CN117756869A - 基于核糖核酸酶靶向嵌合体的核苷定制方法及其在开发新型抗rna病毒药物中的应用 - Google Patents

基于核糖核酸酶靶向嵌合体的核苷定制方法及其在开发新型抗rna病毒药物中的应用 Download PDF

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刘星宇
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Abstract

本发明公开了一种基于核糖核酸酶靶向嵌合体的核苷定制方法及其在开发新型抗RNA病毒药物中的应用，属于化学生物学和药物化学技术领域。本发明方法包括在核糖2'‑位置进行特定化学修饰，以及将RNase L招募基团整合进修饰的核苷上，从而得到特异性地靶向并降解病毒RNA的核糖核酸酶靶向嵌合体，可用于制备抗RNA病毒药物中。本发明这种方法能提高抗病毒药物的效率和安全性，减少抗药性的风险。本发明开发的核苷类似物与传统药物相比，在抑制病毒RNA复制方面显示出更高的效率和特异性，同时降低了对宿主细胞的毒性。本发明提供了一种新的治疗手段，对治疗以SARS‑CoV‑2及其突变株为例的RNA病毒具有重要的临床价值。

Description

基于核糖核酸酶靶向嵌合体的核苷定制方法及其在开发新型 抗RNA病毒药物中的应用
技术领域
本发明属于化学生物学和药物化学技术领域，具体涉及一种基于核糖核酸酶靶向嵌合体(RIBOTAC)的核苷定制方法及其在开发新型抗RNA病毒药物中的应用。
背景技术
RNA病毒在宿主、环境和传播途径等因素的影响，极易导致传染病的大面积暴发和长时间流行。以新冠病毒SARS-CoV-2为例，现有的抗病毒药物策略主要集中在两个方面：一是针对病毒蛋白的抑制剂，二是直接作用于病毒RNA复制过程的核苷类似物。然而，这些方法各有其局限性。
蛋白抑制剂：针对RNA病毒蛋白的抑制剂虽然在某些方面表现出效力，但由于病毒的高突变率，这些药物的长期有效性受到了挑战。此外，这些抑制剂往往无法阻止病毒的整个复制过程。
核苷类似物：传统的核苷类似物策略，如Molnupiravir和Remdesivir，虽然在抗病毒治疗中显示出前景，但它们的作用机制可能导致病毒的快速适应和抗药性发展。Molnupiravir通过增加病毒的突变率抑制病毒，而Remdesivir则是通过终止RNA链的合成来作用。这两种策略都存在着潜在的安全性问题，尤其是在长期应用中。
现有技术在抗病毒效力、安全性和长期应用效果上存在局限性。尤其是在病毒突变率高的情况下，现有药物可能迅速失效。此外，对于核苷类似物的安全性和抗药性问题也是重要的研究方向。
发明内容
本发明的目的在于克服现有抗病毒技术中存在的药物抗药性、安全性问题、疗效限制等缺点与不足，特别是针对SARS-CoV-2病毒治疗的局限性，提供一种基于核糖核酸酶靶向嵌合体(RIBOTAC)的核苷定制方法及其在开发新型抗RNA病毒药物中的应用。本发明基于核糖核酸酶靶向嵌合体的核苷定制策略(图1)，为病毒RNA靶向治疗药物的开发提供了新方法。本发明的目的还在于提供一种新型核糖核酸酶靶向嵌合体及其应用。通过本发明方法开发的药物不仅提高了对病毒RNA的特异性靶向能力，而且通过独特的作用机制，减少了抗药性和安全性问题的风险。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种基于核糖核酸酶靶向嵌合体的核苷定制方法，包括以下步骤：
(1)核苷的修饰：在核糖2'-位置或碱基上进行化学修饰，以得到能被RNA病毒的RNA聚合酶特异性识别的核苷类似物。在核糖2'-位置或碱基上的修饰针对提高对RNA病毒的RNA聚合酶的亲和力而设计，其增强了其与病毒RNA聚合酶的互作，同时降低了对宿主细胞RNA聚合酶的影响。
(2)RNase L招募基团的整合：利用RIBOTAC技术，将RNase L招募基团整合到步骤(1)得到的核苷类似物上，得到核糖核酸酶靶向嵌合体。RNase L招募基团的整合是为了特异性地靶向并降解病毒的RNA，从而抑制病毒的复制。
所述的基于核糖核酸酶靶向嵌合体的核苷定制方法在开发新型抗RNA病毒药物中的应用。通过所述核苷定制方法得到的核糖核酸酶靶向嵌合体，核苷的修饰使其能被RNA病毒的RNA聚合酶特异性识别和利用，而对宿主细胞RNA聚合酶的影响很小，提高了药物的安全性和特异性。整合的RNase L招募基团能够招募RNase L至病毒RNA，从而引发病毒RNA的特定位点降解，抑制病毒的复制。这种方法绕过了对RNA二级结构的依赖，提高了药物抗病毒的特异性和效率。
一种核糖核酸酶靶向嵌合体，其通过上述方法得到。
一种核糖核酸酶靶向嵌合体，结构式如式(Ⅰ)所示：
其中：
A为核糖核苷，包括胞嘧啶核糖核苷、腺嘌呤核糖核苷、尿嘧啶核糖核苷、鸟嘌呤核糖核苷以及非天然的人工碱基核苷等。
B为RNase L招募基团，其能够招募RNase L，招募基团通过连接臂与核糖核苷相连形成一种核糖核酸酶靶向嵌合体，能特异性地靶向病毒的RNA，从而引发病毒RNA的有效降解。
C为连接臂，选自聚乙二醇链、烷基链和改性烷基链，其一端与核糖核苷的糖环2'-位置或碱基以任意形式相连，另一端与RNase L招募基团上的酚羟基以醚键形式连接。
所述的聚乙二醇链为两个乙二醇及以上的直链或支链聚乙二醇链；
所述的烷基链为两个碳以上直链或支链烷基链；
所述的改性烷基链为烷基的任意碳原子被选自-CO-、-O-、-S-、-SO2-、-SO-、-CO2-、-CONH-、-SO2NH-、-NH-、叔氨、季铵的一种或多种基团置换所得的连接臂，所述的改性烷基链具有2个及以上的碳原子长度，其中碳碳单键任选独立地被碳碳双键或碳碳三键置换；
所述的任意形式相连选自酰胺键、酯键、醚键、磺酰胺键、碳氮键、碳碳单键、碳碳双键、碳碳三键等中的一种连接，或者通过CuAAC、SPAAC、IEDDA等点击化学反应方式相连接。
一种核糖核酸酶靶向嵌合体，其为结构如下所示的2’-RIBOTAC-U或5-RIBOTAC-U：
上述核糖核酸酶靶向嵌合体在制备抗RNA病毒的药物中的应用。所述的RNA病毒包括SARS-CoV-2病毒，所述的SARS-CoV-2病毒包括突变株。
本发明的优点和有益效果：
(1)提高抗病毒效率：本发明的核苷修饰策略，通过特定的化学修饰，提供了一种更为高效的方式来抑制RNA病毒的复制，还能通过降解病毒RNA来减少病毒的复制能力。
以SARS-CoV-2为例，本发明开发的药物与现有的抗病毒药物(如Molnupiravir和Remdesivir)相比，本发明更能直接靶向病毒RNA，从而提供了更高的抗病毒效率。
(2)降低抗药性风险：由于本发明在核苷的结构上进行了特定的修饰，这种新型的核苷类似物对病毒RNA聚合酶的识别和利用方式不同于传统药物，更难被病毒通过常规突变途径规避，从而降低了病毒产生抗药性的可能性。
(3)提高安全性和降低毒性：本发明的核苷修饰策略上更为特异性地针对病毒RNA，相比传统的核苷类似物，对宿主细胞的毒性更低，提高了治疗的安全性，特别是在长期应用中。
(4)本发明采用的化学合成方法和原料选择环境污染少和资源消耗低。
综上所述，本发明在提高抗病毒治疗效果、降低抗药性风险以及提升安全性方面具有显著优势。本发明的核苷修饰策略为抗RNA病毒治疗提供了一种新的有效途径。
附图说明
图1为目前已有抗病毒策略与本发明的核糖核酸酶靶向嵌合体策略的原理图。
(A)已知的针对新冠病毒的核苷药物策略。一个策略涉及具有致突变性质的核苷，诱导病毒的致死突变，而另一个策略利用具有RNA合成终止性质的核苷，诱导病毒RNA复制的终止。
(B)本发明融合核糖核酸酶靶向嵌合体的针对新冠病毒的核苷定制策略。
图2为本发明的核糖核酸酶靶向嵌合体的结构示意图。
图3为化合物2’-RIBOTAC-U核磁共振氢谱。
图4为化合物2’-RIBOTAC-U核磁共振碳谱谱。
图5为化合物5-RIBOTAC-U核磁共振氢谱。
图6为化合物5-RIBOTAC-U核磁共振碳谱。
图7为2’-RIBOTAC-U和5-RIBOTAC-U体外抗病毒活性测试结果。
(A)2’-RIBOTAC-U和5-RIBOTAC-U的结构。
(B)显示了RT-qPCR分析的SARS-CoV-2感染细胞处理后的病毒抑制率(相对于DMSO组)。
(C-E)在RT-qPCR实验中，显示了2’-RIBOTAC-U对细胞内SARS-CoV-2复制的浓度依赖性抑制，其中(C)、(D)和(E)分别对应N1、N2和ORF1ab。
(F-G)将2’-RIBOTAC-U与Molnupiravir进行对比，使用RT-qPCR(F)和Westernblot(G)进行比较；在(F)中，两种化合物的浓度均为6.4μM。
图8为2’-RIBOTAC-U和2’-mutRIBOTAC-U体外抗病毒活性测试比较结果。
(A)带有突变的RNase L招募基团的核苷化学结构。
(B-D)基于定量PCR结果，显示了野生型或突变型RNase L招募基团的不同核苷对细胞内新冠病毒的抑制活性的比较：(B)为N1，(C)为N2，(D)为ORF1ab。实心圆代表经不同浓度的2’-RIBOTAC-U处理后计算出的抑制率(相对于DMSO组)，实心三角形代表经不同浓度的2’-mutRIBOTAC-U处理后计算的抑制率(相对于二甲亚砜组)。
(E)显示了2’-RIBOTAC-U和2’-mutRIBOTAC-U针对细胞内SARS-CoV-2抑制效果的Western blot分析。
(F)为图(E)中的Western blot结果的定量分析。
(G-H)展示了使用2’-RIBOTAC-U、2’-mutRIBOTAC-U和Molnupiravir对细胞内SARS-CoV-2的抑制活动的免疫荧光结果；(G)对应于化合物的6.4μM浓度的结果，而(H)展示了25μM浓度的结果。
图9为2’-RIBOTAC-U体内抗病毒活性测试结果。
(A)仓鼠药物给药的示意图(腹腔注射)和病毒感染后的给药方案(感染剂量为104TCID50，感染后2小时开始给药，每天一次，每次200毫克/千克)；四天后从相关部位提取组织、蛋白和RNA样本进行分析。
(B)通过定量PCR展示了从肺和气管部分提取的RNA的分析和计算的抑制率(相对于二甲亚砜组)。
(C)显示了对肺和气管部分提取的蛋白进行Western blot分析的结果，重点关注Vinculin和N蛋白表达水平。
(D)为图(C)结果的定量分析，对二甲亚砜组进行后标准化，展示了化合物对N蛋白表达的抑制率。
(E)展示了肺组织切片的IHC染色的代表性结果(DMSO组和2’-RIBOTAC-U组)。标尺条＝2000μm。
(F)为通过ImageJ软件分析图(E)中染色区域的结果(统计分析使用未配对的Student'st检验进行；误差条表示技术重复的±SD，n＝5，*p<0.05)。
(G)为肺组织切片的代表性组织学分析。对于对照组(二甲亚砜1)：肺组织中显著的大片状固结区域(黑箭头)、腔隙内显著的炎性细胞渗出、出血和水肿(蓝箭头)、支气管腔内炎性细胞和水肿液的存在、以及细胞外血管和支气管周围的套状炎性细胞浸润(绿箭头)、肺泡壁增厚和充血。对于2’-RIBOTAC-U组(2’-RIBOTAC-U 3)：细胞外血管和支气管周围的套状炎性细胞浸润(绿箭头)。标尺条：第1列-100μm，第2列-1000μm，第3列-50μm。
(H)为将图(G)中以及下图10、图11中所有生物学重复的病理学切片分析并将病变程度分级。PPF表示“肺部病理特征”，从成像角度评估肺部的病理表现：PPF1指的是充血、淤血和肺泡壁增厚的程度；PPF2从肺水肿的范围的角度进行评估；PPF3是从肺泡空间出血的角度进行评估；PPF4衡量肺泡腔内炎性细胞浸润的程度；PPF5评估肺固结的程度；PPF6表示支气管腔内出血的程度；PPF7从支气管腔内水肿的角度进行检查；PPF8从支气管腔内炎性细胞渗出的角度进行检查；PPF9是细胞外(围血管和支气管)炎性细胞浸润的程度的评估。根据病变进行了1-4分的等级评定，分别表示轻度、中度、中重度和重度，而0表示没有可检测的病变。将分析后的相应病状打分统计PPF量化分数(统计分析使用未配对的Student'st检验进行；误差条表示技术重复的±SD，n＝5，*p<0.05)。
图10为DMSO处理后仓鼠病理学切片分析结果。
A图为对照组(二甲亚砜组)另4个生物学重复的病理学切片。
二甲亚砜2：可见肺组织片状实变区域(黑色箭头)，肺泡腔大量炎细胞细胞渗出，出血水肿(蓝色箭头)，支气管腔内可见炎细胞及水肿液，间质血管、支气管周围炎细胞渗出浸润呈套袖样(绿色箭头)，肺泡壁增厚，充血淤血；
二甲亚砜3：可见肺组织局灶实变区域(黑色箭头)，肺泡腔少量炎细胞细胞渗出，间质血管、支气管周围炎细胞渗出浸润(绿色箭头)，肺泡壁增厚，充血淤血；
二甲亚砜4：小面积肺泡壁增厚(红色箭头)，间质支气管周围炎细胞浸润(绿色箭头)；
二甲亚砜5：可见肺组织片状实变区域(黑色箭头)，肺泡腔较多炎细胞细胞渗出，出血水肿(蓝色箭头)，支气管腔内可见炎细胞(黄色箭头)，间质血管、支气管周围炎细胞渗出浸润呈套袖样(绿色箭头)；
B图为二甲亚砜组5个生物学重复不同病状的病变程度分级，1-4分，分别表示轻微、轻度、中度及重度，0表示未见此病变。
图11为2’-RIBOTAC-U处理后仓鼠病理学切片分析结果。
A图为药物组另4个生物学重复的病理学切片。
2’-RIBOTAC-U 1：肺组织显示轻微局灶性实变(黑色箭头)，肺泡腔内炎细胞和水肿减少(蓝色箭头)；
2’-RIBOTAC-U 2：肺泡壁轻度增厚(红色箭头)，间质血管和支气管周围炎细胞渗出及浸润减轻(绿色箭头)；
2’-RIBOTAC-U 4：间质支气管周围炎细胞浸润明显减少(绿色箭头)；
2’-RIBOTAC-U 5：局灶性肺组织实变区域减小(黑色箭头)，肺泡腔内炎细胞渗出显著减少(蓝色箭头)，支气管腔内炎细胞减少(黄色箭头)，间质血管和支气管周围炎细胞渗出及浸润减轻(绿色箭头)；
B图为药物组5个生物学重复不同病状的病变程度分级，1-4分，分别表示轻微、轻度、中度及重度，0表示未见此病变。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案以及效果更加清楚，以下对本发明进一步详细说明。此处只为进一步证明本发明确实实现了发明目的，提供了本发明合成的RIBOTAC化合物合成数据和抗病毒活性研究结果，包括活性化合物2’-RIBOTAC-U和5-RIBOTAC-U以及对照化合物2’-mutRIBOTAC-U。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1核苷类似物的化学合成
原料：包括3,4-二羟基苯甲醛、(2-(2-(2-(2-溴乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯、2-苯胺-4-氧代-4,5-二氢噻吩-3-羧酸乙酯、4-戊炔酸琥珀亚胺酯、2’-叠氮-尿苷和5-叠氮甲基-尿苷等，均购自Sigma-Aldrich。
设备：核磁共振波谱仪(NMR)、高分辨质谱仪(HRMS)等，用于分析和表征合成的核苷类似物。
本发明所涉及化合物2’-RIBOTAC-U和5-RIBOTAC-U的合成路线如下：
具体反应步骤如下：
(1)反应设置：以3,4-二羟基苯甲醛为起始物，进行一系列的有机合成反应。
(2)亲核取代反应：化合物1与化合物2在碳酸钾作用下反应，制得化合物3。具体方法如下：将化合物1(1.38克，10毫摩尔)和化合物2(3.56克，10毫摩尔)溶解于50毫升的N,N-二甲基甲酰胺中，然后加入碳酸钾(1.38克，10毫摩尔)，将得到的混合物在50℃下搅拌24小时。反应结束后，减压浓缩除去溶剂，用硅胶层析柱分离纯化残留物，得到1.65克浅黄色油状的化合物3，收率为40％。
(3)Michael加成反应：化合物3与噻吩衍生物(化合物4)反应生成化合物5。具体方法如下：将化合物3(1.5克、3.63毫摩尔)、化合物4(0.95克、3.63毫摩尔)和哌啶(0.31克、3.63毫摩尔)溶解于50毫升乙醇中，回流反应5小时。反应结束后，反应溶液倒入200毫升乙酸乙酯进行稀释，用浓度为1摩尔的氯化铵水溶液洗涤两次和盐水洗涤一次。有机相用在无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩除去溶剂。粗产物经硅胶层析柱分离纯化，得到1.7克黄色固体化合物5，收率为71％。
(4)叔丁基氧羰基保护基(Boc)去除：使用三氟乙酸脱除化合物5的叔丁基氧羰基保护基，得到化合物6。具体方法如下：在化合物5(1.32克，2毫摩尔)溶于无水50毫升的二氯甲烷中，0℃下缓慢滴加30毫升三氟乙酸。其反应液在0℃下搅拌1反应小时后，减压浓缩除去溶剂，得到黄褐色固体化合物6的三氟乙酸盐1.28克，收率98％，其无需进一步提纯即可用于下一步骤。
(5)酰胺缩合反应：化合物6与4-戊炔酸琥珀亚胺酯(化合物7)反应，得到炔功能化的RIBOTAC化合物8。具体方法如下：将所有化合物6(1.28克，1.96毫摩尔)和化合物7(0.39克，2毫摩尔)溶解于50毫升的无水二氯甲烷中，在0℃下缓慢滴加三乙胺(0.4克，4毫摩尔)。所形成的混合反应液在室温下搅拌15小时后，将其稀释成于150毫升的二氯甲烷中，用1摩尔的氯化铵水溶液洗涤两次和盐水洗涤一次。有机相用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩除去溶剂溶。残留物经硅胶柱层析分离纯化，得到0.85克的黄色油状化合物8，收率68％。
(6)点击化学反应：化合物8分别与2’-叠氮-尿苷(化合物9)和5-叠氮甲基-尿苷(化合物10)反应，合成2’-RIBOTAC-U(化合物11)和5-RIBOTAC-U(化合物12)。具体方法如下：分别将化合物9或化合物10(1毫摩尔)、化合物8(0.64克，1毫摩尔)、抗坏血酸钠(0.99克，5毫摩尔)和五水硫酸铜(0.25克，1毫摩尔)溶于20毫升N,N-二甲基甲酰胺与10毫升水的混合溶剂中。然后，反应混合物在50℃下搅拌反应12小时。完成结束后，减压浓缩去除溶剂，残留物用硅胶柱层析柱分离纯化，分别获得0.68克黄色固体2’-RIBOTAC-U(收率75％)和0.65克金黄色固体5-RIBOTAC-U(收率69％)。
通过上述步骤合成的核苷类似物经过硅胶层析柱分离纯化后，核磁共振波谱分析和高分辨质谱确证其结构和纯度。为进一步证明本发明化合物的合成，下面提供本发明每一步合成的产物的核磁共振数据和高分辨质谱数据，其中2’-RIBOTAC-U和5-RIBOTAC-U均为新化合物，核磁共振谱图见图3-6。
化合物3：浅金黄色油状。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.84(s,1H),7.45(d,J＝2.0Hz,1H),7.39(dd,J＝8.2,2.0Hz,1H),6.99(d,J＝8.2Hz,1H),5.16(s,1H),4.30–4.25(m,2H),3.93–3.87(m,2H),3.76–3.68(m,4H),3.68–3.61(m,4H),3.55(t,J＝5.1Hz,2H),3.31(q,J＝5.3Hz,2H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ191.10,156.08,151.36,147.27,131.31,123.73,115.43,112.89,79.24,70.68,70.51,70.48,70.35,70.21,69.16,69.06,40.36,28.42.HRMS(ESI+)m/z calcd for C20H31NNaO8 +[M+Na]+:436.1942,found:436.1937.
化合物5：浅黄色固体。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ11.49(s,1H),7.73(s,1H),7.49(dd,J＝8.6,7.0Hz,2H),7.42–7.35(m,3H),7.24(s,1H),7.12(d,J＝2.2Hz,1H),7.07–6.99(m,1H),6.90(d,J＝8.4Hz,1H),5.13(br,1H),4.41(q,J＝7.1Hz,2H),4.23–4.18(m,2H),3.88–3.82(m,2H),3.75–3.71(m,2H),3.69(dt,J＝6.0,1.7Hz,2H),3.64(qq,J＝3.3,2.1Hz,4H),3.54(t,J＝5.1Hz,2H),3.30(q,J＝5.5Hz,2H),2.25(s,2H),1.46–1.41(m,12H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ182.23,176.23,167.03,156.05,147.50,147.30,137.18,131.51,129.90,128.55,127.77,125.76,124.12,123.52,116.56,114.11,97.94,79.19,70.63,70.44,70.37,70.22,69.29,69.20,60.59,40.35,28.42,14.45.HRMS(ESI+)m/z[M+H]+,C33H43N2O10S+,计算值:659.2633；检测值:659.2628.
化合物8：黄色油状。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ11.49(s,1H),7.84(br,1H),7.73(s,1H),7.53–7.47(m,2H),7.42–7.37(m,3H),7.12(d,J＝2.2Hz,1H),7.02(dd,J＝8.5,2.2Hz,1H),6.88(d,J＝8.4Hz,1H),6.45(t,J＝5.5Hz,1H),4.41(q,J＝7.1Hz,2H),4.22–4.18(m,2H),3.88–3.83(m,2H),3.75–3.67(m,4H),3.63(s,4H),3.57(dd,J＝5.6,4.3Hz,2H),3.49–3.44(m,2H),2.51–2.45(m,2H),2.41–2.36(m,2H),1.99(t,J＝2.6Hz,1H),1.44(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ182.23,176.22,171.21,167.00,147.56,147.15,137.17,131.48,129.90,128.46,127.81,125.73,124.15,124.12,123.48,116.79,113.57,97.94,83.10,70.58,70.31,70.24,70.19,69.25,68.58,60.59,39.32,35.17,14.45.HRMS(ESI+)m/z[M+H]+C33H39N2O9S+,计算值：639.2371；检测值：639.2381。
化合物2’-RIBOTAC-U：金黄色固体。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.00(d,J＝8.1Hz,1H),7.76(s,1H),7.56(s,1H),7.45–7.31(m,5H),7.01(d,J＝2.1Hz,1H),6.95(dd,J＝8.3,2.1Hz,1H),6.75(d,J＝8.3Hz,1H),6.44(d,J＝6.5Hz,1H),5.61(d,J＝8.1Hz,1H),5.27(t,J＝6.2Hz,1H),4.45(dd,J＝5.9,3.9Hz,1H),4.26(q,J＝7.1Hz,2H),4.13(dt,J＝4.0,2.7Hz,1H),4.07–4.01(m,2H),3.82–3.68(m,4H),3.58–3.45(m,8H),3.38(t,J＝5.5Hz,2H),3.25(s,2H),2.87(t,J＝7.4Hz,2H),2.43(t,J＝7.5Hz,2H),1.28(t,J＝7.1Hz,3H).13CNMR(101MHz,CD3OD)δ183.07,176.51,173.20,165.72,164.40,150.64,149.45,146.95,140.44,137.37,132.02,129.52,127.97,125.50,124.64,124.37,124.27,123.36,115.97,115.78,101.92,97.63,86.55,86.44,70.18,70.17,70.13,70.07,69.76,69.26,69.10,68.20,65.90,60.80,59.99,38.94,34.86,21.17,13.44.HRMS(ESI+)m/z[M+H]+,C42H50N7O14S+,计算值：908.3131,检测值：908.3153。
化合物5-RIBOTAC-U：金黄色固体。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.20(s,1H),7.62(s,1H),7.56(s,1H),7.45–7.33(m,5H),7.00(d,J＝2.1Hz,1H),6.95(dd,J＝8.3,2.0Hz,1H),6.75(d,J＝8.3Hz,1H),5.77(d,J＝3.8Hz,1H),5.08(s,2H),4.27(q,J＝7.1Hz,2H),4.09–4.03(m,4H),3.93-3.88(m,1H),3.75–3.72(m,2H),3.67-3.62(m,1H),3.60–3.57(m,2H),3.58-3.53(m,2H),3.53–3.49(m,3H),3.46(dt,J＝5.9,1.8Hz,2H),3.36(t,J＝5.5Hz,2H),3.20–3.18(m,2H),2.83(t,J＝7.4Hz,2H),2.40(t,J＝7.4Hz,2H),1.28(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ183.16,176.52,173.25,165.62,163.17,150.74,149.36,146.94,146.24,141.41,137.36,131.99,129.53,128.03,125.53,124.71,124.36,124.31,122.48,115.96,115.73,108.14,97.62,89.54,84.95,74.49,70.12,70.09,69.99,69.74,69.60,69.19,69.13,68.13,60.68,60.03,46.24,38.88,34.82,21.11,13.46.HRMS(ESI+)m/z[M+H]+,C43H52N7O15S+,计算值：938.3237；检测值：938.3194。
实施例2体外抗病毒活性测试
细胞株：Huh7-ACE2细胞，用于SARS-CoV-2病毒复制模型。
病毒株：SARS-CoV-2原始株。
实验操作：
(1)细胞预处理：Huh7-ACE2细胞用核苷类似物预处理1小时。
(2)病毒感染：细胞随后感染SARS-CoV-2，感染倍数(MOI)为0.05。
(3)病毒量测定：使用反转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)技术，测定细胞质和上清中的病毒RNA拷贝数。
(4)RT-qPCR和Western blot分析：评估病毒载量和蛋白表达。
(5)免疫荧光实验：用于评估病毒蛋白在组织中的分布。
结果如图7、8所示，2’-RIBOTAC-U和5-RIBOTAC-U均能有效抑制Huh7-ACE2细胞中SARS-CoV-2的复制，其中2’-RIBOTAC-U的效果更为显著。
实施例3体内抗病毒活性测试
实验动物：6周大雌性叙利亚仓鼠，从特定无病原体环境中获得。
感染与治疗：
(1)病毒感染：仓鼠通过鼻内接种感染SARS-CoV-2。
(2)药物治疗：感染后，用2’-RIBOTAC-U进行腹腔注射治疗，剂量为200mg/kg，连续治疗4天。
对照组：对照组接受等体积的DMSO溶液。
药物组、对照组各5个重复。
数据收集：
(1)采样：感染后第四天收集肺和气管组织。
(2)RT-qPCR和Western blot分析：评估病毒载量和蛋白表达。
(3)免疫荧光实验：用于评估病毒蛋白在组织中的分布。
(4)苏木精-伊红(HE)染色：观察组织的形态学变化。
结果如图9所示，接受2’-RIBOTAC-U治疗的仓鼠在肺和气管组织中的SARS-CoV-2RNA和蛋白水平显著降低。免疫荧光实验显示，治疗组中病毒蛋白的表达显著减少。如图9、10、11所示，2’-RIBOTAC-U治疗组的肺组织炎症反应减轻，肺泡结构保持相对完整，与二甲亚砜对照组相比有显著改善。
以上实施例证明了本发明在抗病毒治疗方面的有效性。
这些实施例仅用于解释本发明，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于核糖核酸酶靶向嵌合体的核苷定制方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)核苷的修饰：在核糖2'-位置或碱基上进行化学修饰，以得到能被RNA病毒的RNA聚合酶特异性识别的核苷类似物；
(2)RNase L招募基团的整合：将RNase L招募基团整合到步骤(1)得到的核苷类似物上，得到核糖核酸酶靶向嵌合体。
2.权利要求1所述的基于核糖核酸酶靶向嵌合体的核苷定制方法在开发抗RNA病毒药物中的应用。
3.一种核糖核酸酶靶向嵌合体，其特征在于：通过权利要求1所述的方法得到。
4.一种核糖核酸酶靶向嵌合体，其特征在于：结构式如式(Ⅰ)所示：
其中，A为核糖核苷，B为RNase L招募基团，C为连接臂。
5.根据权利要求3所述的核糖核酸酶靶向嵌合体，其特征在于：所述的核糖核苷包括天然核糖核苷、非天然的人工碱基核苷；所述的天然核糖核苷包括胞嘧啶核糖核苷、腺嘌呤核糖核苷、尿嘧啶核糖核苷、鸟嘌呤核糖核苷。
6.根据权利要求3所述的核糖核酸酶靶向嵌合体，其特征在于：所述的连接臂选自聚乙二醇链、烷基链、改性烷基链，其一端与核糖核苷的糖环2'-位置或碱基连接，另一端与RNase L招募基团连接。
7.根据权利要求5所述的核糖核酸酶靶向嵌合体，其特征在于：
所述的聚乙二醇链为两个乙二醇以上的直链或支链聚乙二醇链；
所述的烷基链为两个碳以上直链或支链烷基链；
所述的改性烷基链为烷基的任意碳原子被选自-CO-、-O-、-S-、-SO2-、-SO-、-CO2-、-CONH-、-SO2NH-、-NH-、叔氨、季铵的一种或多种基团置换所得的连接臂；所述的改性烷基链具有2个以上的碳原子长度，其中碳碳单键任选独立地被碳碳双键或碳碳三键置换。
8.一种核糖核酸酶靶向嵌合体，其特征在于：为结构如下所示的2’-RIBOTAC-U或5-RIBOTAC-U：
9.权利要求3-8任一项所述的核糖核酸酶靶向嵌合体在制备抗RNA病毒的药物中的应用。
10.根据权利要求1所述的方法或权利要求3-8任一项所述的应用，其特征在于：所述的RNA病毒包括SARS-CoV-2病毒，所述的SARS-CoV-2病毒包括突变株。
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