CN117756933A - 抗鼠疫耶尔森氏菌的重链抗体或其抗原结合片段及其相关生物材料与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗鼠疫耶尔森氏菌的重链抗体或其抗原结合片段及其相关生物材料与应用，属于生物技术领域。本发明提供的抗体的重链可变区中HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次为SEQ ID No.1的第26‑33位、第51‑58位、第97‑110位。本发明所提供的抗体能够特异性结合鼠疫菌保护性抗原F1蛋白，能够中和鼠疫菌，可完全保护小鼠免受50倍LD50鼠疫菌肺递送攻击。本发明所提供的抗体可用于鼠疫菌感染的防治，具有重要的生物学和医学意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及抗鼠疫耶尔森氏菌的重链抗体或其抗原结合片段及其相关生物材料与应用。
背景技术
鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis，简称鼠疫菌/鼠疫杆菌)感染引起的一种人畜共患传染病，其传染性强，病程进展块，病死率极高。
目前对鼠疫的临床治疗主要采用抗生素，但抗生素的使用易产生耐药株，目前已分离出鼠疫耶尔森菌的多重耐药菌株，因此研究新的治疗手段就显得尤为重要。目前，还没有获得批准供人类使用的鼠疫疫苗。当前的候选亚单位疫苗由两种保护性抗原F1和LcrV配制而成。两种抗原都会引发中和抗体反应，这些中和抗体可直接作用于细菌，从而使宿主清除感染。因此特异性的鼠疫中和抗体用于鼠疫治疗是未来的一个重要发展方向。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供有保护效果的抗鼠疫耶尔森氏菌的抗体。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明的目的是提供一株鼠疫中和抗体及其应用。
第一方面，本发明要求保护抗鼠疫耶尔森氏菌的重链抗体或其抗原结合片段。
本发明要求保护抗鼠疫耶尔森氏菌的重链抗体或其抗原结合片段，所述重链抗体或其抗原结合片段含有名称为HCDR1、HCDR2和HCDR3的三个互补决定区，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别为是SEQ ID No.1的第26-33位、SEQ ID No.1的第51-58位、SEQID No.1的第97-110位。
上述互补决定区的序列根据Kabat定义。
进一步地，所述重链抗体或其抗原结合片段包括重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.1，或者与SEQ ID No.1具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(FR))。
在本发明保护范围内，所述抗体可为全长抗体、单链Fv片段、Fab片段、F(ab’)2片段等各种形式。
在本发明的具体实施方式中，所述全长抗体的重链恒定区为IgG1亚型。
具体地，所述重链抗体为FW3-R1-Fc、FW3-R3-Fc和FW3-Fc，所述FW3-R1-Fc的氨基酸序列为SEQ ID No.10，所述FW3-R3-Fc的氨基酸序列为SEQ ID No.12，所述FW3-Fc的氨基酸序列为SEQ ID No.4，或者与SEQ ID No.10、SEQ ID No.12或SEQ ID No.4具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(FR))。
具体地，所述抗原结合片段为单域抗体。所述单域抗体的氨基酸序列可为SEQIDNo.1。
上述术语“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。所述抗原结合片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常，当基于摩尔来表示活性时，所述抗原结合片段保留至少10％的母体结合活性。具体地，所述抗原结合片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。
第二方面，本发明要求保护生物材料，所述生物材料为如下任一种：
1)含有前述的重链抗体或其抗原结合片段的单克隆抗体；
2)含有前述的重链抗体或其抗原结合片段的小分子抗体。
所述小分子抗体可为如下任一种：
F1、Fab抗体；
F2、Fv抗体；
F3、单链抗体；
F4、Fab′片段。
术语“Fab′片段”含有一条抗体轻链和包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间区域的一条抗体重链的部分，由此可在两个Fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab′)2分子。
术语“F(ab′)2片段”含有两条轻链和两条包含CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab′)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。
术语“纳米抗体(单域抗体)”(VHH)为由抗体重链可变区组成的多肽。单域抗体可按照如下方法制备：将抗体重链可变区(VH)通过基因工程方法表达，获得仅含VH片段的抗体。单域抗体与抗原结合的能力及其稳定性，与完全抗体基本一致。
术语“最小识别单位(MRU)”是指仅含可变区中单一CDR结构，分子质量仅为完整抗体的1％左右，可结合相应抗原。
术语“Fab抗体”是由抗体的重链Fd和完整轻链通过二硫键结合而成的异二聚体，仅含一个抗原结合位点。可按照如下方法制备Fab抗体：将重链Fd和完整轻链的编码基因连接，融合细菌蛋白信号肽基因后可在大肠杆菌内分泌表达Fab抗体(Fab片段)，并有完整的立体折叠和链内、链间二硫键。所述重链Fd指Fab中约1/2的H链部分(约含225个氨基酸残基，包括VH、CH1和部分铰链区)。
术语“Fv抗体”是仅由抗体的重链可变区和轻链可变区组成的化合物。重链可变区和轻链可变区通过非共价键连接。可按照如下方法制备Fv抗体：可分别构建含有VH和VL基因的载体，共转染细胞，使之分别表达，再组装成功能性Fv抗体；也可在载体中的VH和VL之间设置终止密码，分别表达两个小分子蛋白片段，再通过非共价键结合而形成Fv抗体(Fv片段)。
术语“单链抗体”(ScFv)是用短肽将抗体的重链可变区和轻链可变区连接而成的多肽。可按照如下方法制备ScFv：是指用寡核苷酸接头(linker)连接轻链和重链可变区基因，使之表达单一的多肽链，称为单链抗体(ScFv)。多肽链能自发折叠成天然构象，保持Fv的特异性和亲和力。
第三方面，本发明要求保护一种核酸分子，所述核酸分子编码前述的重链抗体或其抗原结合片段。
进一步地，在所述核酸分子中，编码所述抗体的重链可变区中HCDR1、HCDR2和HCDR3的核苷酸序列分别为SEQ ID No.2自5’端起第76-99位、第151-174位、第289-330位。
更进一步地，在所述核酸分子中，编码所述抗体的所述重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID No.2或者与SEQ ID No.2具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(FR))。
更加具体地，在所述核酸分子中，编码所述抗体的重链的核苷酸序列为SEQIDNo.3或者与SEQ ID No.3具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(FR))。
第四方面，本发明要求保护含有前文第三方面所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌。
在本发明的具体实施方式中，将SEQ ID No.3(抗体重链的编码基因)克隆到pTSE-hFc载体的酶切位点Sal I和Nhel I之间后得到表达所述抗体的重链的重组表达载体；所述重组细胞为将上述分别表达所述抗体重链重组表达载体转染HEK293-F细胞后得到的重组细胞。
第五方面，本发明要求保护一种药物组合物。
本发明所要求保护的药物组合物包含前文第一方面中所述的抗体和生理上或药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
本文中，上述“生理上或药学上可接受的载体或稀释剂”是指对有机体无明显刺激作用，而且不会损害药物组合物中所述试剂的生物活性及性能的那些载体和稀释剂。
本文中，“生理上或药学上可接受的赋形剂”是指加到药物组合物中进一步有利于所述试剂的服用的惰性物质。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料。
第六方面，本发明要求保护如下任一所示应用：
(A1)前文第三方面中所述的核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌在制备前文第一方面中所述抗体或前文第五方面中所述药物组合物中的应用；
(A2)前文第一方面中所述抗体在制备前文第四方面中所述药物组合物中的应用；
(A3)前文第一方面中所述抗体或前文第三方面中所述核酸分子或前文第四方面中所述表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或前文第五方面中药物组合物在制备用于预防和/或治疗由鼠疫耶尔森氏菌感染所致疾病的产品中的应用；
(A4)前文第一方面中所述抗体或前文第三方面中所述核酸分子或前文第四方面中所述表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或前文第五方面中药物组合物在制备用于抑制鼠疫耶尔森氏菌感染的产品中的应用；
(A5)前文第一方面中所述抗体或前文第三方面中所述核酸分子或前文第四方面中所述表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或前文第五方面中药物组合物在制备用于检测鼠疫耶尔森氏菌的产品中的应用；
(A6)前文第一方面中所述抗体或前文第三方面中所述核酸分子或前文第四方面中所述表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或前文第五方面中药物组合物在制备用于中和鼠疫耶尔森氏菌的产品中的应用；
(A7)前文第一方面中所述抗体或前文第三方面中所述核酸分子或前文第四方面中所述表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或前文第五方面中药物组合物在制备用于检测鼠疫耶尔森氏菌的F1蛋白的产品中的应用；
(A8)前文第一方面中所述抗体或前文第三方面中所述核酸分子或前文第四方面中所述表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或前文第五方面中药物组合物在制备用于结合鼠疫耶尔森氏菌的F1蛋白的产品中的应用。
在本发明的具体实施方式中，所述鼠疫耶尔森氏菌具体为鼠疫耶尔森氏菌201株。
本发明制备了一种抗鼠疫菌的中和抗体。实验证明，该抗体能够特异性结合鼠疫菌保护性抗原F1蛋白，能够中和鼠疫菌，可完全保护小鼠免受50倍LD50鼠疫菌肺递送攻击。本发明所提供的抗体可用于鼠疫菌感染的防治，具有重要的生物学和医学意义。
附图说明
图1为纯化后的FW3-Fc抗体SDS-PAGE检测结果。
图2为抗体FW3-Fc与F1的结合能力检测。
图3为抗体FW3-Fc在小鼠体内中和活性检测。
图4为抗鼠疫人源化重链抗体与F1的结合能力检测。
图5为抗鼠疫人源化重链抗体在小鼠体内中和活性检测。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、抗体的发现
一、骆驼免疫及免疫抗体库的制备
取符合免疫要求用、健康无传染病、无实验用免疫史的骆驼一匹，免疫之前采血留本底血清。首次免疫取0.6mg鼠疫菌F1重组蛋白(实施例3步骤一制备)用弗氏完全佐剂乳化，骆驼皮下多点注射。间隔2周加强免疫，取0.6mg重组F1蛋白以弗氏不完全佐剂乳化，骆驼皮下多点注射，注射前采血，共进行四次加强免疫。五免后2周采集骆驼外周血150mL。
用淋巴细胞分离液(Stemcell，07851)分离外周血淋巴细胞。用RNA提取试剂盒(Omega，R6834)提取RNA，以提取的总RNA为模板，利用反转录试剂盒(Invitrogen，180180-051)反转录cDNA，引物采用试剂盒中的随机引物。然后以反转录得到的cDNA为模板，参考文献(Journal ofImmunological Methods，201(1997)，35–55)合成引物，通过巣氏PCR扩增单域抗体重链可变区基因，并克隆至pADSCFV-S载体(参见发明专利201510097117.0)，构建单域抗体库。经检测抗体库的库容达到2×108。
二、抗鼠疫杆菌F1蛋白单域抗体库的筛选
以F1重组蛋白(实施例3步骤一制备)为抗原，利用固相筛选策略(实验方案参考“噬菌体展示：通用实验指南/(美)克拉克森(Clackson,T)，(美)洛曼(Lowman,H.B.)编；马岚等译。化学工业出版社，2008.5”)筛选上述构建的骆驼单域抗体库，共进行三轮筛选，最终获得能特异性结合鼠疫杆菌F1蛋白的单域抗体，将其命名为FW3。FW3的氨基酸序列为SEQID No.1(对应的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2)。
SEQ ID No.1：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFSDYGMSWVRQAPGKDLEWVSGISNLGSYTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNSLKSEDTALYYCTRGGTLGTMTYPKYAGQGTQVTISS
SEQ ID No.2：
Gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtgcagcctggggggtctctgagactctcctgtgcagcctctggatttatcttcagtgattacgggatgagctgggtccgccaggctcctgggaaggacctggagtgggtgtcaggtattagtaatcttggaagttacacatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaatgccaagaacacgctgtctctgcaaatgaacagcctgaaatctgaggacacggccctgtattactgtacccggggaggtaccttagggactatgacgtatcccaaatacgcgggccaggggacccaggtcaccatctcctca
实施例2、抗鼠疫菌重链抗体的制备
将筛选到的骆驼单域抗体FW3融合人Fc改造为重链抗体，命名为FW3-Fc。过程如下：
一、重组质粒的构建
pTSE-hFc载体：记载于非专利文献“谢青,李志颖,张卫等.抗鼠疫菌保护性抗原V抗体的筛选与鉴定[J].中国病原生物学杂志,2022,17(03):266-271”，公众可从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
1、在FW3的核苷酸序列(SEQ ID No.2)的5'端添加CGGT四位碱基后将其插入pTSE-hFc(该载体带有人抗体Fc段)的Sal I和Nhe I酶切位点之间且保持其他核苷酸序列不变，得到可表达FW3融合人Fc的重链抗体FW3-Fc的重组表达载体pTSE-hFc-FW3-Fc。将在FW3的核苷酸序列(SEQ ID No.2)的5'端添加CGGT四位碱基后的序列插入pTSE-hFc载体后，CGGT四位碱基用于补齐pTSE-hFc载体上的信号肽的读码框。
重链抗体FW3-Fc，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
SEQ ID No.3：
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtgcagcctggggggtctctgagactctcctgtgcagcctctggatttatcttcagtgattacgggatgagctgggtccgccaggctcctgggaaggacctggagtgggtgtcaggtattagtaatcttggaagttacacatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaatgccaagaacacgctgtctctgcaaatgaacagcctgaaatctgaggacacggccctgtattactgtacccggggaggtaccttagggactatgacgtatcccaaatacgcgggccaggggacccaggtcaccatctcctcagctagcgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgctgcatgaggctctgcacagccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggtaaatga
SEQ ID No.4：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFSDYGMSWVRQAPGKDLEWVSGISNLGSYTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNSLKSEDTALYYCTRGGTLGTMTYPKYAGQGTQVTISSASDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID No.4中，自N端第1-121位氨基酸残基组成重链可变区VH(其中，第26-33位氨基酸残基组成HCDR1，第51-58位氨基酸残基组成HCDR2，第97-110位氨基酸残基组成HCDR3)，第122-350位氨基酸残基为重链恒定区和铰链区。
SEQ ID No.3所示的DNA分子编码SEQ ID No.4所示的多肽(重链)。SEQ ID No.3中，自5’端第1-363位核苷酸编码VH(其中，第76-99位核苷酸编码HCDR1，第151-174位核苷酸编码HCDR2，第289-330位核苷酸编码HCDR3)，第364-1050位核苷酸编码重链恒定区和铰链区，第1051-1053位核苷酸为终止密码子。
其中，互补决定区的序列根据Kabat定义。重链抗体FW3-Fc的铰链区、CH2和CH3来源于IgG1。
二、抗体的制备
1、抗体的表达
将上述步骤一构建好的表达质粒pTSE-hFc-FW3-Fc，利用转染试剂FectoPRO DNATransfection Reagent(Polyplus，116-001)转染FreeStyleTM HEK293-F细胞(Invitrogen，R79007)。具体如下：转染前一天选取生长状态良好的，密度在2-3×106/mL左右的FreeStyleTM HEK293-F细胞，离心去除上清，用FreeStyle 293培养基(Gibco，12338-018)重悬，调整细胞密度为1.0×106/mL，按30mL细胞悬液/瓶进行分装，37℃，5％CO2，125rpm，细胞摇床中震荡培养；转染当天，转染复合物制备：24μL的FectoPRO转染试剂稀释于3mLFreeStyle 293培养基，轻轻混匀，加入重链质粒24μg，混匀后室温放置10min；然后将混合溶液加到准备好的FreeStyleTM HEK293-F细胞中，轻轻混匀，放回细胞摇床中继续培养；转染后48小时开始监测细胞活度，在细胞活度降到80-85％时8,000rpm离心10min收集培养上清进行纯化。
2、抗体的纯化
收集的抗体表达上清用0.45μm滤膜过滤以去除杂质，利用HiTrapTMMabSelectXtra预装柱(GE，28-4082-58)进行纯化，洗脱液使用0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH3.0收集UV280>100时的洗脱峰。再用HitrapTM Dedalting层析柱置换缓冲液为PBS(pH7.4)，取部分样品SDS-PAGE检测和浓度检测，其余的分装冻存于-80℃备用。
图1为纯化后的FW3-Fc抗体SDS-PAGE检测结果。由图可见，纯化后的FW3-Fc抗体还原性样品有一条清晰的条带，分子约为40kDa，与预期相符。
3、抗体的定量
将纯化并置换后的抗体溶液用0.45μm滤膜过滤除菌，取样用NanoDrop紫外分光光度计(Thermo Scientific)测定蛋白浓度，浓缩至4mg/mL。
实施例3、FW3-Fc抗体的特异性结合能力检测
一、F1重组蛋白的制备
F1重组蛋白按照中国发明专利“一株鼠疫中和抗体及其应用”(ZL202210150974.2，授权公告号CN114560932B)第0066-0073段的方法制备。
二、FW3-Fc抗体与F1结合能力的检测
1、取F1重组蛋白(步骤一制备)，补碳酸盐包被缓冲液(pH 9.6)稀释至2μg/mL，按每孔100μL加入到酶标板(Corning，9018)中，每个样品设置3个复孔，4℃包被过夜；
2、取上述酶标板，PBST(PBS+0.1％Tween20)洗板6次，加入含有2％BSA的PBS封闭液，37℃孵育2h；
3、取上述酶标板，弃去封闭液，每孔加入100μL按照2倍倍比稀释的实施例2得到的FW3-Fc抗体(最高浓度为10μg/mL，125nmol/L)，一共设置23个梯度，37℃孵育90min；
4、取上述酶标板，PBST(PBS+0.1％Tween20)洗6次，每孔加入100μL的1：5000倍稀释酶标抗体-山羊抗人IgG-HRP(中杉金桥，ZB-2304)，37℃孵育45min；
5、取所述酶标板，然后PBST洗板6次，每孔加入100μL OPD底物显色液，室温下孵育10min；
6、每孔加入100μL 2M硫酸溶液终止反应；
7、酶标仪492nm/630nm双波长测定光密度值。
结果如图2所示。图中，横坐标为蛋白摩尔浓度的对数值，纵坐标为光密度值。分析显示FW3-Fc抗体与F1重组蛋白的结合能力为EC50＝0.00134nM。
实施例4、FW3-Fc抗体小鼠体内中和活性检测
用攻毒剂量为1000CFU(50×LD50)的鼠疫菌201株(记载于杨文慧等.鼠疫耶尔森氏菌人工气溶胶的沉降与衰亡空气生物学特性研究.军事医学,2019年9期”一文，按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用)以液体气溶胶肺递送方式(采用肺部液体定量雾化器，HRH-MAG4，北京慧荣和科技有限公司产品)攻毒小鼠(雌性6-8周龄Balb/C小鼠)，每组六只。分别在攻毒后3小时、6小时、12小时和24小时通过尾静脉对抗体组小鼠注射实施例2得到的抗体FW3-Fc，剂量分别为100μg(即图3中FW3-Fc 100μg组)、200μg(即图3中FW3-Fc 200μg组)、400μg(即图3中FW3-Fc400μg组)，注射体积均为100μL，对照组小鼠尾静脉注射生理盐水100μL，观察并记录攻毒后14天内各组小鼠生存情况，绘制生存曲线。
结果如图3所示，在50×LD50鼠疫菌201株攻击下，对照组小鼠在第5-6天已经全部死亡，FW3-Fc抗体400μg组在攻毒后3小时和6小时给药均可完全保护小鼠，存活率为100％(6/6)；在攻毒后12小时和24小时注射400μg FW3-Fc抗体可以保护50％的小鼠，存活率为50％(3/6)；FW3-Fc抗体200μg组在攻毒后3小时和6小时给药，小鼠存活率为66.7％(4/6)，在攻毒后12小时和24小时给药，小鼠存活率为33.3％(2/6)；FW3-Fc抗体100μg组在攻毒后3小时给药，小鼠存活率为83.3％(5/6)，在攻毒后6小时给药，小鼠存活率为66.7％(4/6)，在攻毒后12小时给药，小鼠存活率为16.7％(1/6)，在攻毒后24小时给药，小鼠存活率为33.3％(2/6)。由此可见，攻毒后越早给药、给药剂量越高，抗体的保护效果越好。
实施例5、抗鼠疫重链抗体FW3-Fc的人源化改造及活性评价
一、抗鼠疫重链抗体FW3-Fc的人源化改造
抗鼠疫重链抗体FW3-Fc的人源化改造委托三优生物医药(上海)有限公司完成，共获得8条人源化序列，其中FW3-R1和FW3-R3的中和活性较好，FW3-R1的基因序列为SEQ IDNO.5，FW3-R1的氨基酸序列为SEQ ID NO.6，FW3-R3的基因序列为SEQ ID NO.7，FW3-R1的氨基酸序列为SEQ ID NO.8。
将FW3-R1的核苷酸序列(SEQ ID No.5)和FW3-R3的核苷酸序列(SEQ ID No.7)的5'端分别添加CGGT四位碱基后插入pTSE-hFc(该载体带有人抗体Fc段)的Sal I和Nhe I酶切位点之间且保持其他核苷酸序列不变，分别得到可表达FW3-R1融合人Fc的重链抗体FW3-R1-Fc的重组表达载体pTSE-hFc-FW3-R1-Fc和FW3-R3融合人Fc的重链抗体FW3-R3-Fc的重组表达载体pTSE-hFc-FW3-R3-Fc。将在FW3-R1的核苷酸序列(SEQ ID No.5)或FW3-R3的核苷酸序列(SEQ ID No.7)的5'端添加CGGT四位碱基后的序列插入pTSE-hFc载体后，CGGT四位碱基用于补齐pTSE-hFc载体上的信号肽的读码框。
重链抗体FW3-R1-Fc，其氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。重链抗体FW3-R3-Fc，其氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。
SEQ ID No.10中，自N端第1-121位氨基酸残基组成重链可变区VH(其中，第26-33位氨基酸残基组成HCDR1，第51-58位氨基酸残基组成HCDR2，第97-110位氨基酸残基组成HCDR3)，第122-350位氨基酸残基为重链恒定区和铰链区。SEQ IDNo.12中，自N端第1-121位氨基酸残基组成重链可变区VH(其中，第26-33位氨基酸残基组成HCDR1，第51-58位氨基酸残基组成HCDR2，第97-110位氨基酸残基组成HCDR3)，第122-350位氨基酸残基为重链恒定区和铰链区。
SEQ ID No.9所示的DNA分子编码SEQ ID No.10所示的多肽(重链)。SEQ ID No.9中，自5’端第1-363位核苷酸编码VH(其中，第76-99位核苷酸编码HCDR1，第151-174位核苷酸编码HCDR2，第289-330位核苷酸编码HCDR3)，第364-1050位核苷酸编码重链恒定区和铰链区，第1051-1053位核苷酸为终止密码子。SEQ ID No.11所示的DNA分子编码SEQ IDNo.12所示的多肽(重链)。SEQ ID No.11中，自5’端第1-363位核苷酸编码VH(其中，第76-99位核苷酸编码HCDR1，第151-174位核苷酸编码HCDR2，第289-330位核苷酸编码HCDR3)，第364-1050位核苷酸编码重链恒定区和铰链区，第1051-1053位核苷酸为终止密码子。
SEQ ID NO.5：
GaggtgcagctggttgaatctggcggaggattggttcagcctggcggctctctgagactgtcttgtgccgcctctggcttcatcttctccgactacggcatgtcctgggtccgacaggctcctggcaaagacctggaatgggtgtccggcatctccaacctgggctcctacacctactacgccgactccgtgaagggcagattcaccatctccagagacaacgccaagaacaccctgagcctgcagatgaactccctgagagccgagGacaccgctctgtactactgtacaagaggcggaaccctgggcaccatgacctatcctaagtatgctggccagggaaccctcgtgaccatctcctct
SEQ ID NO.6：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFSDYGMSWVRQAPGKDLEWVSGISNLGSYTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNSLRAEDTALYYCTRGGTLGTMTYPKYAGQGTLVTISS
SEQ ID NO.7：
Gaggtgcagctggttgaatctggcggaggattggttcagcctggcggctctctgagactgtcttgtgccgcctctggcttcatcttctccgactacggcatgtcctgggtccgacaggctcctggcaaagacctggaatgggtgtccggcatctccaacctgggctcctacacctactacgccgactccgtgaagggcagattcaccatctccagagacaacgccaagaacaccctgagcctgcagatgaactccctgagagccgaggacaccgctctgtactactgtacaagaggcggaaccctgggcaccatgacctatcctaagtatgctggccagggcaccctggtcacagtgtcatct
SEQ ID NO.8：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFSDYGMSWVRQAPGKDLEWVSGISNLGSYTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNSLRAEDTALYYCTRGGTLGTMTYPKYAGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.9：
gaggtgcagctggttgaatctggcggaggattggttcagcctggcggctctctgagactgtcttgtgccgcctctggcttcatcttctccgactacggcatgtcctgggtccgacaggctcctggcaaagacctggaatgggtgtccggcatctccaacctgggctcctacacctactacgccgactccgtgaagggcagattcaccatctccagagacaacgccaagaacaccctgagcctgcagatgaactccctgagagccgagGacaccgctctgtactactgtacaagaggcggaaccctgggcaccatgacctatcctaagtatgctggccagggaaccctcgtgaccatctcctctgctagcgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgctgcatgaggctctgcacagccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggtaaatga
SEQ ID NO.10：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFSDYGMSWVRQAPGKDLEWVSGISNLGSYTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNSLRAEDTALYYCTRGGTLGTMTYPKYAGQGTLVTISSASDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.11：
Gaggtgcagctggttgaatctggcggaggattggttcagcctggcggctctctgagactgtcttgtgccgcctctggcttcatcttctccgactacggcatgtcctgggtccgacaggctcctggcaaagacctggaatgggtgtccggcatctccaacctgggctcctacacctactacgccgactccgtgaagggcagattcaccatctccagagacaacgccaagaacaccctgagcctgcagatgaactccctgagagccgaggacaccgctctgtactactgtacaagaggcggaaccctgggcaccatgacctatcctaagtatgctggccagggcaccctggtcacagtgtcatctgctagcgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgctgcatgaggctctgcacagccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggtaaatga
SEQ ID NO.12：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFSDYGMSWVRQAPGKDLEWVSGISNLGSYTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNSLRAEDTALYYCTRGGTLGTMTYPKYAGQGTLVTVSSASDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
抗体的制备参照实施例2中第二部分。
二、抗鼠疫人源化重链抗体与F1结合能力的检测
1、向探针固定盒中每孔添加200μL用1×PBS配制的终浓度为0.02％Tween 20和0.2％BSA(IgG-Free，Protease-Free)的Q Buffer溶液，挑选适量ProA探针放入固定盒中预先浸泡30min。
2、配制上样体系：用Q buffer溶液将本实施例第一部分得到的待测抗体FW3-R1-Fc和FW3-R3-Fc稀释至30nM，抗原稀释至1200nM(即图4中的1200nM组)、600nM(即图4中的600nM组)、300nM(即图4中的300nM组)、150nM(即图4中的150nM组)、75nM(即图4中的75nM组)。
3、设置反应程序，Baseline后按照Loading-Association顺序设置程序。
4、实验检测：将待测样品添加至96孔检测板中(200μL/孔)。将探针固定盒与检测板放入检测器内，并检查固定无误后，运行检测程序。
5、检测完成后，将数据导入软件DataAnalysis 7.0中进行处理计算KD值，输出实验结果见图4，图4中A为亲本FW3-Fc，图4中B和C分别为人源化后的FW3-R1-Fc、FW3-R3-Fc，结合的曲线未见明显差异。计算抗体与抗原的亲和力KD值，FW3-Fc的KD(M)＝4.43E-09，FW3-R1-Fc的KD(M)＝3.42E-09、FW3-R3-Fc的KD(M)＝4.36E-09，数值均在相同数量级，相差不大，说明人源化后的重链抗体保留了亲本抗体与抗原结合的特性。
三、抗鼠疫人源化重链抗体在小鼠体内中和活性的检测
用攻毒剂量为1000CFU(50×LD50)的鼠疫菌201株(记载于“杨文慧等.鼠疫耶尔森菌人工气溶胶的沉降与衰亡空气生物学特性研究.军事医学,2019年9期”一文，按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用)以液体气溶胶肺递送方式(采用肺部液体定量雾化器，HRH-MAG4，北京慧荣和科技有限公司产品)攻毒小鼠(雌性6-8周龄Balb/C小鼠)，每组六只。3小时后通过尾静脉对抗体组小鼠注射人源化重链抗体FW3-R1-Fc 400μg(即图5中的FW3-R1-Fc)或FW3-R3-Fc 400μg(即图5中的FW3-R3-Fc)，注射体积为100μL，对照组小鼠尾静脉注射生理盐水100μL，观察并记录攻毒后14天内各组小鼠生存情况，绘制生存曲线。
结果如图5所示，在50×LD50鼠疫菌201株攻击下，对照组小鼠在第5天已经全部死亡，平均存活时间为3.83d，FW3-R1-Fc和FW3-R3-Fc抗体400μg组至实验结束全部存活，存活率为100％(6/6)，与人源化前的亲本组FW3-Fc中和活性相当。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.抗鼠疫耶尔森氏菌的重链抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链抗体或其抗原结合片段含有名称为HCDR1、HCDR2和HCDR3的三个互补决定区，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别是SEQ ID No.1的第26-33位、SEQ IDNo.1的第51-58位和SEQ IDNo.1的第97-110位。
2.根据权利要求1所述的重链抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链抗体或其抗原结合片段包括重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.1，或者与SEQID No.1具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性。
3.根据权利要求1或2所述的重链抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链抗体含有重链恒定区，所述重链恒定区为IgG1亚型。
4.根据权利要求1或2所述的重链抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链抗体为FW3-R1-Fc、FW3-R3-Fc和FW3-Fc，所述FW3-R1-Fc的氨基酸序列为SEQ ID No.10，所述FW3-R3-Fc的氨基酸序列为SEQ ID No.12，所述FW3-Fc的氨基酸序列为SEQ ID No.4。
5.根据权利要求1或2所述的重链抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段为单域抗体。
6.生物材料，其特征在于，所述生物材料为如下任一种：
1)含有权利要求1-5中任一所述的重链抗体或其抗原结合片段的单克隆抗体；
2)含有权利要求1-5中任一所述的重链抗体或其抗原结合片段的小分子抗体。
7.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-5中任一所述的重链抗体或其抗原结合片段。
8.含有权利要求7所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌。
9.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1-5中任一所述的重链抗体或其抗原结合片段和生理上或药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
10.应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：
(A1)权利要求7或8中任一所述的核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌在制备权利要求1-5中任一所述重链抗体或其抗原结合片段或权利要求9所述药物组合物中的应用；
(A2)权利要求1-5中任一所述重链抗体或其抗原结合片段在制备权利要求9所述药物组合物中的应用；
(A3)权利要求1-9中任一所述重链抗体或其抗原结合片段或核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或药物组合物在制备用于预防和/或治疗由鼠疫耶尔森氏菌感染所致疾病的产品中的应用；
(A4)权利要求1-9中任一所述重链抗体或其抗原结合片段或核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或药物组合物在制备用于抑制鼠疫耶尔森氏菌感染的产品中的应用；
(A5)权利要求1-9中任一所述重链抗体或其抗原结合片段或核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或药物组合物在制备用于检测鼠疫耶尔森氏菌的产品中的应用；
(A6)权利要求1-9中任一所述重链抗体或其抗原结合片段或核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或药物组合物在制备用于中和鼠疫耶尔森氏菌的产品中的应用；
(A7)权利要求1-9中任一所述重链抗体或其抗原结合片段或核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或药物组合物在制备用于检测鼠疫耶尔森氏菌的F1蛋白的产品中的应用；
(A8)权利要求1-9中任一所述重链抗体或其抗原结合片段或核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或药物组合物在制备用于结合鼠疫耶尔森氏菌的F1蛋白的产品中的应用。
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2023
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