4-8‰且pH值为8.0-9.0的中重度盐碱土壤环境，现有的芦笋种质资源无法耐受其过高的盐碱环境，种植过程中芦笋幼苗长势弱，抽生的茎数量少；且随着种植时间的延长，存在有芦笋幼苗失去活性或生长缓慢的问题。
进一步的，现有常规的育种创制芦笋耐盐碱种质的方法，还存在有育种年限长（一般种年限至少为3年），育种效率低下，创制成本高且创制的芦笋种质的耐盐碱性能不稳定等问题。
由此，提供一种能够解决前述缺陷的创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法，具有重要意义。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法，能够弥补现有技术对于耐中重度盐碱芦笋新品种选育方法方面的研究不足，克服现有的芦笋种质资源仅能够适应于低度盐碱地种植，无法耐受中重度盐碱土壤环境的问题；以及克服现有创制芦笋耐盐碱种质方法存在的育年限长、育种效率低下、创制成本高；以及创制的芦笋种质的耐盐碱性能不稳定的问题。
为解决以上技术问题，本发明采取的技术方案如下：
一种创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法，由以下步骤组成：启动培养、一次增殖培养、二次增殖培养、三次增殖培养、继代增殖培养、生根培养、转接培养。
所述启动培养的方法为，首先选取确定采用的高产优质芦笋种质，具体是，根据芦笋笋条的外观形态、口感风味、产量、生育指数、病情指数等，选取综合性状好的芦笋为高产优质芦笋种质；选取该高产优质芦笋种质中前一年度未受过病虫害的露地种植芦笋，于当年的4月中旬到5月期间，选择从地里冒出来粗细均匀，直径在1.8-2.2cm范围内，高度为20cm左右，且鳞片包裹紧实的笋条；贴地从笋条基部切取，获得优质新鲜笋条；接种于Y-1启动培养基中培养，控制培养温度为24-26℃，光照时间为每天12-14小时，光照强度为2500-3000Lx，培养时间为18-21天；经四代继代培养，获得增殖芦笋试管苗。
所述启动培养中，Y-1启动培养基的原料及含量为：MS培养基、6-BA 1.0-1.2mg/L、NAA 0.1mg/L、蔗糖45g/L、琼脂粉5g/L；Y-1启动培养基的pH值为5.8。
所述MS培养基为改良MS基础培养基，具体成分及含量为：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇1.0mg/L，烟酸0.5mg/L，维生素H 1.0mg/L。
所述一次增殖培养的方法为，将增殖芦笋试管苗，接种于NaCl含量为9.5-10g/L，pH值为6.2的Y-2增殖培养基中培养，控制培养温度为24-26℃，光照时间为每天12-14小时，光照强度为2500-3000Lx，培养时间为16-20天；此时大部分组织会开始玻璃化，停止增殖，获得正常增殖的组织。
所述一次增殖培养中，Y-2增殖培养基的原料及含量为：MS培养基、6-BA 0.6-0.8mg/L、IAA 0.1mg/L、褪黑素0.05mg/L、蔗糖45g/L、琼脂粉5g/L；Y-2增殖培养基中采用的MS培养基与前述步骤相同。
所述二次增殖培养的方法为，将一次增殖培养后的正常增殖的组织，接种于NaCl含量为3-3.5g/L，pH值为6.2的Y-2增殖培养基中，继代培养30-40天，获得二次增殖组织。
所述二次增殖培养中，Y-2增殖培养基的原料及含量为：MS培养基、6-BA 0.6-0.8mg/L、IAA 0.1mg/L、褪黑素0.05mg/L、蔗糖45g/L、琼脂粉5g/L；Y-2增殖培养基中采用的MS培养基与前述步骤相同。
所述二次增殖培养中，培养温度为24-26℃，光照时间为每天12-14小时，光照强度为2500-3000Lx。
所述三次增殖培养的方法为，将二次增殖组织转入至Na2CO3含量为1.77g/L、Na2SO4含量为2.37g/L、NaHCO3含量为2.8g/L、NaCl含量为1.95g/L，pH值为9.5的Y-2增殖培养基中培养12-15天，此时大部分组织会出现失绿、变白、褐化直至死亡的情况；将存活的增殖组织转入NaCl含量为3g/L，pH值为6.2的Y-2增殖培养基中，继代培养30-40天，获得三次增殖组织。
所述三次增殖培养中，Y-2增殖培养基的原料及含量为：MS培养基、6-BA 0.6-0.8mg/L、IAA 0.1mg/L、褪黑素0.05mg/L、蔗糖45g/L、琼脂粉5g/L；Y-2增殖培养基中采用的MS培养基与前述步骤相同。
所述三次增殖培养中，培养温度为24-26℃，光照时间为每天12-14小时，光照强度为2500-3000Lx。
所述继代增殖培养的方法为，采用三次增殖组织重复一次增殖培养、二次增殖培养、三次增殖培养的操作两次，获得继代组织。
所述生根培养的方法为，采用继代组织，截取茎尖或者直径在1.0-2.0mm范围内的茎段，转入Y-3生根培养基中培养，控制培养温度为26-28℃，光照时间为每天14-16小时，光照强度为2500-3000Lx，培养时间为21-30天，获得完整试管苗。
所述生根培养中，Y-3生根培养基的原料及含量为：1/2MS培养基、KT 0.05mg/L、IBA 1.0mg/L、IAA 0.1mg/L、Ancymidol 0.1mg/L、褪黑素0.05mg/L、蔗糖25g/L、琼脂粉5g/L；Y-3生根培养基中采用的MS培养基与前述步骤相同；1/2MS表示前面所述改良MS培养基中大量元素含量为原有水平的50%。
所述转接培养的方法为，将获得的完整试管苗接种于Na2CO3含量为1.77g/L、Na2SO4含量为2.37g/L、NaHCO3含量为2.8g/L、NaCl含量为1.95g/L，pH值为9.5的Y-4转接培养基中培养，控制培养温度为26-28℃，光照时间为每天14-16小时，光照强度为2500-3000Lx，培养时间为21-28天；获得健壮的试管苗，并进行过渡移栽种植，完成创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培，获得耐中重度盐碱芦笋种质。
所述转接培养中，Y-4转接培养基的原料及含量为：1/2MS培养基、褪黑素0.05mg/L、蔗糖18g/L、琼脂粉2.5g/L；Y-4转接培养基中采用的MS培养基与前述步骤相同；1/2MS表示前面所述改良MS培养基中大量元素含量为原有水平的50%。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1）本发明的创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法中，通过对芦笋笋条进行启动培养后，依次重复采用三次特定含量及pH的高盐胁迫诱导（一次增殖培养）、特定含量及pH的低盐胁迫诱导（二次增殖培养）、特定盐碱成分组成、含量及pH的盐碱混合胁迫诱导（三次增殖培养），同时在一至三次增殖培养中采用含有特定含量褪黑素和IAA的培养基，进行创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培，能够获得耐受含盐量大于6‰，pH值大于8.5的芦笋种质，弥补现有技术对于耐中重度盐碱芦笋新品种选育方法方面的研究不足，克服现有的芦笋种质资源仅能够适应于低度盐碱地种植，无法耐受中重度盐碱土壤环境的问题；同时，通过本发明的创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法，创制获得的芦笋种质的耐盐碱性能稳定，适用于规模化作业。
2）经试验，采用本发明的创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法，创制获得的耐中重度盐碱芦笋种质试管苗，在Na2CO3含量为1.77g/L、Na2SO4含量为2.37g/L、NaHCO3含量为2.8g/L、NaCl含量为1.95g/L，pH值为9.5的培养基中培养20天，试管苗能够有效适应高盐碱环境，对高盐碱环境的应激反应不明显，生长状态良好，根系正常生长，表现出拟叶密，分枝多的特性。
3）本发明的创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法，能够有效克服现有创制芦笋耐盐碱种质方法存在的育年限长、育种效率低下、创制成本高的问题；有效提高育种效率，减少育种年限，采用本发明的组培方法仅需要1年半的时间就可以获得大量的耐中重度盐碱芦笋种质。
4）本发明的创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法，能够为耐盐碱芦笋品种的选育提供大量耐高度盐碱的试验基础材料，加快耐盐碱芦笋品种的选育进程，也有利于耐盐碱芦笋品种的多样性；同时，耐盐碱芦笋品种的选育将会为中重度盐碱地的开发利用提供新的方向，进一步提高中重度盐碱土地的利用率，增加盐碱地经济收益。
附图说明
图1为实施例1中一次增殖培养获得的正常增殖组织图；
图2为实施例1中继代增殖培养获得的继代组织图；
图3为实施例1中生根培养获得的完整试管苗图；
图4为对比例1的生长状态对比图；
图5为对比例2的生长状态对比图；
图6为对比例3中①的生长状态对比图；
图7为对比例3中②的生长状态对比图；
图8为对比例3中③的生长状态对比图；
图9为对比例3中④的生长状态对比图；
图10为对比例3中⑤的生长状态对比图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现说明本发明的具体实施方式。
实施例1
本实施例提供一种创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法，具体为：
1、启动培养
首先选取确定采用的高产优质芦笋种质，具体是，根据芦笋笋条的外观形态、口感风味、产量、生育指数、病情指数等，选取综合性状好的芦笋为高产优质芦笋种质。
本实施例中采用的高产优质芦笋种质为芦笋品种“鲁芦笋七号”中的优良雄株（材料一）。
选取该高产优质芦笋种质中前一年度未受过病虫害的露地种植芦笋，于当年的4月中旬到5月期间，选择从地里冒出来粗细均匀，直径在2.0-2.2cm范围内，高度为20cm左右，且鳞片包裹紧实的笋条；贴地从笋条基部切取，获得优质新鲜笋条；接种于Y-1启动培养基中培养，控制培养温度为26℃，光照时间为每天12小时，光照强度为2800Lx，培养时间为20天；经四代继代培养，获得增殖芦笋试管苗。
其中，Y-1启动培养基的配方为：MS+6-BA 1.2mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖45g/L+琼脂粉5g/L，pH值为5.8。
MS培养基为改良MS基础培养基，具体成分及含量为：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇1.0mg/L，烟酸0.5mg/L，维生素H 1.0mg/L。
6-BA为6-苄氨基嘌呤。
NAA为1-萘乙酸。
2、一次增殖培养
将上一步骤经四代继代培养获得的增殖芦笋试管苗，接种于NaCl含量为10g/L，pH值为6.2的Y-2增殖培养基中培养，控制培养温度为26℃，光照时间为每天12小时，光照强度为2800Lx，培养时间为18天；此时大部分组织会开始玻璃化，停止增殖，获得正常增殖的组织（如说明书附图1所示）。
其中，Y-2增殖培养基的配方为：MS+6-BA 0.8mg/L+IAA 0.1mg/L+褪黑素0.05mg/L+蔗糖45g/L+琼脂粉5g/L。
Y-2增殖培养基中采用的MS培养基与前述步骤相同。
IAA为吲哚-3-乙酸。
3、二次增殖培养
将一次增殖培养后的正常增殖的组织，接种于NaCl含量为3g/L，pH值为6.2的Y-2增殖培养基中，继代培养36天，获得二次增殖组织。
其中，二次增殖培养的培养条件与Y-2增殖培养基，均与一次增殖培养相同。即二次增殖培养的培养温度为26℃，光照时间为每天12小时，光照强度为2800Lx；Y-2增殖培养基的配方为：MS+6-BA 0.8mg/L+IAA 0.1mg/L+褪黑素0.05mg/L+蔗糖45g/L+琼脂粉5g/L。
4、三次增殖培养
将二次增殖组织转入至含有Na2CO31.77g/L+Na2SO42.37g/L+NaHCO32.8g/L+NaCl1.95g/L，pH值为9.5的Y-2增殖培养基中培养15天，此时大部分组织会出现失绿、变白、褐化直至死亡的情况；将存活的增殖组织转入NaCl含量为3g/L，pH值为6.2的Y-2增殖培养基中，继代培养35天，获得三次增殖组织。
其中，三次增殖培养的培养条件与Y-2增殖培养基，均与一次增殖培养相同。即三次增殖培养的培养温度为26℃，光照时间为每天12小时，光照强度为2800Lx；Y-2增殖培养基的配方为：MS+6-BA 0.8mg/L+IAA 0.1mg/L+褪黑素0.05mg/L+蔗糖45g/L+琼脂粉5g/L。
5、继代增殖培养
针对三次增殖组织，重复前述一次增殖培养（高盐胁迫诱导）、二次增殖培养（低盐胁迫诱导）、三次增殖培养（盐碱混合胁迫诱导）的操作两次，获得生长健壮的继代组织（如说明书附图2所示）。
6、生根培养
将获得的生长健壮的继代组织，截取茎尖转入Y-3生根培养基中培养，控制培养温度为28℃，光照时间为每天14小时，光照强度为2800Lx，培养时间为24天，获得完整试管苗（如说明书附图3所示）。
其中，Y-3生根培养基的配方为：1/2MS+KT 0.05mg/L+IBA 1.0mg/L+IAA 0.1mg/L+Ancymidol 0.1mg/L+褪黑素0.05mg/L+蔗糖25g/L+琼脂粉5g/L。
Y-3生根培养基中采用的MS培养基与前述步骤相同。1/2MS表示MS培养基中大量元素含量为原有水平的50%。
KT为植物生长调节剂KT。
IBA为吲哚丁酸。
Ancymidol为嘧啶醇。
7、转接培养
将获得的完整试管苗接种于Na2CO31.77g/L+Na2SO42.37g/L+NaHCO32.8g/L+NaCl1.95g/L，pH值为9.5的Y-4转接培养基中培养，控制培养温度为26℃，光照时间为每天14小时，光照强度为2800Lx，培养时间为24天；获得健壮的试管苗，并进行过渡移栽种植，完成创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培，获得耐中重度盐碱芦笋种质。
其中，Y-4转接培养基的配方为：1/2MS+褪黑素0.05mg/L+蔗糖18g/L+琼脂粉2.5g/L。
Y-4转接培养基中采用的MS培养基与前述步骤相同。1/2MS表示MS培养基中大量元素含量为原有水平的50%。
实施例2
本实施例提供一种创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法，具体为：
1、启动培养
首先选取确定采用的高产优质芦笋种质，具体是，根据芦笋笋条的外观形态、口感风味、产量、生育指数、病情指数等，选取综合性状好的芦笋为高产优质芦笋种质。
本实施例中采用的高产优质芦笋种质为芦笋品种“冠军”中的优良雄株（材料二）。
选取该高产优质芦笋种质中前一年度未受过病虫害的露地种植芦笋，于当年的4月中旬到5月期间，选择从地里冒出来粗细均匀，直径在1.8-2.0cm范围内，高度为20cm左右，且鳞片包裹紧实的笋条；贴地从笋条基部切取，获得优质新鲜笋条；接种于Y-1启动培养基中培养，控制培养温度为25℃，光照时间为每天14小时，光照强度为2500Lx，培养时间为21天；经四代继代培养，获得增殖芦笋试管苗。
其中，Y-1启动培养基的配方为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖45g/L+琼脂粉5g/L，pH值为5.8。
MS培养基为改良MS基础培养基，具体成分及含量为：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇1.0mg/L，烟酸0.5mg/L，维生素H 1.0mg/L。
6-BA为6-苄氨基嘌呤。
NAA为1-萘乙酸。
2、一次增殖培养
将上一步骤经四代继代培养获得的增殖芦笋试管苗，接种于NaCl含量为9.5g/L，pH值为6.2的Y-2增殖培养基中培养，控制培养温度为25℃，光照时间为每天14小时，光照强度为2500Lx，培养时间为20天；此时大部分组织会开始玻璃化，停止增殖，获得正常增殖的组织。
其中，Y-2增殖培养基的配方为：MS+6-BA 0.6mg/L+IAA 0.1mg/L+褪黑素0.05mg/L+蔗糖45g/L+琼脂粉5g/L。
Y-2增殖培养基中采用的MS培养基与前述步骤相同。
IAA为吲哚-3-乙酸。
3、二次增殖培养
将一次增殖培养后的正常增殖的组织，接种于NaCl含量为3.2g/L，pH值为6.2的Y-2增殖培养基中，继代培养30天，获得二次增殖组织。
其中，二次增殖培养的培养条件与Y-2增殖培养基，均与一次增殖培养相同。即二次增殖培养的培养温度为25℃，光照时间为每天14小时，光照强度为2500Lx；Y-2增殖培养基的配方为：MS+6-BA 0.6mg/L+IAA 0.1mg/L+褪黑素0.05mg/L+蔗糖45g/L+琼脂粉5g/L。
4、三次增殖培养
将二次增殖组织转入至含有Na2CO31.77g/L+Na2SO42.37g/L+NaHCO32.8g/L+NaCl1.95g/L，pH值为9.5的Y-2增殖培养基中培养14天，此时大部分组织会出现失绿、变白、褐化直至死亡的情况；将存活的增殖组织转入NaCl含量为3g/L，pH值为6.2的Y-2增殖培养基中，继代培养30天，获得三次增殖组织。
其中，三次增殖培养的培养条件与Y-2增殖培养基，均与一次增殖培养相同。即三次增殖培养的培养温度为25℃，光照时间为每天14小时，光照强度为2500Lx；Y-2增殖培养基的配方为：MS+6-BA 0.6mg/L+IAA 0.1mg/L+褪黑素0.05mg/L+蔗糖45g/L+琼脂粉5g/L。
5、继代增殖培养
针对三次增殖组织，重复前述一次增殖培养（高盐胁迫诱导）、二次增殖培养（低盐胁迫诱导）、三次增殖培养（盐碱混合胁迫诱导）的操作两次，获得生长健壮的继代组织。
6、生根培养
将获得的生长健壮的继代组织，截取直径在1.0-2.0mm范围内的茎段转入Y-3生根培养基中培养，控制培养温度为27℃，光照时间为每天15小时，光照强度为2500Lx，培养时间为21天，获得完整试管苗。
其中，Y-3生根培养基的配方为：1/2MS+KT 0.05mg/L+IBA 1.0mg/L+IAA 0.1mg/L+Ancymidol 0.1mg/L+褪黑素0.05mg/L+蔗糖25g/L+琼脂粉5g/L。
Y-3生根培养基中采用的MS培养基与前述步骤相同。1/2MS表示MS培养基中大量元素含量为原有水平的50%。
KT为植物生长调节剂KT。
IBA为吲哚丁酸。
Ancymidol为嘧啶醇。
7、转接培养
将获得的完整试管苗接种于Na2CO31.77g/L+Na2SO42.37g/L+NaHCO32.8g/L+NaCl1.95g/L，pH值为9.5的Y-4转接培养基中培养，控制培养温度为27℃，光照时间为每天15小时，光照强度为2500Lx，培养时间为21天；获得健壮的试管苗，并进行过渡移栽种植，完成创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培，获得耐中重度盐碱芦笋种质。
其中，Y-4转接培养基的配方为：1/2MS+褪黑素0.05mg/L+蔗糖18g/L+琼脂粉2.5g/L。
Y-4转接培养基中采用的MS培养基与前述步骤相同。1/2MS表示MS培养基中大量元素含量为原有水平的50%。
实施例3
本实施例提供一种创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法，具体为：
1、启动培养
首先选取确定采用的高产优质芦笋种质，具体是，根据芦笋笋条的外观形态、口感风味、产量、生育指数、病情指数等，选取综合性状好的芦笋为高产优质芦笋种质。
本实施例中采用的高产优质芦笋种质为芦笋品种“鲁芦笋七号”中的优良雄株（材料一）。
选取该高产优质芦笋种质中前一年度未受过病虫害的露地种植芦笋，于当年的4月中旬到5月期间，选择从地里冒出来粗细均匀，直径在2.0-2.2cm范围内，高度为20cm左右，且鳞片包裹紧实的笋条；贴地从笋条基部切取，获得优质新鲜笋条；接种于Y-1启动培养基中培养，控制培养温度为24℃，光照时间为每天13.5小时，光照强度为3000Lx，培养时间为18天；经四代继代培养，获得增殖芦笋试管苗。
其中，Y-1启动培养基的配方为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖45g/L+琼脂粉5g/L，pH值为5.8。
MS培养基为改良MS基础培养基，具体成分及含量为：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇1.0mg/L，烟酸0.5mg/L，维生素H 1.0mg/L。
6-BA为6-苄氨基嘌呤。
NAA为1-萘乙酸。
2、一次增殖培养
将上一步骤经四代继代培养获得的增殖芦笋试管苗，接种于NaCl含量为9.8g/L，pH值为6.2的Y-2增殖培养基中培养，控制培养温度为24℃，光照时间为每天13小时，光照强度为3000Lx，培养时间为16天；此时大部分组织会开始玻璃化，停止增殖，获得正常增殖的组织。
其中，Y-2增殖培养基的配方为：MS+6-BA 0.6mg/L+IAA 0.1mg/L+褪黑素0.05mg/L+蔗糖45g/L+琼脂粉5g/L。
Y-2增殖培养基中采用的MS培养基与前述步骤相同。
IAA为吲哚-3-乙酸。
3、二次增殖培养
将一次增殖培养后的正常增殖的组织，接种于NaCl含量为3.5g/L，pH值为6.2的Y-2增殖培养基中，继代培养40天，获得二次增殖组织。
其中，二次增殖培养的培养条件与Y-2增殖培养基，均与一次增殖培养相同。即二次增殖培养的培养温度为24℃，光照时间为每天13小时，光照强度为3000Lx；Y-2增殖培养基的配方为：MS+6-BA 0.6mg/L+IAA 0.1mg/L+褪黑素0.05mg/L+蔗糖45g/L+琼脂粉5g/L。
4、三次增殖培养
将二次增殖组织转入至含有Na2CO31.77g/L+Na2SO42.37g/L+NaHCO32.8g/L+NaCl1.95g/L，pH值为9.5的Y-2增殖培养基中培养12天，此时大部分组织会出现失绿、变白、褐化直至死亡的情况；将存活的增殖组织转入NaCl含量为3g/L，pH值为6.2的Y-2增殖培养基中，继代培养40天，获得三次增殖组织。
其中，三次增殖培养的培养条件与Y-2增殖培养基，均与一次增殖培养相同。即三次增殖培养的培养温度为24℃，光照时间为每天13小时，光照强度为3000Lx；Y-2增殖培养基的配方为：MS+6-BA 0.6mg/L+IAA 0.1mg/L+褪黑素0.05mg/L+蔗糖45g/L+琼脂粉5g/L。
5、继代增殖培养
针对三次增殖组织，重复前述一次增殖培养（高盐胁迫诱导）、二次增殖培养（低盐胁迫诱导）、三次增殖培养（盐碱混合胁迫诱导）的操作两次，获得生长健壮的继代组织。
6、生根培养
将获得的生长健壮的继代组织，截取直径在1.0-2.0mm范围内的茎段转入Y-3生根培养基中培养，控制培养温度为26℃，光照时间为每天16小时，光照强度为3000Lx，培养时间为30天，获得完整试管苗。
其中，Y-3生根培养基的配方为：1/2MS+KT 0.05mg/L+IBA 1.0mg/L+IAA 0.1mg/L+Ancymidol 0.1mg/L+褪黑素0.05mg/L+蔗糖25g/L+琼脂粉5g/L。
Y-3生根培养基中采用的MS培养基与前述步骤相同。1/2MS表示MS培养基中大量元素含量为原有水平的50%。
KT为植物生长调节剂KT。
IBA为吲哚丁酸。
Ancymidol为嘧啶醇。
7、转接培养
将获得的完整试管苗接种于Na2CO31.77g/L+Na2SO42.37g/L+NaHCO32.8g/L+NaCl1.95g/L，pH值为9.5的Y-4转接培养基中培养，控制培养温度为28℃，光照时间为每天16小时，光照强度为3000Lx，培养时间为28天；获得健壮的试管苗，并进行过渡移栽种植，完成创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培，获得耐中重度盐碱芦笋种质。
其中，Y-4转接培养基的配方为：1/2MS+褪黑素0.05mg/L+蔗糖18g/L+琼脂粉2.5g/L。
Y-4转接培养基中采用的MS培养基与前述步骤相同。1/2MS表示MS培养基中大量元素含量为原有水平的50%。
对比例1
实施例1的技术方案中，完成生根培养步骤后，将完整试管苗转接至NaCl含量为10g/L的Y-4增殖培养基中，采用原转接培养条件进行培养，记录材料在Y-4转接培养基中培养至15天时的生长状态，标记为C组。
同时在对比例1中设置A组：采用实施例1的高产优质芦笋种质（“鲁芦笋七号”优良雄株）和组培方法，其不同之处为：不采用原有的一次增殖培养（高盐胁迫诱导）、二次增殖培养（低盐胁迫诱导）、三次增殖培养（盐碱混合胁迫诱导），采用不含盐碱成分的Y-2增殖培养基，进行常规培养（即不进行胁迫诱导）。完成生根培养步骤后，将完整试管苗转接至NaCl含量为10g/L的Y-4增殖培养基中，采用原转接培养条件进行培养，记录材料在Y-4转接培养基中培养至15天时的生长状态。
在对比例1中设置B组：采用实施例1的组培方法，其不同之处为：不采用原有的一次增殖培养（高盐胁迫诱导）、二次增殖培养（低盐胁迫诱导）、三次增殖培养（盐碱混合胁迫诱导），修改为在一次增殖培养、二次增殖培养、三次增殖培养中，均采用NaCl含量为9.5g/L的Y-2增殖培养基，持续进行高盐胁迫诱导培养。完成生根培养步骤后，将完整试管苗转接至NaCl含量为10g/L的Y-4增殖培养基中，采用原转接培养条件进行培养，记录材料在Y-4转接培养基中培养至15天时的生长状态。
具体生长状态的对比结果见说明书附图4。
对比例2
实施例2的技术方案中，在转接培养步骤中，将完整试管苗转接至Na2CO31.77g/L+Na2SO42.37g/L+NaHCO32.8g/L+NaCl 1.95g/L，pH值为9.5的Y-4转接培养基中进行培养，记录材料在Y-4转接培养基中培养至15天时的生长状态，标记为C组。
同时在对比例2中设置A组：采用实施例2的高产优质芦笋种质（“冠军”优良雄株）和组培方法，其不同之处为：不采用原有的一次增殖培养（高盐胁迫诱导）、二次增殖培养（低盐胁迫诱导）、三次增殖培养（盐碱混合胁迫诱导），采用不含盐碱成分的Y-2增殖培养基，进行常规培养（即不进行胁迫诱导）。在转接培养步骤中，将完整试管苗转接至Na2CO31.77g/L+Na2SO42.37g/L+NaHCO32.8g/L+NaCl 1.95g/L，pH值为9.5的Y-4转接培养基中进行培养，记录材料在Y-4转接培养基中培养至15天时的生长状态。
在对比例2中设置B组：采用实施例2的组培方法，其不同之处为：不采用原有的一次增殖培养（高盐胁迫诱导）、三次增殖培养（盐碱混合胁迫诱导），修改为在一次增殖培养、二次增殖培养、三次增殖培养中，均采用NaCl含量为9.5g/L的Y-2增殖培养基，持续进行高盐胁迫诱导培养。在转接培养步骤中，将完整试管苗转接至Na2CO31.77g/L+Na2SO42.37g/L+NaHCO32.8g/L+NaCl 1.95g/L，pH值为9.5的Y-4转接培养基中进行培养，记录材料在Y-4转接培养基中培养至15天时的生长状态。
具体生长状态的对比结果见说明书附图5。
通过附图4可以看出，对比例1中C组和B组获得的芦笋植株，在NaCl含量为10g/L的Y-4增殖培养基中培养15天，生长状态无显著差异，均能够在高盐环境中保持绿色存活状态；对比例1中A组与其他组差异明显，生长状态差，根部失去活性，已停止生长，无法适应高盐环境。
通过附图5可以看出，对比例2中A-C组获得的芦笋植株，在Na2CO31.77g/L+Na2SO42.37g/L+NaHCO32.8g/L+NaCl 1.95g/L，pH值为9.5的Y-4转接培养基中培养15天，生长差异明显。其中C组生长状态良好，能够在盐碱环境中保持绿色存活状态，其盐碱环境对于C组植株无明显不良影响；B组植株的部分已经失绿变黄，根部也失去活性，停止生长；A组生长状态最差，根部完全失去活性，已停止生长，明显无法适应高盐环境。
通过对比例1和对比例2的对比结果可以看出，采用本发明的创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法获得的芦笋植株，耐盐碱性出现显著的提高，而且在胁迫诱导过程中，通过一次增殖培养（高盐胁迫诱导）、二次增殖培养（低盐胁迫诱导）、三次增殖培养（盐碱混合胁迫诱导）获得的植株，比一直使用NaCl进行高盐胁迫诱导获得的植株，其盐碱适应范围更广，耐盐碱能力更强。
结果表明，采用本发明的创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法获得的芦笋植株的耐中重度盐碱性能，明显优于仅采用高盐胁迫培养以及常规培养所获得的芦笋植株。
对比例3
为验证褪黑素和IAA在创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法中的协同作用，设置以下对比试验：
①实施例1的芦笋增殖组织经一次增殖培养、二次增殖培养、三次增殖培养后，分别转入至NaCl含量为10g/L的以下培养基中：
增殖培养基A：MS+6-BA 0.8mg/L+NAA 0.1mg/L；
增殖培养基B：MS+6-BA 0.8mg/L+IAA 0.1mg/L+褪黑素0.05mg/L。
控制培养温度为26℃，光照时间为每天12小时，光照强度为2800Lx，培养20天时，记录生长状态，生长状态对比图具体如说明书附图6所示。
②实施例1的芦笋增殖组织经两轮次的一次增殖培养、二次增殖培养、三次增殖培养后，分别转入至NaCl含量为10g/L的以下培养基中：
增殖培养基A：MS+6-BA 0.8mg/L+NAA 0.1mg/L；
增殖培养基B：MS+6-BA 0.8mg/L+IAA 0.1mg/L+褪黑素0.05mg/L。
控制培养温度为26℃，光照时间为每天12小时，光照强度为2800Lx，培养20天时，记录生长状态，生长状态对比图具体如说明书附图7所示。
③实施例2的芦笋增殖组织经一次增殖培养、二次增殖培养、三次增殖培养后，分别转入至NaCl含量为10g/L的以下培养基中：
增殖培养基A：MS+6-BA 0.6mg/L+NAA 0.1mg/L；
增殖培养基B：MS+6-BA 0.6mg/L+IAA 0.1mg/L+褪黑素0.05mg/L。
控制培养温度为26℃，光照时间为每天12小时，光照强度为2800Lx，培养20天时，记录生长状态，生长状态对比图具体如说明书附图8所示。
④实施例2的芦笋增殖组织经两轮次的一次增殖培养、二次增殖培养、三次增殖培养后，分别转入至NaCl含量为10g/L的以下培养基中：
增殖培养基A：MS+6-BA 0.6mg/L+NAA 0.1mg/L；
增殖培养基B：MS+6-BA 0.6mg/L+IAA 0.1mg/L+褪黑素0.05mg/L。
控制培养温度为26℃，光照时间为每天12小时，光照强度为2800Lx，培养20天时，记录生长状态，生长状态对比图具体如说明书附图9所示。
⑤采用褪黑素和IAA配合进行胁迫诱导：实施例1的技术方案中，一次增殖培养、二次增殖培养、三次增殖培养中按量添加褪黑素和IAA；生根培养中按量添加褪黑素和IAA；在转接培养步骤中，将完整试管苗转接至Na2CO31.77g/L+Na2SO42.37g/L+NaHCO32.8g/L+NaCl1.95g/L，pH值为9.5的Y-4转接培养基中进行培养，记录材料在Y-4转接培养基中培养至15天时的生长状态；具体见说明书附图10中的右图。
不采用褪黑素和IAA进行胁迫诱导：实施例1的技术方案中，一次增殖培养、二次增殖培养、三次增殖培养所采用的增殖培养基中，均省略褪黑素和IAA的使用；生根培养中采用的生根培养基省略褪黑素和IAA的使用；在转接培养步骤中，将完整试管苗转接至Na2CO31.77g/L+Na2SO42.37g/L+NaHCO32.8g/L+NaCl 1.95g/L，pH值为9.5的Y-4转接培养基中进行培养，记录材料在Y-4转接培养基中培养至15天时的生长状态；具体见说明书附图10中的左图。
从附图6-10可以看出，本发明在创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法中采用褪黑素和IAA协同配合重复进行三次高盐胁迫诱导、低盐胁迫诱导、盐碱混合胁迫诱导过程，能够有效提高芦笋的耐盐碱能力，获得的芦笋材料受到盐碱胁迫产生的应激反应明显弱于不采用褪黑素和IAA进行胁迫诱导的芦笋材料。
同时，芦笋材料在不采用褪黑素和IAA的培养基中进行胁迫诱导过程中，芦笋颜色变紫的概率显著提高，且培养获得的株形也明显偏小，受盐碱胁迫产生的应激反应更明显；本发明的在创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法中采用褪黑素和IAA协同配合降低盐碱环境对芦笋材料的伤害程度。对比例3的⑤中，在最终获得完整芦笋植株后，转入至含盐碱的转接培养基中培养15天，发现组培胁迫过程中不添加IAA和褪黑素获得的芦笋材料根部受盐碱的影响大，部分芦笋材料的根尖部分出现受损变色情况，根部生长较为迟缓；而添加IAA和褪黑素配合进行胁迫诱导获得的芦笋材料，根部生长虽然较其在正常环境中稍慢，但根部没有受损，根系发育正常。而且从外形来看，添加IAA和褪黑素获得的芦笋材料比不添加IAA和褪黑素的株形更大，拟叶更密，分枝更多；本发明的在创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法中采用的褪黑素和IAA能够有效被芦笋材料吸收利用，提高其对于中重度盐碱的耐受能力。
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法，其特征在于，由以下步骤组成：启动培养、一次增殖培养、二次增殖培养、三次增殖培养、继代增殖培养、生根培养、转接培养；
所述启动培养的方法为，切取获得芦笋笋条，接种于Y-1启动培养基中，经四代继代培养，获得增殖芦笋试管苗；
所述Y-1启动培养基的原料及含量为：MS培养基、6-BA 1.0-1.2mg/L、NAA 0.1mg/L、蔗糖45g/L、琼脂粉5g/L；Y-1启动培养基的pH值为5.8；
所述一次增殖培养的方法为，将所述增殖芦笋试管苗，接种于NaCl含量为9.5-10g/L，pH值为6.2的Y-2增殖培养基中，培养16-20天，获得正常增殖的组织；
所述一次增殖培养中，Y-2增殖培养基的原料及含量为：MS培养基、6-BA 0.6-0.8mg/L、IAA 0.1mg/L、褪黑素0.05mg/L、蔗糖45g/L、琼脂粉5g/L；
所述二次增殖培养的方法为，将一次增殖培养后的正常增殖的组织，接种于NaCl含量为3-3.5g/L，pH值为6.2的Y-2增殖培养基中，继代培养30-40天，获得二次增殖组织；
所述二次增殖培养中，Y-2增殖培养基的原料及含量为：MS培养基、6-BA 0.6-0.8mg/L、IAA 0.1mg/L、褪黑素0.05mg/L、蔗糖45g/L、琼脂粉5g/L；
所述三次增殖培养的方法为，将二次增殖组织，接种于Na2CO3含量为1.77g/L、Na2SO4含量为2.37g/L、NaHCO3含量为2.8g/L、NaCl含量为1.95g/L，pH值为9.5的Y-2增殖培养基中培养12-15天后；将存活的增殖组织转入至NaCl含量为3g/L，pH值为6.2的Y-2增殖培养基中，继代培养30-40天，获得三次增殖组织；
所述三次增殖培养中，Y-2增殖培养基的原料及含量为：MS培养基、6-BA 0.6-0.8mg/L、IAA 0.1mg/L、褪黑素0.05mg/L、蔗糖45g/L、琼脂粉5g/L；
所述Y-1启动培养基和Y-2增殖培养基中，采用的MS培养基的原料及含量为：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇1.0mg/L，烟酸0.5mg/L，维生素H1.0mg/L；
所述继代增殖培养的方法为，采用三次增殖组织重复一次增殖培养、二次增殖培养、三次增殖培养的操作两次，获得继代组织；
所述继代组织经生根培养、转接培养，获得耐中重度盐碱芦笋种质。
2.根据权利要求1所述的创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法，其特征在于，所述一次增殖培养中，培养温度为24-26℃，光照时间为每天12-14小时，光照强度为2500-3000Lx；
所述二次增殖培养中，培养温度为24-26℃，光照时间为每天12-14小时，光照强度为2500-3000Lx；
所述三次增殖培养中，培养温度为24-26℃，光照时间为每天12-14小时，光照强度为2500-3000Lx。
3.根据权利要求1所述的创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法，其特征在于，所述启动培养中，培养温度为24-26℃，光照时间为每天12-14小时，光照强度为2500-3000Lx，培养时间为18-21天。
4.根据权利要求1所述的创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法，其特征在于，所述生根培养的方法为，采用继代组织，截取茎尖或者直径在1.0-2.0mm范围内的茎段，转入Y-3生根培养基中培养，培养时间为21-30天，获得完整试管苗；
所述Y-3生根培养基的原料及含量为：1/2MS培养基、KT 0.05mg/L、IBA 1.0mg/L、IAA0.1mg/L、Ancymidol 0.1mg/L、褪黑素0.05mg/L、蔗糖25g/L、琼脂粉5g/L。
5.根据权利要求4所述的创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法，其特征在于，所述生根培养中，培养温度为26-28℃，光照时间为每天14-16小时，光照强度为2500-3000Lx。
6.根据权利要求1所述的创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法，其特征在于，所述转接培养的方法为，将生根培养获得的完整试管苗，接种于Na2CO3含量为1.77g/L、Na2SO4含量为2.37g/L、NaHCO3含量为2.8g/L、NaCl含量为1.95g/L，PH值为9.5的Y-4转接培养基中培养21-28天，获得试管苗并进行过渡移栽种植，获得耐中重度盐碱芦笋种质；
所述Y-4转接培养基的原料及含量为：1/2MS培养基、褪黑素0.05mg/L、蔗糖18g/L、琼脂粉2.5g/L。
7.根据权利要求6所述的创制耐中重度盐碱芦笋种质的组培方法，其特征在于，所述转接培养中，培养温度为26-28℃，光照时间为每天14-16小时，光照强度为2500-3000Lx。
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